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Biochemistry

मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए लिपिड बूंद अलगाव

Published: April 17, 2017 doi: 10.3791/55585
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

लिपिड बूंदों हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) सहित कई रोगाणुओं की प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण अंगों कर रहे हैं। हम संबद्ध प्रोटीन की मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लिपिड बूंदों को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन; यह इस तरह के वायरस के संक्रमण, पर्यावरण के तनाव, या नशीली दवाओं के उपचार के रूप में की स्थिति, की एक किस्म के तहत इस्तेमाल किया जा सकता।

Abstract

लिपिड बूंदों विरिअन morphogenesis के ख्यात साइट के रूप में, विभिन्न रोगजनकों की एक किस्म है, सबसे प्रमुखता से हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) की प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण हैं। मात्रात्मक लिपिड छोटी बूंद proteome विश्लेषण प्रोटीन हैं जो करने के लिए स्थानीय बनाना या इस तरह के वायरस के संक्रमण के रूप में शर्तों के तहत लिपिड बूंदों से विस्थापित कर रहे हैं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक एचसीवी के साथ संक्रमण के बाद लिपिड छोटी बूंद proteome में परिवर्तन चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया वर्णन करते हैं। हम सेल संस्कृति (SILAC) में एमिनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करें और इस प्रकार मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन quantitate करने के लिए "भारी" अमीनो एसिड के साथ कोशिकाओं में से एक की आबादी का पूरा proteome लेबल। लिपिड छोटी बूंद अलगाव के लिए, दो सेल आबादी (यानी एचसीवी से संक्रमित / "प्रकाश" अमीनो एसिड और असंक्रमित नियंत्रण / "भारी" अमीनो एसिड) मिलाया 1: 1 और hypotonic बफर में यंत्रवत् lysed। नाभिक और सेल घ को हटाने के बादकम गति centrifugation द्वारा ebris, लिपिड छोटी बूंद जुड़े प्रोटीन isotonic बफर में तीन चरणों धोने के बाद दो बाद में ultracentrifugation चरणों से समृद्ध कर रहे हैं। लिपिड छोटी बूंद अंशों की शुद्धता अलग subcellular डिब्बों को पहचानने एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया जाता है। लिपिड छोटी बूंद जुड़े प्रोटीन तो एसडीएस-पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) Coomassie धुंधला द्वारा पीछा से अलग होते हैं। tryptic डाइजेस्ट के बाद, पेप्टाइड्स तरल क्रोमैटोग्राफी-electrospray ionization-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ईएसआई-एमएस / एमएस) द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। इस विधि का उपयोग करना, हम एचसीवी संक्रमण पर लिपिड बूंदों कि प्रो- या एंटीवायरल मेजबान कारकों का प्रतिनिधित्व कर सकते करने के लिए भर्ती प्रोटीन की पहचान की। हमारे विधि इस तरह के रोगज़नक़ के संक्रमण, पर्यावरण के तनाव, या नशीली दवाओं के उपचार के रूप में विभिन्न कोशिकाओं और संस्कृति की स्थिति, की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

(ट्राइग्लिसराइड्स (TG) और कोलेस्ट्रॉल एस्टर (सीई)) लिपिड बूंदों अत्यधिक गतिशील cytoplasmic (और परमाणु) सेल उदासीन लिपिड के एक प्रमुख से बना अंगों हैं एम्बेडेड प्रोटीन 1 के साथ फॉस्फोलिपिड की एक monolayer से घिरा। सभी प्रकार की कोशिकाओं लिपिड बूंदों का उत्पादन है, लेकिन वे आकार, लिपिड रचना, और प्रोटीन सजावट में भिन्नता है। लिपिड बूंदों ऊर्जा और झिल्ली अग्रदूत जलाशयों के रूप में या प्रोटीन जमा के रूप में सेवारत सहित विविध कार्यों को पूरा। इसके अलावा, लिपिड के तेज के माध्यम से, वे lipotoxicity से कोशिकाओं, रिहाई लिपिड संकेतन अणुओं के रूप में की रक्षा, और प्रोटीन गिरावट और जालिका (ईआर) तनाव प्रतिक्रियाओं 2 में शामिल हैं। जैसे, प्रोटीन के एक मेजबान लिपिड बूंदों के लिए बाध्य और अन्य अंगों के साथ उनकी पीढ़ी, गिरावट, तस्करी, और बातचीत तय करते हैं। उनमें से सदाशयी लिपिड छोटी बूंद बंधनकारी प्रोटीन की perilipin परिवार (PLIN1-5) कर रहे हैंच "> 3।

लिपिड छोटी बूंद जीवजनन संभावना ईआर, जहां ईआर-निवासी एंजाइमों उदासीन लिपिड कि झिल्ली दोहरी परत के भीतर जमा के संश्लेषण को उत्प्रेरित पर शुरू होता है, उदासीन लिपिड की एक लेंस, एक प्रक्रिया है कि हाल ही में खमीर 4 में अच्छी तरह से कल्पना की गई थी गठन। झुकने झिल्ली और बुलंद phosphatidic एसिड और diacylglycerol स्तरों तो फॉस्फोलिपिड जैव संश्लेषण में शामिल प्रोटीन को आकर्षित करने के लिए लगा रहे हैं, कोर उदासीन लिपिड और परिरक्षण फॉस्फोलिपिड के एक साथ संश्लेषण के रूप में लिपिड छोटी बूंद पीढ़ी 5 के लिए आवश्यक है। transmembrane डोमेन को शरण देने एंजाइमों कि ईआर में निवास इस प्रक्रिया को उत्प्रेरित। बड़े लिपिड बूंदों को विस्तार लिपिड synthesizing एंजाइमों कि एक amphipathic हेलिक्स बंदरगाह और इस तरह लिपिड बूंदों को ईआर से यात्रा कर सकते हैं की एक अलग वर्ग की गतिविधि की आवश्यकता है। लिपिड बूंदों से लिपिड को जुटाने triglycerid के स्थानीय सक्रियण के माध्यम से होता हैई और diacylglycerol lipases वसा ट्राइग्लिसराइड lipase (ATGL) और हार्मोन के प्रति संवेदनशील lipase (एचएसएल) या इस तरह के स्थूल और microlipophagy या के रूप में विभिन्न autophagic रास्ते, द्वारा संरक्षिका की मध्यस्थता भोजी 6। लिपिड बूंदों ऐसे माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में अन्य सेलुलर organelles, और ईआर (बीटा ऑक्सीकरण और लिपिड संश्लेषण के लिए) के साथ बातचीत, लेकिन (लिपिड संश्लेषण और प्रोटीन की तस्करी के लिए) भी लाइसोसोम, endosomes, और रिक्तिकाएं intracellular बैक्टीरिया 7 से प्रेरित है। दरअसल बैक्टीरिया, वायरस, और यहां तक कि परजीवी प्रतिकृति और दृढ़ता के लिए लिपिड बूंदों लक्षित करते हैं, उन्हें एचसीवी 8 के बीच में।

एचसीवी संक्रमण प्रति वर्ष 9 लगभग 0.5 मिलियन लोगों की मृत्यु के लिए लेखांकन जिगर संबंधी रुग्णता और मृत्यु दर दुनिया भर के प्रमुख कारणों में से एक है। एचसीवी संक्रमण की सही संख्या अज्ञात है, लेकिन हाल के अनुमानों का सुझाव है कि 130 - 150 मिलियन लोगों लंबे समय से संक्रमित हैं। कोई VACCINई मौजूद है, लेकिन हाल ही में मंजूरी दे दी प्रत्यक्ष अभिनय विषाणु-विरोधी नाटकीय रूप से मानक इंटरफेरॉन आधारित चिकित्सा की तुलना में चिकित्सकीय प्रतिक्रियाओं वृद्धि हुई है। हालांकि, दुनिया भर में, रोगियों के उपचार की संभावना नई चिकित्सा विज्ञान के अत्यंत उच्च लागत की वजह से प्रतिबंधित कर दिया जाएगा। सभी व्यक्तियों के बारे में आधा लंबे समय से एचसीवी से संक्रमित वसामय यकृत रोग (स्टीटोसिस), एक शर्त हेपाटोसाइट्स में लिपिड बूंदों के अत्यधिक संचय की विशेषता का विकास। दिलचस्प, लिपिड बूंदों भी एचसीवी प्रतिकृति के लिए के रूप में महत्वपूर्ण सेलुलर organelles उभरा है, कथित रूप से वायरल विधानसभा साइटों 10, 11 के रूप में सेवारत।

एचसीवी से संक्रमित कोशिकाओं में, वायरल प्रोटीन कोर और NS5A, एक प्रक्रिया है कि ट्राइग्लिसराइड जैव संश्लेषण पर निर्भर करता है में लिपिड बूंदों को स्थानीय बनाना diacylglycerol acyltransferase -1 (DGAT1) के अवरोधकों के रूप में लिपिड बूंदों और बाद में एचसीवी कण उत्पादन से 12 तस्करी ख़राब >, 13, 14, 15। इसके अलावा, या तो कोर या NS5A के लिपिड छोटी बूंद बाध्यकारी डोमेन में म्यूटेशन एचसीवी विधानसभा 16, 17 को दबाने। कोर और NS5A फिर अन्य सभी वायरल प्रोटीन, साथ ही वायरल आरएनए प्रतिकृति परिसरों की भर्ती, बारीकी से लिपिड के साथ जुड़े 16 बूंदों झिल्ली को। सभी वायरल प्रोटीन का एक ठोस की कार्रवाई संक्रामक वायरल संतान 10, 11 के सफल उत्पादन के लिए आवश्यक है। संरचनात्मक प्रोटीन virions की हिस्सा हैं, और nonstructural प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक बातचीत को बढ़ावा देने के। दिलचस्प, सदाशयी लिपिड छोटी बूंद बाध्यकारी प्रोटीन PLIN3 / TIP47 दोनों एचसीवी आरएनए प्रतिकृति और virions 18 की रिहाई, 19 के लिए आवश्यक है 20। इन हाल के अग्रिमों के बावजूद, यंत्रवत विवरण, विशेष रूप से एचसीवी प्रतिकृति की देर चरणों के दौरान वायरस मेजबान बातचीत की, ख़राब ढंग से परिभाषित बने हुए हैं, और लिपिड बूंदों की सटीक समारोह अज्ञात है।

यहाँ, हम जुड़े प्रोटीन की मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लिपिड बूंदों को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन। इस विधि का उपयोग करना, हम एक मेजबान प्रोटीन है कि सह-fractionates लिपिड बूंदों के साथ और कुशल एचसीवी परिपक्वता 21 के लिए आवश्यक है के रूप में एचसीवी संक्रमण के दौरान लिपिड छोटी बूंद proteome में व्यापक परिवर्तन और पहचान Annexin A3 पाया।

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Protocol

सेल संस्कृति में एमिनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग (SILAC) के लिए मीडिया 1. तैयारी

नोट: यहाँ, SILAC प्रोटीन quantitation किट - DMEM 13 सी 6 एल Arginine-एचसीएल की 50 मिलीग्राम SILAC लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ पूरक। dialyzed भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) SILAC प्रोटीन quantitation किट के साथ प्रदान की जाती है।

  1. DMEM मध्यम के प्रत्येक बोतल से 50 एमएल निकालें और dialyzed FCS के 50 एमएल जोड़ें।
  2. 13 सी 6 एल लाइसिन-2HCl के 50 मिलीग्राम और माध्यम के 1 एमएल में 13 सी 6 एल Arginine-एचसीएल की 50 मिलीग्राम भंग। अच्छी तरह से मिलाएं और DMEM + FCS माध्यम से अमीनो एसिड जोड़ें।
  3. 1x पेन / Strep और 1x एल glutamine विकल्प जोड़ें। बाँझ फिल्टर मध्यम एक 0.45 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग कर। "भारी" SILAC माध्यम के रूप में बोतल लेबल करें।
  4. "प्रकाश" मध्यम तैयार करने के लिए, दोहराएँ 1.1 कदम - 1.3 एल Arginine-एचसीएल के 50 मिलीग्राम और एल लाइसिन-2HCl की 50 मिलीग्राम का उपयोग कर। के रूप में "बोतल लेबल करेंप्रकाश "SILAC मध्यम।

2. SILAC-लेबलिंग और एमिनो एसिड निगमन नियंत्रण

  1. कोशिकाओं Trypsinize (1x ट्रिप्सिन- EDTA) और विभाजन 1 x 10 6 अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम की 2 एमएल, अच्छी तरह से "भारी" SILAC माध्यम के साथ एक और "प्रकाश" के साथ एक युक्त थाली के 2 कुओं में 5 Huh7.5 कोशिकाओं SILAC मध्यम।
  2. संस्कृति कम से कम 6 मार्ग के लिए कोशिकाओं (विभाजन अनुपात: 1: 6); 6 मार्ग के बाद, "भारी" अमीनो एसिड के समावेश 95% से अधिक होना चाहिए।
  3. हार्वेस्ट "भारी" का 1 x 10 6 कोशिकाओं - और "प्रकाश" -labeled सेल आबादी समावेश प्रभावकारिता का विश्लेषण करने के लिए। 1x पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें और 160 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
  4. MS-बफर (150 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.4, और 1 मिमी EDTA 1x प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ पूरक) के 150 μL में सेल छर्रों Resuspend और 30 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं सेते हैं। ल्य्से ग4 डिग्री सेल्सियस पर sonication द्वारा एल।
    नोट: निम्न sonication के यहां इस्तेमाल किया सेटिंग्स हैं: टाइमर, पकड़; उत्पादन नियंत्रण, 8; कर्तव्य चक्र, 80%; और 2 x 30 दालों।
  5. 11,000 XG पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटा दें। एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और एक डिटर्जेंट संगत प्रोटीन परख के साथ प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
  6. 6x नमूना बफर (375 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 6.8, 25.8% ग्लिसरॉल, 123 मिलीग्राम / एमएल एसडीएस, 600 माइक्रोग्राम / एमएल bromophenol नीले, और 60 μL / एमएल β-mercaptoethanol), फोड़ा 95 ° पर साथ प्रोटीन की 75 माइक्रोग्राम मिक्स 5 मिनट के लिए सी, और एसडीएस में एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन को अलग लगभग 1 घंटे के लिए (3.02 ग्राम / एल Tris आधार, 18.8 ग्राम / एल ग्लाइसिन, और 1 ग्राम / एल एसडीएस) 180 वी पर चल रहे बफर या निर्माताओं के अनुसार 'निर्देश।
  7. कोलाइडयन Coomassie धुंधला समाधान में जेल में स्थानांतरित करें। प्रत्येक लेन से एक ही प्रोटीन बैंड आबकारी। ट्रिप्सिन के साथ प्रोटीन को पचाने और एमएस विश्लेषण करने से समावेश प्रभावकारिता का विश्लेषणरों, के रूप में 22 का वर्णन किया।

3. SILAC लेबल Huh7.5 कोशिकाओं के लिपिड बूंद अलगाव

  1. कोशिकाओं में से एक जनसंख्या को संक्रमित (यानी "प्रकाश" अमीनो एसिड के साथ लेबल उन) (जैसे, JC1 NS5AB-mKO2-बीएसडी, MOI 1) 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए, वर्णित के रूप में 21 वायरस शेयरों के साथ विकासशील द्वारा एक एचसीवी संवाददाता वायरस से ।
    नोट: JC1 NS5AB-mKO2-बीएसडी एक प्रतिदीप्ति संवाददाता (मोनोमेरिक Kusabira ऑरेंज 2, mKO2) एक Blasticidin प्रतिरोध जीन (बीएसडी) एक डुप्लिकेट NS5A-NS5B दरार साइट के बीच के बाद संक्रमण दर पर नजर रखने के ले जा रहा एक एचसीवी वायरस, पहले से वर्णित 21 है, 23। एचसीवी के साथ काम करें BSL2 + (यूएसए) या S3 ** (जर्मनी) बायोसेफ्टी स्तरीय रोकथाम और प्रथाओं की आवश्यकता है। इसके बजाय एचसीवी के साथ संक्रमण की, कोशिकाओं विभिन्न रोगजनकों से संक्रमित हो सकता है।
  2. एचसीवी से संक्रमित "प्रकाश" कोशिकाओं और noninfected & # विस्तार34;। भारी "कोशिकाओं संस्कृतियों के passaging के दौरान, पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ एक विभाज्य को ठीक करने और के रूप में वर्णित 21, एचसीवी संक्रमण दर का निर्धारण फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन का फ्लो (जैसे, mKO2) द्वारा; । JC1 NS5AB-mKO2-बीएसडी एचसीवी तनाव का उपयोग कर रहे हैं, तो एचसीवी पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए "प्रकाश" मध्यम करने के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल blasticidin एस जोड़ें: संक्रमण दर लिपिड छोटी बूंद अलगाव नोट के लिए उच्च से अधिक 90% होना चाहिए।
  3. 1 घ लिपिड छोटी बूंद अलगाव से पहले, पीबीएस trypsinize, "प्रकाश" और "भारी" मध्यम में resuspend के साथ कोशिकाओं को धोने, और एक Neubauer गिनती चैम्बर का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती। बीज एक 150 सेमी 2 सेल संस्कृति डिश में प्रत्येक जनसंख्या का 7 x 10 6 कोशिकाओं। प्रति "प्रकाश" और "भारी" सेल आबादी कम से कम 5 व्यंजन तैयार करें। संस्कृति मध्यम / पकवान हे / एन के 30 एमएल में कोशिकाओं।
  4. मध्यम निकालें और 1x पीबीएस में कोशिकाओं को धोने। 1x में कोशिकाओं अलग करेंपीबीएस एक सेल स्क्रेपर का उपयोग कर।
  5. एक Neubauer गिनती चैम्बर का उपयोग कर दोनों सेल आबादी की गणना करें और एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में बराबर सेल नंबर पूल। 160 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
  6. पीबीएस निकालें और सुक्रोज बफर (0.25 एम सुक्रोज, 1 मिमी EDTA, और 1 मिमी डीटीटी, प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ पूरक) के 1 एमएल में सेल गोली resuspend। एक चुस्त Dounce homogenizer के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और बर्फ पर 200 स्ट्रोक के साथ कोशिकाओं lyse।
    नोट: trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग कर पूरा सेल की पुष्टि करें।
  7. एक 1.5 एमएल microfuge ट्यूब में lysate हस्तांतरण और 1,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नाभिक और सेल मलबे नीचे स्पिन।
  8. centrifugation के बाद, एक इनपुट नियंत्रण के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर बाद परमाणु अंश के 25 μL (पीएन) के एक विभाज्य की दुकान।
  9. अपकेंद्रित्र ट्यूब (11 x 60 मिमी) के तल पर पीएन अंश के बाकी जगह और लिपिड छोटी बूंद धोने बफर (साथ ओवरले ~ 3 एमएल, 4 एमएल मुन्नाअल) (50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर पीएच 7.4, 100 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 1 मिमी EDTA, और 1 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड)।
  10. 100,000 XG पर 2 घंटे और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। (- 500 μL, लिपिड बूंदों की मात्रा पर निर्भर लगभग 250) ट्यूब के ऊपर से चल लिपिड छोटी बूंद एक तुला, कुंद प्रवेशनी का उपयोग कर अंश जल को संचित करें। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब (11 x 60 मिमी) में लिपिड छोटी बूंद अंश रखें, लिपिड छोटी बूंद धोने बफर (~ 3.5 एमएल, 4 एमएल कुल) के साथ ओवरले, और centrifugation कदम दोहराएँ।
  11. ट्यूब के ऊपर से चल लिपिड छोटी बूंद एक तुला, कुंद प्रवेशनी का उपयोग कर अंश जल को संचित करें और एक नया 1.5 एमएल microfuge ट्यूब के लिए लिपिड बूंदों हस्तांतरण। 21,000 XG पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए लिपिड छोटी बूंद धोने बफर और स्पिन के 500 μL जोड़ें।
    ध्यान दें: लिपिड बूंदों एक सफेद बैंड बफर के शीर्ष पर तैर के रूप में दिखाई देते हैं।
  12. एक जेल लोड हो रहा है विंदुक टिप का उपयोग आधारस्थित धोने बफर निकालें और इस धोने कदम तीन बार दोहराएँ।
  13. बफर धोने एक जेल लोड हो रहा है विंदुक टिप का उपयोग के अंतिम निकालने के बाद, एनपी 40 lysis बफर के 10 μL (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, और 1% एनपी 40 के साथ 5 लिपिड छोटी बूंद भिन्न की μL मिश्रण , प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ पूरक)। वायरस निष्क्रिय करने के लिए करता है, तो संक्रामक सामग्री के साथ काम 1 घंटे के लिए बर्फ पर नमूना सेते हैं। एक डिटर्जेंट संगत प्रोटीन परख के साथ प्रोटीन के स्तर का निर्धारण; प्रोटीन की कम से कम 35 माइक्रोग्राम MS-विश्लेषण के लिए की जरूरत है।
  14. -20 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड छोटी बूंद अंशों की दुकान।
  15. 4x लोड हो रहा है डाई के साथ लिपिड छोटी बूंद अंश की इसी मात्रा मिक्स। 1 घंटे के लिए बर्फ पर सेते वायरस निष्क्रिय करने के लिए करता है, तो संक्रामक सामग्री के साथ काम कर। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।
  16. निर्माताओं के प्रोटोकॉल के अनुसार एसडीएस-पृष्ठ का उपयोग कर प्रोटीन को अलग करें। कोलाइडयन Coomassie धुंधला समाधान में जेल में स्थानांतरित करें। जेल से सभी प्रोटीन बैंड आबकारी। Tryptic में जेल पाचन 24 <के बाद/ Sup>, नमूने लुप्त हो और उन्हें 0.1% फार्मिक एसिड में भंग। LC-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण करें।
    नोट: यहाँ, LC-एमएस / एमएस एक Quadrupole समय-ऑफ-द उड़ान जन स्पेक्ट्रोमीटर (क्यू टीओएफ) पर या एक रैखिक जाल Quadrupole (LTQ) Orbitrap जन स्पेक्ट्रोमीटर पर प्रदर्शन किया गया विश्लेषण करती है। दोनों उपकरणों एक नैनो UPLC व्यवस्था करने के लिए एक ईएसआई स्रोत के साथ मिलकर कर रहे थे। डाटा विश्लेषण करती है और LC-एमएस / एमएस क्यू टीओएफ पर और Orbitrap जन स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण करती है के रूप में वर्णित 21, 22 प्रदर्शन किया गया। मानव केरातिन के साथ नमूना दूषित करने नहीं महान ख्याल रखना। हमेशा केरातिन-मुक्त विंदुक युक्तियाँ और ट्यूब का उपयोग करें। केरातिन मुक्त रसायनों के साथ लामिना का प्रवाह हुड के तहत बफर तैयार करें। उपयोग करने से पहले, आसुत जल और इथेनॉल के साथ सभी सतहों और उपकरणों को साफ। हमेशा दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं।

4. लिपिड बूंद पवित्रता का विश्लेषण

  1. लिपिड छोटी बूंद अंशों 1 की aliquots पतला: 2 और इनपुट अंशों (कदम 3.9 देखें) एनपी 40 lys साथ 01:10बफर है। वायरस निष्क्रिय करने के लिए करता है, तो संक्रामक सामग्री के साथ काम 1 घंटे के लिए बर्फ पर नमूने सेते हैं। एक डिटर्जेंट संगत प्रोटीन परख के साथ प्रोटीन के स्तर का निर्धारण करते हैं।
  2. 6x नमूना बफर के साथ प्रोटीन की बराबर मात्रा मिलाएं और वायरस को निष्क्रिय करने के अगर संक्रामक सामग्री के साथ काम 1 घंटे के लिए बर्फ पर नमूने सेते हैं। एसडीएस-पृष्ठ के साथ आगे बढ़ें और प्रोटीन 90 मिनट के लिए 80 वी पर टैंक सोख्ता द्वारा एक nitrocellulose झिल्ली पर स्थानांतरित।
    नोट: बफर (टीबीएस-टी (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.6, 150 मिमी NaCl, और 0.05% Tween20) में 5% नोनफेट सूखे दूध पाउडर) को रोकने में झिल्ली को अवरुद्ध करने के बाद, लिपिड छोटी बूंद मार्कर के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ सेते हैं (उदाहरण के लिए , PLIN1, PLIN2, या PLIN3) और अन्य subcellular डिब्बों (के मार्करों जैसे, CALR, MnSOD, या ट्यूबिलिन), माध्यमिक एचआरपी-युग्मित एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया। प्रोटीन का पता लगाने के लिए chemiluminescence का प्रयोग करें।

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Representative Results

लिपिड बूंदों विरिअन विधानसभा के ख्यात साइटों के रूप में एचसीवी संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन morphogenesis और virions की बाहर निकलने के आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात है। उपन्यास मेजबान निर्भरता इस प्रक्रिया में शामिल कारकों की पहचान करने के लिए, हम एचसीवी-संक्रमित कोशिकाओं 21 (चित्रा 1 ए) के मात्रात्मक लिपिड छोटी बूंद proteome विश्लेषण प्रदर्शन किया। हम लिपिड बूंदों शुद्ध के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की और नियमित रूप से लिपिड छोटी बूंद-बंधनकारी प्रोटीन PLIN2 / ADRP और PLIN3 / TIP47 और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए इस तरह के β ट्यूबिलिन के रूप में अन्य सेलुलर डिब्बों के मार्कर, की कमी, माइटोकॉन्ड्रिया के लिए MnSOD के एक मजबूत संवर्धन का पता चला, या ईआर (चित्रा 1 बी, सी) के लिए calreticulin / calnexin। हम, प्रोटीन है कि मज़बूती से Huh7.5 कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) और में लिपिड बूंदों के साथ cofractionate की एक सूची तैयार की आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग कर, पहचान प्रोटीन है कि विशेष रूप से नियुक्त किया जाता हैकरने के लिए या एचसीवी-संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 1E) में लिपिड बूंदों से विस्थापित। हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि एचसीवी अपने नियमित चयापचय समारोह और / या विनियमन से लिपिड बूंदों डिस्कनेक्ट और ख्यात मेजबान निर्भरता और प्रतिबंध कारकों की पहचान।

आकृति 1
आकृति 1: (ए) प्रयोग की योजना। भोली Huh7.5 कोशिकाओं "भारी" अमीनो एसिड या "प्रकाश" अमीनो एसिड के साथ लेबल रहे थे। "प्रकाश" अमीनो एसिड ले जाने प्रकोष्ठों एक एचसीवी संवाददाता वायरस (JC1 NS5AB-mKO2-बीएसडी) से संक्रमित थे। "लाइट" और "भारी" एमिनो एसिड लेबल आबादी मिलाया गया, और लिपिड बूंदों दो बाद में ultracentrifugation और तीन धोने कदम, एसडीएस-पृष्ठ के द्वारा अलग से पृथक किया गया है, और LC-ईएसआई-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किया। नोट ultracentrifugati के बाद चल सफेद लिपिड छोटी बूंद अंश (लाल तीर) पर और microfuge ट्यूबों में कपड़े धोने की। (बी) के बाद परमाणु और लिपिड छोटी बूंद भिन्न के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण लिपिड छोटी बूंद भागों में लिपिड छोटी बूंद मार्कर प्रोटीन की एक संवर्धन और अन्य सेलुलर डिब्बों के मार्करों की कमी को दर्शाता है। (सी) Coomassie नीले रंग और चांदी के बाद परमाणु सतह पर तैरनेवाला (पीएन) और लिपिड छोटी बूंद अंशों एसडीएस-पृष्ठ के द्वारा अलग से धुंधला। चांदी धुंधला केवल दृश्य के लिए प्रस्तुत किया है। (डी) पेप्टाइड और Huh7.5 कोशिकाओं के लिपिड छोटी बूंद भागों में पहचान प्रोटीन की प्रोटीन कवरेज का प्रतिशत की संख्या के हीटमैप (कटऑफ: ≥5 पेप्टाइड और ≥20% कवरेज)। (ई) हीटमैप समृद्ध या एचसीवी के साथ संक्रमण के बाद समाप्त हो गया लिपिड छोटी बूंद जुड़े प्रोटीन चित्रण (मंझला, 1.5 गुना कटऑफ के लिए सामान्यीकृत, * पी <0.05, ** p <0.01, *** पी <0.001)। 21 से संशोधित।एट = "_ blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम संवर्धन और इस तरह के वायरल संक्रमण के रूप में विविध संस्कृति की स्थिति, के तहत लिपिड बूंदों के साथ जुड़े प्रोटीन की कमी की तुलना करने के मात्रात्मक लिपिड छोटी बूंद proteome विश्लेषण के लिए लिपिड बूंदों को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, proteome विश्लेषण लेबल से मुक्त कुल शिखर तीव्रता के आधार पर quantifications के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। इस विधि कोई गतिशील रेंज सीमित है और चयापचय समस्याओं से बचा जाता है। SILAC दृष्टिकोण का लाभ यह है कि नमूने पहले लिपिड छोटी बूंद अलगाव जमा कर रहे हैं, और इसलिए परिणाम नमूना तैयार करने में त्रुटियों से स्वतंत्र हैं, पचाने और LC-एमएस / एमएस विश्लेषण है। हम अत्यधिक मात्रात्मक लिपिड छोटी बूंद proteome विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण सलाह देते हैं।

संवर्धन या लिपिड छोटी बूंद जुड़े एमएस विश्लेषण में मनाया प्रोटीन की कमी एक प्रेरण या प्रोटीन अभिव्यक्ति के दमन, मात्रात्मक द्वारा अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण को प्रतिबिंबित सकता हैई आरटी-पीसीआर और (अधिमानतः) पश्चिमी सोख्ता की सलाह दी है। लिपिड छोटी बूंद अलगाव पश्चिमी सोख्ता और lipophilic रंगों, BODIPY या LD540, वर्णित 21 के रूप में है कि दाग लिपिड बूंदों की तरह साथ immunofluorescence विश्लेषण के बाद: इसके अलावा, दो तरीकों संवर्धन या विशिष्ट प्रोटीन की कमी लिपिड बूंदों में सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

यह सुनिश्चित करें कि "भारी" अमीनो एसिड के साथ लेबलिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति या लिपिड छोटी बूंद स्थानीयकरण प्रभावित नहीं करता है और "प्रकाश" मध्यम और पर्यावरण स्रोतों से प्रोटीन दूषित पदार्थों को पहचानने के लिए बदली लेबलिंग की स्थिति के साथ प्रयोग करें। प्रोटीन की पहचान के लिए, खोज दोनों पेप्टाइड और प्रोटीन के स्तर पर एक झूठी खोज दर (एफडीआर) 0.01 की साथ किया जाना चाहिए। 4 स्वतंत्र प्रयोगों, अलग मार्ग और विभिन्न वायरस शेयर की तैयारियों से कोशिकाओं के साथ - उच्च विश्वास परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, हम कम से कम 3 प्रदर्शन की सलाह। मीटर पर निर्भर करता हैपरिवर्तन की agnitude, अधिक स्वतंत्र प्रयोगों की आवश्यकता हो सकती।

थोड़ा अलग सेल नंबर या लिपिड बूंदों के लिए सही करने के लिए मात्रात्मक एमएस डेटा को सामान्य के लिए, "प्रकाश" का पता लगाने के अनुपात सभी पहचान प्रोटीन की औसत के माध्यम से विभाजित करके, "भारी" पेप्टाइड्स, या इसके विपरीत से अधिक केंद्र बदली लेबलिंग की स्थिति में , के रूप में 25 का वर्णन किया। लिपिड बूंदों की राशि नमूने के बीच काफी अलग है, तो इस तरह के रूप में PLIN2 लिपिड छोटी बूंद मार्कर प्रोटीन, करने के लिए सामान्य, उचित हो सकता है। हम PLIN2 स्तर तक हमारे एमएस डेटा को सामान्य होने के बाद हम जब हम मंझला करने के लिए सामान्य रूप में इसी तरह के परिणाम लगता है (विश्लेषण दिखाया गया है)। ध्यान दें, सेल संस्कृति शर्तों हम प्रयोग के तहत, हम एचसीवी संक्रमण पर महत्वपूर्ण लिपिड छोटी बूंद संचय का पता नहीं लगा।

लिपिड बूंदों अन्य सेलुलर organelles, सबसे विशेष रूप माइटोकांड्रिया और ईआर के साथ निकट संपर्क में हैं। इसलिए, प्रोटीन fरॉम इन डिब्बों अलगाव के दौरान लिपिड बूंदों के साथ सह-fractionate कर सकते हैं। अगर इस तरह के एक "दूषित" प्रोटीन संक्रमण या उपचार के लिए प्रतिक्रिया में बहुतायत में अनछुए है, यह तुलनात्मक लिपिड छोटी बूंद proteome विश्लेषण प्रभावित नहीं करेगा। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि, कि कुछ परिस्थितियों में, लिपिड बूंदों और अन्य अंगों के बीच संपर्क बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, lipolytic शर्तों के तहत, mitochondrial प्रोटीन बेसल की स्थिति 26 की तुलना में lipolytically प्रेरित 3T3-एल 1 adipocytes से लिपिड छोटी बूंद भागों में उच्च आवृत्तियों पर पाया जाता है। उत्तेजित नए सिरे से lipogenesis, दूसरे हाथ पर, ईआर के साथ बढ़ाया संघ को जन्म दे सकता है। इन परिवर्तनों को तो विभिन्न उत्तेजनाओं से प्रेरित organelle बातचीत में परिवर्तन शुद्ध लिपिड छोटी बूंद स्थानीयकरण को प्रतिबिंबित करता है, भले ही नहीं प्रतिबिंबित और दिलचस्प हो सकता है।

हम एक व्यापक मात्रात्मक लिपिड छोटी बूंद proteom के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल कियाएचसीवी से संक्रमित, बनाम असंक्रमित नियंत्रण कक्षों की ई विश्लेषण एचसीवी संक्रमण के कारण अव्यवस्थाएं प्रकट करने के लिए और एचसीवी प्रतिकृति 21 के नियामकों की पहचान। hepatoma सेल लाइन Huh7.5 में, हम नियमित रूप से अप लिपिड छोटी बूंद अंशों भीतर 2,900 प्रोटीन, प्रत्येक प्रयोग में कई पेप्टाइड्स के साथ की पहचान 300 प्रोटीन की पहचान की ~ साथ। एचसीवी के साथ संक्रमण के बाद, हम दोनों भर्ती और मेजबान प्रोटीन की कमी मनाया। पहचान के रूप में अत्यधिक एचसीवी से संक्रमित कोशिकाओं के लिपिड बूंदों में समृद्ध कई प्रोटीन पहले से एचसीवी मेजबान कारकों के रूप में प्रकाशित किया गया है (जैसे, मृत बॉक्स प्रोटीन 1 और 3 (DDX1, DDX3) या इन्सुलिन जैसे विकास कारक द्वितीय mRNA बाध्यकारी प्रोटीन 1 ( IGF2BP1)), SILAC दृष्टिकोण 27, 28, 29 की विश्वसनीयता का संकेत है। इसके अलावा, भर्ती प्रोटीन अक्सर शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन के लिए एनोटेट, विषाणु आरएनए replic की तंग संघ पर प्रकाश डालालिपिड छोटी बूंद दशमलव वाले समझना परिसरों। इसके विपरीत, लिपिड बूंदों से समाप्त प्रोटीन मुख्य रूप से लिपिड चयापचय की प्रक्रिया के लिए एनोटेट कर रहे थे, यह दर्शाता है कि एचसीवी उनके सामान्य चयापचय विनियमन और समारोह से लिपिड बूंदों डिस्कनेक्ट करने के लिए प्रोटीन संरचना perturbs।

प्रोटोकॉल हम का वर्णन विभिन्न सेल लाइनों और संस्कृति की स्थिति के लिए सुधारने योग्य है और विभिन्न रोगज़नक़ों कि प्रतिकृति के लिए लिपिड बूंदों पर निर्भर के जीवन चक्र में लिपिड बूंदों के समारोह का गूढ़ रहस्य में मदद कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम JFH1 का निर्माण, T वकिटा (राष्ट्रीय संस्थान के लिए JC1 निर्माणों के लिए आर Bartenschlager (हीडलबर्ग विश्वविद्यालय), Huh7.5 कोशिकाओं के लिए मुख्यमंत्री चावल (रॉकफेलर विश्वविद्यालय), J मैक्लौचलन (चिकित्सा अनुसंधान परिषद विषाणु विज्ञान यूनिट) धन्यवाद संक्रामक रोग, जापान) JFH1 के लिए, और बी वेबस्टर और वकी ग्रीन (विषाणु विज्ञान के ग्लैडस्टोन संस्थान और इम्यूनोलॉजी) HCVcc संवाददाता निर्माणों के लिए। इस काम DFG से धन द्वारा समर्थित किया गया (एचई 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 और संस्थान 337 / 16-1 2013 (एचएस))। हैन्रिक पे्ट संस्थान, प्रायोगिक विषाणु विज्ञान के लिए लाइबनिट्स संस्थान नि: शुल्क और हैम्बर्ग के Hanseatic शहर और स्वास्थ्य संघीय मंत्रालय द्वारा समर्थित है। funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के लिए निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM Thermo Fisher 89983 
13C6 L-Arginine-HCl 50 mg Thermo Fisher 88210
Roti-Load 1 Roth GmbH K929.1
Roti-Blue 5x Concentrate Roth GmbH A152.2 
10x SDS-Tris-Glycine - Buffer Geyer Th. GmbH & Co.KG  A1415,0250 
GlutaMAX (100x) Life Technologies GmbH  350500038 
Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P4333-100ml 
DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline Sigma-Aldrich Chemie GmbH  D8537 
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich Chemie GmbH  T3924-100ML 
Sodium Chloride BioChemica AppliChem GmbH A1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbH A1086,5000A 
EDTA BioChemica AppliChem GmbH A1103,0250
Protease Inhibitor Cocktail 5 mL Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P8340-5ML 
D(+)-Sucrose BioChemica AppliChem GmbH A3935,1000
Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF AppliChem GmbH A0625
DC Protein Assay  Bio-Rad Laboratoris GmbH  500-0116 
Glycerol AppliChem GmbH 151339
SDS Ultrapure AppliChem GmbH A1112
Bromophenol blue AppliChem GmbH A2331
β-Mercaptoethanol  AppliChem GmbH A4338
Blasticidin Invivogen ant-bl-1 
Potassium Chloride  AppliChem GmbH A1039
Phenylmethanesulfonyl Fluoride  AppliChem GmbH A0999
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Chemie GmbH  221309
Dipotassium Hydrogenphosphate Sigma-Aldrich Chemie GmbH  P3786 
DTT  AppliChem GmbH A2948
NP-40 AppliChem A1694
TWEEN 20 AppliChem A4974
Nonfat dried milk powder AppliChem A0830
Anti-ADFP/ ADRP  abcam ab52355
M6PRB1/TIP47 100 µg abcam ab47639
Calreticulin, pAb 200 µg Enzo Life Science GmbH  ADI-SPA-600-F 
Anti-β-Tubulin  Sigma-Aldrich Chemie GmbH  T6074 200µl  
Ethanol absolute (EtOH) Geyer Th. GmbH & Co.KG  A3678,0250  
Anti-MnSOD Enzo Life Science GmbH  ADI-SOD-110-F
Anti-mouse HRP Thermo Fisher Pierce 32430
Anti-rabbit HRP Thermo Fisher  Pierce 32460
Amersham Hyperfilm ECL GE Healthcare 28906836
Lumi-Light Western Blotting Substrate Sigma-Aldrich Chemie GmbH  12015196001
96-Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One GmbH  655 180 
Terumo Syringe 1 mL Terumo SS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm  SARSTEDT  83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel Bio-Rad Laboratoris GmbH  456-9034 
6-Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One GmbH  657160 
Dishes Nunclon 150/20  Fisher Scientific GmbH  10098720 - 168381 
Cell Scraper neoLab Migge GmbH  C-8120 
Tube, 50 mL Greiner Bio-One GmbH  227261 
SafeSeal Tube RNase-free  SARSTEDT  72.706.400 
Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm Beckman Coulter GmbH  344062 
Suction Needles Transcodent 6482
Biosphere Fil. Tip 1000  SARSTEDT  70.762.211 
Biosphere Fil. Tip 200 SARSTEDT  70.760.211 
Biosphere Fil. Tip 10 SARSTEDT  70.1130.210 
Dounce Tissue Grinder Fisher Scientific GmbH  11883722
Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders Fisher Scientific GmbH  10389444
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL Eppendorf 5355 000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,  BioRad 165-8033
Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber BioRad 165-4110
PowerPac HC Power Supply Biorad 164-5052
Centrifuge  Eppendorf 5424R
Centrifuge  Eppendorf 5424
Optima L-90K Beckman Coulter GmbH  365670
SW 60 Ti Rotor Beckman Coulter GmbH  335649
Infinite M1000 PRO Tecan

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References

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जैव रसायन अंक 122 लिपिड छोटी बूंद लिपिड निकायों मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेल संस्कृति में अमीनो एसिड (SILAC) प्रोटीन मात्रा के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) वायरस के संक्रमण
मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए लिपिड बूंद अलगाव
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Rösch, K., Kwiatkowski, M., Schlüter, H., Herker, E. Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e55585, doi:10.3791/55585 (2017).

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