Summary
지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.
Abstract
지질 방울은 비리의 형태 형성의 추정되는 사이트로, 다른 병원균의 다양한 가장 눈에 띄게 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 복제에 중요합니다. 양적 지질 방울 프로테옴 분석에 지역화 또는 바이러스 감염과 같은 조건에서 지질 방울에서 변위 단백질을 식별 할 수 있습니다. 여기, 우리는 성공적으로 HCV 감염 다음과 같은 지질 방울 프로테옴의 변화를 특징 짓는 데 사용 된 프로토콜을 설명합니다. 우리는 세포 배양 (SILAC)에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨 사용하여 질량 분석에 의해 단백질을 정량하는 "무거운"아미노산 셀 중 하나 명 인구의 전체 프로테옴 레이블을 붙입니다. 도 1 및 저장성 완충액에 용해 기계적 : 지질 방울 분리를위한 두 개의 세포 집단 (즉, HCV 감염 / "광"아미노산 및 비감염 제어 / "무거운"아미노산 1) 혼합한다. 핵 및 세포 D를 제거한 후저속 원심 분리에 의해 ebris은 지질 방울 - 관련 단백질은 등장 완충액 세 세척 단계 다음에 두 단계 이후의 초 원심 분리에 의해 농축된다. 지질 방울 분획의 순도는 상이한 세포 내 구획을 인식하는 항체로 웨스턴 블 롯팅하여 분석한다. 지질 방울 - 관련 단백질 후 쿠마시 염색 하였다 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리된다. 트립신 소화 후에, 펩티드는 액체 크로마토 그래피 - 전기 분무 이온화 텐덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS / MS)에 의해 정량화된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 프로 또는 바이러스 호스트 요소를 나타낼 수 HCV 감염시 지질 방울에 모집 단백질을 확인했다. 우리의 방법은 병원체 감염, 환경 스트레스, 약물 치료와 같은 다른 세포 및 배양 조건의 종류에 적용될 수있다.
Introduction
지질 방울 높은 중성 지질 코어 이루어지는 동적 세포질 (핵) 세포 소기관이다 (중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)) 임베디드 단백질 1 인지질 단층에 의해 둘러싸인. 모든 종류의 세포는 지질 방울을 생산하지만, 크기, 지질 성분, 단백질 장식 다양합니다. 지질 소적 에너지와 막 전구체 저수지 또는 단백질 침착 물로서 작용 등 다양한 기능을 수행. 또한, 지질의 흡수를 통해, 그들은 신호 분자로서 세포에서 리포 독성 (lipotoxicity), 박리 보호 지질 및 단백질 분해하고 소포체 (ER) 스트레스 반응에 관여하는 2. 따라서, 단백질의 호스트 지질 방울에 결합하여 다른 세포 소기관과 함께 자신의 생성, 파괴, 인신 매매, 및 상호 작용을 제어합니다. 그 중 (PLIN1-5) 선의의 지질 방울 결합 단백질의 perilipin 가족F "> 3.
지질 생합성 액적 가능성 중성 지질 렌즈 최근 효모 4 좋게 가시화하는 처리를 형성 ER 상주 효소 막 이중층 내에 축적 중성 지질 합성을 촉매 소포체에서 시작한다. 굽힘 막과 높은 포스 폰산 및 디아 실 글리세롤의 수준은 다음 지질 액적 생성 (5)에 필요한 코어 중성 지질 및 인지질 차폐 동시로 합성 인지질 생합성에 관여하는 단백질을 유도하는 것으로 생각된다. 응급실에있는 횡단 도메인을 품고 효소는이 과정을 촉진. 큰 지질 방울에 확장은 양친 매성 나선 항구 따라서 지질 방울에 ER에서 여행 할 수 지질 합성 효소의 다른 클래스의 활동을 필요로한다. 지질 방울로부터 지질의 동원은 triglycerid의 지역의 활성화를 통해 발생E 및 디아 실 글리세롤 리파제는 트리글리세리드 지방 분해 효소 (ATGL) 및 호르몬 민감성 리파아제 (HSL) 또는 다량 및 microlipophagy autophagic 또는 상이한 경로에 의해 자식 작용은 6 매개 샤페론. 지질 방울 및 ER (베타 - 산화 및 지질 합성) 같은 미토콘드리아와 같은 다른 세포 소기관과 상호 작용하지만, (지질 합성과 단백질 밀수)도 리 소솜, 엔도 솜 및 세포 내 박테리아 (7)에 의해 유도 된 액포로. 실제로 박테리아, 바이러스, 심지어 기생충은 그들 HCV (8) 사이에 복제 및 지속성에 대한 지질 방울을 대상.
HCV 감염은 9 학년 당 약 50 만 명이 사망를 차지, 전 세계적으로 간 관련 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. HCV 감염의 진정한 수를 알 수 있지만, 최근의 추정치는 130 것을 제안 - 150,000,000명이 만성적으로 감염된다. 어떤 VACCIN 없습니다전자는 존재하지만, 최근에 승인 된 직동 항 바이러스 극적으로 표준 인터페론 기반 치료에 비해 치료 반응을 증가시킨다. 그러나 전 세계적으로 환자의 치료는 가능성으로 인해 새로운 치료제의 매우 높은 비용으로 제한됩니다. 모든 개인의 약 절반이 만성 지방간 질환 (지방간), 간세포의 지질 방울의 과도한 축적을 특징으로하는 조건을 개발 HCV에 감염. 흥미롭게도, 지질 방울도 추정되는 바이러스 성 조립 사이트 (10), (11)의 역할, HCV 복제 같은 중요한 세포 소기관을 나타났다.
HCV에 감염된 세포에서, 바이러스 단백질 코어 및 NS5A는 디아 실 글리세롤 아실 트랜스퍼 라제 1 (DGAT1)의 억제제로서, 중성 생합성에 따라 공정에서 지질 소적에 지역화 지질 방울과 후속 HCV 입자 제조 12 피킹 악영향 > 13, 14, 15. 또한, 코어 또는 NS5A 중의 지질 방울 - 결합 도메인의 돌연변이 HCV 조립체 (16), (17)을 억제. 코어 및 NS5A는 밀접하게 16 방울 지질과 관련된 세포막에, 다른 모든 바이러스 성 단백질뿐만 아니라 바이러스 성 RNA 복제 단지를 모집. 모든 바이러스 단백질의 공동 작업은 전염성 바이러스 자손 (10), (11)의 성공적인 생산을 위해 필요합니다. 구조적 단백질은 비리 온의 일부분이며, 비 구조 단백질은이 과정에 필요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 촉진한다. 흥미롭게도, 선의의 지질 방울 - 결합 단백질 PLIN3 / TIP47 모두의 HCV RNA 복제 및 비리 온 (18)의 릴리즈 19에 필요
여기서는 연관된 단백질의 정량적 질량 분석을위한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 지질 방울-fractionates 공동 효율적인 HCV 성숙 (21)에 요구되는 호스트 단백질로서 HCV 감염 동안 지질 방울 프로테옴의 큰 변화 및 식별 넥신 A3 알았다.
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Protocol
세포 배양에서 아미노산으로 안정 동위 원소 표지 (SILAC) 용 매체 1의 제조
주 : 여기에서, SILAC 단백질 정량 키트 - DMEM이 SILAC 표지에 사용 된 13 C 6 아르기닌 L 염산 50 mg의 보충. 투석 된 소 태아 혈청 (FCS)을 SILAC 단백질 정량 키트가 제공된다.
- DMEM 배지에서 각각 50 ㎖ 병을 제거하고 투석 된 FCS 50 mL를 첨가.
- 13 C 6 L 라이신 2HCl 50 mg의 배지 1 ㎖의 13 C 6 L 염산 아르기닌 50mg을 녹인다. 철저하게 혼합하고, DMEM + FCS 매체에 아미노산을 추가합니다.
- 1X 펜 / 연쇄상 구균 및 1X L 글루타민 대체를 추가합니다. 멸균 필터 0.45 μm의 필터를 사용하여 기록 매체. "무거운"SILAC 매체로 병 레이블.
- L- 아르기닌 염산 50 mg의 L- 라이신 2HCl-50를 사용하여 1.3 mg의 -은 "광"배지를 제조하기 위해 반복 단계 1.1. "같은 병 레이블광 "SILAC 매체.
2. SILAC 라벨링 및 아미노산 설립 제어
- 를 Trypsinize 세포 (1X 트립신 EDTA) 및 스플릿 1 × 배지 2 ㎖, 웰은 "무거운"SILAC 배지 하나는 "광"하나를 포함하는 6 웰 배양 접시에 2 웰에 5 개 Huh7.5 세포 SILAC 매체.
- 문화 적어도 6 통로 용 셀 (분할 비 : 1 : 6); 6 개 통로 후 "무거운"아미노산의 혼입이 95 % 이상이어야한다.
- 수확은 "무거운"1 × 106 세포 - 및 "라이트"라벨이 지정된 세포군 혼입 효능을 분석한다. 1X PBS에서 세포를 세척하고 160 XG에서 5 분, 4 ° C 원심 분리하여 세포 펠렛.
- MS 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 1X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충 된 50 mM 트리스 -HCl pH 7.4, 1 mM의 EDTA)을 150 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 30 분간 얼음에 세포를 배양한다. 를 Lyse는 C4 ℃에서 초음파 처리하여 학습 학생.
참고 : 다음 여기에 사용되는 초음파의 설정은 다음과 같습니다 타이머 개최; 출력 제어부, 8; 듀티 사이클이 80 %; 2 X 30 펄스. - 11,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거한다. 새로운 튜브로 상청액을 옮기고 세제 호환 단백질 분석하여 단백질 농도를 결정한다.
- 95 °에서 6X 샘플 완충액 (375 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 25.8 % 글리세롤, 123 ㎎ / ㎖ SDS, 청색 600 ㎍ / ㎖의 브로 모 페놀 60 μL / ㎖ β 머 캅토 에탄올), 종기 단백질 75 μg의 믹스 C 5 분, 약 1 시간 동안 완충액 180 V에서 (3.02 g / L 트리스 염기, 18.8 g / L 글리신, 1 g / L SDS)를 실행하거나 제조에 따른 SDS에서 SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리 '지시.
- 콜로이드 쿠마시 염색 액으로 겔을 전송. 각 레인에서 같은 단백질 밴드를 절제. 트립신 단백질을 소화하고 MS의 analysi 의해 혼입 효능을 분석S는, 22로 설명했다.
SILAC 표지 Huh7.5 세포의 3. 지질 방울 절연
- 셀들 중 하나 개 집단 감염 (즉, "빛"아미노산으로 표시된 것) (즉, JC1 NS5AB-mKO2-BSD가 MOI 1) 37 ℃에서 4 시간 동안 21 바와 같이 바이러스 축적량 배양하여 HCV 리포터 바이러스 .
참고 : JC1 NS5AB-mKO2-BSD (21) 이전에 설명, 중복 NS5A-NS5B 분열 사이트 간의 블라스트 저항 유전자 (BSD) 다음 감염률을 모니터링하는 형광 기자 (단량체 Kusabira 오렌지 2, mKO2)를 나르는 HCV 바이러스입니다, (23). HCV과 협력 BSL2 + (USA) 또는 S3 ** (독일) 바이오 안전성 수준 봉쇄과 실천이 필요합니다. 대신 HCV 감염의 세포가 다른 병원균에 감염 될 수있다. - HCV에 감염된 "빛"세포와 비감염 & #를 확장34]. 무거운 "세포 배양액의 계대 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 분취 량을 수정하고 21 바와 같이, 형광 마커 단백질의 유동 세포 계측법 (예 mKO2)하여 HCV 감염 비율을 결정하며 . JC1 NS5AB-mKO2-BSD의 HCV 균주를 사용하는 경우, HCV 양성 세포에 대해 선택하는 "광"배지에 10 ㎍ / ㎖의에 블라스트의 S를 추가 감염률 지질 방울 분리 주 대 90 % 이상이어야한다.
- 지질 액적 분리에 앞서 1 개 (D)은 PBS,를 Trypsinize "가벼운"및 "무거운"배지에 재현 탁하여 세포를 세척하고, 노이 바 우어 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. 시드 150 cm2로 세포 배양 접시에 각각의 인구의 7 × 106 세포. "빛"과 "무거운"세포 인구 당 적어도 5 개 요리를 준비합니다. 배양액 / 접시 O / N 30 ㎖의 세포.
- 매체를 제거하고 1X PBS로 세포를 씻어. 1 배에서 세포를 분리PBS는 셀 스크레이퍼를 사용하여.
- 노이 바 우어 카운팅 챔버를 이용하여 두 세포 집단을 카운트하고, 50 mL의 원심 분리 튜브에 동일 셀 번호 풀. 160 XG에서 5 분, 4 ° C 원심 분리하여 세포 펠렛.
- PBS를 제거하고 슈 크로스 완충액 (0.25 M 수 크로스, 1 mM의 EDTA, 1mM의 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일 보충)의 1 mL의 세포 펠렛을 재현 탁. 꽉 끼는 다운스 균질화하여 세포 현탁액을 옮기고 얼음 200 스트로크 용균.
참고 : 트리 판 블루 염색법을 사용하여 완전한 세포 용해를 확인합니다. - 1.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에 이동 해물 1000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 핵 및 세포 파편을 스핀.
- 원심 분리 후, 입력 제어 -20 ℃에서 이후 핵 분획을 25 μL (PNS)의 분취 량을 저장한다.
- 3 mL의 원심 분리 튜브 (11 X 60mm)의 하단에있는 PNS 분획의 나머지를 올려 놓고 ~ 지질 방울 세척 완충액 (오버레이와 4 ML의 TOT를AL) (50mM의 인산 칼륨 완충액 pH 7.4, 100 mM의 염화칼륨, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드).
- 100,000 XG에 2 시간, 4 ° C에 대한 원심 분리기. (- 지질 방울의 양에 따라 500 μL, 250)는 튜브의 상부로부터 절곡 무딘 캐뉼라를 사용하여 부동 지질 방울 분획 수확. 원심 분리 튜브 (11 X 60mm)의 지질 방울 분획 배치 지질 방울 세척 완충액 (~ 3.5 ㎖; 4 ㎖의 합계)를 오버레이하고, 원심 분리 단계를 반복한다.
- 튜브의 상부로부터 절곡 무딘 캐뉼라를 사용하여 부동 지질 방울 분획을 수확하여 새로운 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 지질 방울 옮긴다. 21,000 XG, 4 ℃에서 20 분 동안 지질 방울 세척 완충액 스핀 500 μL를 추가한다.
참고 : 지질 방울 버퍼의 상단에 떠있는 흰색 밴드로 나타납니다. - 겔 로딩 피펫 팁을 사용하는 직하 세척 완충액을 제거하고,이 세정 공정을 세 번 반복한다.
- 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 세척 완충액의 최종 제거한 후, NP-40 용해 완충액 10 μL (50 mM 트리스 -HCl, pH 7.4, 150 mM의 염화나트륨, 1 % NP-40 5 μL 지질 방울 분획 믹스 ) 프로테아제 억제제 칵테일 보충. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 샘플을 품어. 세제 호환 단백질 분석으로 단백질 수준을 결정하고; 단백질의 적어도 35 μg의 MS 분석은 필요하다.
- -20 ° C에서 지질 방울 분수를 저장합니다.
- 4X 로딩 염료와 지질 방울 분획의 해당 볼륨을 섞는다. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 품어. 5 분 동안 95 ° C에서 끓인다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리한다. 콜로이드 쿠마시 염색 액으로 겔을 전송. 겔로부터 모든 단백질 밴드를 절제. 트립신의 겔 소화 24 <후/ SUP> 시료를 증발시켜 0.1 % 포름산 그들을 용해. LC-MS / MS로 분석한다.
주 : 여기에서, LC-MS / MS는 극자 비행 시간 형 질량 분석계 (Q-TOF) 또는 선형 트랩 사중 극자 (LTQ) orbitrap 질량 분광기 분석을 수행 하였다. 두 장비는 나노 UPLC 시스템에 ESI 소스와 결합되었다. 데이터 분석 LC-MS / MS (21), (22)을 기술 된 바와 같이 수행 된 Q-TOF에 orbitrap과 질량 분석기에서 분석한다. 인간의 각질과 함께 샘플을 오염하지 않도록 상당한주의를 기울입니다. 항상 각질없는 피펫 팁 및 튜브를 사용합니다. 각질없는 화학 물질 층류 후드 버퍼를 준비합니다. 사용하기 전에 증류수와 에탄올 모든 표면 및 장치를 청소합니다. 항상 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오.
지질 방울 순도 4. 분석
- 지질 방울 분획 1 씩 희석 : 2 입력 분획 NP-40과 1시 10분리스 (단계 3.9 참조)버퍼이다. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 샘플을 품어. 세제 호환 단백질 분석과 단백질 수준을 결정합니다.
- 6X 샘플 완충액으로 단백질의 동일한 양을 혼합하고 감염성 물질로 작업하는 경우, 바이러스를 비활성화하는 얼음상에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다. SDS-PAGE로 진행하고 90 분 동안 80 V에서 탱크 블 롯팅에 의해 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 옮긴다.
주 : 완충액 (TBS-T (10 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 -20) 중 5 % 무 지방 건조 우유 분말) 블로킹 막을 차단 한 후, (지질 방울 마커에 대한 항체와 함께 배양 예 , PLIN1, PLIN2 또는 PLIN3)와 다른 세포 내 구획 (마커의 예 이차 HRP 결합 항체이어서 CALR, MnSOD 또는 튜 불린). 단백질의 검출을위한 화학 발광을 사용합니다.
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Representative Results
지질 방울 비리 어셈블리의 추정 사이트와 같은 HCV 감염에 매우 중요하지만, 형태 형성과 비리의 출구의 분자 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 이 과정에 관여하는 신규 한 호스트 종속 요소를 식별하기 위해 HCV에 감염된 세포를 21 (도 1a)의 양적 지질 방울 프로테옴 분석을 수행 하였다. 우리는 지질 소적의 정제를위한 프로토콜을 확립하고 일상적 지질 방울 결합 단백질 PLIN2 / ADRP 및 PLIN3 / TIP47과 미토콘드리아 용 마이크로 튜브에 대한 이러한 β-tubulin의 다른 세포 구획 마커의 고갈 MnSOD 강한 농축 검출 또는 ER (도 1B, C)에 대한 칼레 티 큘린 / calnexin. 우리는 동위 원소 라벨을 사용하여, 특별히 모집 확인 된 단백질을 안정적으로 Huh7.5 세포 (그림 1D)와 지질 방울 cofractionate 단백질의 목록을 컴파일또는 HCV 감염 세포 (도 1E)의 지질 소적 변위. 우리의 결과는 HCV는 정규 대사 기능 및 / 또는 규정에서 지질 방울을 끊 나타냅니다 및 추정 호스트 의존성 및 제한 요소를 식별합니다.
그림 1 : 실험의 (A) 방식. 나이브 Huh7.5 셀은 "무거운"아미노산 또는 "광"아미노산으로 표지 하였다. "빛"아미노산을 운반하는 세포는 HCV 기자 바이러스 (JC1 NS5AB-mKO2-BSD)에 감염되었다. "가벼운"및 "무거운"아미노산 표시된 집단을 혼합하고, 지질 방울은 SDS-PAGE에 의해 분리 된 두 개의 연속 초 원심 세 세정 단계에 의해 단리시키고, LC-ESI-MS / MS로 분석 하였다. ultracentrifugati 후 떠있는 하얀 지질 방울 부분 (빨간색 화살표)를 참고 세척에 미세 원심 분리 튜브이다. (B) 이후 핵 지질 방울 분획의 웨스턴 블롯 분석은 지질 방울 분획 지질 방울 마커 단백질의 농축 및 다른 세포 구획 마커의 고갈을 나타낸다. 이후 핵 상등액 (PNS) 및 SDS-PAGE에 의해 분리 된 지질 방울 분획 (C) 쿠마시 블루, 실버 염색. 실버 염색은 시각화를 위해 제공됩니다. (D) 펩티드 Huh7.5 세포의 지질 방울 분획에서 발견 된 단백질의 단백질의 비율에 따르면 수의 히트 맵 (컷오프 : ≥5 펩티드 및 ≥20 % 커버리지). (E)가 농축 히트 맵 또는 HCV 감염 후 지질 방울 - 관련 단백질을 고갈 묘사 (중앙값 1.5 배 컷오프로 정규화 * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). (21) 수정.등 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 우리는 바이러스 감염 등 다양한 배양 조건에서 지질 소적과 연관된 단백질의 농축 및 고갈 비교 정량 지질 방울 프로테옴 분석 지질 방울을 분리하는 프로토콜을 기술한다. 다른 방법으로, 프로테옴 분석 전체 피크 강도에 기초하여 라벨없는 정량화하여 수행 될 수있다. 이 메소드는 동적 범위 제한이 없으며 대사 문제를 피할 수있다. SILAC 접근법의 장점은 샘플 전에 지질 방울 분리를 풀링하고, 따라서 결과가 다이제스트, 샘플 준비의 오류와 무관하고, LC-MS / MS 분석이다. 우리는 매우 정량적 지질 방울 프로테옴 분석을 위해이 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
유도 또는 단백질의 발현을 억제, quantitativ 의해 발현 수준의 분석을 반영 할 수있는 보충 또는 MS 분석에서 관찰 지질 방울 - 관련 단백질의 고갈로E 및 RT-PCR (바람직) 웨스턴 블 롯팅을 의뢰한다. 웨스턴 블 롯팅 및 BODIPY 또는 LD540, 기재 (21)로서 그 얼룩 지질 방울 같은 지용성 염료로 면역 분석 하였다 지질 방울 분리 : 또한, 두 가지 방법이 지질 소적의 농축 또는 특정 단백질의 고갈을 확인하는데 사용될 수있다.
"무거운"아미노산 라벨이 단백질 발현 또는 지질 물방울 현지화에 영향을주지 않고 "빛"매체 환경 소스에서 단백질 오염 물질을 식별 할 수 있도록 교환 라벨 조건으로 실험을 수행합니다. 단백질 식별을위한 검색이 펩티드 및 단백질 수준 모두에서 0.01 잘못된 탐색 비율 (FDR)을 수행한다. 다른 구절과 다른 바이러스 재고 준비에서 세포와 4 개의 독립적 인 실험 - 높은 신뢰도의 결과를 보장하기 위해, 우리는 적어도 3을 수행하는 것이 좋습니다. 는 M에 따라변화의 agnitude는 더 독립적 인 실험이 필요할 수 있습니다.
정량적 MS 데이터를 정규화 식별 된 모든 단백질의 중앙값으로 나누어 교체 표시 상태에서, "중량"펩티드, 또는 그 반대를 통해 "빛"의 검출 비율 중심, 세포 수 또는 지질 방울 다소 차이를 보정 할 로 (25)를 설명했다. 지질 방울의 양이 샘플 사이 크게 다른 경우 등 PLIN2 같은 지질 방울 마커 단백질에 정상화 것이 바람직 할 수도있다. 우리가 PLIN2 수준으로 우리의 MS 데이터를 정상화 할 때, 우리는 우리가 중간에 정상화 때와 비슷한 결과를 찾을 수 (분석은 도시하지 않음). 참고로, 우리가 사용하는 세포 배양 조건에서, 우리는 HCV 감염시 중요한 지질 방울 축적을 감지하지 않습니다.
지질 방울은 다른 세포 소기관, 특히 미토콘드리아와 ER에 밀착 있습니다. 따라서, 단백질에서 F롬이 구획 분리하는 동안 지질 방울과 협력 분별 수 있습니다. 이러한 "오염 물질"단백질은 감염이나 치료에 대한 반응에 풍부하게 변경되지 않은 경우, 그것은 비교 지질 방울 프로테옴 분석에 영향을 미치지 않습니다. 어떤 상황에서, 지질 방울 및 다른 세포 소기관 사이의 접촉이 변경 될 수 있다는 점 주목해야합니다. 예를 들어, 지질 분해 조건 하에서, 미토콘드리아 단백질은 기저 상태 (26)에 비해 자극 lipolytically 3T3-L1 지방 세포에서 지질 소적 분획 높은 주파수에서 검출된다. 자극 새로운 지방 생성, 다른 한편으로는, ER와 향상된 관계로 이어질 수 있습니다. 이러한 변화는 순수한 지질 방울 현지화의 반사 아니더라도, 다양한 자극에 의해 유도 된 세포 기관의 상호 작용의 변화를 반영하고 흥미로운 수 있습니다.
우리는 광범위한 양적 지질 방울 proteom이 프로토콜을 사용HCV 감염, 대 감염되지 않은 대조군 세포의 전자 분석은 HCV 감염에 의한 섭동을 공개하고 HCV 복제 (21)의 규제를 식별 할 수 있습니다. 간암 세포주 Huh7.5에서, 우리는 일상적으로 ~와 함께, 지질 방울 분수 내에서 2,900 단백질 각 실험에서 여러 펩티드로 식별 300 개 단백질을 확인했다. HCV 감염에 따라, 우리는 모두 모집 및 호스트 단백질의 고갈을 관찰했다. 높은 HCV에 감염된 세포의 지질 방울에 풍부한 것으로 확인 여러 단백질은 이전에 (HCV 호스트 요소로 게시 예를 들어, DEAD 상자 단백질 1과 3 (DDX1, DDX3) 또는 인슐린 유사 성장 인자 II 단백질 1 (mRNA에 결합 된 IGF2BP1))에 접근 SILAC 27, 28, 29의 신뢰도를 나타낸다. 또한, 고용 된 단백질은 종종 바이러스 RNA의 replic의 긴밀한 관계를 강조하는, RNA 결합 단백질에 대한 주석되고지질 방울 분수와 ATION 단지. 반면, 지질 소적 120408 단백질은 주로 HCV가 정상적인 대사 조절 및 기능에서 지질 소적을 분리하는 단백질 조성물을 교란 나타내는 지질 대사에 대한 주석 하였다.
우리가 설명하는 프로토콜은 서로 다른 세포주 및 배양 조건을 수정할 수있는과 복제 지질 방울에 따라 다른 병원균의 라이프 사이클에 지질 방울의 기능을 해독에 도움이 될 수.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리의 JFH1 구성, T. 와키 타 (국립 연구소의 JC1 구조에 대한 R. 문헌 [Bartenschlager (하이델베르크 대학)의 Huh7.5 세포에 대한 CM 라이스 (록펠러 대학교), J 맥로치랜 (의학 연구위원회 (Medical Research Council) 바이러스학 단위) 감사합니다 HCVcc 리포터 작 제물에 대한 감염증의 JFH1 일본) 및 B. 웹스터 WC 및 그린 (바이러스학 글래드스턴 연구소 면역학). 이 작업은 DFG 자금 지원 하였다 (HE 6889 / 2-1 (EH), 337 / 15-1 2,013 INST 및 이달 337 / 16-1 2,013 (HS)). 하인리히 Pette 연구소, 실험 바이러스학에 대한 라이프니츠 연구소는 자유와 한자 동맹의 도시인 함부르크와 건강의 연방 교육부에 의해 지원됩니다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
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