Summary
gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.
Abstract
gotitas de lípidos son vitales para la replicación de una variedad de diferentes agentes patógenos, lo más prominente el virus de la hepatitis C (HCV), como el sitio putativo de la morfogénesis del virión. el análisis del proteoma gotas de lípidos cuantitativa se puede utilizar para identificar las proteínas que se localizan en o desplazadas de gotitas de lípidos bajo condiciones tales como las infecciones de virus. A continuación, se describe un protocolo que ha sido utilizado con éxito para caracterizar los cambios en el proteoma gotas de lípidos después de la infección por el VHC. Utilizamos isótopos estables Etiquetado con Aminoácidos en cultivo celular (SILAC) y por lo tanto etiquetar el proteoma completo de una población de células con aminoácidos "pesados" para cuantificar las proteínas por espectrometría de masas. Para el aislamiento de gotitas de lípidos, las dos poblaciones de células (es decir, aminoácidos infectados por el VHC / "luz" y ácidos no infectadas de control / "pesados" amino) se mezclan 1: 1 y se lisaron mecánicamente en tampón hipotónico. Después de retirar los núcleos y células debris por centrifugación a baja velocidad, las proteínas de gotitas asociada a lípidos se enriquecen mediante dos etapas de ultracentrifugación posteriores seguido de tres etapas de lavado en tampón isotónico. La pureza de las fracciones de gotas de lípidos se analizó por transferencia de Western con anticuerpos que reconocen diferentes compartimentos subcelulares. proteínas de gotitas asociada a lípidos se separan luego mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido de tinción con Coomassie. Después de digestión tríptica, los péptidos se cuantifican mediante espectrometría de masas de cromatografía de ionización por electrospray en tándem líquido (LC-ESI-MS / MS). Usando este método, se identificaron proteínas reclutados a gotitas de lípidos tras la infección HCV que podrían representar factores del huésped pro- o antivirales. Nuestro método se puede aplicar a una variedad de diferentes células y condiciones de cultivo, tales como la infección con patógenos, estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.
Introduction
Gotitas de lípidos son altamente orgánulos celulares citoplasmáticos (y nucleares) dinámicas compuestas de un núcleo de lípidos neutros (triglicéridos (TG) y de éster de colesterol (CE)) cerrado por una monocapa de fosfolípidos con proteínas incrustadas 1. Todos los tipos de células producen gotitas de lípidos, pero que varían en tamaño, composición lipídica, y la decoración de la proteína. gotitas de lípidos cumplen diversas funciones, incluyendo servir como depósitos de energía y precursores de membrana o como depósitos de proteínas. Además, a través de la absorción de lípidos, que protegen las células de la lipotoxicidad, lípidos de liberación como moléculas de señalización, y están involucrados en la degradación de proteínas y las respuestas al estrés de retículo endoplásmico (ER) 2. Como tal, una gran cantidad de proteínas se unen a las gotas de lípidos y gobernar su generación, la degradación, la trata, y la interacción con otros organelos. Entre ellos se encuentran la familia de proteínas de unión perilipina gotas de lípidos de buena fe (PLIN1-5)f "> 3.
Lipid gotita biogénesis probable comienza en el ER, donde las enzimas ER-residente catalizan la síntesis de lípidos neutros que se acumulan dentro de la bicapa de la membrana, formando una lente de lípidos neutros, un proceso que recientemente se visualizó muy bien en la levadura 4. Membrana de flexión y los niveles elevados de ácido y diacilglicerol fosfatídicos son entonces pensaron para atraer a las proteínas implicadas en la biosíntesis de fosfolípidos, como la síntesis simultánea de los lípidos neutros de núcleo y los fosfolípidos de blindaje que se requiere para la generación de gotas de lípidos 5. Las enzimas que albergan dominios transmembrana que residen en el ER catalizan este proceso. Expansión a grandes gotas de lípidos requiere la actividad de una clase diferente de enzimas lípidos sintetizar que albergan una hélice anfipática y por lo tanto puede viajar desde el ER a gotitas de lípidos. La movilización de lípidos de gotitas de lípidos se produce a través de la activación local del triglicéridoE y diacilglicerol lipasa lipasas adiposo triglicéridos (ATGL) y lipasa sensible a hormonas (HSL) o por diferentes vías autofágicas, tales como macro- y microlipophagy o autofagia 6 chaperona-mediadas. Gotitas de lípidos interactúan con otros orgánulos celulares, tales como las mitocondrias (por beta-oxidación y la síntesis de lípidos) y ER (para la síntesis de lípidos y el tráfico de proteínas), pero también con los lisosomas, endosomas, y las vacuolas inducidos por bacterias intracelulares 7. De hecho bacterias, virus, e incluso parásitos diana gotitas de lípidos para la replicación y la persistencia, entre ellos HCV 8.
Infección por el VHC es una de las principales causas de morbilidad relacionada con el hígado y mortalidad en todo el mundo, lo que representa aproximadamente 0,5 millones de muertes al año 9. El número real de infecciones por VHC es desconocida, pero las estimaciones recientes sugieren que 130 - 150 millones de personas están infectadas crónicamente. sin vaccine existe, pero los antivirales de acción directa-aprobados recientemente aumentar de forma espectacular las respuestas terapéuticas en comparación con la terapia estándar con interferón. Sin embargo, en todo el mundo, el tratamiento de los pacientes probablemente será restringido debido a los costos extremadamente altos de las nuevas terapias. Alrededor de la mitad de todos los individuos infectados crónicamente con VHC desarrollan enfermedad de hígado graso (esteatosis), una condición caracterizada por la acumulación excesiva de gotitas de lípidos en los hepatocitos. Curiosamente, gotitas de lípidos también surgieron orgánulos celulares como vitales para la replicación del VHC, que sirve putativamente como sitios de ensamblaje viral 10, 11.
En las células infectadas con el VHC, el núcleo de la proteína viral y NS5A localizar a gotitas de lípidos en un proceso que depende de la biosíntesis de triglicéridos, como inhibidores de la diacilglicerol aciltransferasa-1 (DGAT1) poner en peligro el tráfico a gotas de lípidos y producción de partículas posterior HCV 12 >, 13, 14, 15. Además, las mutaciones en los dominios de unión de gotitas de lípidos de cualquiera de núcleo o NS5A suprimen ensamblaje del VHC 16, 17. Core y NS5A reclutan entonces todas las otras proteínas virales, así como los complejos de replicación de ARN viral, a las membranas estrechamente asociados con lípidos gotitas 16. Se requiere una acción concertada de todas las proteínas virales para la producción exitosa de la progenie viral infecciosa 10, 11. Las proteínas estructurales son parte de los viriones, y las proteínas no estructurales promueven las interacciones proteína-proteína necesarios para este proceso. Curiosamente, se requiere la bona fide la unión a lípidos gotita-PLIN3 proteína / TIP47 tanto para la replicación del ARN del VHC y la liberación de viriones de 18, 19
A continuación, describimos un método para aislar las gotitas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas. Usando este método, hemos encontrado cambios profundos en el proteoma gotas de lípidos durante la infección por VHC y identificado anexina A3 como una proteína de acogida que la co-fracciona con gotitas de lípidos y es necesario para la maduración HCV eficiente 21.
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Protocol
1. Preparación de los medios de comunicación para isótopos estables Etiquetado con Aminoácidos en cultivo celular (SILAC)
NOTA: Aquí, la proteína SILAC cuantificación Kit - DMEM suplementado con 50 mg de 13 C 6 L-Arginina-HCl fue utilizado para el etiquetado de SILAC. El dializado suero de ternero fetal (FCS) se proporciona con el kit de cuantificación de proteínas SILAC.
- Eliminar 50 ml de cada botella de medio DMEM y añadir 50 ml de FCS dializado.
- Disolver 50 mg de 13 C 6 L-lisina-2HCl y 50 mg de 13 C 6 L-Arginina-HCl en 1 ml de medio. Mezclar bien y añadir los aminoácidos para el medio DMEM + FCS.
- Añadir 1x penicilina / estreptomicina y 1x sustituto de L-glutamina. Estéril-filtro el medio utilizando un filtro de 0,45! M. Etiquetar la botella como medio de SILAC "pesado".
- Para preparar el medio "luz", repita los pasos 1.1 a 1.3 usando 50 mg de L-Arginina-HCl y 50 mg de L-lisina-2HCl. Etiquetar la botella como ""Medio SILAC luz.
2. SILAC-etiquetado y Amino Acid Control de Incorporación
- Se tripsinizan las células (1x tripsina-EDTA) y división 1 x 10 5 Huh7.5 células en 2 pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos que contiene 2 ml de medio, uno bien con el medio SILAC "pesado" y una con la "luz" medio SILAC.
- Cultivar las células durante al menos 6 pasos (relación de división: 1: 6); después de 6 pasos, la incorporación de los aminoácidos "pesados" debe ser más de 95%.
- Cosecha 1 x 10 6 células de la "pesada" - población de células marcada con y "luz" para analizar la eficacia de incorporación. Lavar las células en 1x PBS y sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 160 xg y 4 ° C.
- Resuspender los sedimentos celulares en 150 l de MS-tampón (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, y EDTA 1 mM suplementado con 1x cóctel inhibidor de proteasa) y se incuban las células en hielo durante 30 min. Lisar las cells por sonicación a 4 ° C.
NOTA: Los siguientes son los ajustes de sonicación utilizados aquí: temporizador, mantenga; control de salida, 8; ciclo de trabajo, 80%; y 2 x 30 pulsos. - Eliminar los restos celulares por centrifugación durante 10 min a 11.000 xg y 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y determinar la concentración de proteína con un ensayo de proteínas con capacidad para un detergente.
- Mezclar 75 g de proteína con tampón de muestra 6x (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% de glicerol, 123 mg / ml de SDS, 600 g / bromofenol ml azul, y 60! L / ml β-mercaptoetanol), hervir a 95 ° C durante 5 min, y se separan las proteínas por SDS-PAGE en SDS tampón de ejecución (/ base 3,02 g L Tris, 18,8 g / l de glicina, y 1 g / L SDS) a 180 V durante aproximadamente 1 h o de acuerdo con los fabricantes "instrucciones.
- Transferir el gel en una solución coloidal tinción Coomassie. Escindir la misma banda de proteína de cada carril. Digerir las proteínas con tripsina y analizar la eficacia incorporación por MS analysis, como se describe 22.
3. Aislamiento de los lípidos de la gotita de células Huh7.5 SILAC marcado
- Infect una población de células (es decir, los marcados con ácidos "ligeros" amino) con un reportero virus VHC mediante la incubación con reservas de virus (por ejemplo, Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) durante 4 horas a 37 ° C, como se describe 21 .
NOTA: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD es un virus HCV que lleva un reportero de fluorescencia (monomérica Kusabira Naranja 2, mKO2) para controlar las tasas de infección, seguida por una resistencia a blasticidina Gen (BSD) entre un sitio de escisión NS5A-NS5B duplicada, se ha descrito previamente 21, 23. Trabaja con VHC requiere BSL2 + (EE.UU.) o S3 ** (Alemania) y las prácticas de contención de nivel de bioseguridad. En lugar de la infección por el VHC, las células pueden ser infectados con diferentes patógenos. - Expandir las células infectadas con el VHC "luz" y no infectado & #34;. Células pesados" Durante el passaging de las culturas, fijar una alícuota con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS y se determinan las tasas de infección por HCV mediante citometría de flujo de la proteína marcadora fluorescente (por ejemplo, mKO2), como se describe 21; la las tasas de infección debe ser superior a 90% para los lípidos gotita aislamiento NOTA:. Si se utiliza el NS5AB-mKO2-BSD cepa de HCV Jc1, añadir 10 g / ml de blasticidina S al medio de "luz" para seleccionar las células positivos para el VHC.
- 1 d antes del aislamiento gotas de lípidos, lavar las células con PBS, trypsinize, resuspender en "luz" y "pesado" medio y el recuento de las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Seed 7 x 10 6 células de cada población en un 150 cm placa de cultivo de 2 células. Preparar al menos 5 platos por población de células "luz" y "pesado". Cultivar las células en 30 ml de medio / placa O / N.
- Retirar el medio y lavar las células en 1x PBS. Desprender las células en 1xPBS usando un rascador de células.
- Contar ambas poblaciones celulares utilizando una cámara de recuento Neubauer y agrupar los números de células iguales en un tubo de centrífuga de 50 ml. Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 160 xg y 4 ° C.
- Retire el PBS y resuspender el sedimento celular en 1 ml de tampón de sacarosa (0,25 M de sacarosa, EDTA 1 mM, y DTT 1 mM, suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa). Transferir la suspensión celular a un homogeneizador Dounce de ajuste hermético y lisar las células con 200 golpes sobre hielo.
NOTA: Confirmar la lisis celular completa mediante tinción con azul de tripano. - Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar los núcleos y los residuos celulares durante 10 min a 1.000 xg y 4 ° C.
- Después de la centrifugación, almacenar una parte alícuota de 25 l de la fracción post-nuclear (PNS) a -20 ° C como un control de entrada.
- Coloque el resto de la fracción de PNS en el fondo del tubo de centrífuga (11 x 60 mm) y de superposición con tampón de lípidos gotita de lavado (~ 3 ml; 4 ml total) (50 mM de tampón de fosfato de potasio pH 7,4, 100 mM de cloruro de potasio, EDTA 1 mM, y fluoruro de fenilmetanosulfonilo 1 mM).
- Centrifugar durante 2 horas a 100.000 xg y 4 ° C. Cosecha de la fracción de gotas de lípidos flotante utilizando un doblado, cánula roma de la parte superior del tubo (aproximadamente 250 - 500 l, dependiendo de la cantidad de gotitas de lípidos). Coloque la fracción de gotitas de lípidos en un tubo de centrífuga (11 x 60 mm), superposición con tampón de lípidos gotita de lavado (~ 3,5 ml; 4 ml total), y repetir el paso de centrifugación.
- Cosecha de la fracción de gotas de lípidos flotante utilizando un doblado, cánula roma de la parte superior del tubo y transferir las gotitas de lípidos a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 500! L de tampón de lavado gotas de lípidos y centrifugado durante 20 min a 21.000 xg y 4 ° C.
NOTA: las gotas de lípidos aparecen como una banda blanca que flota en la parte superior de la memoria intermedia. - Eliminar el tampón de lavado subyacente usando una punta de pipeta de carga de gel y repetir esta etapa de lavado tres veces.
- Después de la eliminación final del tampón de lavado usando una punta de pipeta de carga de gel, mezclar 5 l de fracciones de gotitas de lípidos con 10! L de tampón de lisis NP-40 (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, y 1% de NP-40 , suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa). Incubar la muestra en hielo durante 1 h para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso. Determinar el nivel de proteína con un ensayo de proteínas con capacidad para un detergente; al menos 35 g de proteína se necesita para MS-análisis.
- Almacenar las fracciones de gotitas de lípidos a -20 ° C.
- Mezclar el volumen correspondiente de la fracción de gotas de lípidos con colorante de carga de 4x. Incubar en hielo durante 1 h para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso. Hervir a 95 ° C durante 5 min.
- Separar las proteínas utilizando SDS-PAGE según el protocolo de los fabricantes. Transferir el gel en una solución coloidal tinción Coomassie. Extirpar todas las bandas de proteínas desde el gel. Después de la digestión tríptica en gel 24 </ Sup>, evaporar las muestras y disolverlos en ácido fórmico al 0,1%. Analizar por LC-MS / MS.
NOTA: En este caso, LC-MS / MS se realizó en un espectrómetro de masas de cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF) o en una trampa lineal cuadrupolo (LTQ) orbitrap espectrómetro de masas. Ambos instrumentos se acoplaron con un ESI-fuente a un sistema nano-UPLC. Análisis de datos y análisis LC-MS / MS en la Q-TOF y en el espectrómetro de masas orbitrap se realizaron como se ha descrito 21, 22. Tenga mucho cuidado de no contaminar la muestra con queratina humana. Utilice siempre tubos y puntas de pipeta libre de queratina. Preparar tampones bajo la campana de flujo laminar con productos químicos libre de queratina. Antes de uso, limpiar todas las superficies y dispositivos con agua destilada y etanol. Siempre use guantes y una bata de laboratorio.
4. Análisis de los lípidos de la gotita Pureza
- Diluir alícuotas de fracciones gotas de lípidos 1: 2 y fracciones de entrada (véase el paso 3.9) 01:10 con NP-40 lyses buffer. Se incuban las muestras en hielo durante 1 h para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso. Determinar el nivel de proteína con un ensayo de proteínas con capacidad para un detergente.
- Mezcle cantidades iguales de proteína con tampón de muestra 6x e incubar las muestras en hielo durante 1 h para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso. Proceder con SDS-PAGE y transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia de tanque a 80 V durante 90 min.
NOTA: Después de bloquear la membrana en tampón de bloqueo (5% seca sin grasa leche en polvo en TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 150 mM, y 0,05% de Tween 20)), se incuba con anticuerpos dirigidos contra marcadores de gotitas de lípidos (por ejemplo, , PLIN1, PLIN2, o PLIN3) y los marcadores de otros compartimentos subcelulares (por ejemplo, CALR, MnSOD, o tubulina), seguido de anticuerpos HRP acoplados secundarias. Utilice quimioluminiscencia para la detección de proteínas.
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Representative Results
gotitas de lípidos son vitales para la infección por HCV como los sitios putativos de ensamblaje del virión, pero los mecanismos moleculares de la morfogénesis y la salida de los viriones son en gran parte desconocidos. Para identificar nuevos factores de dependencia de acogida que participen en ese proceso, se realizó el análisis del proteoma gotas de lípidos cuantitativa de células infectados por el VHC 21 (Figura 1A). Hemos establecido un protocolo para la purificación de gotas de lípidos y de manera rutinaria detectó un fuerte enriquecimiento de la unión a lípidos gotita-proteínas PLIN2 / ADRP y PLIN3 / TIP47 y un agotamiento de los marcadores de otros compartimentos celulares, tales como β-tubulina de los microtúbulos, MnSOD para las mitocondrias, o calreticulina / calnexina para el ER (Figura 1B, C). Hemos recopilado una lista de proteínas que cofractionate fiable con gotitas de lípidos en las células Huh7.5 (Figura 1D) y, utilizando el etiquetado de isótopos, proteínas identificadas que son reclutados específicamenteo desplazados de gotas de lípidos en las células infectadas por el VHC (Figura 1E). Nuestros resultados indican que el VHC desconecta gotitas de lípidos de su función metabólica normal y / o la regulación e identificar factores de dependencia de acogida y de restricción putativos.
Figura 1: (A) Esquema del experimento. células Huh7.5 Naïve se marcaron con ácidos "pesado" de aminoácido o aminoácidos "ligeros". Células que portan aminoácidos "luz" se infectaron con un virus reportero HCV (Jc1 NS5AB-mKO2-BSD). poblaciones de ácidos marcado con amino "luz" y "pesados" se mezclaron, y las gotas de lípidos se aislaron por dos subsiguiente ultracentrifugación y tres etapas de lavado, separadas por SDS-PAGE, y se analizaron por LC-ESI-MS / MS. Tenga en cuenta la fracción flotante blanco gotas de lípidos (flecha roja) después ultracentrifugati en y de lavado en tubos de microcentrífuga. (B) Análisis de transferencia Western de fracciones de gotas post-nucleares y lípidos muestra un enriquecimiento de proteínas marcadoras de gotas de lípidos en las fracciones de gotas de lípidos y un agotamiento de los marcadores de otros compartimentos celulares. (C) azul de Coomassie y tinción de plata de sobrenadante post-nuclear (PNS) y las fracciones de gotas de lípidos separadas por SDS-PAGE. La tinción con plata se presenta sólo para visualización. (D) Mapa de calor del número de péptidos y porcentaje de cobertura de proteína de las proteínas identificadas en las fracciones de gotitas de lípidos de las células Huh7.5 (valor de corte: ≥5 péptidos y cobertura ≥20%). (E) Heatmap que representa de enriquecido o empobrecido proteínas de gotitas asociada a lípidos después de la infección con HCV (normalizado a la mediana, de corte de 1,5 veces, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Modificado de 21.et = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, se describe un protocolo para aislar gotitas de lípidos para el análisis de gotas de lípidos proteoma cuantitativo para comparar el enriquecimiento y agotamiento de proteínas asociadas con gotitas de lípidos bajo diversas condiciones de cultivo, tales como infecciones virales. Como un método alternativo, el análisis del proteoma se puede realizar con cuantificaciones libre de etiqueta basado en intensidades total de los picos. Este método no tiene ninguna limitación de la gama dinámica y evita problemas metabólicos. La ventaja del enfoque de SILAC es que las muestras se agrupan antes del aislamiento gotas de lípidos, y por lo tanto los resultados son independientes de errores en la preparación de muestras, digerir, y el análisis LC-MS / MS. Recomendamos altamente este enfoque para el análisis del proteoma de gotas de lípidos cuantitativa.
A medida que el enriquecimiento o el agotamiento de las proteínas de gotitas asociada lípidos observados en el análisis MS podría reflejar una inducción o represión de la expresión de proteínas, el análisis de los niveles de expresión por quantitative RT-PCR y (preferiblemente) se aconseja el Western Blot. Además, dos métodos pueden ser utilizados para verificar el enriquecimiento o el agotamiento de proteínas específicas en gotitas de lípidos: aislamiento gotas de lípidos seguido de transferencia Western y análisis de inmunofluorescencia con colorantes lipófilos, como BODIPY o LD540, que las gotitas de mancha de lípidos como se describe 21.
Realizar experimentos con condiciones de etiquetado intercambiadas para asegurar que el etiquetado con aminoácidos "pesados" no influye en la expresión de proteínas o lípidos localización de gotas y para identificar contaminantes proteínas de las fuentes ambientales medio "luz" y. Para la identificación de proteínas, la búsqueda debe realizarse con una tasa de falsos descubrimiento (FDR) de 0,01 en tanto el péptido y el nivel de proteína. Para asegurar resultados de alta confianza, se aconseja realizar al menos 3 - 4 experimentos independientes, con células de diferentes pasajes y diferentes preparaciones de virus de valores. Dependiendo de la magnitud del cambio, podría ser necesario más experimentos independientes.
Para la normalización de los datos cuantitativos MS para corregir el número de células o gotitas de lípidos ligeramente diferente, centrar los ratios de detección de la "luz" sobre los péptidos "pesados", o viceversa, en condiciones de etiquetado intercambiadas dividiendo a través de la mediana de todas las proteínas identificadas , como se describe 25. Si la cantidad de gotitas de lípidos difiere significativamente entre las muestras, normalizando a proteínas marcadoras de gotitas de lípidos, tales como PLIN2, podría ser aconsejable. Cuando se normaliza nuestros datos de MS a niveles PLIN2, encontramos resultados similares a cuando se normaliza a la mediana (el análisis no se muestra). Es de destacar que, bajo las condiciones de cultivo celular que usamos, no detectamos significativa acumulación de gotas de lípidos después de la infección por VHC.
gotitas de lípidos están en estrecho contacto con otros orgánulos celulares, lo más notablemente las mitocondrias y la ER. Por lo tanto, las proteínas From estos compartimentos pueden co-fraccionar con gotitas de lípidos durante el aislamiento. Si una proteína tal "contaminante" es inalterada en abundancia en respuesta a la infección o el tratamiento, no se afecta el análisis de lípidos gotita proteoma comparativa. Hay que señalar, sin embargo, que en algunas circunstancias, el contacto entre las gotitas de lípidos y otros orgánulos podría ser alterado. Por ejemplo, en condiciones de acción lipolítica, las proteínas mitocondriales se detectan a frecuencias más altas en las fracciones de gotas de lípidos de adipocitos 3T3-L1 acción lipolítica estimulados en comparación con condiciones basales 26. Estimulado lipogénesis de novo, por otro lado, podría conducir a la asociación mejorada con el ER. Estos cambios a continuación reflejan cambios en la interacción orgánulo inducidos por los diversos estímulos y podrían ser interesantes, aunque no reflectante de la localización de gotas de lípidos puro.
Se utilizó este protocolo para una extensa proteom gotas de lípidos cuantitativaanálisis e de, células de control frente a no infectados infectados por el VHC para revelar las perturbaciones causadas por la infección por VHC y para identificar reguladores de la replicación del VHC 21. En la línea celular de hepatoma Huh7.5, que habitualmente identificado hasta 2.900 proteínas dentro de fracciones de gotitas de lípidos, con ~ 300 proteínas identificadas con múltiples péptidos en cada experimento. Después de la infección por el VHC, se observó la contratación tanto y el agotamiento de las proteínas del huésped. Varias proteínas identificadas como altamente enriquecido en gotitas de lípidos de las células infectadas con el VHC se han publicado anteriormente como factores del huésped HCV (por ejemplo, caja de proteínas DEAD 1 y 3 (DDX1, DDX3) o factor-II de crecimiento similar a la insulina proteína 1 (ARNm vinculante IGF2BP1)), lo que indica la fiabilidad del enfoque SILAC 27, 28, 29. Además, las proteínas son a menudo reclutados anotados para las proteínas de unión a ARN, destacando la estrecha asociación de la replic RNA viralcomplejos ación con fracciones de gotitas de lípidos. En contraste, las proteínas empobrecido de gotitas de lípidos fueron anotados principalmente para los procesos metabólicos de lípidos, lo que indica que el VHC perturba la composición de proteínas para desconectar las gotitas de lípidos de su regulación metabólica normal y la función.
El protocolo se describe es modificable a diferentes líneas celulares y condiciones de cultivo y podría ayudar en el desciframiento de la función de gotitas de lípidos en el ciclo de vida de los diferentes patógenos que dependen de gotitas de lípidos para la replicación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a R. Bartenschlager (Universidad de Heidelberg) para las construcciones JC1, CM Arroz (Universidad de Rockefeller) para las células Huh7.5, J. McLauchlan (Unidad de Virología del Medical Research Council) para la construcción, T. Wakita (Instituto Nacional de JFH1 Enfermedades Infecciosas, Japón) para la JFH1, y B. Webster y WC Greene (Instituto Gladstone de Virología e Inmunología) para las construcciones de reportero HCVcc. Este trabajo fue apoyado por fondos de la DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, y INST 337 / 16-1 2013 (HS)). El Instituto Heinrich Pette, Instituto Leibniz de Virología Experimental es apoyado por la Ciudad Libre y Hanseática de Hamburgo y el Ministerio Federal de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentrate | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| Anti-β-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| Ethanol absolute (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo Syringe 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
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