Summary
Inyección subretinal se ha aplicado extensamente en estudios preclínicos de terapia de reemplazo de la célula de vástago para la degeneración macular relacionada con la edad. En este artículo visualizado, describimos una técnica de inyección subretinal menos riesgoso, reproducible y exacto modificado vía trans-escleral para entregar las células en los ojos de rata.
Abstract
Enfermedades degenerativas retinianas como la degeneración macular senil (DMS) son la principal causa de pérdida de visión irreversible en todo el mundo. AMD se caracteriza por la degeneración del pigmento retiniano epitelial (RPE) las células, que son una monocapa de células apoyar funcionalmente y anatómicamente envolver alrededor de la retina neural. Tratamientos farmacológicos actuales para la no-neovascular AMD (AMD seco) sólo retrasar la progresión de la enfermedad pero no pueden restaurar la visión, que requiere estudios dirigidos a identificar nuevas estrategias terapéuticas. Reemplazar las células RPE degenerativas con las células sanas tiene promesa para el tratamiento de AMD seco en el futuro. Extensos estudios preclínicos de terapias de reemplazo de la célula de vástago para AMD implican el trasplante de las células RPE derivadas de células madre en el espacio subretinal de modelos animales, en la que se aplica la técnica de inyección subretinal. El enfoque más utilizado en estos estudios preclínicos con animales es a través de la ruta trans-escleral, que es hecha difícil por la falta de visualización directa de la extremo de la aguja y a menudo puede resultar en daño retiniano. Un enfoque alternativo a través del vítreo permite la observación directa de la posición del extremo de la aguja, pero lleva un alto riesgo de traumas quirúrgicos como son disturbados más tejidos del ojo. Hemos desarrollado un método de inyección trans-escleral modificada menos arriesgado y reproducibles que utiliza aguja definidos ángulos y profundidades con éxito y siempre entregar las células RPE en el espacio subretinal de rata y evitar excesivo daño retiniano. Las células entregadas de esta manera se han demostrado previamente ser eficaz en la rata del Royal College of Surgeons (RCS) por al menos 2 meses. Esta técnica puede utilizarse no sólo para la célula, sino también para la entrega de pequeñas moléculas o terapias genéticas.
Introduction
La retina humana situada en la parte posterior de las funciones del ojo como un tejido sensorial ligero y juega un papel fundamental en la percepción de la visión. Disfunción de las células retinianas o muerte de la célula por lo tanto causa problemas de visión o ceguera permanente. Enfermedades que implican degeneración o disfunción de las células en distintas capas de la retina se conocen como enfermedades retinianas degenerativas, entre las que AMD es el tipo más común y la principal causa de ceguera irreversible en los ancianos en los países desarrollados 1,2. El proceso patológico de AMD está asociado con la acumulación de "drusen" entre la capa del EPR y membrana de Bruch subyacente, lo que deteriora a su vez apoyo RPE de la fisiología del fotorreceptor, llevando a la atrofia de retina neural y de pérdida de visión3, 4,5. Hasta el momento, no existe cura para secar (no-neovascular) AMD. La aparición de la terapia de la célula de vástago como un nuevo paradigma en medicina regenerativa trae la esperanza de reemplazar las células RPE disfuncionales o muertas con células madre derivadas de células sanas. De hecho, estudios preclínicos de trasplante células (p. ej., células madre embrionarias) madre-derivado las células RPE en modelos animales RPE-degenerativas han sido realizados6,7, algunas de las cuales han progresado a ensayos clínicos8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recientemente, una fuente alternativa de células madre residentes en la capa de EPR humana, las células RPE humanas (hRPESCs), fue identificada por nuestro laboratorio y en la actualidad se está utilizando en estudios preclínicos de terapia de trasplante de células (hRPESC-RPE) de RPE derivadas de hRPESC para AMD 10 , 11 , 12 , 13.
La técnica de inyección subretinal es aplicada en los estudios preclínicos mencionados por varios grupos, incluyendo nuestro grupo. Hay dos enfoques generales para la inyección subretinal en animales: trans-vitreal y trans-escleral. El enfoque trans-vitreal tiene la ventaja del cirujano pudiendo observar directamente el extremo de la aguja penetra el ojo anterior, cruza la cavidad vitreal todo junto a la lente y penetra en la retina en la parte posterior del ojo para llegar a la subretinal espacio14,15,16. Sin embargo, requiere interrumpir la retina en dos ubicaciones (anteriores y posteriores), conlleva el riesgo de dañar la lente y puede resultar en reflujo de células en el vítreo cuando la aguja se retrae. En contraste, el enfoque trans-esclerótica, en principio, evita la participación de la retina y vítreo y reflujo sale del ojo. En roedores pigmentados, el cirujano puede observar inicialmente penetración de la esclerótica, pero después paso a la coroides pigmentada, el extremo de la aguja ya no es visible. Sin observación directa, rompiendo la retina es común y puede producir disección retiniana y entrega de las células o sangre en el vítreo. Por otra parte, porque se curva la superficie del ojo, es muy difícil saber que aguja ángulos y profundidades son más eficaces para las inyecciones de trans-escleral.
En este artículo visualizado, presentamos un método de inyección subretinal trans-escleral por el uso de las evaluaciones post-quirúrgicos con tomografía de coherencia óptica (OCT), que permite un examen detallado del sitio de inyección. Nuestra técnica de inyección trans-escleral utiliza ubicaciones definidas, ángulos y profundidades de agujas de inyección producir trauma quirúrgico muy bajo y alta confiabilidad. Aquí, demostramos específicamente la inyección de las células de RPE hRPESC en el espacio subretinal de la rata RCS, un modelo preclínico de AMD humana. Con este método de inyección, con éxito y siempre entregamos las células RPE hRPESC en el espacio subretinal de ojos de ratas RCS con una tasa de éxito muy alta. Inyección de células fue encontrada para resultar en la preservación de los fotorreceptores RCS por lo menos 2 meses después de la inyección13. Este procedimiento se realiza con el microscopio de disección y es fácil de aprender. Se requieren dos personas (un cirujano y un ayudante) para realizar la inyección y el tiempo promedio de inyección para cada animal es menos de 5 minutos. Los ángulos definidos y profundidad para agujas de inyección hace posible para los laboratorios, donde el OCT está disponible, para lograr éxito inyección subretinal. Permite acceso subretinal altamente reproducible y puede ser utilizado no sólo para la célula, sino también de drogas entrega y gene terapias.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad del estado de Nueva York en Albany.
1. preparación de la inyección de
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Preparación de una suspensión de células RPE hRPESC
Nota: Los siguientes pasos se realizan en campana de cultivo estériles para tejidos y familiaridad con técnica estéril básica se requiere.- Aislar células hRPE primaria de donante humano ojos de 50-90 años y células en cultivo en placas de 24 pocillos12. Criopreservar las células en el paso 1, deshielo según sea necesario y la cultura del paso 2 (P2) las células para 4-5 semanas (figura 1A) para inyección.
- Retire el medio de cultivo12 y suavemente pozos enjuague dos veces con 500 μl pre calentado 1 X fosfato tampón salino de Dulbecco sin calcio y magnesio (1 x DPBS-CMF) añadiendo 1 X DPBS-CMF en pozos con una pipeta de 1000 μl y sacándola con un vacío.
- Añadir 300 μL de tripsina/DNasa a cada pocillo. Incube las células RPE hRPESC en tripsina/DNasa (4 kU DNasa por 1 mL de tripsina-EDTA 0,25%) durante 4 minutos a 37 ° C para disociar las células.
- Compruebe las células bajo el microscopio para ver si han redondeado para arriba. Seguir a incubar las células en tripsina/DNasa por un adicional 2 min si no han detenido a todavía.
- Una vez que las células se redondean hacia arriba, utilice una pipeta de 1000 μl triturate las células separadas del pozo y transferir la tripsina/DNasa que contiene las células separadas en un tubo cónico de 15 mL con un volumen igual de medio de cultivo precalentada, para inactivar la tripsina/DNasa.
- Enjuague pozos con 1 con DPBS X-CMF transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo, especialmente alrededor de los bordes del pozo; luego añadir estas células al anterior tubo cónico.
- Centrifugar el tubo cónico a 286 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
- Quite el sobrenadante y resuspender las células con 1 mL medio de cultivo.
- Contar las células usando un hemocitómetro.
- Centrifugue a 286 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
- Quite el sobrenadante y resuspender las células en estéril equilibrio sal solución (BSS) en 50.000 células/μl (para entregar 50.000 células en el 1 volumen de μl durante la inyección subretinal).
- Transferir la suspensión de células final (CS) en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL y en una mezcla de hielo y agua hasta el uso de la inyección.
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Preparación del inyector del celular
- Inserte una aguja biselada calibre 33 estéril en la jeringa de inyección y atorníllela firmemente a montar el inyector.
- Limpie el inyector con etanol al 100% 5 - 6 veces.
- Limpie el inyector con etanol al 70% 5 - 6 veces.
- Limpie el inyector con BSS 5 - 6 veces.
- Marca la aguja del inyector con un rotulador negro estéril en una posición de 600 μm de la punta de la aguja con el microscopio de disección (figura 1B).
- Coloque el inyector en un micromanipulador para inyección.
2. subretinal inyección
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Área quirúrgica y preparación de animales
- Pesan una rata RCS de 4-5 semana de edad (60-100 g) y anestesiar mediante el sistema de suministro de vapor de isoflurano.
Nota: Para inducir anestesia mantener la tasa de flujo de isoflurano en un 5%. Confirmar la profundidad de la anestesia con las patas y luego reducir el caudal a 2-3% para el mantenimiento de la anestesia durante la cirugía. - Colocar un paño estéril de cirugía, con una almohada debajo, en la etapa del microscopio de disección para configurar una zona quirúrgica estéril.
- La rata de transferencia al área quirúrgico y la rata en un cono de nariz, conectado al sistema para mantener la anestesia isoflurano.
- Cubrir el cuerpo de la rata con una gasa. Pellizque el dedo de rata para confirmar la anestesia completa.
- Pesan una rata RCS de 4-5 semana de edad (60-100 g) y anestesiar mediante el sistema de suministro de vapor de isoflurano.
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Trans-escleral inyección subretinal bajo el microscopio
- Aplique una gota de lubricante ocular en ojos no operados la rata.
- Posición de la rata en su lado derecho con su ojo izquierdo hacia el techo para la inyección, su cabeza hacia la derecha del cirujano y su espalda hacia el cirujano.
- Recorte cualquier bigotes que cubren el ojo con unas tijeras pequeñas.
- Gotear una pequeña cantidad de lavado de ojos desde el lado temporal del ojo izquierdo y recoger el exceso en el lado nasal con un aplicador de algodón para limpiar el ojo.
- Dilatar a la pupila con fenilefrina de tropicamida y 2.5% de 1% (recién hecha de fenilefrina 10% diluyendo en solución salina 0.9% estéril en el día de la cirugía) para un examen de OCT después de la inyección mediante la aplicación de una gota de cada uno.
- Tire suavemente de la piel que rodea el ojo 4 - 6 veces para abrir el párpado para que el ojo es ligeramente proptosed para facilitar el acceso a las regiones posteriores al limbus.
- Aplique una gota de la colada del ojo y mantener el ojo húmedo.
- Suavemente triturate CS (preparado en el paso 1.1.12) y carga el inyector con 1,2 μl CS. El extra 0,2 μl se utiliza para compensar la expulsión de inyección.
Nota: Basado en nuestras mediciones, sobre 5.000-8.000 células se pierden en el reflujo con una inyección de 50.000 células/μl que equivale a cerca de 10-16% de pérdida de la célula y un extra de 0,2 μl CS se inyectó para compensar esta pérdida de la célula. - Colocar el inyector llenado de CS en un micromanipulador (o asistente sotenga lo) verticalmente como RPE células tienden a hundirse fácilmente en suspensión.
- Aplique una gota de 0.5% proparacaine (anestésico tópico local) en el ojo y retirar el exceso con un aplicador de algodón.
Nota: Este paso debe suprimir el reflejo corneal y evitar que el ojo parpadea durante los pasos posteriores. - Use pinzas y agarre la conjuntiva posterior al limbus, gire el ojo por vía nasal, levante la conjuntiva para hacer una "tienda".
- Utilice tijeras para cortar la parte superior de la "tienda" para hacer una pequeña abertura en la conjuntiva y exponga la esclera subyacente.
- Utilice pinzas para agarrar el borde del margen restante de conjuntiva junto al limbus y gire el ojo por la nariz para que el eje pupilar está en un ángulo de unos 30 grados con respecto a la tapa de tabla (figura 1). Agarre constante del margen de conjuntiva es necesario para proporcionar una fuerza contra durante las inserciones de la aguja y mantener el ojo en un ángulo óptimo.
- Para hacer un agujero piloto para la inyección de células, coloque el extremo de una aguja de insulina estéril de calibre 31 biselado en 1.200-1.500 μm posterior al limbo con la abertura de la punta hacia arriba.
- Ajuste el ángulo de la aguja de insulina para que sea 10-15 grados por encima de la esclera (tangente a un plano imaginario en el sitio de inyección previsto). Poco a poco penetrar el complejo de la coroides de la esclera hasta una profundidad de aguja de unos 500 μm. En la rata pigmentada, el extremo de la aguja 'desaparecerán' debajo de la coroides pigmentada. Para la marca de la aguja de insulina utilizada aquí, la distancia entre la punta de la aguja y el bisel es 500 μm.
- Cuidadosamente retire la aguja de insulina (puede verse un muy pequeño derrame de sangre).
- Si se observa sangrado excesivo, una lanza de ojo se puede aplicar para limpiar el agujero, si es necesario. Sangrado persistente después de la aplicación lanza indica un buque puede haber sido dañado.
- Guiar la aguja de inyector cargado de células RPE en el orificio piloto, con la abertura hacia abajo y en un ángulo de unos 10-15 grados en relación con la superficie del local de la esclera.
- Inserte suavemente la aguja del inyector en el agujero piloto a una profundidad de alrededor de 500 μm al espacio subretinal. Debe existir sobre un margen de 100 μm entre el borde de la marca de lápiz negro y el punto donde la aguja está cubierta por la coroides pigmentada (figura 1C y 1D).
- Pregunte el asistente Presione suavemente el émbolo de la jeringa del inyector para inyectar el volumen adecuado de las células (aproximadamente 1,2 μL). Estar dispuestos a proporcionar algunos Counter-force como el ayudante presiona el émbolo.
Nota: Previa práctica de simulacro con el asistente puede proporcionar el cirujano y el ayudante con la experiencia necesaria con este paso. - Mientras visualmente enfocando la pluma marca de borde, mantenga el inyector en su lugar para 25-30 s y luego retraiga lentamente el inyector. Comúnmente se observa una pequeña cantidad de reflujo.
Nota: Si se observa no hay reflujo, puede haber una inyección intravítrea. Si ves a contracorriente a través del sello o células de relleno debajo de la esclerótica, la inyección era demasiado poco. - Enjuague la emanación celular desde el sitio de inyección con el lavado de ojo estéril 3 veces y recoger el exceso con un aplicador de algodón.
- Aplique una gota de lubricante ocular en el ojo operado y la rata de transferencia a la estación de OCT para examinar la situación de las células trasplantadas y el tamaño de la ampolla subretinal.
3. después de la inyección tratamiento
-
Tratamiento para aliviar el dolor y antiinflamatorios
- Inyectar la buprenorfina en 0.1 mg/kg de peso corporal en solución salina por vía subcutánea para disminuir el dolor.
- Inyectar dexametasona a 1,6 mg/kg de peso corporal en solución salina por inyección intraperitoneal (I.P.) para el control de la inflamación.
-
Recuperación de animales
- Volver a la rata en la jaula de recuperación con una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal.
- Observar el ojo operado para detectar signos de hemorragia.
- Observar la rata para que salga de la anestesia.
- Devolver el animal recuperado a una jaula nueva bandera la jaula con una tarjeta de la cirugía y monitorizar diariamente para detectar cualquier signo de peligro, hemorragia ocular o opacities córneos. Notificar inmediatamente al veterinario si hay preocupaciones.
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Representative Results
Usando la técnica descrita en este artículo, hemos ofrecido constantemente células RPE hRPESC en el espacio subretinal de ratas RCS controlando precisamente la ubicación, ángulo y profundidad de la inserción de la aguja del inyector en el tejido (figura 1B-D ). Inmediatamente siguiente trasplante, un examen de OCT fue realizado para observar el sitio de inyección y la ampolla subretinal creado por las células trasplantadas. Evaluación post quirúrgica OCT sirve como una herramienta de detección para evaluar la calidad de las inyecciones y el monitoreo de daño retiniano o hemorragia. La ampolla subretinal (figura 2A, C y D) y el sitio de la inyección (figura 2A y B) se podía ver claramente bajo el OCT análisis. La ampolla subretinal usualmente se resuelve en 24 horas después de la inyección. Aunque el tamaño de las ampollas es difícil usando OCT, podemos estimar el área de la ampolla suponiendo que es igual al área de conservación del fotorreceptor por trasplante de la célula. Previamente hemos demostrado que una inyección μL 1 de 50.000 células podría ahorrar unos 6-7% área de la retina RCS en el sitio de inyección13. Como se muestra en la figura 2A, C y D, la retina las capas estaban intactas en el sitio de inyección, no sangre fue detectada en la ampolla, y no se observaron células en el vítreo, demostrando un mínimo trauma causado por la inyección. Además, imágenes representativas de la OCT de inyecciones se incluyeron también como referencia (figura 2E y F).
Con el uso de PTU como una herramienta de retroalimentación, hemos optimizado el ángulo y la profundidad de inserción de la aguja del inyector en el tejido. Una vez optimizado, este método nos ha permitido alcanzar una tasa de éxito de acceso subretinal 90,8% con sólo 5.7% quirúrgico falla, basado en los resultados de más de 300 inyecciones subretinales anteriores realizados en nuestros otros estudios13 (tabla 1). En el restante 3.5%, los PTU no se realizaron por varias razones, incluyendo ojos no en una posición adecuada debido a ojo asociada a anestesia isoflurano rodando17.
A los 7 días después del trasplante, los ojos de rata operada fueron anucleados, fijado y seccionado para análisis immunohistological. Una célula humana marcador nuclear (Hunu)18 y un RPE células marcador (OTX2)19 se utilizan para detectar las células trasplantadas. Figura 3 demostró una capa gruesa de células de EPR trasplantadas en el espacio subretinal, una semana después de la inyección, fue manchado positivamente con ambos marcadores, confirmando la identidad y la entrega exitosa de los trasplantes. En una semana después de la inyección, el gran número de células, como se muestra en la figura 3, puede rápidamente declinar a un pequeño número más adelante debido a la inmunorespuesta del anfitrión incluso en inmunodeprimidos RCS ratas20. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la capa de fotorreceptores degenerados de ojos de ratas RCS puede encontrarse para ser rescatado por al menos 2 meses después del trasplante con RPE hRPESC13.
Figura 1 : Una imagen de 4 semana - viejo P2 hRPESC-RPE células y una demostración del ángulo y la profundidad que la aguja del inyector se utiliza durante la inyección. (A) una imagen de contraste de fase de 4 - semanas de edad células de RPE hRPESC P2 utilizado para la inyección. Barra de escala = 100 μm. (B) un esquema que muestra la distancia entre el borde del marcador y la punta de la aguja del inyector de 600 μm medido por una microescala. La graduación mínima de la microescala es 100 μm. (C) una historieta que muestra la sección transversal de la estructura anatómica del ojo de una rata y una vista lateral del ángulo y profundidad que la aguja del inyector se inserta en la pared del ojo. El eje pupilar del ojo de rata es de 30 grados con respecto a la mesa y la aguja del inyector es de 15 grados con respecto a la superficie del local del globo ocular. (D) una caricatura que muestra el punto de partida del marcador en la aguja del inyector y la vista superior del sitio de inyección donde 500 μm de la aguja del inyector se inserta en un espacio de 100 μm y el tejido queda entre la abertura del agujero de inyección y el borde de la marke r. la ubicación del agujero es 1.200-1.500 μm posterior al limbus. Punta de la aguja se muestra en su lado, pero debe estar boca abajo durante la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes de OCT del ojo operado rata inmediatamente después de la inyección. (A) una imagen de OCT B-scan de un ojo operado que muestra un sitio de la ampolla y la inyección subretinal, sin hemorragia intravítrea. (B) una OCT volumen intensidad (VIP) imagen de proyección de una serie de B-scan, que representa la imagen de fondo enface de la zona inyectada. El sitio de inyección pequeñas es visible en la imagen de VIP mostrando el trauma mínimo. (C) una imagen ampliada del OCT de (A) que muestra las células trasplantadas en el espacio subretinal con todas las capas retinianas marcado. Esta imagen demuestra que las células trasplantadas fueron situadas en el espacio subretinal. (D) una imagen de OCT B-scan mostrando una ampolla subretinal de tamaño medio. (E) una imagen de OCT B-scan mostrando una inyección subretinal fallida con CS situados en el espacio de intravitreal. (F) una imagen B-scan de OCT una inyección subretinal fallida con la retina entera empujando a través de en el sitio de inyección. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : La coloración de Immunohistological de retina congelado secciones después del trasplante de las células de RPE hRPESC. (A) el marcador nuclear de la célula humano (Hunu) coloración indicando la detección de las células humanas trasplantadas de RPE. (B, E) Contador nuclear de la célula tinción (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) mostrando las capas retinianas, la trasplante y la capa RPE. (C) una imagen fusionada de Hunu y DAPI que indica que las células trasplantadas hRPE están ubicadas en el espacio subretinal. La separación entre el trasplante y la capa RPE es un artefacto de procesamiento asociado con cryo-protección de ojos RCS para secciones congeladas. (D) RPE células marcador (OTX2) tinción de las células humanas trasplantadas de RPE. (F) una imagen fusionada de OTX2 y DAPI. Barra de escala = 20μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Total ojos inyectados de ratas RCS | Buenas ampollas subretinales bajo OCT | Pequeñas ampollas subretinales bajo OCT | Total sin complicaciones las ampollas subretinales bajo OCT | Complicatd ampollas subretinales bajo OCT (por ejemplo burbuja de aire o hemorragia retiniana) | No realiza OCT | Falla quirúrgica (ninguna ampolla subretinal bajo OCT) | |
| Conde | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % de total ojos inyectados | ------ | 82.80% | 7,96% | 90.76% | 1,59% | 1.91% | 5,73% |
| (Estos datos son resumidos de diez cohortes de inyecciones subretinales en ratas RCS) | |||||||
Tabla 1: Resumen de inyecciones subretinales de diez cohortes experimentales en ratas RCS.
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Discussion
La técnica de inyección subretinal en este artículo es a través de la vía trans-escleral, donde la aguja del inyector penetra en las capas externas (complejo de esclera-coroides-RPE) de la pared del ojo sin dañar la retina neural o molestar a la cavidad vítrea. Un enfoque alternativo trans-vitreal tiene un riesgo potencial de daño de la lente hacia la catarata, ya que el lente de los roedores ocupa la mayor parte de la cavidad vítrea. En comparación con este método, nuestra técnica es menos riesgoso y causa trauma mínimo como la aguja del inyector tiene que ir a través de la cavidad vítrea entera para alcanzar el espacio subretinal. Las examinaciones de OCT en nuestros estudios demostraron eventos de muy rara penetración retiniana y, en exámenes de seguimiento en los animales, no hay ningún desprendimiento de retina persistente. Además, el sitio de inyección es muy pequeño (< 200 μm de diámetro) cuando usando un inyector de calibre 33 agujas por lo que la alteración estructural del complejo esclerótica coroides de RPE es muy limitada. Después de la retracción de la aguja, el orificio de inyección auto no sella automáticamente puntada o pegamento de tejido es necesario.
Complicaciones con la cirugía incluyen sangrado excesivo en la zona de inyección o desde dentro del agujero piloto. Al usar pinzas para agarrar el margen de la conjuntiva en el limbo, solo suave fuerza es necesario para evitar pellizcar los vasos sanguíneos y disminuir el sangrado posible. Antes de crear el orificio piloto, examine el sitio de inyección previsto para evitar la penetración de vasos sanguíneos superficiales. Mediante el uso de una lanza, el orificio piloto puede ser despejó de la sangre antes de la inserción de la aguja de inyección de la célula. Si el sangrado del orificio piloto persiste después de unas cuantas aplicaciones de la lanza, un buque puede haber sido roto. Otra complicación que se observa es un pequeño porcentaje de ratas RCS desarrollo de opacities córneos postoperatoriamente. En algunos casos, los opacities eran crónicos y otros eran transitorios. Animales con opacidades persistentes se quitaron en el grupo de estudio. Opacities córneos pueden desarrollar debido a la sequedad de ojo, daño físico, la inflamación, fármacos o irritación química21. Para reducir su formación, el ojo debe mantenerse húmedo por mantener la lubricación ocular amplio y evite tocar la córnea con un aplicador de algodón u otras herramientas durante la operación.
El protocolo de inyección había contorneado aquí utiliza enfoque definidos ángulos y profundidades de la aguja en relación con puntos de referencia oculares y ángulos de vista en relación con la mesa quirúrgica en nuestra configuración. El uso de las exploraciones OCT después de la inyección fue importante en el refinamiento de estos parámetros de inyección para proporcionar control reproductivo del trasplante de la célula del EPR en el espacio subretinal de las ratas con alta exactitud. Una vez dominado por la práctica repetida, el método es simple de realizar. Se recomienda, especialmente en la formación, que se realizan exámenes oculares postoperatorio para determinar los resultados. El ángulo y la profundidad del inyección la aguja voluntad probablemente necesita un ajuste en consecuencia a esta retroalimentación dependiendo de la configuración quirúrgica, la edad del animal, o si se utilizan otras especies de animales (por ejemplo, ratón).
Para evaluar la calidad de la inyección y determinar la inclusión o exclusión de un estudio, la presencia de subretinal desangrado de observación OCT es fundamental. En laboratorios, donde OCT está disponible, los criterios descritos a continuación pueden utilizarse para una rápida proyección por los cirujanos para excluir sospecha inyección falla: (1) antes de la inyección: (a) agujero piloto se hace demasiado profundo (es decir, profundidad significativa > 500 μm; para la marca de aguja de insulina utilizada aquí, la distancia desde la punta de la aguja hasta la mitad del bisel es 500 μm). (b) agujero sangra excesivamente (es decir, sangrado no se puede detener aplicación de fuerza en el agujero con lanzas de ojo). (c) la aguja de inyección va demasiado profunda (es decir, > 500 μm de profundidad significativa o el marcador de aguja de inyección entra en el tejido complejo de la coroides/esclerótica/RPE). (2) durante la inyección: (a) no se puede mantener la aguja en el orificio del piloto durante la inyección. (b) salida inmediatamente alrededor de la aguja de inyección durante la inyección. (c) la aguja es empujada demasiado profunda (es decir, se va el marcador de la aguja de inyección en el tejido complejo de la coroides/esclerótica/RPE) como observado por el cirujano durante la inyección. (d) no se puede mantener la aguja en posición por más de 5 segundos después de la inyección. (e) exceso de sangre cuando se está retrayendo la aguja de inyección. (f) no reflujo/flujo visto después de la retracción de la aguja de inyección cuando se combina con el paso 2.
Tomados en conjunto, con una gestión cuidadosa de la localización de la aguja, ángulos y profundidades, la técnica de inyección subretinal trans-escleral es altamente confiable, exacta y puede llevar a trauma quirúrgico mínimo. Con todos estos beneficios, esta técnica puede utilizarse no sólo para la entrega de células de EPR, sino también para otros tipos de células, compuestos o terapias genéticas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer su ayuda en la cirugía y Susan Borden para la preparación de células RPE Patty Lederman. También reconocemos NYSTEM C028504 para la financiación de este proyecto. Justine D. Miller es apoyado por los NIH grant F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
