Summary
網膜の注射は、加齢黄斑変性症に対する幹細胞補充療法の臨床研究で広く適用されています。この可視化の記事でラットの目に細胞を提供する強膜によるリスクの少ない、再現性と正確に変更された網膜注入手法について述べる。
Abstract
加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの網膜変性疾患は、世界的な不可逆的な視力喪失の主要な原因です。AMD は、機能的にサポートおよび解剖学的神経網膜の周りを囲むセルの単分子膜は、網膜色素上皮 (RPE) 細胞の退化によって特徴付けられます。非血管新生 AMD (AMD) の現在の薬理学的治療法は、病気の進行を遅くしか新規治療戦略の特定を目的とした研究を施行したビジョンを復元できません。変性の網膜色素上皮細胞を乾燥 AMD を将来的に治療するために健康な細胞の将来性に置き換えます。AMD のための幹細胞補充療法の広範な前臨床研究は、幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜注入の技術を適用する動物モデルの網膜への移植を含みます。これらの前臨床動物研究で最も頻繁に使用されるアプローチは、針の端の直接可視化の欠乏によって困難になされる、網膜の損傷で起因できるしばしば強膜ルートを通じてです。針終了位置の直接観察が可能硝子体を通して別のアプローチがより目の組織が邪魔と手術のトラウマ高いリスクを運ぶ。我々 は正常にし一貫してラット網膜下腔網膜色素上皮細胞を提供し、過剰な網膜の損傷を避けるために定義された針の角度と深さを使用するリスクが少ないと再現性のある変更された強膜注入手法を開発しました。この方法で配信される細胞は、最低 2 ヶ月は王立外科医師 (RCS) ラットで結構効果があります以前実証されています。細胞移植のみならず小分子や遺伝子治療の配信、この手法を使用することができます。
Introduction
人間の網膜は光感覚組織として目関数の後ろに位置し、視覚認知に重要な役割を果たしています。網膜細胞の機能不全や細胞死したがってビジョンの問題や永久的な盲目を引き起こします。変性や網膜の異なる層の細胞の機能不全を伴う疾患はその中で AMD は最も一般的なタイプとの先進国で高齢者に回復不能な失明の主要な原因、網膜変性疾患として知られています。1,2。AMD の病理学的プロセスが網膜色素上皮層と順番視細胞の生理学、神経網膜の萎縮およびビジョンの損失3につながるの RPE サポートを損なう基になるブルッフ膜の間「ドルーゼン」蓄積関連付け 4,5。これまでの治療がない高度な (非血管新生) AMD を乾燥します。幹細胞療法として再生医療の新しいパラダイムの出現は、健康な細胞の幹細胞の機能不全や死者の網膜色素上皮細胞を交換の希望をもたらします。確かに、広範な臨床研究移植の幹細胞 (例えば、ヒト胚性幹細胞)-RPE 変性動物モデルに派生の網膜色素上皮細胞が実行6、7にいくつかの進歩をされています。臨床試験8,9 (NCT01344993、ClinicalTrials.gov)。最近では、幹細胞が人間の網膜色素上皮層、人間の網膜色素上皮幹細胞 (hRPESCs) の居住者の代替ソース研究室によって識別され、現在 amd hRPESC 派生した網膜色素上皮細胞 (RPE-hRPESC) 移植療法の臨床研究で使用されて10,11,12,13。
網膜下注入の技術は、上記当社グループを含む複数のグループによる前臨床試験に適用されます。動物の網膜注入の 2 つの一般的なアプローチ: トランス vitreal と強膜。トランス vitreal 方法の利点はレンズに全体 vitreal 腔を越える前眼に浸透、浸透、subretinal に到達する目に後ろに網膜と針の端を直接観察することが外科医のスペース14,,1516。ただし、それは (前部と後部)、2 つの場所で網膜を中断すること、レンズを傷つけるリスクを運ぶし、針が取り消されるとき硝子体に細胞の逆流の可能性があります必要があります。対照的に、トランス強膜方法は、原則として、網膜と硝子体の関与を回避し、逆流が目を終了します。色素性の齧歯動物の外科医は当初、強膜の浸透を観察できるが、色素性の脈絡膜に通過後針の端が表示されなくなります。直接観察することがなく網膜に違反は一般的と網膜剥離、硝子体に細胞や血液の配信になります。また、眼の表面が湾曲しているために、強膜注射のため最も効果的などの針の角度と深さを知ることは非常に困難です。
この可視化の記事で光コヒーレンストモグラフィ (OCT)、注射部位の詳細な検査ができると手術後の評価を使用して通知強膜網膜注入法を紹介します。私たちの強膜注入法は、定義済みの場所、角度、および非常に低い外科的外傷と高信頼性を生成する注射針の深さを利用しています。ここでは、人間の AMD の前臨床モデル RCS ラットの網膜注入 hRPESC 網膜色素上皮細胞を具体的に示す.この注入法で正常にかつ一貫して救わ hRPESC 網膜色素上皮細胞に非常に高い成功率で RCS ラットの目の網膜。細胞の注射以前が認め RCS 視細胞の保全に注入13後少なくとも 2 ヶ月。この手順は、解剖顕微鏡の下で行われ、学ぶことは簡単です。(外科医と助手) 注射を実行する二人必要で、それぞれの動物の注入の平均時間は 5 分未満。定義された角度と注射針の深さは 10 月が正常網膜注入を達成するために利用可能な研究所を可能にします。それは再現性の高い網膜にアクセスできます、細胞移植のみならず、医薬品配送と遺伝子治療のために使用できます。
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Protocol
動物を含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、アルバニーのニューヨークの州立大学、によって承認されています。
1. 事前注入準備
-
HRPESC RPE の細胞懸濁液の調製
注: 滅菌のティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行し、基本的な生殖不能の技術と知識が必要です。- 主な hRPE 細胞を分離および 24 ウェル プレート12に培養細胞を 50 から 90 年間人間のドナーから目が高齢者します。通路 1 細胞を凍結、融解必要に応じて文化通路 2 (P2) 細胞の注入の 4-5 週間 (図 1 a) の。
- 培地12を外し、軽く 500 μ L で 2 回リンス井戸で加温ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水カルシウム & マグネシウムなし X 1 (1 DPBS CMF x) 1 を追加することによって X DPBS-CMF 井戸 1,000 μ L ピペットを使用し、真空を使用してそれを削除することに。
- 各ウェルに 300 μ L トリプシン/DNAse を追加します。トリプシン/dn (0.25% トリプシン-EDTA の 1 mL あたり 4 区 DNase) セルを分離する 37 ° C で 4 分で hRPESC 網膜色素上皮細胞を孵化させなさい。
- 彼らを切り上げているかどうかを顕微鏡下で細胞を確認します。まだ切り上げ彼らない場合さらに 2 分間トリプシン/DNase のセルをインキュベートし続けます。
- セルが切り上げられます、一度カップ刻んだ井戸から剥離細胞とトリプシン/DNase を不活化する、予め温めておいた培の等量と 15 mL の円錐管に剥離細胞を含むトリプシン/DNase を転送する 1,000 μ L ピペットを使用します。
- 予め温めておいた 1 と井戸をリンス優しく特に; 井戸の縁の周りを上下、ピペッティングにより X DPBS CMF以前の円錐管にこれらの細胞を追加します。
- 細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 286 x g で円錐形の管を遠心します。
- 上澄みを除去し、培地 1 mL の細胞を再懸濁します。
- 診断を使用してセルをカウントします。
- 細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 286 × g で遠心分離機します。
- 上澄みを除去し、細胞に滅菌バランスの取れた塩ソリューション (BSS) 50,000 細胞/μ L で (網膜注入中に 1 μ L のボリュームの 50,000 セルを配信) に再懸濁します。
- 1.7 mL 遠心チューブに氷-水混合物の注入に使用されるまで最終的な細胞懸濁液 (CS) を転送します。
-
セル インジェクターの準備
- 注射器とインジェクターを組み立てるにはしっかりとネジに滅菌 33 ゲージ ベベル針を挿入します。
- 5-6 回 100% エタノールでインジェクターをフラッシュします。
- 5-6 回の 70% エタノール噴射装置をフラッシュします。
- 5-6 回 BSS とインジェクターをフラッシュします。
- (図 1 b) 解剖顕微鏡下で針の先端から 600 μ m の位置にある黒のマーカーペン滅菌とインジェクター針をマークします。
- 注射用マイクロマニピュレーターにインジェクターを配置します。
2. 網膜注入
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外科領域と動物の準備
- 4-5 週齢 RCS ラット (60-100 g) の重量を量るし、イソフルラン蒸気の配信システムを使用してそれを麻酔します。
注:誘発するには、麻酔は 5% にイソフルランの流量を維持します。足を押すことによって麻酔の深さを確認し、手術中に麻酔維持のための 2-3%、流量を減らします。 - 滅菌手術ドレープ、滅菌手術領域を設定する解剖顕微鏡のステージの下に、加熱パッドを配置します。
- 外科領域にラットを転送し、ラットを麻酔を維持するためにイソフルラン システムに接続されている鼻の円錐形に配置します。
- ガーゼでラットの体をカバーしてください。完全麻酔を確認するラットのつま先をピンチします。
- 4-5 週齢 RCS ラット (60-100 g) の重量を量るし、イソフルラン蒸気の配信システムを使用してそれを麻酔します。
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顕微鏡下強膜網膜注入
- ラットの unoperated 目に目の潤滑剤の滴を適用します。
- 注射、外科医の右手に向かって頭とその外科医の方のための天井に直面して左眼の右側にラットを配置します。
- 小さなハサミで目をカバーするひげをトリムします。
- 左眼の時間的側面から目の洗浄量を点滴し、目を洗うに綿棒で鼻側に過剰を収集します。
- それぞれの滴を適用することによって投与後 10 月受験 (たて 10% フェニレフリンから手術の日にそれ 0.9% 生理食塩水で希釈することによって作られる) 1% 2.5% とトロピカミド フェニレフリンで瞳孔を散大させます。
- 4-6 回目の周囲の皮膚を軽く引いてするまぶたを開き、目は若干れ角膜輪部の後方の領域にアクセスするため、突出しています。
- 目の洗浄の適用ドロップ、目の潤いを保ちます。
- 優しく (1.1. 12 のステップで準備) CS をカップ刻んだし、1.2 μ L CS とインジェクターをロードします。余分な 0.2 μ L が注入逆流を補うために使用されます。
注:について私たちの測定に基づく 5,000-8,000 セルはセル損失の約 10-16% に相当する 50,000 の細胞/μ の注射で逆流で失われ、0.2 μ L CS の余分をこのセル損失を補償するために注入されました。 - 満ちている CS マイクロマニピュレーターにインジェクターを配置 (またはそれを保持するアシスタント) 垂直として RPE 細胞傾向にある懸濁液で簡単に沈みます。
- 目にプロパラカイン 0.5% (ローカル局所麻酔薬) のドロップを適用し、綿アプリケーター付き過剰を削除します。
注:この手順は、角膜反射を抑制するし、目が後続の手順の実行中に点滅するを防ぐ必要があります。 - 結膜、角膜の後方をグリップし、鼻、目を回転させる「テント」結膜を持ち上げて鉗子を使用します。
- 結膜に小さな開口部を確認し、基になる強膜を公開「テント」上部をカットするはさみを使用します。
- 鉗子を使用して、残り結膜角膜マージンの端をつかんで、瞳孔軸テーブル トップ (図 1) を基準にして約 30 度の角度で、鼻、目を回転します。針挿入時反力を提供するために、最適な角度で目を維持するために、結膜縁の継続的な把握が必要です。
- 細胞の注入のための下穴をするためには、滅菌ベベル 31 ゲージ インスリンの針の先端位置は 1,200-1,500 μ m 直面している先端の開口縁の後方で。
- 10-15 度 (目的の注射部位の虚数平面に接線) 強膜上にあるインスリンの針の角度を調整します。約 500 μ m の針の深さに強膜・脈絡膜複合体にゆっくりと浸透します。色素性のラットで針の端が「消滅」色素性の脈絡膜の下にあります。ここで使用されるインスリンの針のブランド、針の先端から面取りまでの距離は 500 μ m です。
- 慎重に撤回するインスリンの針 (血の非常に小さい胸水が見られるかもしれない)。
- 過度の出血が認められる場合、目槍は、必要に応じて、穴をオフに適用できます。継続的な出血後槍アプリケーション容器が破損しています。
- 上下強膜の局所的な面を基準にして約 10-15 度の角度に直面して開口をパイロット穴に挿入、RPE 細胞ロード インジェクター針をガイドします。
- インジェクター針を網膜の領域にアクセスする約 500 μ m の深さにパイロット穴にそっと挿入します。黒のペンのマークの端と針が (図 1と1 D) 色素性の脈絡膜で覆われているポイントの間 100 μ m のマージンについて必要があります。
- 優しく細胞 (約 1.2 μ L) の適切な量を注入する注入器注射器のプランジャーを押し下げるにアシスタントを頼みます。プランジャーを押すとアシスタントとしていくつかの反力を提供する準備ができてください。
注:アシスタントの前に模擬練習は外科医とこのステップに必要な経験を持つアシスタントの両方を提供できます。 - ペンで視覚的に焦点を当てながらエッジをマーク、25-30 秒の場所にインジェクターを保持、インジェクターをゆっくりと上げます。少量の逆流がよく観察されます。
注:逆流を認められなかった場合で、ケナコルト硝子体内注入をされてありますいる可能性があります。逆流シールや、強膜の下に充填セルを介して場合は、注入が浅すぎていた。 - 3 回滅菌目洗うと注射部位から細胞排出を洗うし、綿アプリケーター付き過剰を収集します。
- 運営の目に目の潤滑剤の滴を適用し、ラットを移植細胞の場所と網膜の胞のサイズを検討する 10 月駅に転送します。
3. 後注入治療
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抗炎症、痛みの緩和治療
- 痛みを軽減する皮下生理食塩水で 0.1 mg/kg 体重でブプレノルフィンを注入します。
- 腹腔内注入 (i. p.) 炎症制御による生理食塩水で 1.6 mg/kg 体重でデキサメタゾンを注入します。
-
動物の回復
- ラットを体温を維持する熱ランプの下で回復ケージに戻ります。
- 運営の目には出血の兆候を確認します。
- 麻酔が出てくるようにラットを観察します。
- 回復した動物を新鮮なケージに戻る手術カードでケージをフラグし、毎日の苦痛、眼出血、角膜混濁の兆候を監視します。懸念がある場合は、すぐに獣医師を通知します。
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Representative Results
この資料で説明する手法を使用すると、一貫して納品 hRPESC 網膜色素上皮細胞 RCS ラットの網膜下腔の場所、角度、および組織 (図 1 b-D にインジェクター針挿入の深さを正確に制御することにより).すぐに次の移植は、OCT 検査を行った注射部位及び移植の細胞によって作成された網膜下の水疱を観察します。手術後 10 月評価は注射や網膜の損傷や出血を監視の質を評価するためのスクリーニング ツールとして提供しています。両方網膜下水疱 (図 2 a、 CおよびD) 注射部位 (図 2 aおよびB) はスキャン OCT ではっきり確認できたし、。網膜下の水疱は、通常注射後 24 時間以内に解決します。鉱物のサイズの測定は困難な OCT を用いたが、我々 は細胞移植による視細胞保護区域に等しいと仮定すると水疱エリアを見積もることができます。我々 は以前 50,000 セルの 1 μ L 注入の約 6-7% が保存される可能性がありますを示したインジェクション サイト13周囲の RCS 網膜の領域。ブレブの血液注射部位のレイヤーがそのまま図 2 a、 CおよびDレチナールのように、検出されなかったと硝子体、注射による最小限の外傷を示す細胞は認められなかった。さらに、失敗した注射の代表的な 10 月の画像も (図 2 eおよびF) 参照が含まれていた。
フィードバック ツールとして 10 月の使用は、我々 は角度と組織にインジェクター針挿入の深さを最適化されています。最適化されれば、90.8% 5.7% だけ手術で網膜のアクセスの成功率を達成するためにこのメソッドが失敗した場合は、当社他研究13 (表 1) で実行される以上 300 の前網膜注射の結果に基づきます。残りの 3.5% で、OCTs が17を圧延イソフルラン麻酔関連する目のための適切な位置ではなく目を含むいくつかの理由のため実行されません。
移植後 7 日で作動させたラットの目が除核固定および免疫組織学的解析のために区分されました。ひと細胞核マーカー (Hunu)18および網膜色素上皮細胞マーカー (OTX2)19は、移植された細胞を検出する使用されました。図 3は、id と移植の配信の成功を確認する、注入後、1 週間は積極的に両方のマーカーで染まっていた網膜移植網膜色素上皮細胞の厚い層を示した。注射後 1 週間は、多数のセル、図 3のようにが急速に低下少数後で宿主の免疫応答免疫抑制 RCS ラット20でさえのために。それにもかかわらず、前述したように、RCS ラットの目の退化した視細胞層が hRPESC RPE13移植後少なくとも 2 ヶ月間救出されることを見つけることができます。
図 1:4 週間の古い P2 hRPESC 網膜色素上皮細胞と角度とインジェクター針を注入する際使用する深さのデモのイメージ。(A) 位相差像 4 週間の古い P2 hRPESC 網膜色素上皮細胞は注入に使用されます。スケールバー = 100 μ m。 (B)、マイクロ スケールによって測定されるマーカーの端とインジェクター針の先端の間 600 μ m 距離を示す模式図。マイクロ スケールの最小目盛は 100 μ m (C) 漫画のラットの目の解剖学的構造と角度とインジェクター針が眼球壁に挿入する深さの側面図の断面図を示します。ラットの目の瞳孔の軸はテーブルの上を基準にして 30 度、インジェクター針が眼球の局所的な面に対して 15 °。(噴射孔の開口部と、マルケの端間 D) インジェクター針と組織と 100 μ m のスペースに 500 μ m のインジェクター針が挿入される注射部位の上面のマーカーの開始点を示す漫画を左します。r. 穴の場所は、角膜輪部の後方の 1,200-1,500 μ m です。針の先端は、その側に表示されますが、フェイス ダウンをする必要があります注入中。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:注射後すぐに作動させたラットの目の OCT 画像。(A) 10 月 B スキャン画像作動させた目を網膜下水疱・ インジェクション サイト、硝子体内出血なしを示します。(B) 10 月ボリューム強度投影 (VIP) イメージの注入領域の enface 眼底像を表す B スキャン シリーズ。小さな注射部位は、最小限の外傷を示す VIP 画像に表示されます。(C) すべての網膜の層の網膜の移植細胞を示す (、) の拡大 10 月画像をマークしました。この画像は、移植された細胞が網膜の領域に位置していたことを示した。(D) 平均サイズ網膜下水疱を示す 10 月 B スキャン画像。(E) 硝子体内空間に位置する CS と失敗した網膜注入を示す 10 月 B スキャン画像。(F) 注射部位をつつき網膜全体に障害が発生した網膜注入を示す 10 月 B スキャン画像。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 免疫組織学的染色網膜 hRPESC 網膜色素上皮細胞の移植後のセクションを凍結します。(A) ひと細胞核マーカー (Hunu) 染色移植ひと網膜色素上皮細胞の検出を示します。(B, E)セルの核のカウンター染色 (4', 6-diamidino-2-phenylindole;DAPI) 網膜の層、移植、網膜色素上皮層を示します。(C) Hunu と移植された hRPE 細胞が網膜にあることを示す DAPI のマージされた画像。移植と網膜色素上皮層の間の分離は、凍結切片の RCS 目を低温保護に関連付けられている処理アイテムです。(D) 網膜色素上皮細胞移植ひと網膜色素上皮細胞のマーカー (OTX2) 染色。(F) OTX2 の DAPI の合併のイメージ。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 合計注入された RCS ラットの目 | 10 月下良い網膜鉱物 | 10 月の下で小さな網膜鉱物 | 10 月下総非複雑な網膜下の鉱物 | 10 月 (すなわち網膜出血や空気の泡) の下で Complicatd 網膜鉱物 | 10 月は実行されません。 | 手術失敗 (網膜のブレブ 10 月の下) | |
| カウント | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| 合計注入目の % | ------ | 82.80% | 7.96% | 90.76% | 1.59% | 1.91% | 5.73% |
| (これらのデータは RCS ラットの網膜の注射の 10 匹のグループから要約) | |||||||
表 1: RCS ラットの 10 実験コホートから網膜下注射の概要。
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Discussion
この資料に示されている網膜注入法はインジェクター針が神経網膜を傷つけるまたは硝子体腔を乱すことがなく目の壁の外側の層 (強膜・脈絡膜・網膜色素複合体) を貫通強膜の経路です。代替トランス vitreal アプローチには、レンズの損傷を齧歯動物のレンズが硝子体腔の大半を占めているので、白内障につながるの潜在的なリスクがあります。このメソッドと比較して、本手法はリスクが少ないで、インジェクター針は網膜の領域に到達する全体の硝子体腔をまたぐ必要がないので、最小限の外傷を引き起こします。確かに、私たちの研究で OCT 所見網膜浸透の非常にまれなイベントと、動物のフォロー アップ試験では永続的な網膜剥離がないです。また、注射部位が非常に小さい (< 200 μ m 径) 針 33 ゲージ注射器を用いたときの強膜・脈絡膜・網膜色素複合体の構造は非常に限られたので。針撤回後注入穴自己シールないのでステッチ自動的にまたは組織接着剤が必要です。
インジェクション周辺または内から過度の出血、手術の合併症が含まれます下の穴。角膜輪部結膜余白をグリップに鉗子を使用している場合、血管をつまんでを避けるために、可能な限り出血を減少だけ穏やかな力が必要です。パイロット穴を作成するには、前に表在血管の侵入を防ぐ目的の注射部位を調べます。槍を用いた細胞注射針の挿入前に血のパイロット穴をクリアできます。槍のいくつかのアプリケーションの後下の穴からの出血が続く場合、容器は壊れたされて可能性があります。観測した別の合併症は術後角膜混濁を開発 RCS ラットの小さな割合です。いくつかのケースで混濁, 慢性患者と他の人は一時的なものでした。永続的な不透明度を持つ動物は、研究グループから削除されました。目の乾燥、物理的な損傷、炎症、薬や化学物質の刺激21により角膜混濁を開発できます。形成を減らすためには、目は十分な目の潤滑を維持することで水分保持する必要があり、操作中に綿アプリケーターや他のツールで角膜を触れないでください。
使用して定義されたアプローチ角度と眼のランドマークを基準にして針の深さと私たちの設定の外科的テーブルを基準目角度、注入プロトコルはここで説明。投与後 OCT スキャンの使用は精度の高い網膜色素上皮細胞移植ラットの網膜下腔の再現性の高い制御を提供するためにこれらの注入パラメーターの精製において重要でした。反復練習によって習得メソッドは実行する簡単です。勧めします、特に、訓練の成果を判断する手術後の眼の試験が行われています。角度と注射針が必要調整の深さに応じて、手術のセットアップによってこのフィードバックに年齢の動物、および/または他の動物種を使用する場合 (たとえばマウス)。
注入品質を評価し、追加または研究から除外を決定、10 月観測から血を流した subretinal の存在が重要です。10 月が使用できない場合、研究所で以下の基準使用できます迅速なスクリーニングのための外科医によって疑われる注入失敗を除外する: 射出する前に (1): (a) パイロット穴が深すぎるで (すなわち、重要な深さ > 500 μ m の傾斜面の真ん中に針の先端からの距離を使用ここでは、インスリンの針のブランドは 500 μ m)。(b) 下穴が過度に出血 (すなわち、出血が停止できない目槍で穴に力を適用する)。(c) 注射針が深すぎる (すなわち、重要な深さ > 500 μ m または注射針のマーカーは強膜、脈絡膜、RPE の複雑な組織に入る)。(2) 射出時: 射出時にパイロット穴に注射針を維持するために (a) できません。(b) 注入時の注射針のすぐ周りの漏れ。(c) 注射針があまりにも深いプッシュされます (すなわち、強膜、脈絡膜、RPE の複雑な組織に注射針のマーカーになる) 外科医によって注入する際に気づいた。(d) 注入後 5 秒以上の位置に注射針を維持することができません。(e) 過剰な血液注射針を取り消すとき。(f) ない逆流/流出手順 2 と組み合わせると注射針の後を見て。
まとめると、針の位置、角度、深さ、慎重な管理と強膜網膜注入の技術は信頼性の高い、正確なと最小限の外科的外傷を運ぶことができます。これらの利点は、網膜色素上皮細胞の配信のみならず、他の細胞の種類、化合物や遺伝子治療も、この手法を使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は RPE 細胞の準備のため手術とスーザン ボーデンに彼女の援助のためのパテ レダーマンを感謝したいです。我々 はまた、このプロジェクトのための資金の NYSTEM C028504 を認めます。ジャスティン D. ミラーは NIH によってサポートされて F32EY025931 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
