Summary
Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.
Abstract
Vetdruppels zijn essentieel voor de replicatie van een aantal verschillende pathogenen, het meest opvallend de Hepatitis C Virus (HCV), de vermoedelijke plaats van virion morfogenese. Kwantitatieve proteoomanalyse lipide druppeltje kan worden gebruikt om eiwitten die gelokaliseerd worden of worden verplaatst vanuit vetdruppels onder omstandigheden zoals virusinfecties identificeren. Hier beschrijven we een protocol dat met succes is gebruikt om de veranderingen in de lipide druppel proteoom na infectie met HCV te karakteriseren. Wij gebruiken Stabiele isotopen met aminozuren in Cell Culture (SILAC) en daarmee labelen totale proteoom van een populatie van cellen met "zware" aminozuren om de eiwitten te kwantificeren door massaspectrometrie. Op lipide druppel isolatie worden de twee celpopulaties (dat wil zeggen met HCV geïnfecteerde / "light" aminozuren en niet-geïnfecteerde controle / "zware" aminozuren) gemengd 1: 1 en mechanisch gelyseerd in hypotonische buffer. Na verwijdering van de kernen en cellen debris door lage snelheid centrifugatie worden lipide-druppeltjes geassocieerde eiwitten verrijkt met twee opeenvolgende stappen ultracentrifugatie gevolgd door drie wasstappen in isotone buffer. De zuiverheid van het lipide druppel fracties geanalyseerd met Western blotting met antilichamen die verschillende subcellulaire compartimenten. Lipide-druppeltjes geassocieerde eiwitten worden vervolgens gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door Coomassie kleuring. Na tryptische digestie worden de peptiden gekwantificeerd door vloeistofchromatografie-electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS). Met deze methode, we geïdentificeerde eiwitten gerekruteerd lipidedruppeltjes bij HCV-infectie die pro- of antivirale gastheerfactoren kunnen vertegenwoordigen. De werkwijze kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende cellen en kweekomstandigheden, zoals infectie met pathogenen, stress of behandeling met geneesmiddelen.
Introduction
Vetdruppels die aan snelle veranderingen cytoplasmatische (nucleus) celorganellen bestaande uit een kern van neutrale lipiden (triglycerides (TG) en cholesterol ester (CE)) omsloten door een monolaag van fosfolipiden met ingebedde eiwitten 1. Alle soorten cellen produceren vetdruppels, maar ze variëren in grootte, lipidesamenstelling, en eiwitten decoratie. Vetdruppels vervullen verschillende functies, waaronder het dienen als energie en membraan precursor reservoirs of eiwitafzettingen. Bovendien, door de opname van lipiden, zij beschermen cellen tegen lipotoxicity, afgifte lipiden zoals signaalmoleculen en zijn betrokken bij eiwitafbraak en endoplasmatisch reticulum (ER) stressrespons 2. Als zodanig kan een groot aantal proteïnen binden aan vetdruppels en bepalen hun generatie, afbraak, handel en interactie met andere organellen. Onder hen zijn de perilipin familie van bona fide lipide druppel bindende eiwitten (PLIN1-5)f "> 3.
Lipide druppeltje biogenese waarschijnlijk vanaf het ER, waarin ER-resident enzymen katalyseren de bereiding van neutrale lipiden die zich ophopen in het membraan bilaag, waardoor een lens van neutrale lipiden, een werkwijze die onlangs mooi werd zichtbaar in gist 4. Membraan buigen en verhoogde fosfatidinezuur en diacylglycerol niveaus worden vervolgens gedacht dat eiwitten die bij fosfolipide biosynthese aantrekken de gelijktijdige synthese van de kern neutrale lipiden en fosfolipiden afscherming nodig is voor lipide droplet generation 5. Enzymen huisvesten transmembraandomeinen die de ER bevinden dit proces katalyseren. Uitbreiding naar grote vetdruppels vereist de activiteit van een andere klasse van lipide-synthetiserende enzymen die een amfipathische helix haven en dus reizen van het ER naar vetdruppels. De mobilisatie van lipiden uit vetdruppels gebeurt via de lokale activatie van het triglyceridee en diacylglycerollipasen adipose triglyceride lipase (ATGL) en hormoongevoelige lipase (HSL) of door verschillende autofagocytische routes, zoals macro- en microlipophagy of chaperonne-gemedieerde autofagie 6. Lipidedruppeltjes interactie met andere cellulaire organellen, zoals mitochondriën (voor beta-oxidatie en lipidesynthese) en ER (voor lipidesynthese en eiwittransport), maar ook met lysosomen, endosomen en vacuolen geïnduceerd door intracellulaire bacteriën 7. Inderdaad bacteriën, virussen, en zelfs parasieten richten vetdruppels voor replicatie en persistentie, waaronder HCV 8.
HCV-infectie is een van de belangrijkste oorzaken van lever-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit wereldwijd, goed voor ongeveer 0,5 miljoen doden per jaar 9. Het werkelijke aantal HCV-infecties is onbekend, maar recente schattingen suggereren dat 130-150.000.000 mensen chronisch geïnfecteerd. geen vaccine bestaat, maar de onlangs goedgekeurde direct-werkende antivirale middelen drastisch verhogen van de therapeutische respons vergeleken met de standaard-interferon gebaseerde therapie. Echter, de hele wereld, de behandeling van patiënten zullen waarschijnlijk worden beperkt als gevolg van de extreem hoge kosten van de nieuwe therapieën. Ongeveer de helft van alle personen die chronisch geïnfecteerd zijn met HCV te ontwikkelen leververvetting (steatose), een aandoening gekenmerkt door de buitensporige accumulatie van vetdruppels in levercellen. Intrigerend vetdruppels voren tevens als vitale cellulaire organellen voor HCV-replicatie, vermoedelijk dienende virale assemblagesites 10, 11.
In HCV-geïnfecteerde cellen, het virale eiwit en NS5A kern lokaliseren lipide druppeltjes in een proces dat afhangt triglyceridebiosynthese, als remmers van diacylglycerol acyltransferase-1 (DGAT1) aantasting handel lipide druppeltjes en daaropvolgende HCV deeltjesproducie 12 >, 13, 14, 15. Bovendien mutaties in het lipide-droplet bindende domeinen van zowel kern- of NS5A onderdrukken HCV samenstel 16, 17. Kern en NS5A rekruteren dan alle andere virale eiwitten, alsook virale RNA-replicatie complexen membranen nauw verbonden met vetdruppels 16. Een samenspel van alle virale eiwitten is vereist voor de succesvolle productie van infectueuze virale nakomelingen 10, 11. De structurele proteïnen zijn deel van de virions, en de niet-structurele eiwitten bevorderen eiwit-eiwitinteracties vereist voor dit proces. Intrigerend is de bona fide lipide-droplet bindingseiwit PLIN3 / TIP47 vereist zowel HCV-RNA-replicatie en afgifte van virions 18, 19
Hier beschrijven we een werkwijze voor vetdruppels te isoleren voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten. Met deze methode, hebben we diepgaande veranderingen in het lipide druppel proteoom tijdens HCV infectie en geïdentificeerd annexine A3 als gastheer eiwit dat co-fractioneert met vetdruppels en is vereist voor efficiënte HCV rijping 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van media betreffende stabiele isotopen Labeling met aminozuren in Cell Culture (SILAC)
OPMERKING: Hier, de SILAC Protein Kwantificeringskit - DMEM aangevuld met 50 mg 13C 6 L-Arginine-HCl werd gebruikt voor SILAC labeling. De gedialyseerd foetaal kalfsserum (FCS) is voorzien van de SILAC eiwitkwantificering Kit.
- Verwijder 50 ml uit elke fles DMEM medium en voeg 50 ml gedialyseerd FCS.
- Los 50 mg 13C 6 L-lysine-2HCl en 50 mg 13C 6 L-arginine-HCl in 1 ml medium. Meng goed en voeg de aminozuren aan de DMEM + FCS medium.
- Voeg 1x Pen / Strep en 1 x L-glutamine vervanger. Steriel filter het medium via een 0,45 urn filter. Label de fles als "zwaar" SILAC medium.
- De "lichte" medium bereiden Herhaal stap 1,1-1,3 onder toepassing van 50 mg L-arginine-HCl en 50 mg L-lysine-2HCl. Label de fles als "light" SILAC medium.
2. SILAC-labeling en aminozuur Incorporation Controle
- Trypsinize cellen (1 x trypsine-EDTA) en split 1 x 10 5 cellen Huh7.5 in 2 putjes van een 6-well kweekplaat met 2 ml medium, een putje met de "zware" SILAC medium en een met de "light" SILAC medium.
- Kweken van de cellen gedurende tenminste 6 doorgangen (split ratio: 1: 6); na 6 passages, moet de opname van de "zware" aminozuren meer dan 95% bedragen.
- Harvest 1 x 10 6 cellen van de "zware" - en "light" gelabelde celpopulatie op de integratie werkzaamheid te analyseren. Was de cellen in 1 x PBS en pelleteren van de cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 160 xg en 4 ° C.
- Resuspendeer de celpellets in 150 gl MS-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4 en 1 mM EDTA aangevuld met 1x proteaseremmer cocktail) en incubeer de cellen op ijs gedurende 30 minuten. Lyse de cells door sonificatie bij 4 ° C.
LET OP: De volgende zijn de geluidsgolven hier gebruikt: timer, te houden; vermogensregeling, 8; duty cycle, 80%; en 2 x 30 pulsen. - Verwijder de celresten door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 11.000 xg en 4 ° C. Breng de supernatant over naar een nieuwe buis en bepaal de eiwitconcentratie met een detergens-compatibele eiwitbepaling.
- Meng 75 ug eiwit met 6x monsterbuffer (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% glycerol, 123 mg / ml SDS, 600 gg / ml broomfenolblauw en 60 pl / ml β-mercaptoethanol), kookt bij 95 ° C gedurende 5 min, en scheiden de eiwitten door SDS-PAGE SDS-loopbuffer (3,02 g / l Tris-base, 18,8 g / l glycine en 1 g / l SDS) bij 180 V gedurende ongeveer 1 uur of volgens de fabrikant 'instructies.
- Breng de gel in colloïdale Coomassie kleuroplossing. Snijden dezelfde eiwitband van elke laan. Verteren van de eiwitten met trypsine en analyseren van de opname werkzaamheid van MS analysis, zoals beschreven 22.
3. Lipide Druppeltje Isolatie van SILAC gelabelde cellen Huh7.5
- Infect een populatie van cellen (dwz gelabeld met "lichte" aminozuren) met een HCV reportervirus door incubatie met virus voorraden (bijv Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) gedurende 4 uur bij 37 ° C, zoals beschreven 21 .
OPMERKING: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD is een HCV-virus met een fluorescentie reporter (monomeer Kusabira Orange 2, mKO2) aan besmettingstarieven gevolgd door een blasticidineresistentiegen (BSD) tussen een gedupliceerde NS5A-NS5B-splitsingsplaats monitoren eerder beschreven 21 23. Werken met HCV vereist BSL2 + (USA) of S3 ** (Duitsland) bioveiligheid niveau containment en praktijken. In plaats van infectie met HCV kunnen cellen worden geïnfecteerd met verschillende pathogenen. - Openen HCV-geïnfecteerde "light" cellen en niet-geïnfecteerd & #34;. Zware" cellen Tijdens de passage van de kweken, stelt een monster met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en bepaal het HCV infecties door flow cytometrie van de fluorescente merker eiwit (bijvoorbeeld mKO2), zoals beschreven 21, de . Als u de Jc1 NS5AB-mKO2-BSD HCV-stam, voeg 10 ug / ml blasticidine S aan "lichte" middel om te selecteren op HCV-positieve cellen: infecties hoger zijn dan 90% op lipide druppeltje isolatie NOTE.
- 1 d vóór lipide druppel isolatie, was de cellen met PBS, trypsinize, resuspendeer in "lichte" en "zware" medium, en tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Zaad 7 x 10 6 cellen van elke populatie in een 150 cm2 celkweekschaal. Maak minstens 5 gerechten per "light" en "zware" celpopulatie. De cellen te kweken in 30 ml medium / schaal O / N.
- Verwijder het medium en was de cellen in 1 x PBS. Maak de cellen in 1xPBS met behulp van een cel schraper.
- Aantal beide celpopulaties met een Neubauer telkamer en gelijke celaantallen bundelen in een 50 ml centrifugebuis. Pellet de cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 160 xg en 4 ° C.
- Verwijder de PBS en resuspendeer de celpellet in 1 ml sucrose buffer (0,25 M sucrose, 1 mM EDTA en 1 mM DTT, aangevuld met protease inhibitor cocktail). Breng de celsuspensie nauwsluitend Dounce homogenisator en lyseren van de cellen met 200 slagen op ijs.
LET OP: Bevestig volledige cellysis met behulp van trypan blauw kleuring. - Breng het lysaat in een 1,5 ml microfugebuis en spin neer de kernen en celresten gedurende 10 minuten bij 1000 xg en 4 ° C.
- Na centrifugeren, slaan een portie van 25 pl van de post-nucleaire fractie (PNS) bij -20 ° C als invoerbesturingselement.
- Plaats de rest van de PNS fractie onderaan centrifugebuis (11 x 60 mm) en overlay met lipide druppel wasbuffer (~ 3 ml, 4 ml total) (50 mM kaliumfosfaatbuffer pH 7,4, 100 mM kaliumchloride, 1 mM EDTA en 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride).
- Centrifugeer gedurende 2 uur bij 100.000 xg en 4 ° C. Oogst de drijvende lipide druppel fractie via een gebogen, stompe injectienaald vanaf de bovenkant van de buis (ongeveer 250-500 pl, afhankelijk van de hoeveelheid vetdruppels). Plaats de lipide druppel fractie in een centrifugebuis (11 x 60 mm), bekleding met lipide druppel wasbuffer (~ 3,5 ml, 4 ml totaal) en herhaal de centrifugatiestap.
- Oogst de drijvende lipide druppel fractie via een gebogen, stompe injectienaald van de top van de buis en breng de vetdruppels een nieuwe 1,5 ml microfugebuis. Voeg 500 ul van lipide druppel wasbuffer en centrifugeren gedurende 20 min bij 21.000 xg en 4 ° C.
OPMERKING: Lipide druppeltjes verschijnen als een witte band drijvend op de top van de buffer. - Verwijder het onderliggende wasbuffer onder toepassing van een gel-lading pipetpunt en herhaal deze wasstap driemaal.
- Na de uiteindelijke verwijdering van de wasbuffer met behulp van een gel-lading pipetpunt, meng 5 pl lipide druppel fracties met 10 pl NP-40 lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl en 1% NP-40 , aangevuld met protease inhibitor cocktail). Incubeer het monster op ijs gedurende 1 uur om het virus te inactiveren als het werken met infectieus materiaal. Bepaal het eiwitniveau met een detergens-compatibele eiwitbepaling; ten minste 35 ug eiwit is nodig voor MS-analyse.
- Bewaar het lipide druppel fracties bij -20 ° C.
- Meng het overeenkomstige volume van de druppel lipide fractie met 4x ladingskleurstof. Incubeer op ijs gedurende 1 uur om het virus te inactiveren als het werken met infectieus materiaal. Koken bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Scheid de eiwitten met behulp van SDS-PAGE volgens het protocol van de fabrikant. Breng de gel in colloïdale Coomassie kleuroplossing. Snijden alle eiwitbanden van de gel. Na tryptische digestie in de gel 24 </ Sup>, verdampen de monsters en ontbinden in 0,1% mierenzuur. Analyse door LC-MS / MS.
OPMERKING: Hier analyses LC-MS / MS werd uitgevoerd op een Quadrupole Time-of-Flight massaspectrometer (Q-TOF) of een lineaire Trap Quadrupole (LTQ) orbitrap massaspectrometer. Beide instrumenten werden gekoppeld met een ESI-bron naar een nano-UPLC systeem. Data analyseert en LC-MS / MS analyses van de Q-TOF en het orbitrap massaspectrometer werd uitgevoerd zoals beschreven 21, 22. Let goed op het monster met menselijke keratine niet te besmetten. Gebruik altijd keratine-vrije pipetpunten en buizen. Bereid buffers onder de laminaire stroming kap met keratine-vrij chemicaliën. Vóór gebruik Reinig alle oppervlakken en apparatuur met gedestilleerd water en ethanol. Draag altijd handschoenen en een laboratoriumjas.
4. Analyse van Lipide Droplet Zuiverheid
- Verdunde monsters van lipide druppel fracties 1: 2 en inputfracties (zie stap 3.9) 01:10 met NP-40 lysis buffer. Incubeer de monsters op ijs gedurende 1 uur om het virus te inactiveren als het werken met infectieus materiaal. Bepaal het eiwitniveau met een detergens-compatibele eiwitbepaling.
- Meng gelijke hoeveelheden eiwit met 6x-monsterbuffer en incubeer de monsters op ijs gedurende 1 uur om het virus te inactiveren als het werken met infectieus materiaal. Doorgaan met SDS-PAGE en overdracht van de eiwitten op een nitrocellulose membraan door blotting tank bij 80 V gedurende 90 minuten.
OPMERKING: Na blokkeren van het membraan in blokkerende buffer (5% niet-vette droge melkpoeder in TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl en 0,05% Tween 20)), geïncubeerd met antilichamen tegen lipide druppeltjes merkers (bv , PLIN1, PLIN2 of PLIN3) en merkers van andere subcellulaire compartimenten (bijvoorbeeld CALr, MnSOD of tubuline), gevolgd door secundair HRP-gekoppelde antilichamen. Met chemiluminescentie voor de detectie van proteïnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vetdruppels zijn van levensbelang voor HCV-infectie als de vermeende plaatsen van virion assemblage, maar de moleculaire mechanismen van morfogenese en uittreden van virusdeeltjes zijn grotendeels onbekend. Op nieuwe gastheer afhankelijkheid factoren betrokken bij dit proces te identificeren, voerden we kwantitatieve lipide druppel proteoom analyse van HCV-geïnfecteerde cellen 21 (Figuur 1A). We hebben een protocol voor het zuiveren vetdruppels en routinematig gedetecteerd sterke verrijking van de lipide-druppeltjes eiwitten PLIN2 / ADRP en PLIN3 / TIP47 en uitputting van merkers van andere cellulaire compartimenten, zoals β-tubuline tot microtubuli, MnSOD voor mitochondria, of calreticuline / calnexine voor de ER (Figuur 1B, C). We stelden een lijst van eiwitten die betrouwbaar cofractionate met lipidedruppels in Huh7.5 cellen (figuur 1D) en met behulp van isotopen, die eiwitten die specifiek worden gerekruteerdof verplaatst van vetdruppels in HCV-geïnfecteerde cellen (Figuur 1E). Onze resultaten geven aan dat HCV verbreekt vetdruppels van hun reguliere metabolische functie en / of regelgeving en identificeren van vermeende gastheer afhankelijkheid en beperking van factoren.
Figuur 1: (A) Schema van het experiment. Naïve Huh7.5 cellen werden gelabeld met "zware" aminozuren of "light" aminozuren. Cellen die "light" aminozuren werden geïnfecteerd met een HCV reportervirus (Jc1 NS5AB-mKO2-BSD). "Lichte" en "zware" aminozuur gemerkte populaties werden gemengd en vetdruppels werden geïsoleerd door twee opeenvolgende ultracentrifugatie en drie wasstappen, gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd met LC-ESI-MS / MS. Let op de drijvende witte lipide druppel fractie (rode pijl) na ultracentrifugati op en wassen in microcentrifugebuizen. (B) Western blot analyse van post-kern en lipide druppel fracties toont een verrijking van lipide druppel markereiwitten lipide druppel fracties en uitputting van merkers van andere cellulaire compartimenten. (C) Coomassie blauw en zilverkleuring post-nucleaire supernatant (PNS) en lipide druppel fracties door SDS-PAGE. Silver kleuring is louter ter visualisatie. (D) Temperatuurkaart het aantal peptiden en eiwitgehalte dekking van geïdentificeerde eiwitten in lipide druppel fracties van Huh7.5 cellen (cutoff: ≥5 peptiden en ≥20% dekking). (E) Temperatuurkaart beeltenis verrijkt of verarmd lipide-droplet geassocieerde eiwitten na infectie met HCV (genormaliseerd naar het gemiddelde, 1,5-voudig cutoff, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0.001). Gemodificeerd van 21.et = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een protocol lipidedruppeltjes isoleren kwantitatieve lipide druppel proteoom analyse om de verrijking en verarming van eiwitten geassocieerd met vetdruppels onder diverse kweekomstandigheden, zoals virale infecties te vergelijken. Als alternatieve werkwijze kan het proteoom analyse uitgevoerd met labelvrije kwantificering basis van totale piekintensiteiten. Deze methode heeft geen beperking dynamisch bereik en voorkomt stofwisselingsproblemen. Het voordeel van de SILAC benadering is dat de monsters samengevoegd voorafgaande lipide druppel isolatie, en dus de resultaten onafhankelijk zijn van fouten in monsterbereiding, verteren, en LC-MS / MS analyse. We raden deze aanpak voor de kwantitatieve lipide druppel proteoomanalyse.
De verrijking en verarming van lipide-droplet geassocieerde eiwitten waargenomen in de MS analyse zou een inductie of onderdrukking van eiwitexpressie, het analyseren van expressieniveaus van quantitativ weerspiegelene RT-PCR en (bij voorkeur) Western blotting geadviseerd. Bovendien kunnen twee werkwijzen worden gebruikt voor de verrijking en verarming van specifieke eiwitten in lipidedruppels controleren: lipide-druppeltjes isolatie gevolgd door western blot en immunofluorescentie-analyse met lipofiele kleurstoffen, zoals BODIPY of LD540, dat vlekken vetdruppels beschreven 21.
Experimenten uitvoeren met verwisseld etiketteringsvoorwaarden opdat de merken met "zware" aminozuren heeft geen invloed eiwitexpressie of lipide druppel lokalisatie en eiwitcontaminanten te identificeren van de "lichte" medium en omgevingsbronnen. Voor proteïne-identificatie, moet het onderzoek worden uitgevoerd met een valse ontdekking rate (FDR) van 0,01 op zowel het peptide en eiwitniveau. Om ervoor te zorgen hoge betrouwbaarheid resultaten, adviseren we uitvoeren van ten minste 3 - 4 onafhankelijke experimenten met cellen van verschillende passages en verschillende virus voorraad preparaten. Afhankelijk van de magnitude van verandering, wellicht meer onafhankelijke experimenten nodig zijn.
Voor het normaliseren van de kwantitatieve MS-gegevens voor het corrigeren van enigszins verschillende aantallen cellen of vetdruppels, centreren detectie verhoudingen van de "lichte" via "zware" peptiden, of omgekeerd, verwisseld labelingscondities door deling door de mediaan van alle geïdentificeerde proteïnen zoals beschreven 25. Indien de hoeveelheid vetdruppels sterk verschilt tussen de monsters, genormaliseerd lipide druppel markereiwitten, zoals PLIN2, zou wenselijk zijn. Toen we onze MS-gegevens normaliseren PLIN2 niveaus, vergelijkbare resultaten als toen we normaliseren naar de mediaan vinden we (analyse niet getoond). Van de nota, onder de celcultuur voorwaarden die wij gebruiken, hebben we niet detecteren significante lipide druppel accumulatie na HCV-infectie.
Lipidedruppeltjes staan in nauw contact met andere cellulaire organellen, met name mitochondria en het ER. Daarom eiwitten from deze compartimenten kunnen samenwerken fractioneren met vetdruppels in isolement. Indien een dergelijke "verontreiniging" eiwit is ongewijzigd in overvloed in reactie op infectie of behandeling, zal het geen invloed op de vergelijkende lipide druppel proteoomanalyse. Het moet echter worden opgemerkt, dat onder bepaalde omstandigheden, het contact tussen vetdruppels en andere organellen zouden kunnen worden gewijzigd. Bijvoorbeeld onder omstandigheden lipolytische, mitochondriale eiwitten worden gedetecteerd bij hogere frequenties in lipide druppel fracties van lipolytically gestimuleerde 3T3-L1 adipocyten opzichte basisomstandigheden 26. Gestimuleerd de novo lipogenese, aan de andere kant, zou kunnen leiden tot een betere samenwerking met de ER. Deze veranderingen weerspiegelen dan veranderingen in organel interactie veroorzaakt door de verschillende stimuli en interessant zou kunnen zijn, zelfs als ze niet een afspiegeling is van zuiver lipide druppel lokalisatie.
We gebruikten dit protocol voor een uitgebreide kwantitatieve lipide druppel proteome analyse van HCV-geïnfecteerde versus geïnfecteerde controlecellen de verstoringen veroorzaakt door HCV-infectie te openbaren en regulatoren identificeren van HCV-replicatie 21. In de hepatomacellijn Huh7.5, we routinematig geïdentificeerd tot 2.900 eiwitten in lipide druppel fracties met -300 geïdentificeerde eiwitten met meerdere peptiden in elk experiment. Na infectie met HCV, zagen we het zowel werving en uitputting van gastheer eiwitten. Verscheidene eiwitten geïdentificeerd als sterk verrijkt vetdruppels van HCV-geïnfecteerde cellen zijn eerder gepubliceerd als HCV gastheerfactoren (bijvoorbeeld DEAD box proteïnen 1 en 3 (DDX1, DDX3) of insuline-achtige groeifactor-II mRNA-bindend eiwit 1 ( IGF2BP1)) waarin de betrouwbaarheid van de SILAC benadering 27, 28, 29. Bovendien worden gerekruteerd eiwitten vaak geannoteerde voor RNA-bindende eiwitten, aandacht voor de nauwe associatie van het virale RNA replication complexen met lipiden druppel fracties. Daarentegen werden eiwitten ontdaan van vetdruppels hoofdzakelijk geannoteerd op lipide metabolisme, wat aangeeft dat HCV verstoort de eiwitsamenstelling de vetdruppels los van hun normale metabolische regulering en functie.
De techniek die we beschrijven wijzigbaar verschillende cellijnen en kweekomstandigheden kunnen helpen bij het ontcijferen van de functie van vetdruppels in de levenscyclus van verschillende pathogenen die afhankelijk vetdruppels voor replicatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken R. Bartenschlager (Universiteit van Heidelberg) voor de Jc1 constructies, CM Rice (Rockefeller University) voor de Huh7.5 cellen, J. McLauchlan (Medical Research Council Virologie Unit) voor de JFH1 bouwen, T. Wakita (National Institute of infectieziekten, Japan) voor JFH1 en B. Webster en WC Greene (Gladstone Instituut voor Virologie en Immunologie) voor HCVcc reporter constructen. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 en INST 337 / 16-1 2.013 (HS)). De Heinrich Pette Institute, Leibniz Instituut voor Experimentele Virologie wordt ondersteund door de Vrije Hanzestad Hamburg en het ministerie van Volksgezondheid. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
