Summary
Lipiddråper er viktige organeller for replikasjon av flere patogener, inkludert hepatitt C-virus (HCV). Vi beskriver en metode for å isolere lipiddråper for kvantitativ massespektrometri av assosierte proteiner; den kan brukes under forskjellige forhold, for eksempel virus infeksjon, omgivende stress, eller medikamentell behandling.
Abstract
Lipiddråper er avgjørende for replikasjon av en rekke forskjellige patogener, mest utpreget et hepatitt C-virus (HCV), som det antatte området av virion morfogenese. Kvantitativ oljedråpe proteomanalyse kan brukes for å identifisere proteiner som lokaliserer seg til eller er forskjøvet fra lipiddråper under betingelser slik som virusinfeksjoner. Her beskriver vi en protokoll som har blitt brukt for å karakterisere endringer i lipid dråpe proteomet følgende infeksjon med HCV. Vi bruker stabile isotoper Merking med Amino Acids in Cell Culture (SILAC) og således merke den komplette proteomet av en populasjon av celler med "tunge" aminosyrer å kvantifisere proteinene ved hjelp av massespektrometri. For oljedråpe isolasjon, er de to cellepopulasjoner (dvs. HCV-infiserte / "lette" aminosyrer og uinfiserte kontroll / "tunge" aminosyrer) blir blandet 1: 1 og lysert mekanisk i hypoton buffer. Etter fjerning av kjerner og celle debris ved lavhastighetssentrifugering, blir oljedråpe-assosierte proteiner anriket ved to påfølgende ultra-sentrifugeringstrinn etterfulgt av tre vasketrinn i isotonisk buffer. Renheten av de oljedråpe fraksjonene blir analysert ved western blotting med antistoffer som gjenkjenner forskjellige subcellulære rom. Oljedråpe-assosierte proteiner blir deretter separert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) etterfulgt av Coomassie-farging. Etter trypsinfordøyelse blir peptidene kvantifisert ved hjelp av væske-kromatografi-elektrospray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS). Ved hjelp av denne metode, identifiserte vi proteiner som rekrutteres til lipiddråper ved HCV-infeksjon som kan representere pro- eller antivirale vertsfaktorer. Vår fremgangsmåte kan anvendes på en rekke forskjellige celler og dyrkningsbetingelser, som for eksempel infeksjon med patogener, omgivende stress, eller medikamentell behandling.
Introduction
Lipiddråper er høydynamiske cytoplasmatiske (og atom) celleorganeller som består av en kjerne av nøytrale lipider (triglyserider (TG) og kolesterolester (CE)) omsluttet av et monolag av fosfolipider med innlagte proteiner 1. Alle celletyper produsere lipiddråper, men de varierer i størrelse, lipidsammensetning, og protein dekorasjon. Lipiddråper oppfylle forskjellige funksjoner, blant annet tjener som energi- og membran forløper-reservoarer eller som proteinavsetninger. I tillegg, gjennom opptak av lipider, beskytte de celler fra lipotoxicity, frigjørings lipider som signalmolekyler, og er involvert i proteinnedbrytning og endoplasmatisk retikulum (ER) stressresponser 2. Som sådan en rekke proteiner som binder seg til lipiddråper og styrer deres generasjon, degradering, handel, og interaksjon med andre organeller. Blant dem er perilipin familie av bona fide oljedråpe-bindende proteiner (PLIN1-5)f "> 3.
Oljedråpe biogenese sannsynligvis starter i ER, hvor ER-resident enzymer som katalyserer syntesen av nøytrale lipider som akkumuleres inne i membranbilaget, danner en linse av nøytrale lipider, en prosess som nylig ble visualisert pent i gjær 4. Membran bøying og forhøyede fosfatidsyre og diacylglycerol nivåer er da tenkt å tiltrekke proteiner involvert i fosfolipid-biosyntese, som simultan syntese av kjerne nøytrale lipider og fosfolipider skjerming er nødvendig for oljedråpe generasjon 5. Enzymer som rommer transmembranområdene som befinner seg ved den ER katalysere denne prosessen. Ekspansjon av store lipiddråper krever aktiviteten til en annen klasse av lipid-syntetiserende som havn en amfipatisk heliks og kan således bevege seg fra ER til lipiddråper. Mobilisering av lipider fra lipiddråper skjer gjennom lokal aktivering av triglyceride og diacylglycerol lipaser adipose triglycerid lipase (ATGL) og hormonsensitive lipase (HSL) eller ved hjelp av forskjellige autophagic reaksjonsveier, slik som makro- og microlipophagy eller anstand-mediert autophagy 6. Lipiddråper kommunisere med andre cellulære organeller, så som mitokondrier (for beta-oksidasjon og lipid syntese) og ER (for lipid syntese og protein handel), men også med lysosomer, endosomer, og vakuoler indusert av intracellulære bakterier 7. Faktisk bakterier, virus, parasitter og til og med å målrette lipiddråper for replikasjon og utholdenhet, blant dem HCV 8.
HCV-infeksjon er en av de viktigste årsakene til leverrelaterte sykelighet og dødelighet over hele verden, og står for om lag 0,5 millioner dødsfall per år ni. Den sanne antall HCV infeksjoner er ukjent, men nyere anslag tyder på at 130 - 150 millioner mennesker er kronisk infisert. Ingen vaccine eksisterer, men nylig godkjent direkte-virkende antivirale dramatisk øke terapeutiske respons sammenlignet med den standard interferon-baserte terapi. Men på verdensbasis, behandling av pasienter vil trolig bli begrenset på grunn av den ekstremt høye kostnader for nye behandlingsformer. Omtrent halvparten av alle personer kronisk infisert med HCV utvikler fettleversykdom (steatose), en tilstand som kjennetegnes ved overdreven akkumulering av fettdråper i hepatocytter. Intriguingly, lipiddråper også utviklet seg til viktige cellulære organ for HCV-replikasjon, putatively tjener som virale montasjesider 10, 11.
I HCV-infiserte celler, virusproteinet kjerne og NS5A lokalisere til lipiddråper i en prosess som er avhengig av triglycerid-biosyntese, som inhibitorer av diacylglycerol-acyltransferase-1 (DGAT1) svekke handelen til lipiddråper og påfølgende HCV framstilling av partikkelen 12 >, 13, 14, 15. I tillegg har mutasjoner i oljedråpe-bindende domener av enten kjernen eller NS5A undertrykke HCV sammenstillingen 16, 17. Kjerne og NS5A deretter rekruttere alle andre virale proteiner, så vel som virale RNA-replikasjonskomplekser, til membraner tett forbundet med lipiddråper 16. En felles virkning av alle virale proteiner nødvendig for en vellykket produksjon av infeksiøs virusavkom 10, 11. De strukturelle proteiner er en del av virioner, og de ikke-strukturelle proteiner fremmer protein-proteininteraksjoner som er nødvendige for denne fremgangsmåten. Intriguingly er bona fide oljedråpe-bindende protein PLIN3 / TIP47 som kreves for både HCV-RNA-replikasjon og frigjøring av virioner 18, 19
Her beskriver vi en fremgangsmåte for å isolere lipiddråper for kvantitativ massespektrometri av assosierte proteiner. Ved hjelp av denne metode, fant vi dyptgående endringer i oljedråpe proteome i løpet av HCV infeksjon og identifisert annexin A3 som er vert-protein som ko-fraksjonerer med lipiddråper og er nødvendig for effektiv HCV-modning 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Media for stabile isotoper Merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC)
MERK: Her er den SILAC proteinkvantifisering Kit - DMEM supplert med 50 mg av 13 C 6 L-arginin-HCl ble brukt for SILAC merking. Den dialysert føtalt kalveserum (FCS) er forsynt med SILAC proteinkvantifisering Kit.
- Fjern 50 ml fra hver flaske med DMEM-medium og tilsett 50 ml av dialysert FCS.
- Oppløs 50 mg av 13 C 6 L-lysin-2HCl og 50 mg av 13 C6-L-arginin-HCI i 1 ml medium. Bland grundig og tilsett aminosyrene til DMEM + FCS-medium.
- Legg 1x Pen / Strep og 1x L-glutamin erstatning. Sterilfilter mediet ved anvendelse av et 0,45 um filter. Merk flasken som "tung" SILAC medium.
- For å fremstille den "lette" medium, gjenta trinn 1,1 til 1,3 ved anvendelse av 50 mg L-arginin-HCl og 50 mg L-lysin-2HCl. Merk flasken som "light" SILAC medium.
2. SILAC-merking og Amino Acid innlemmelse Styre
- Cellene trypsineres (1x Trypsin-EDTA) og splittet 1 x 10 5 Huh7.5 celler til 2 brønner i en 6-brønns kulturplate inneholdende 2 ml medium, en brønn med det "tunge" SILAC medium og en med den "lette" SILAC medium.
- Dyrke cellene i minst 6 passasjer (delingsforhold: 1: 6); etter 6 passeringer, bør inkorporering av den "tunge" aminosyrer være mer enn 95%.
- Avling 1 x 10 6 celler av den "tunge" - og "lett" -merkede cellepopulasjon for å analysere inkorporering effekt. Vask cellene i 1 x PBS og sentrifuger cellene ved sentrifugering i 5 min ved 160 x g og 4 ° C.
- Resuspender cellepelleten i 150 ul MS-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, og 1 mM EDTA supplert med 1x protease-inhibitor cocktail), og inkubere cellene på is i 30 min. Lyse calen ved sonikering ved 4 ° C.
MERK: Følgende er sonikasjonen innstillingene som brukes her: timer, hold; effektstyring, 8; driftssyklus, 80%; og 2 x 30 pulser. - Fjerne celleavfall ved sentrifugering i 10 minutter ved 11.000 xg og 4 ° C. Overfør supernatanten til et nytt rør og bestemme proteinkonsentrasjonen med en detergent-kompatibel proteinanalyse.
- Bland 75 pg protein med 6 x prøvebuffer (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% glycerol, 123 mg / ml SDS, 600 ug / ml bromfenolblått, og 60 ul / ml β-merkaptoetanol), koker ved 95 ° C i 5 minutter, og separere proteiner ved SDS-PAGE på SDS rennende buffer (3,02 g / l Tris-base, 18,8 g / l glycin, og 1 g / l SDS) ved 180 V i ca. 1 time, eller i henhold til produsentene ' bruksanvisning.
- Overfør gelen til kolloidal Coomassie-farging løsning. Eksisere samme protein bånd fra hvert felt. Fordøye proteiner med trypsin og analysere inkorporering effekt ved MS analyseverktøs, som beskrevet 22.
3. Lipid Droplet Isolering av SILAC-merkede celler Huh7.5
- Infisere en populasjon av celler (dvs. de som er merket med "lette" aminosyrer) med en HCV-reporter virus ved inkubering med virusforråd (f.eks JC1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) i 4 timer ved 37 ° C, som beskrevet 21 .
MERK: JC1 NS5AB-mKO2-BSD er en HCV-virus som bærer et fluorescens-reporter (monomer Kusabira Orange 2, mKO2) for å overvåke infeksjonstall etterfulgt av en blasticidin Resistance Gene (BSD) mellom en duplisert NS5A-NS5B-spaltningssete, beskrevet tidligere 21, 23. Arbeid med HCV krever BSL2 + (USA) eller S3 ** (Tyskland) biosikkerhet nivå oppsamling og praksis. I stedet for infeksjon med HCV kan celler infisert med forskjellige patogener. - Utvid HCV-infisert "lette" celler og ikke-infiserte & #34;. Tung" celler Under passering av kulturene, feste en alikvot med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS og bestemme HCV infeksjon priser ved flowcytometri av det fluorescerende markørprotein (f.eks mKO2), som beskrevet 21; i infeksjon priser bør være høyere enn 90% for oljedråpe isolasjon. MERK: Ved bruk av JC1 NS5AB-mKO2-BSD HCV-stamme, tilsett 10 mikrogram / ml blasticidin S til den "lette" medium for å selektere for HCV-positive celler.
- 1 d før oljedråpe isolasjon, vaskes cellene med PBS, trypsineres, resuspendere i "lys" og "tung" medium, og cellene telles ved bruk av et Neubauer tellekammer. Seed 7 x 10 6 celler av hver populasjon i en 150 cm2 cellekulturskål. Forbered minst 5 retter per "lette" og "tunge" cellepopulasjonen. Dyrke cellene i 30 ml medium / skål O / N.
- Fjern medium og vaske cellene i 1 x PBS. Løsne cellene i 1xPBS ved anvendelse av en celleskrape.
- Telle begge cellepopulasjoner ved hjelp av et Neubauer tellekammer og pool som tilsvarer antall celler i et 50 ml sentrifugerør. Sentrifuger cellene ved sentrifugering i 5 min ved 160 x g og 4 ° C.
- Fjern PBS og cellepelleten suspenderes i 1 ml av sukrose-buffer (0,25 M sukrose, 1 mM EDTA og 1 mM DTT, supplert med protease inhibitor cocktail). Overfør cellesuspensjonen til en tettsittende Dounce-homogenisator og lysere cellene med 200 slag på is.
MERK: Bekreft fullstendig cellelyse hjelp trypanblåfarging. - Overfør lysatet til et 1,5 ml mikrofugerør og spinne ned de kjerner og cellerester i 10 minutter ved 1000 xg og 4 ° C.
- Etter sentrifugering lagre en porsjon på 25 pl av det post-nukleære fraksjonen (PNS) ved -20 ° C som et inngangsstyre.
- Sett resten av PNS fraksjonen ved bunnen av sentrifugerøret (11 x 60 mm) og overlappe med oljedråpe vaskebuffer (~ 3 ml, 4 ml total) (50 mM kaliumfosfatbuffer pH 7,4, 100 mM kaliumklorid, 1 mM EDTA og 1 mM fenylmetansulfonylfluorid).
- Sentrifuger i 2 timer ved 100 000 xg og 4 ° C. Høste flytende oljedråpe fraksjon ved hjelp av en bøyd, stumpe kanyle fra toppen av røret (ca. 250 til 500 uL, avhengig av mengden av lipid-dråper). Plasser oljedråpe fraksjonen i et sentrifuge-rør (11 x 60 mm), overlagret med oljedråpe vaskebuffer (~ 3,5 ml; 4 ml totalt), og gjenta sentrifugeringstrinnet.
- Høste flytende oljedråpe fraksjon ved hjelp av en bøyd, stumpe kanyle fra toppen av røret og overføre lipiddråper til et nytt 1,5 ml mikrofuge-rør. Tilsett 500 ul av oljedråpe vaskebuffer og sentrifugering i 20 minutter ved 21.000 xg og 4 ° C.
MERK: lipiddråper vises som et hvitt bånd flyter på toppen av bufferen. - Fjern det nedenforliggende vaskebuffer ved anvendelse av en gel-oppfyllings pipettespissen og gjenta dette vasketrinn tre ganger.
- Etter den endelige fjernelse av vaskebuffer ved anvendelse av en gel-oppfyllingspipettespiss, blande 5 ul lipid dråpefraksjoner med 10 ul av NP-40 lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, og 1% NP-40 , supplert med protease inhibitor cocktail). Inkuber prøven på is i 1 time for å inaktivere viruset hvis arbeider med infeksiøst materiale. Bestem proteinnivået med en detergent-kompatibel proteinanalyse; minst 35 ug protein som er nødvendig for MS-analyse.
- Oppbevar lipid dråpefraksjoner ved -20 ° C.
- Bland det tilsvarende volumet av oljedråpe fraksjonen med 4x lasting fargestoff. Inkuber på is i 1 time for å inaktivere viruset hvis arbeider med infeksiøst materiale. Kok ved 95 ° C i 5 min.
- Separer proteiner ved anvendelse av SDS-PAGE i henhold til fabrikantens protokoll. Overfør gelen til kolloidal Coomassie-farging løsning. Skjære ut alle proteinbåndene fra gelen. Etter tryptisk i-gel fordøyelse 24 </ Sup>, fordampe prøvene og oppløse dem i 0,1% maursyre. Analyse ved LC-MS / MS.
MERK: Her LC-MS / MS-analyser ble utført på en kvadrupol-Time-of-Flight massespektrometer (Q-TOF) eller på en lineær Trap kvadrupol (LTQ) orbitrap massespektrometer. Begge instrumenter som ble koblet med en ESI-kilde til en nano-UPLC system. Dataanalyser og LC-MS / MS-analyser på Q-TOF, og på den orbitrap massespektrometer ble utført som beskrevet 21, 22. Ta stor forsiktighet for ikke å forurense prøven med menneskelig keratin. Bruk alltid keratin-frie pipettespisser og rør. Forbered buffere under laminær strømningshette med keratin-fri kjemikalier. Før bruk, rense alle flater og enheter med destillert vann og etanol. Bruk alltid hansker og en frakk.
4. Analyse av oljedråpe Purity
- Fortynn aliquoter av oljedråpe fraksjoner på 1: 2 og inngangs fraksjoner (se trinn 3.9) fortynnes 1:10 med NP-40 Lyser buffer. Prøvene inkuberes på is i 1 time for å inaktivere viruset hvis arbeider med infeksiøst materiale. Bestem proteinnivået med en detergent-kompatibel proteinanalyse.
- Bland like mengder protein med 6x prøvebuffer, og prøvene inkuberes på is i 1 time for å inaktivere viruset hvis arbeider med infeksiøst materiale. Fortsett med SDS-PAGE og overføre proteinene på et nitrocellulosemembran ved tank-blotting ved 80 V i 90 minutter.
MERK: Etter blokkering av membranen i blokkeringsbuffer (5% fettfri tørrmelk-pulver i TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20)), inkuberes med antistoffer rettet mot oljedråpe markører (f.eks , PLIN1, PLIN2, eller PLIN3) og markører for andre subcellulære kamre (f.eks CALR, MnSOD, eller tubulin), etterfulgt av sekundære HRP-koblet antistoff. Bruk kjemiluminescens for påvisning av proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipiddråper er avgjørende for HCV-infeksjon som de antatte områder av virion montering, men de molekylære mekanismer for morfogenese og utgang av virioner er stort sett ukjent. For å identifisere nye vert avhengighet faktorer som er involvert i den prosess, utførte vi kvantitativ oljedråpe proteomanalyse av HCV-infiserte celler 21 (figur 1A). Vi har etablert en protokoll for rensing av lipiddråper og rutinemessig påvist ved en sterk anrikning av oljedråpe-bindende proteiner PLIN2 / ADRP og PLIN3 / TIP47 og en uttømming av markører for andre cellulære rom, slik som β-tubulin til mikrotubuli, MnSOD for mitokondrier, eller calreticulin / calnexin for ER (figur 1 B, C). Vi samlet en liste av proteiner som på en pålitelig måte cofractionate med lipiddråper i Huh7.5 celler (figur 1d), og, ved hjelp av isotop merking, identifiserte proteiner som er spesifikt rekrutterttil eller forskjøvet fra lipiddråper i HCV-infiserte celler (figur 1E). Våre resultater tyder på at HCV kobler lipiddråper fra sin vanlige metabolske funksjon og / eller regulering og identifisere antatte verten avhengighet og restriksjonsfaktorer.
Figur 1: (A) Reaksjonsskjema av forsøket. Naive Huh7.5 celler ble merket med "tung" aminosyrer eller "lette" aminosyrer. Celler som bærer "lette" aminosyrer ble infisert med en HCV-rapportørvirus (JC1 NS5AB-mKO2-BSD). "Lys" og "tunge" aminosyre-merkede populasjoner ble blandet, og lipiddråper ble isolert ved hjelp av to påfølgende ultrasentrifuge og tre vasketrinn, separert ved SDS-PAGE og analysert ved hjelp av LC-ESI-MS / MS. Legg merke til den flytende hvite lipid dråpe fraksjon (rød pil) etter ultracentrifugati på og vasking i mikrofugerør. (B) Western blot analyse av post-nukleære og oljedråpe fraksjoner viser en anrikning av lipid dråpemarkørproteiner i oljedråpe fraksjoner og en uttømming av markører for andre cellulære rom. (C) Coomassie blå og sølvfarging av post-nukleære supernatant (PNS) og lipidfraksjoner dråpe separert ved hjelp av SDS-PAGE. Sølvfarging blir presentert for visualisering bare. (D) Heatmap av antall peptider og prosentandel protein dekning av proteiner som er identifisert i oljedråpe fraksjoner av Huh7.5 celler (cutoff: ≥5 peptider og ≥20% dekning). (E) Heatmap skildrer anriket eller utarmet oljedråpe-assosierte proteiner etter infeksjon med HCV (normalisert til medianen, 1,5-kutt, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Modifisert fra 21.et = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for å isolere lipiddråper for kvantitativ oljedråpe proteomanalyse å sammenligne anrikning og nedbryting av proteiner forbundet med lipiddråper under forskjellige dyrkningsbetingelser, som for eksempel virusinfeksjoner. Som en alternativ fremgangsmåte, kan den proteomanalyse utføres med etikettfritt kvantifisering basert på totale toppintensiteter. Denne metoden har noen dynamisk område og unngår begrensning metabolske problemer. Fordelen med den SILAC tilnærmingen er at prøvene ble slått sammen før oljedråpe isolasjon, og derfor er resultatene uavhengig av feil i prøvepreparering, fordøye, og LC-MS / MS-analyse. Vi anbefaler denne tilnærmingen for kvantitativ lipid dråpe proteom analyse.
Som anrikning eller uttømming av oljedråpe-assosierte proteiner observert i MS-analyse kunne reflektere en induksjon eller undertrykkelse av proteinekspresjon, analyse av ekspresjonsnivåer av quantitative RT-PCR og (fortrinnsvis) western-blotting er oppmerksom på. I tillegg kan to metoder benyttes for å verifisere anrikning eller uttømming av spesifikke proteiner i lipiddråper: oljedråpe isolasjon, etterfulgt av western-blotting og immunofluorescensanalyse med lipofile fargestoffer, som BODIPY eller LD540, som flekker lipiddråper som beskrevet 21.
Utføre forsøk med byttet merkingsbetingelsene for å sikre at merkingen med "tunge" aminosyrer som ikke påvirker proteinekspresjon eller oljedråpe lokalisering og for å identifisere proteinforurensninger fra den "lette" medium og miljøkilder. For protein identifikasjon, må søket utføres med en falsk oppdagelse hastighet (FDR) på 0,01 på både peptidet og proteinnivå. For å sikre høy tillit resultater, anbefaler vi å utføre minst 3 - 4 uavhengige eksperimenter med celler fra forskjellige deler og ulike virus lager forberedelser. Avhengig av magnitude av endring, kanskje mer uavhengige eksperimenter være nødvendig.
For å normalisere de kvantitative MS-data for å korrigere for litt annen celle tall eller lipiddråper, sentrere påvisningsforhold av den "lette" over den "tunge" peptider, eller vice versa, i byttet merkingsforhold ved å dividere gjennom medianverdien av alle identifiserte proteiner som beskrevet 25. Hvis mengden av lipid-dråper varierer sterkt mellom prøvene, normal til oljedråpe markørproteiner, slik som PLIN2, kan det være tilrådelig. Når vi normalisere våre MS data til PLIN2 nivåer, finner vi lignende resultater som når vi normal til median (analyse ikke vist). Av notatet under celledyrkningsforhold vi bruker, har vi ikke oppdage betydelig lipid dråpe akkumulasjon på HCV-infeksjon.
Lipiddråper er i nær kontakt med andre cellulære organeller, særlig mitokondrier og ER. Derfor, proteiner fROM disse avdelinger kan ko-fraksjonere med lipiddråper under isolering. Dersom en slik "forurensning" protein er uforandret i overflod som respons på infeksjon eller behandling, vil den ikke påvirke den sammenlignbare oljedråpe proteomanalyse. Det må imidlertid bemerkes, at under visse omstendigheter, kan kontakten mellom lipiddråper og andre organeller endres. For eksempel under lipolytiske betingelser, er mitokondrielle proteiner påvises ved høyere frekvenser i lipid dråpefraksjoner fra lipolytically stimulerte 3T3-L1 celler i forhold til basalforhold 26. Stimulert de novo lipogenese, på den annen side, kan føre til økt samarbeid med ER. Disse endringene så gjenspeile endringer i organeller interaksjon indusert på grunn av forskjellige stimuli og kan være interessant, selv om det ikke er representative for ren oljedråpe lokalisering.
Vi brukte denne protokollen for en omfattende kvantitativ lipid dråpe proteome analyse av HCV-infiserte, versus uinfiserte kontrollceller for å avdekke de forstyrrelser forårsaket av HCV-infeksjon, og for å identifisere regulatorer av HCV-replikasjon 21. I hepatomcellelinje Huh7.5, vi rutinemessig identifisert opp til 2900 proteiner i lipid dråpefraksjoner, med ~ 300 proteinene identifisert med multiple peptider i hvert forsøk. Etter infeksjon med HCV-, observerte vi at både rekruttering og uttømming av vertsproteiner. Flere proteiner identifisert som sterkt anriket på lipiddråper av HCV-infiserte celler er tidligere blitt publisert som HCV vertsfaktorer (f.eks, DEAD boks proteiner 1 og 3 (DDX1, DDX3) eller insulinliknende vekstfaktor-II-mRNA-bindende protein 1 ( IGF2BP1)), noe som indikerer påliteligheten av SILAC tilnærmingen 27, 28, 29. I tillegg blir rekruttert proteiner ofte annotert for RNA-bindende proteiner, fremhever tett sammenslutning av det virale RNA replicasjon komplekser med lipid dråpefraksjoner. I motsetning til dette ble proteiner utarmet fra lipiddråper hovedsakelig annotert for lipid metabolske prosesser, noe som indikerer at HCV perturbs proteinsammensetningen for å frakoble lipiddråper fra sin normale metabolske regulering og funksjon.
Protokollen vi beskrive er amendable til forskjellige cellelinjer og dyrkningsbetingelser og kan hjelpe i å tyde funksjon av lipiddråper i livssyklusen til forskjellige patogener som er avhengige av lipiddråper for replikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker R. Bartenschlager (Universitetet i Heidelberg) for JC1 konstruksjoner, CM Rice (Rockefeller University) for Huh7.5 celler, J. McLauchlan (Medical Research Council virologi Unit) for JFH1 konstruere, T. Wakita (National Institute of infeksjons~~POS=TRUNC sykdommer~~POS=HEADCOMP, Japan) for JFH1 og B. Webster og WC Greene (Gladstone Institute of Virology og immunologi) for de HCVcc reporter konstruksjoner. Dette arbeid ble støttet av midler fra DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, og INST 337 / 16-1 2013 (HS)). Heinrich Pette Institute, Leibniz Institutt for eksperimentell virologi er støttet av Free og hansabyen Hamburg og Federal Ministry of Health. De organer hadde ingen rolle i studieutforming, datainnsamling og analyse, beslutning om å utgi, eller fremstillingen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
