Summary
des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.
Abstract
Les gouttelettes lipidiques sont essentielles à la réplication d'une variété de différents agents pathogènes, le plus en évidence le virus de l'hépatite C (VHC), comme le site présumé de virion morphogenèse. analyse des gouttelettes de lipide protéome quantitative peut être utilisée pour identifier les protéines qui se localisent à ou sont déplacés à partir de gouttelettes lipidiques dans des conditions telles que les infections virales. Nous décrivons ici un protocole qui a été utilisé avec succès pour caractériser les changements dans le protéome des gouttelettes de lipides après infection par le VHC. Nous utilisons l'étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) et l'étiquette ainsi le protéome complet d'une population de cellules avec des acides « lourds » acides pour quantifier les protéines par spectrométrie de masse. Pour l' isolation des gouttelettes de lipides, les deux populations de cellules ( par exemple le VHC infectés / acides aminés « légers » et témoins non infectés / acides aminés « lourds ») sont mélangés à 1: 1 et lysées mécaniquement dans un tampon hypotonique. Après avoir enlevé les noyaux et cellules debris par centrifugation à basse vitesse, les protéines de gouttelettes lipidiques associée sont enrichies par deux étapes d'ultracentrifugation ultérieures suivies de trois étapes de lavage dans un tampon isotonique. La pureté des fractions de gouttelettes lipidiques est analysé par transfert de type western avec des anticorps reconnaissant les différents compartiments subcellulaires. protéines associées à des gouttelettes lipidiques sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. Après digestion trypsique, les peptides sont quantifiés par spectrométrie de masse Chromatographie liquide-électrospray-tandem à ionisation (LC-ESI-MS / MS). En utilisant cette méthode, nous avons identifié des protéines recrutées à des gouttelettes lipidiques sur l'infection par le VHC qui pourraient représenter des facteurs d'accueil pro- ou anti-viraux. Notre méthode peut être appliquée à une variété de différentes cellules et conditions de culture, telles que l'infection par des agents pathogènes, stress environnemental ou un traitement médicamenteux.
Introduction
Les gouttelettes lipidiques sont des organelles cellulaires hautement cytoplasmiques (et nucléaires) dynamique composé d'un noyau de lipides neutres (triglycérides (TG) et l' ester de cholestérol (CE)) entourée par une monocouche de phospholipides avec des protéines intégrées 1. Tous les types de cellules produisent des gouttelettes lipidiques, mais ils varient en taille, la composition des lipides, et la décoration des protéines. Les gouttelettes lipidiques remplissent diverses fonctions, notamment comme réservoirs d'énergie et d'un précurseur de membrane ou en tant que dépôts de protéines. De plus, grâce à l'absorption des lipides, ils protègent les cellules de lipotoxicité, les lipides de libération sous forme de molécules de signalisation, et sont impliqués dans la dégradation des protéines et réticulum endoplasmique (RE) les réponses au stress 2. En tant que tel, une multitude de protéines se lient à des gouttelettes lipidiques et régissent leur génération, la dégradation, la traite, et l'interaction avec d'autres organelles. Parmi ceux - ci sont la famille périlipine des protéines de liaison des gouttelettes de lipides de bonne foi (PLIN1-5)f "> 3.
Gouttelette lipidique biogenèse commence probablement à l'ER, où les enzymes ER-résident catalysent la synthèse des lipides neutres qui accumulent dans la membrane bicouche, la formation d' une lentille de lipides neutres, un procédé qui a été récemment visualisé bien dans la levure 4. Membrane de flexion et des taux élevés d'acides phosphatidiques et de diacylglycérol sont alors pensé à attirer des protéines impliquées dans la biosynthèse des phospholipides, comme la synthèse simultanée des lipides neutres de base et les phospholipides de blindage est nécessaire pour la génération de gouttelettes de lipides 5. Enzymes hébergeant des domaines transmembranaires qui se trouvent à l'ER catalysent ce processus. Extension de grosses gouttelettes de lipides nécessite l'activité d'une autre classe d'enzymes de synthèse de lipides qui abritent une hélice amphipathique et peut ainsi se déplacer à partir de l'ER à des gouttelettes lipidiques. La mobilisation des lipides de gouttelettes lipidiques se produit par l'activation locale du triglycéridee lipase et diacylglycérol triglycéride lipases adipeux (ATGL) et de la lipase sensible aux hormones (HSL) ou par différentes voies de autophagiques, tels que autophagie macro- et microlipophagy ou chaperon à médiation 6. Les gouttelettes lipidiques interagissent avec d' autres organelles cellulaires tels que mitochondries (pour la bêta-oxydation et la synthèse des lipides) et ER (pour la synthèse des lipides et le trafic de protéine), mais aussi avec les lysosomes, les endosomes et les vacuoles induites par des bactéries intracellulaires 7. En effet les bactéries, les virus, les parasites et même cible gouttelettes lipidiques pour la réplication et la persistance, parmi eux le VHC 8.
L' infection par le VHC est l' une des principales causes de la morbidité liée au foie et mortalité dans le monde, ce qui représente environ 0,5 million de décès par an 9. Le nombre réel d'infections par le VHC est inconnu, mais les estimations récentes suggèrent que 130 - 150 millions de personnes sont chroniquement infectées. pas VACCINe existe, mais l'augmentation a récemment approuvé Antiviraux-à action directe de façon spectaculaire les réponses thérapeutiques par rapport à la thérapie à base d'interféron standard. Cependant, dans le monde entier, le traitement des patients sera probablement limitée en raison des coûts extrêmement élevés des nouveaux traitements. Environ la moitié des personnes chroniquement infectées par le VHC développent une maladie du foie gras (stéatose), une condition caractérisée par l'accumulation excessive de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. Intrigant, des gouttelettes lipidiques ont également émergé comme organites cellulaires vitaux pour la réplication du VHC, au service putative comme sites d'assemblage viraux 10, 11.
Dans les cellules infectées par le VHC, le noyau de la protéine virale et NS5A localisent à des gouttelettes de lipides dans un processus qui dépend de la biosynthèse des triglycérides, en tant qu'inhibiteurs de la diacylglycérol acyltransférase 1 (DGAT1) compromettre le trafic de gouttelettes lipidiques et la production de particules de VHC subséquente 12 >, 13, 14, 15. En outre, des mutations dans les domaines de gouttelettes lipidiques de liaison de l' une ou noyau NS5A du VHC suppriment l' assemblage 16, 17. Core NS5A recrutent alors toutes les autres protéines virales, ainsi que des complexes de réplication d'ARN viral, des membranes étroitement associées à des gouttelettes lipidiques 16. Une action concertée de toutes les protéines virales est nécessaire pour la production réussie de la descendance virale infectieuse 10, 11. Les protéines structurelles font partie des virions, et les protéines non structurales favorisent les interactions protéine-protéine nécessaire à ce processus. Curieusement, la protéine de liaison aux lipides gouttelettes de bonne foi PLIN3 / TIP47 est nécessaire à la fois pour la replication de l' ARN du VHC et la libération des virions 18, 19
Nous décrivons ici une méthode pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées. En utilisant cette méthode, nous avons trouvé des changements profonds dans le protéome des gouttelettes de lipides lors de l' infection par le VHC et l' annexine A3 identifié comme une protéine hôte qui co-fractionne avec des gouttelettes lipidiques et est nécessaire pour la maturation du VHC efficace 21.
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Protocol
1. Préparation des médias pour l'étiquetage des Isotopes Stables avec des acides aminés dans la culture cellulaire (de SILAC)
REMARQUE: Ici, la Quantification protéine SILAC Kit - DMEM complété avec 50 mg de 13 C 6 L-Arginine-HCl a été utilisé pour l' étiquetage des SILAC. Le sérum de veau foetal dialysé (FCS) est fourni avec la protéine Kit Quantification de SILAC.
- Retirer 50 ml de chaque bouteille de milieu DMEM et ajouter 50 ml de FCS dialysé.
- Dissoudre 50 mg de 13 C 6 L-Lysine-2HCl et 50 mg de 13 C 6 L-Arginine-HCl dans 1 ml de milieu. Bien mélanger et ajouter les acides aminés au milieu DMEM + FCS.
- Ajouter 1x Pen / Strep et 1x substitut L-glutamine. Stérile filtre le milieu en utilisant un filtre de 0,45 um. Etiqueter le flacon comme « lourd » moyen de SILAC.
- Pour préparer la "lumière" milieu, répéter les étapes 1.1 à 1.3 en utilisant 50 mg de L-arginine-HCl et 50 mg de L-Lysine-2HCl. Etiqueter la bouteille "lumière » moyenne SILAC.
2. SILAC-étiquetage et de contrôle des acides aminés constitutifs
- Trypsiniser les cellules (1 x trypsine-EDTA) et fendue 1 x 10 5 Huh7.5 cellules dans 2 puits d'une plaque de culture à 6 puits contenant 2 ml de milieu, un puits avec le milieu de SILAC « lourd » et l' autre avec la « lumière » moyen SILAC.
- Cultiver les cellules pendant au moins 6 passages (de rapport de division: 1: 6); après 6 passages, l'incorporation des acides aminés « lourds » doit être supérieure à 95%.
- Récolte 1 x 10 6 cellules de la « lourd » - et « lumière » population de cellules à analyser marqué au l'efficacité d'incorporation. Laver les cellules dans du PBS 1x et sédimenter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 160 x g et 4 ° C.
- Remettre en suspension les culots cellulaires dans 150 ul de tampon SM (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, et EDTA 1 mM additionné de cocktail d'inhibiteurs de protease 1x) et incuber les cellules sur de la glace pendant 30 min. Lyse caunes par sonication à 4 ° C.
REMARQUE: Les éléments suivants sont les paramètres de sonication utilisés ici: minuterie, tenez; commande de sortie, 8; cycle de travail, 80%; et 2 x 30 impulsions. - Éliminer les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 min à 11 000 xg à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et déterminer la concentration en protéine avec un dosage de protéine compatible avec les détergents.
- Mélanger 75 pg de protéine avec un tampon 6x d'échantillon (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% de glycerol, 123 mg / ml de SDS, 600 ug / ml de bleu de bromophénol, et 60 ul / ml β-mercaptoethanol), faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min, et on sépare les protéines par SDS-PAGE dans un tampon de migration SDS (3,02 g / L de base Tris, 18,8 g / glycine L et 1 g / L SDS) à 180 V pendant environ 1 h ou selon les fabricants ' instructions.
- Transférer le gel dans une solution de coloration colloïdale Coomassie. Exciser la même bande de protéines de chaque voie. Digèrent les protéines avec la trypsine et d'analyser l'efficacité de l'incorporation par MS analysis, tel que décrit 22.
3. Lipid Droplet Isolement des cellules Huh7.5 SILAC marqué
- Infect une population de cellules ( par exemple ceux marqués avec "légers" acides aminés) avec un virus rapporteur du VHC par incubation avec des stocks de virus (par exemple, Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) pendant 4 h à 37 ° C, comme décrit 21 .
REMARQUE: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD est un virus VHC portant un journaliste de fluorescence pour surveiller les taux d'infection (monomère Kusabira Orange 2, mKO2) suivie d'une résistance Blasticidin gène (BSD) entre un site de clivage NS5A-NS5B dupliquée, décrit précédemment 21, 23. Le travail avec le VHC exige NSB2 + (Etats-Unis) ou S3 ** (Allemagne) confinement de niveau de biosécurité et les pratiques. Au lieu de l'infection par le VHC, les cellules peuvent être infectées par des agents pathogènes différents. - Développez les cellules « légères » infectés par le VHC et non infectés & #34;. Des cellules lourdes » Au cours de l'repiquage des cultures, fixer une partie aliquote avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS et déterminer les taux d'infection par le VHC par cytométrie de flux de la protéine marqueur fluorescent (par exemple, mKO2), comme décrit 21; la les taux d'infection devraient être supérieurs à 90% pour l' isolement des gouttelettes lipidiques . REMARQUE: Si vous utilisez le Jc1 NS5AB-mKO2-BSD souche du VHC, ajouter 10 pg / mL blasticidine S au milieu « lumière » pour sélectionner des cellules infectées par le VHC.
- 1 d avant l'isolement des gouttelettes de lipides, laver les cellules avec du PBS, trypsiniser, remettre en suspension dans « lumière » et « lourd » moyen, et compter les cellules en utilisant une chambre de Neubauer. Graine 7 x 10 6 cellules de chaque population dans un 150 cm 2 boîte de culture cellulaire. Préparer au moins 5 plats par population cellulaire « légère » et « lourd ». Culture des cellules dans 30 ml de milieu / plat O / N.
- Retirez le milieu et laver les cellules dans du PBS 1x. Détachez les cellules 1xPBS en utilisant un grattoir à cellules.
- Compter les deux populations de cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer et mettre en commun des nombres égaux de cellules dans un tube à centrifugation de 50 ml. Pellet les cellules par centrifugation pendant 5 min à 160 x g et 4 ° C.
- Retirer le PBS et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon de saccharose (saccharose 0,25 M, EDTA 1 mM et DTT 1 mM, additionné de cocktail d'inhibiteurs de protease). Transférer la suspension cellulaire à un homogénéisateur Dounce moulants et lyser les cellules avec 200 coups sur la glace.
REMARQUE: Confirmer la lyse cellulaire complète en utilisant une coloration au bleu trypan. - Transférer le lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml et centrifuger les noyaux et les débris cellulaires pendant 10 min à 1000 x g et 4 ° C.
- Après centrifugation, stocker une partie aliquote de 25 ul de la fraction post-nucléaire (SNP) à -20 ° C en tant que contrôle d'entrée.
- Placer le reste de la fraction PNS au fond du tube de centrifugation (11 x 60 mm) et recouvrir avec du tampon de lavage de gouttelettes de lipides (~ 3 ml, 4 ml total) (50 mM, pH du tampon phosphate de potassium 7,4, 100 mM de chlorure de potassium, 1 mM d'EDTA et 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle).
- Centrifuger pendant 2 h à 100 000 x g et 4 ° C. La récolte de la fraction des gouttelettes de lipides flottante en utilisant une courbe, canule émoussée de la partie supérieure du tube (environ 250 à 500 ul, en fonction de la quantité de gouttelettes de lipides). Placer la fraction des gouttelettes de lipides dans un tube de centrifugeuse (11 x 60 mm), la superposition avec le tampon de lavage de gouttelettes de lipides (~ 3,5 ml, 4 ml au total), et répéter l'étape de centrifugation.
- La récolte de la fraction des gouttelettes de lipides flottante en utilisant une courbe, canule émoussée de la partie supérieure du tube et de transférer les gouttelettes lipidiques dans une nouvelle 1,5 mL tube de microcentrifugation. Ajouter 500 pi de tampon de lavage de gouttelettes de lipides et de spin pendant 20 min à 21 000 xg à 4 ° C.
REMARQUE: les gouttelettes apparaissent sous la forme Lipid une bande blanche flottant au-dessus du tampon. - Retirer le tampon de lavage sous-jacente en utilisant une pointe de pipette de charge de gel et répéter cette étape de lavage à trois reprises.
- Après l'élimination finale du tampon de lavage en utilisant une pointe de pipette de charge de gel, mélanger 5 ul de fractions de gouttelettes lipidiques avec 10 ul de tampon de lyse NP-40 (Tris-HCl 50 mM 7,4, 150 mM de NaCl et 1% de NP-40 , additionné de cocktail d'inhibiteurs de protease). Incuber l'échantillon sur la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Déterminer le niveau de protéine avec un dosage de protéine compatible avec les détergents; au moins 35 ug de protéine est nécessaire pour MS-analyse.
- Stocker les fractions de gouttelettes de lipides à -20 ° C.
- Mélanger le volume correspondant de la fraction des gouttelettes de lipide avec 4x colorant de charge. Incuber sur la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min.
- Séparer les protéines par SDS-PAGE selon le protocole du fabricant. Transférer le gel dans une solution de coloration colloïdale Coomassie. Exciser toutes les bandes de protéines du gel. Après digestion tryptique en gel 24 </ Sup>, évaporer les échantillons et les dissoudre dans 0,1% d'acide formique. Analyser par LC-MS / MS.
REMARQUE: Ici, les analyses LC-MS / MS ont été effectuées sur un spectromètre de masse quadripôle-Time-of-Flight (Q-TOF) ou sur un piège linéaire quadripôle (LTQ) Orbitrap spectromètre de masse. Les deux instruments ont été couplés avec un ESI-source à un système nano-UPLC. Les analyses de données et LC-MS / MS analyse sur le Q-TOF et le spectromètre de masse Orbitrap ont été effectuées comme décrit 21, 22. Prenez soin de ne pas contaminer l'échantillon avec la kératine humaine. Utilisez toujours des conseils et des tubes pipette sans kératine. Préparer des tampons sous le capot d'écoulement laminaire avec des produits chimiques libres kératiniques. Avant toute utilisation, nettoyez toutes les surfaces et dispositifs avec de l'eau distillée et de l'éthanol. Portez toujours des gants et une blouse de laboratoire.
4. Analyse des Lipid Droplet Pureté
- Diluer aliquotes de fractions de gouttelettes lipidiques 1: 2 et des fractions d'entrée (voir étape 3.9) 01:10 avec NP-40 à Lysest un tampon. Incuber les échantillons sur la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Déterminer le niveau de protéine avec un dosage de protéine compatible avec les détergents.
- Mélanger des quantités égales de protéine avec un tampon 6x de l'échantillon et incuber les échantillons sur de la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Procéder à la SDS-PAGE et transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose par buvardage de réservoir à 80 V pendant 90 min.
REMARQUE: Après blocage de la membrane dans du tampon de blocage (5% de poudre de lait en poudre écrémé dans du TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl et 0,05% de Tween 20)), incuber avec des anticorps dirigés contre des marqueurs de gouttelettes lipidiques (par exemple , , PLIN1, PLIN2 ou PLIN3) et des marqueurs des autres compartiments subcellulaires (par exemple, CALR, MnSOD, ou la tubuline), suivis par des anticorps couplés à la HRP-secondaire. Utilisez chimioluminescence pour la détection de protéines.
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Representative Results
Les gouttelettes lipidiques sont essentielles à l'infection par le VHC que les sites présumés de l'assemblage des virions, mais les mécanismes moléculaires de la morphogenèse et la sortie de virions sont en grande partie inconnus. Identifier les facteurs de dépendance hôte nouveaux impliqués dans ce processus, nous avons effectué une analyse quantitative du protéome des gouttelettes de lipides des cellules infectées par le VHC-21 (Figure 1A). Nous avons établi un protocole de purification de gouttelettes lipidiques et habituellement détectée un fort enrichissement des protéines de gouttelettes se liant aux lipides PLIN2 / PAAC et PLIN3 / TIP47 et un épuisement des marqueurs d'autres compartiments cellulaires, tels que les β-tubuline pour microtubules, MnSOD pour les mitochondries, ou calréticuline / calnexine pour le ER (figure 1B, C). Nous avons compilé une liste de protéines qui cofractionate de manière fiable avec des gouttelettes lipidiques dans les cellules Huh7.5 (figure 1D) et, en utilisant un marquage isotopique, protéines identifiées qui sont spécifiquement recrutésou déplacé à partir de gouttelettes lipidiques dans les cellules infectées par le VHC (Figure 1E). Nos résultats indiquent que le VHC débranche gouttelettes lipidiques de leur fonction métabolique régulière et / ou d'un règlement et d'identifier la dépendance hôte putatifs et les facteurs de restriction.
Figure 1: (A) Schéma de l'expérience. les cellules naïves Huh7.5 ont été marquées avec des acides aminés « lourds » ou « légers » acides aminés. Les cellules portant « légères » acides aminés ont été infectés par un virus rapporteur du VHC (Jc1 NS5AB-mKO2-BSD). « Lumière » et les populations marquées d'acides-aminés « lourds » ont été mélangés, et des gouttelettes lipidiques ont été isolées par ultracentrifugation deux ultérieur et trois étapes de lavage, séparés par SDS-PAGE et analysés par LC-ESI-MS / MS. Notez la fraction flottante blanc de gouttelettes de lipides (flèche rouge) après ultracentrifugati le lavage et dans des tubes de microcentrifugation. (B) Analyse par Western blot des fractions de gouttelettes post-nucléaires et de lipides représente un enrichissement de protéines marqueurs de gouttelettes lipidiques dans les fractions de gouttelettes lipidiques et un épuisement des marqueurs d'autres compartiments cellulaires. (C) Coomassie coloration au bleu et l' argent du surnageant post-nucléaire (PNS) et des fractions de gouttelettes lipidiques séparées par SDS-PAGE. coloration à l'argent est présenté pour la visualisation seulement. (D) Heatmap du nombre de peptides et le pourcentage de couverture de la protéine de protéines identifiées dans les fractions de gouttelettes de lipides de cellules Huh7.5 (seuil: ≥5 peptides et de la couverture de ≥20%). (E) Heatmap dépeignant enrichis ou appauvris protéines associées à des gouttelettes lipidiques après l' infection par le VHC (normalisée à la médiane, de coupure de 1,5 fois, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Modifié de 21.et = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour isoler des gouttelettes lipidiques pour l'analyse du protéome des gouttelettes de lipides quantitative pour comparer l'enrichissement et l'appauvrissement des protéines associées à des gouttelettes lipidiques dans des conditions de culture diverses, telles que les infections virales. En tant que méthode alternative, l'analyse du protéome peut être réalisée avec quantifications sans étiquette basée sur l'intensité totale des pics. Cette méthode n'a aucune limite de plage dynamique et évite les problèmes métaboliques. L'avantage de l'approche SILAC est que les échantillons sont mis en commun l'isolement des gouttelettes de lipides avant, et par conséquent, les résultats sont indépendants des erreurs dans la préparation des échantillons, la digestion et l'analyse LC-MS / MS. Nous vous recommandons fortement cette approche pour l'analyse protéomique des gouttelettes de lipides quantitative.
Comme l'enrichissement ou l'appauvrissement des protéines de gouttelettes lipidiques associée observées dans l'analyse de MS pourrait refléter une induction ou la répression de l'expression des protéines, l'analyse des niveaux d'expression par quantitative RT-PCR et (de préférence) Western Blot est conseillé. En outre, deux méthodes peuvent être utilisées pour vérifier l'enrichissement ou appauvrissement de protéines spécifiques dans des gouttelettes lipidiques: isolation des gouttelettes de lipide suivie par transfert de Western et l' analyse d'immunofluorescence avec des colorants lipophiles, tels que BODIPY ou LD540, que les gouttelettes de lipides dans le colorant tel que décrit 21.
Effectuer des expériences avec des conditions d'étiquetage permutés pour faire en sorte que l'étiquetage des « lourds » acides aminés n'influence pas l'expression des protéines ou la localisation des gouttelettes de lipides et d'identifier les contaminants protéiques du milieu « lumière » et les sources environnementales. Pour l'identification des protéines, doit être effectuée la recherche avec un taux de faux positifs (FDR) de 0,01 à la fois le peptide et la protéine. Afin de garantir des résultats de haute confiance, nous vous recommandons d'effectuer au moins 3 - 4 expériences indépendantes, avec des cellules de différents passages et différentes préparations de stocks de virus. En fonction de la mpleur des changements, des expériences indépendantes pourrait être nécessaire.
Pour normaliser les données quantitatives MS pour corriger le nombre de cellules légèrement différentes ou gouttelettes lipidiques, centre les rapports de détection de la « lumière » sur les peptides « lourds », ou vice versa, dans des conditions d'étiquetage permutées en divisant par la médiane de toutes les protéines identifiées , tel que décrit 25. Si la quantité de gouttelettes lipidiques diffère sensiblement entre les échantillons, normalisant aux protéines marqueurs de gouttelettes de lipides, tels que PLIN2, pourrait être souhaitable. Lorsque l'on normalise nos données MS à des niveaux PLIN2, nous trouvons des résultats similaires que lorsque l'on normalise à la médiane (analyse non représenté). Il convient de noter, dans les conditions de culture cellulaire que nous utilisons, nous ne détectons pas significative l'accumulation de gouttelettes lipidiques lors de l'infection par le VHC.
Les gouttelettes lipidiques sont en contact étroit avec d'autres organites cellulaires, et plus particulièrement les mitochondries et la salle d'urgence. Par conséquent, les protéines From ces compartiments peuvent co-fractionnement avec des gouttelettes lipidiques au cours de l'isolement. Si une telle protéine « contaminant » est inchangé en abondance en réponse à une infection ou d'un traitement, il ne sera pas influer sur l'analyse comparative des gouttelettes de lipides protéome. Il faut noter toutefois que dans certaines circonstances, le contact entre les gouttelettes lipidiques et d'autres organites peut être modifié. Par exemple, dans des conditions lipolytiques, les protéines mitochondriales sont détectées à des fréquences plus élevées dans les fractions de gouttelettes de lipides par les adipocytes 3T3-L1 lipolytically stimulées par rapport aux conditions de base 26. Stimulé lipogenèse de novo, d'autre part, pourrait conduire à une association renforcée avec l'ER. Ces changements reflètent alors les changements dans l'interaction des organites induites par les différents stimuli et peut-être intéressant, même si pas le reflet de la localisation pure gouttelettes de lipides.
Nous avons utilisé ce protocole pour une vaste protéome de gouttelettes de lipides quantitativel' analyse des e-infectés du VHC, par rapport aux cellules témoins non infectées pour révéler les perturbations causées par l' infection par le VHC et d'identifier les régulateurs de la réplication du VHC 21. Dans la lignée cellulaire d'hépatome Huh7.5, nous avons régulièrement identifié jusqu'à 2.900 protéines dans les fractions de gouttelettes de lipides, avec ~ 300 protéines identifiées avec plusieurs peptides dans chaque expérience. Suite à l'infection par le VHC, nous avons observé le recrutement à la fois et l'épuisement des protéines hôtes. Plusieurs protéines identifiées comme hautement enrichi à des gouttelettes lipidiques des cellules infectées par le VHC ont été publiés en tant que facteurs d'accueil du VHC (par exemple, les protéines de la boîte DEAD 1 et 3 (DDX1, DDX3) ou analogue à l' insuline de protéine ARNm de liaison du facteur II de croissance 1 ( IGF2BP1)), indiquant la fiabilité de la méthode de SILAC 27, 28, 29. En outre, les protéines sont souvent recrutés annotées pour des protéines de liaison ARN, mettant en évidence l'association étroite de la replique de l'ARN viralcomplexes ation avec des fractions de gouttelettes de lipides. En revanche, les protéines appauvri de gouttelettes lipidiques ont été annotées principalement pour les processus métaboliques lipidiques, ce qui indique que le VHC perturbe la composition de protéines pour déconnecter les gouttelettes de lipides à partir de leur régulation métabolique et la fonction normales.
Le protocole, nous décrivons est amendable à différentes lignées cellulaires et des conditions de culture et pourrait aider à déchiffrer la fonction des gouttelettes lipidiques dans le cycle de vie des différents agents pathogènes qui dépendent de gouttelettes lipidiques pour la réplication.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions R. Bartenschlager (Université de Heidelberg) pour les constructions jc1, CM Riz (Université Rockefeller) pour les cellules Huh7.5, J. McLauchlan (Conseil de recherches médicales Virologie) pour la construction JFH1, T. Wakita (Institut national de la Maladies infectieuses, Japon) pour le JFH1, et B. Webster et WC Greene (Gladstone Institute of Virology and Immunology) pour les constructions rapporteurs HCVcc. Ce travail a été financé par des fonds de la DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 et INST 337 / 16-1 2013 (SH)). L'Institut Heinrich Pette, Institut Leibniz pour Experimental Virology est pris en charge par la Ville libre et hanséatique de Hambourg et le ministère fédéral de la santé. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
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