Summary
Lipiddroppar är viktiga organeller för replikation av flera patogener, däribland hepatit C-virus (HCV). Vi beskriver ett förfarande för att isolera lipiddroppar för kvantitativ masspektrometri av associerade proteiner; den kan användas under en mängd olika tillstånd, såsom virusinfektion, miljöstress, eller läkemedelsbehandling.
Abstract
Lipiddroppar är avgörande för replikation av en mängd olika patogener, framförallt den hepatit C-virus (HCV), som det förmodade stället hos virion morfogenes. Kvantitativ lipiddroppe proteomanalys kan användas för att identifiera proteiner som lokaliserar till eller är förskjutna från lipiddroppar under betingelser såsom virusinfektioner. Här beskriver vi ett protokoll som har använts med framgång för att karakterisera förändringar i lipiddroppe proteomet efter infektion med HCV. Vi använder stabila isotopen Märkning med Aminosyror i Cell Culture (SILAC) och därmed märka den kompletta proteomet av en population av celler med "tunga" aminosyror för att kvantifiera proteiner genom masspektrometri. För lipiddroppe isolering, är de två cellpopulationer (dvs. HCV-infekterade / "lätta" aminosyror och oinfekterade kontroll / "tunga" aminosyror) blandades 1: 1 och lyserades mekaniskt i hypoton buffert. Efter avlägsnande av kärnor och cell debris genom låghastighetscentrifugering, är lipid droppassocierade proteiner anrikas genom två efterföljande ultracentrifugeringssteg följt av tre tvättningssteg i isoton buffert. Renheten hos de lipid-dropp fraktionerna analyseras genom Western blotting med antikroppar som känner igen olika subcellulära utrymmen. Lipid droppassocierade proteiner separeras sedan genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) följt av Coomassie-färgning. Efter tryptisk digere peptiderna kvantifierades med vätskekromatografi-elektrosprayjonisering-tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS). Med denna metod, identifierade vi proteiner som rekryteras till lipiddropparna vid HCV-infektion som kan tyda pro- eller antivirala värdfaktorer. Vår metod kan tillämpas på en mängd olika celler och odlingsbetingelser, såsom infektion med patogener, miljöstress, eller läkemedelsbehandling.
Introduction
Lipiddroppar är högdynamiska cytoplasmatiska (och nukleära) cellorganeller som består av en kärna av neutrala lipider (triglycerider (TG) och kolesterolester (CE)) inneslutet av ett monoskikt av fosfolipider med inbäddade proteiner 1. Alla celltyper producerar lipiddroppar, men de varierar i storlek, lipidkomposition och protein dekoration. Lipiddroppar uppfylla olika funktioner, inklusive tjänar som energi- och membranbildande reservoarer eller som proteinavlagringar. Dessutom, genom upptaget av lipider, skydda de celler från lipotoxicitet, släpp lipider som signalmolekyler, och är inblandade i proteinnedbrytning och endoplasmatiska nätverket (ER) stressresponser 2. Som sådan, en mängd proteiner binder till lipiddroppar och styra deras generation, nedbrytning, trafficking, och interaktion med andra organeller. Bland dem är den perilipin familjen av bona fide lipiddroppe bindande proteiner (PLIN1-5)f "> 3.
Lipiddroppe biogenes sannolikt börjar vid ER, där ER-resident enzymer katalyserar syntesen av neutrala lipider som ackumuleras inuti membrandubbelskikt, som bildar en lins av neutrala lipider, en process som nyligen visualiserades snyggt i jäst 4. Membran böjning och förhöjda fosfatidinsyra och diacylglycerol nivåer sedan tänkt att locka proteiner involverade i fosfolipid-biosyntesen, såsom den samtidiga syntesen av de centrala neutrala lipider och avskärmnings fosfolipider krävs för lipiddroppe generation 5. Enzymer som härbärgerar transmembrandomäner som bor vid ER katalyserar denna process. Expansionen till stora lipiddroppar kräver aktiviteten av en annan klass av lipid-syntetiserande enzymer som härbärgerar en amfipatisk helix och kan sålunda reser från ER till lipiddroppar. Mobiliseringen av lipider från lipiddroppar sker genom den lokala aktiveringen av triglyceride och diacylglycerol lipaser adipös triglyceridlipas (ATGL) och hormonkänsligt lipas (HSL) eller genom olika autophagic reaktionsvägar, såsom makro- och microlipophagy eller kaperonet medierad autophagy 6. Lipiddroppar interagera med andra cellulära organeller, såsom mitokondrier (för beta-oxidation och lipidsyntes) och ER (för lipidsyntes och protein trafficking), men också med lysosomer, endosomer och de vakuoler som induceras av intracellulära bakterier 7. I själva verket bakterier, virus och även parasiter rikta lipiddropparna för replikering och uthållighet, bland dem HCV 8.
HCV-infektion är en av de viktigaste orsakerna till leverrelaterad sjuklighet och dödlighet i världen, står för ungefär 0,5 miljoner dödsfall per år 9. Det verkliga antalet HCV-infektioner är okänd, men de senaste uppskattningar tyder på att 130 - 150 miljoner människor är kroniskt infekterade. Ingen vaccine finns, men den nyligen godkända direktverkande antivirala läkemedel ökar terapeutiska svar dramatiskt jämfört med standardinterferonbaserad behandling. Men över hela världen, för behandling av patienter kommer sannolikt att begränsas på grund av de extremt höga kostnaderna för nya läkemedel. Ungefär hälften av alla personer kroniskt infekterade med HCV utvecklar fettlever (leversteatos), ett tillstånd som kännetecknas av överdriven ansamling av lipiddroppar i hepatocyter. Intriguingly, lipiddroppar framkom också som vitala cellulära organeller för HCV-replikation, förmodat tjänstgör som virala monteringsställen 10, 11.
I HCV-infekterade celler, det virala proteinkärnan och NS5A lokalisera till lipiddroppar i en process som är beroende av triglycerid biosyntes, som inhibitorer av diacylglycerol-acyltransferas-1 (DGAT1) försämra trafficking till lipiddroppar och efterföljande HCV partikelproduktion 12 >, 13, 14, 15. Dessutom mutationer i lipid droppbindande domäner av antingen kärnan eller NS5A trycka HCV aggregatet 16, 17. Kärnan och NS5A sedan rekrytera alla andra virala proteiner, såväl som virala RNA-replikationskomplex, till membran närstående lipiddroppar 16. Krävs En samordnad verkan av alla virala proteiner för framgångsrik produktion av infektiös viral avkomma 10, 11. De strukturella proteinerna är en del av virionerna, och de icke-strukturella proteinerna främja protein-proteininteraktioner som krävs för denna process. Intriguingly är bona fide lipiddroppe-bindande protein PLIN3 / TIP47 krävs för både HCV RNA-replikation och frisättning av virioner 18, 19
Här beskriver vi en metod för att isolera lipiddroppar för kvantitativ masspektrometri av associerade proteiner. Användning av denna metod fann vi djupgående förändringar i lipiddroppe proteomet under HCV-infektion och identifierad annexin A3 som ett värdprotein som co-fraktionerar med lipiddroppar och krävs för effektiv HCV mognad 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Media for Stable Isotope Märkning med Aminosyror i Cell Culture (SILAC)
OBS: Här, den SILAC Protein Kvantifiering Kit - DMEM kompletterat med 50 mg av 13 C 6 L-arginin-HCl användes för SILAC märkning. Den dialyserade fetalt kalvserum (FCS) är försedd med den SILAC Protein Kvantifiering Kit.
- Avlägsna 50 ml från varje flaska DMEM-medium och tillsätt 50 ml av dialyserad FCS.
- Lös upp 50 mg av 13 C 6 L-lysin-2HCl och 50 mg av 13 C 6 L-arginin-HCl i 1 ml medium. Blanda väl och tillsätt aminosyrorna till DMEM + FCS-medium.
- Lägg 1x Pen / Strep och 1x L-glutamin substitut. Sterilfilter mediet med användning av ett 0,45 pm filter. Märk flaskan som "tunga" SILAC medium.
- För att framställa den "lätt" medium, upprepa steg 1,1-1,3 med användning av 50 mg L-arginin-HCl och 50 mg L-lysin-2HCl. Märk flaskan som "ljus" SILAC medium.
2. SILAC-märkning och Amino Acid Incorporation Kontroll
- Trypsinize celler (1x Trypsin-EDTA) och split 1 x 10 5 Huh7.5 celler i 2 brunnar i en 6-brunnars odlingsplatta innehållande 2 ml medium, en brunn med "tunga" SILAC medium och en med den "lätt" SILAC medium.
- Odla cellerna under minst 6 passager (delningsförhållande: 1: 6); efter 6 passager, bör inkorporeringen av de "tunga" aminosyror vara mer än 95%.
- Skörd 1 x 10 6 celler av den "tunga" - och "ljus" -märkt cellpopulation för att analysera införlivandet effekt. Tvätta cellerna i 1x PBS och pelletera cellerna genom centrifugering under 5 min vid 160 xg och 4 ° C.
- Resuspendera cellpelletar i 150 mikroliter av MS-buffert (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, och 1 mM EDTA kompletterat med 1x proteasinhibitorcocktail) och inkubera cellerna på is under 30 min. Lysera calnar genom sonikering vid 4 ° C.
OBS: Följande är sonication inställningar som används här: timer, håll; utgångsregler, 8; arbetscykel, 80%; och 2 x 30 pulser. - Avlägsna celldebris genom centrifugering under 10 min vid 11 tusen xg och 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt rör och bestämma proteinkoncentrationen med en detergent-kompatibel proteinanalys.
- Blanda 75 | j, g protein med 6x provbuffert (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% glycerol, 123 mg / ml SDS, 600 | ig / ml bromfenolblått, och 60 ul / ml β-merkaptoetanol), kokar vid 95 ° C i 5 minuter, och separera proteiner genom SDS-PAGE i SDS löpande buffert (3,02 g / L Tris-bas, 18,8 g / i glycin och 1 g / L SDS) vid 180 V under ca 1 h eller enligt tillverkarna instruktioner.
- Överför gelén i kolloidal Coomassie-färgning lösning. Skära ut samma proteinband från varje bana. Digerera proteinerna med trypsin och analysera införlivandet effekt medelst MS analysis, såsom beskrivits 22.
3. Lipid Droplet Isolering av SILAC märkt Huh7.5 Celler
- Infektera en population av celler (dvs. de som märkts med "lätta" aminosyror) med en HCV-rapportvirus genom att inkubera med virusförråd (t.ex. JC1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) under 4 h vid 37 ° C, såsom beskrivits 21 .
OBS: JC1 NS5AB-mKO2-BSD är en HCV-virus som bär en fluorescensreporter (monomert Kusabira Orange 2, mKO2) för att övervaka infektionsfrekvenser följt av en Blasticidin Resistance Gene (BSD) mellan en duplicerad NS5A-NS5B-klyvningsstället, som beskrivits tidigare 21, 23. Arbeta med HCV kräver BSL2 + (USA) eller S3 ** (Tyskland) biosäkerhet nivå inneslutning och praxis. I stället för infektion med HCV, kan celler vara infekterade med olika patogener. - Expandera HCV-infekterade "lätta" celler och ickeinfekterade & #34;. Tunga" celler Under passage av kulturerna, fixa en alikvot med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS och bestämma HCV-smittade genom flödescytometri av det fluorescerande markörprotein (t ex mKO2), såsom beskrivs 21; den infektionhastigheter bör vara högre än 90% för lipiddroppe isolering. OBSERVERA: Om du använder JC1 NS5AB-mKO2-BSD HCV-stam, tillsätt 10 | ig / ml blasticidin S till den "lätt" medium för att selektera för HCV-positiva celler.
- 1 d före lipiddroppe isolering, tvätta cellerna med PBS, trypsinize, återsuspendera i "ljus" och "tunga" medium och räkna cellerna med användning av en Neubauer-räknekammare. Utsäde 7 x 10 6 celler av varje population i en 150 cm 2 cellodlingsskål. Bered minst 5 rätter per "light" och "tunga" cellpopulation. Odla cellerna i 30 ml medium / skål O / N.
- Avlägsna mediet och tvätta cellerna i 1x PBS. Lossa cellerna i 1xPBS med användning av en cellskrapa.
- Räkna båda cellpopulationer med användning av en Neubauer-räknekammare och pool lika cellantal i en 50 ml centrifugrör. Pellets cellerna genom centrifugering under 5 min vid 160 xg och 4 ° C.
- Avlägsna PBS och återsuspendera cellpelleten i ett ml sackarosbuffert (0,25 M sackaros, 1 mM EDTA och 1 mM DTT, kompletterat med proteasinhibitorcocktail). Överföra cellsuspensionen till en åtsittande Dounce homogenisator och lysera cellerna med 200 slag på is.
OBS! Bekräfta fullständig cellysering med hjälp av trypan blå färgning. - Överför lysatet till en 1,5 ml mikrofugrör och centrifugera ner kärnorna och cellrester för 10 min vid 1000 xg och 4 ° C.
- Efter centrifugering, lagra en alikvot av 25 | il av den post-nukleära fraktionen (PNS) vid -20 ° C som en ingångskontroll.
- Placera resten av PNS-fraktionen i botten av centrifugröret (11 x 60 mm) och överlagra med lipiddroppe tvättbuffert (~ 3 ml; 4 ml total) (50 mM kaliumfosfatbuffert pH 7,4, 100 mM kaliumklorid, 1 mM EDTA och 1 mM fenylmetansulfonylfluorid).
- Centrifugera i 2 h vid 100 tusen xg och 4 ° C. Skörda flytande lipiddroppe fraktion med användning av en böjd, trubbig kanyl från toppen av röret (ca 250 - 500 mikroliter, beroende på mängden av lipiddroppar). Placera lipiddroppe fraktionen i ett centrifugrör (11 x 60 mm), överlagring med lipiddroppe tvättbuffert (~ 3,5 ml; 4 ml totalt), och upprepa centrifugeringssteget.
- Skörda flytande lipiddroppe fraktion med användning av en böjd, trubbig kanyl från toppen av röret och överföra lipiddroppar i ett annat 1,5 ml mikrofugrör. Lägga 500 mikroliter av lipiddroppe tvättbuffert och snurra i 20 min vid 21 tusen xg och 4 ° C.
OBS: lipiddropparna visas som ett vitt band flyter ovanpå bufferten. - Ta bort det underliggande tvättbuffert med användning av en gel loading pipettspets och upprepa denna tvättsteg tre gånger.
- Efter den slutliga avlägsnandet av tvättbuffert med användning av en gel loading pipettspets, blanda 5 | il av lipid droppfraktioner med 10 mikroliter av NP-40-lysbuffert (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl och 1% NP-40 , kompletterat med proteasinhibitorcocktail). Inkubera provet på is under 1 h för att inaktivera virus om att arbeta med infektiöst material. Bestämma proteinnivån med en detergent-kompatibel proteinanalys; minst 35 ug av protein behövs för MS-analys.
- Lagra lipid dropp fraktionerna vid -20 ° C.
- Blanda motsvarande volym av lipiden droppfraktion med 4x laddningsfärg. Inkubera på is under 1 h för att inaktivera virus om att arbeta med infektiöst material. Koka vid 95 ° C under 5 min.
- Separera proteiner med användning av SDS-PAGE enligt tillverkarens protokoll. Överför gelén i kolloidal Coomassie-färgning lösning. Skära alla proteinbanden från gelén. Efter tryptisk in-gel digestion 24 </ Sup>, indunsta proverna och upplösa dem i 0,1% myrsyra. Analysera genom LC-MS / MS.
OBS: Här, analyser LC-MS / MS utfördes på en Quadrupole-Time-of-Flight masspektrometer (Q-TOF) eller på en Linjär Trap Quadrupole (LTQ) Orbitrap masspektrometer. Båda instrumenten kopplades med en ESI-källa till en nano-UPLC systemet. Dataanalyser och LC-MS / MS-analyser på Q-TOF och på den Orbitrap masspektrometer utfördes såsom beskrivits 21, 22. Var mycket noga med att inte förorena provet med mänsklig keratin. Använd alltid keratin fria pipettspetsar och rör. Förbereda buffertar under huv med laminärt flöde med keratin fria kemikalier. Före användning, rengöra alla ytor och enheter med destillerat vatten och etanol. Bär alltid handskar och en laboratorierock.
4. Analys av Lipid Droplet Renhet
- Utspädda alikvoter av lipid droppfraktioner 1: 2 och inmatnings fraktionerna (se steg 3,9) 01:10 med NP-40 lysär buffert. Inkubera proverna på is under 1 h för att inaktivera virus om att arbeta med infektiöst material. Bestämma proteinnivån med en detergent-kompatibel proteinanalys.
- Blanda lika mängder protein med 6x provbuffert och inkubera proverna på is under 1 h för att inaktivera viruset vid arbete med infektiöst material. Vidare med SDS-PAGE och överföra proteinerna till ett nitrocellulosamembran genom tankblotting vid 80 V under 90 min.
OBS: Efter blockering av membranet i blockeringsbuffert (5% fettfri torrmjölkspulver i TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl och 0,05% Tween 20)), inkubera med antikroppar riktade mot lipid droppmarkörer (t.ex. , PLIN1, PLIN2, eller PLIN3) och markörer för andra subcellulära utrymmen (t.ex. CALR, MnSOD, eller tubulin), följt av sekundära HRP-kopplade antikroppar. Använda kemiluminiscens för påvisande av proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipiddroppar är avgörande för HCV-infektion som de förmodade ställen för virionsammanfogningen, men de molekylära mekanismerna för morfogenes och utträde av virioner är till stor del okända. Att identifiera nya värdberoende faktorer inblandade i denna process, utförde vi kvantitativ lipiddroppe proteomanalys av HCV-infekterade celler 21 (figur 1A). Vi etablerat ett protokoll för rening av lipiddroppar och rutinmässigt detekteras en stark anrikning av lipiddroppe bindande proteiner PLIN2 / ADRP och PLIN3 / TIP47 och en utarmning av markörer av andra cellulära avdelningar, såsom β-tubulin för mikrotubuli, MnSOD för mitokondrier, eller kalretikulin / kalnexin för ER (Figur 1B, C). Vi sammanställt en lista av proteiner som tillförlitligt cofractionate med lipiddroppar i Huh7.5 celler (figur 1D) och, med användning av isotopmärkning, identifierade proteiner som är specifikt rekryterademed eller förskjuten från lipiddroppar i HCV-infekterade celler (figur 1E). Våra resultat tyder på att HCV kopplar lipiddropparna från sin ordinarie metabolisk funktion och / eller reglering och identifiera förmodade värdberoende och begränsningsfaktorer.
Figur 1: (A) Schema av experimentet. Naiva Huh7.5 celler märktes med "tunga" aminosyror eller "lätta" aminosyror. Celler som bär "lätta" aminosyror infekterades med en HCV-rapportvirus (JC1 NS5AB-mKO2-BSD). "Light" och "tunga" aminosyra-märkta populationerna blandades och lipiddroppar isolerades genom två efterföljande ultracentrifugerings och tre tvättsteg, åtskilda av SDS-PAGE och analyserades genom LC-ESI-MS / MS. Notera den flytande vita lipiddroppe fraktion (röd pil) efter ultracentrifugati på och tvättning i mikrofugrör. (B) Western blot-analys av post-nukleära och lipid droppfraktioner visar en anrikning av lipid droppmarkörproteiner i lipid droppfraktioner och en utarmning av markörer av andra cellulära avdelningar. (C) Coomassie-blått och silverfärgning av postnukleära supernatanten (PNS) och lipid droppfraktioner separerade genom SDS-PAGE. Silverfärgning presenteras endast visualisering. (D) Heatmap av antalet peptider och andel protein täckning av proteiner som identifierats i lipid droppfraktioner av Huh7.5 celler (cutoff: ≥5 peptider och ≥20% täckning). (E) Heatmap föreställande anrikad eller utarmad lipiddroppe associerade proteiner efter infektion med HCV (normaliserad till medianen, 1,5-faldig cutoff, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Modifierad från 21.et = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för att isolera lipiddroppar för kvantitativ lipiddroppe proteomanalys att jämföra anrikning och utarmning av proteiner associerade med lipiddroppar enligt olika odlingsbetingelser, såsom virala infektioner. Som en alternativ metod, kan den proteomanalys utföras med märkningsfria kvantifieringar baserade på totala toppintensiteter. Denna metod har ingen dynamisk begränsning område och undviker metaboliska problem. Fördelen med SILAC tillvägagångssätt är att proverna poolas före lipiddroppe isolering och därför resultaten är oberoende av fel i provberedning, smälta, och LC-MS / MS-analys. Vi rekommenderar denna metod för kvantitativ lipiddroppe proteomanalys.
Som anrikning eller utarmning av lipid droppassocierade proteiner som observerats i MS-analysen skulle kunna återspegla en induktion eller repression av proteinuttryck, analys av uttrycksnivåer av quantitative RT-PCR och (företrädesvis) western blotting rekommenderas. Dessutom kan två metoder användas för att verifiera anrikning eller utarmning av specifika proteiner i lipiddroppar: lipiddroppe isolering följt av western blotting och immunfluorescensanalys med lipofila färgämnen, såsom BODIPY eller LD540, att fläck lipiddroppar som beskrivits 21.
Utföra experiment med swappade villkor märkning för att säkerställa att märkning med "tunga" aminosyror inte påverkar proteinexpression eller lipiddroppe lokalisering och för att identifiera proteinföroreningar från "light" medium och miljökällor. För proteinidentifiering, bör sökningen utföras med en falsk upptäckten hastighet (FDR) av 0,01 på både peptid och proteinnivå. För att säkerställa hög förtroende resultat rekommenderar vi att utföra minst 3 - 4 oberoende experiment med celler från olika passager och olika viruslagerberedningar. Beroende på magnitude förändring kan flera oberoende experiment krävas.
För normalisering av de kvantitativa MS-data för att korrigera för något annorlunda cellantal eller lipiddroppar, centrera detekteringsförhållandena av "ljus" under de "tunga" peptider, eller vice versa, i swappade betingelser märkning genom att dividera genom medianen av alla identifierade proteiner , såsom beskrivs 25. Om mängden av lipiddroppar skiljer sig signifikant mellan proverna, normalisering till lipid droppmarkörproteiner, såsom PLIN2, kan vara tillrådligt. När vi normalisera våra MS-data till PLIN2 nivåer finner vi liknande resultat som när vi normalisera till medianen (analys visas ej). Notera under cellodlingsbetingelser vi använder vi inte upptäcker betydande lipiddroppe ansamling på HCV-infektion.
Lipiddropparna är i nära kontakt med andra cellulära organeller, främst mitokondrier och ER. Därför, proteiner from dessa fack kan samverka fraktionera med lipiddroppar under isolering. Om en sådan "kontaminant" protein är oförändrat i överflöd som svar på infektion eller behandling, kommer det inte att påverka den jämförande lipiddroppe proteomanalys. Det bör noteras dock att under vissa omständigheter kan kontakten mellan lipiddroppar och andra organ ändras. Till exempel, under lipolytiska betingelser, är mitokondriella proteiner detekterades vid högre frekvenser i lipid dropp fraktioner från lipolytiskt stimulerade 3T3-L1 adipocyter jämfört med basala förhållanden 26. Stimuleras de novo lipogenes, å andra sidan, kan leda till ökad association med ER. Dessa förändringar återspeglar sedan förändringar i organell interaktion inducerade av olika stimuli och kan vara intressant, även om de inte reflekterar ren lipiddroppe lokalisering.
Vi använde detta protokoll för en omfattande kvantitativ lipiddroppe proteome-analys av HCV-infekterade, kontra oinfekterade kontrollceller för att avslöja de störningar som orsakas av HCV-infektion och för att identifiera regulatorer av HCV-replikation 21. I hepatomcellinjen Huh7.5, vi rutinmässigt identifierade upp till 2900-proteiner inom lipid droppfraktioner, med ~ 300 proteiner identifierades med flera peptider i varje experiment. Efter infektion med HCV, observerade vi både rekrytering och utarmning av värdproteiner. Flera proteiner identifierats som höggradigt berikad vid lipiddroppar av HCV-infekterade celler har tidigare publicerats som HCV värdfaktorer (t.ex., DEAD-box-proteiner 1 och 3 (DDX1, DDX3) eller insulinliknande tillväxtfaktor-II-mRNA-bindande protein 1 ( IGF2BP1)), vilket indikerar tillförlitligheten hos SILAC strategi 27, 28, 29. Dessutom rekryteras proteiner ofta kommenterad för RNA-bindande proteiner och belyser den snäva associering av det virala RNA replication komplex med lipid droppfraktioner. I kontrast, överfördes proteiner utarmat från lipiddroppar huvudsakligen kommenterad för lipid metaboliska processer, vilket indikerar att HCV stör proteinkompositionen för att koppla bort de lipiddroppar från deras normala metabolisk reglering och funktion.
Protokollet beskriver vi är möjligt att ändra till olika cellinjer och odlingsbetingelser och kan bidra till att dechiffrera funktionen av lipiddroppar i livscykeln för olika patogener som är beroende av lipiddropparna för replikering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar R. Bartenschlager (University of Heidelberg) för JC1 konstruktioner, CM Rice (Rockefeller University) för Huh7.5 celler, J. McLauchlan (Medical Research Council Virology Unit) för JFH1 bygga, T. Wakita (National Institute of infektions~~POS=TRUNC sjukdomar~~POS=HEADCOMP, Japan) för JFH1, och B. Webster och WC Greene (Gladstone Institute of Virology and Immunology) för de HCVcc reporterkonstruktioner. Detta arbete stöddes av medel från DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), Inst 337 / 15-1 2013 och INST 337 / 16-1 2013 (HS)). Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology stöds av Free och hansastaden Hamburg och den federala hälsoministeriet. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
