Optisk kohærens tomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Summary

Dette manuskript beskriver en protokol for i vivo billeddannelse af musen nethinden med høj opløsning spektrale domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT). Det fokuserer på retinal ganglion celler (RGC) i regionen peripapillary, med flere scanning og kvantificere tilgange beskrevet.

Abstract

Strukturelle forandringer i nethinden er almindelige manifestationer af oftalmologiske sygdomme. Optisk kohærens tomografi (OCT) gør det muligt for deres identifikation i vivo— hurtigt, gentagne gange og med en høj opløsning. Denne protokol beskriver OCT imaging i mus nethinden som et kraftfuldt værktøj til at studere optic neuropatier (OPN). OCT-systemet er et interferometri-baseret, ikke-invasiv alternativ til fælles slagtningen histologiske assays. Det giver en hurtig og præcis vurdering af retinale tykkelse, giver mulighed for at spore ændringer, såsom retinal udtynding eller fortykkelse. Vi præsenterer den billedbehandling proces og analyse med eksempel på linjen Opa1^delTTAG mus. Tre typer af scanninger er foreslået, med to kvantificering metoder: standard og hjemmelavet calipre. Sidstnævnte er bedst for brug på peripapillary nethinden under radial scanninger; at være mere præcis, er at foretrække, at analysere tyndere strukturer. Alle tilgange beskrevet her er designet til retinal ganglion celler (RGC) men er let at tilpasse til andre cellepopulationer. Afslutningsvis OLT er effektiv i mus model fænotyper og har potentiale til at blive brugt for pålidelig evaluering i terapeutiske indgreb.

Introduction

OCT er et diagnosticeringsværktøj, der letter gennemgangen af retinale strukturer¹, herunder synsnerven hoved (ONH). Gennem årene er det blevet en pålidelig indikator for sygdomsprogression i mennesker^2,3, samt i gnavere^4,5. Det bruger interferometri for at oprette tværsnit billeder af nethinden lag på 2 µm aksial beslutning. Det inderste lag er det retinale nerve fiber lag (RNFL), indeholdende RGC axoner, som er efterfulgt af ganglion cellelag (GCL), der indeholder for det meste RGC organer. Næste er den inderste plexiform lag (IPL), hvor RGC dendritter mødes bipolar, vandret og amacrine celle axoner. Disse sammen med vandrette celler, danne de indre nukleare lag (INL), og deres fremspring forbinde med fotoreceptor axoner i den ydre plexiform lag (OPL). Dette er efterfulgt af den ydre nukleare lag (ger), med fotoreceptor celle organer, og er adskilt fra fotoreceptor laget af den ydre begrænsende membran (OLM), også kaldet den indre segment/ydre segment (IS / OS) lag. Endelig er de sidste observerbare lag i mus nethinden den retinale pigment epitel (ÅV) og årehinden (C). RNFL alene er normalt også tynd skal måles i mus; således er analysere RNFL/GCL i stedet at foretrække^4,5. En anden mulighed er GC komplekse lag, der indeholder de sidstnævnte ud over IPL, gør det tykkere og dermed endnu nemmere at måle på OCT scanner⁴. Derfor, OCT kan give indsigt i de patologiske status af nethinden, såsom i OPNs.

Alternativt, tykkelsen af musen nethinden er ofte analyseres med slagtningen histologi. Dog, denne teknik ansigter begrænsninger med hensyn til væv samling, fiksering, skæring, farvning, montering, etc. derfor nogle defekter, såsom subtile tykkelse ændringer, ikke kan registreres. Endelig, da den samme mus ikke kan testes på flere tid peger, antallet af dyr pr. studere meget stigninger, i modsætning til i OLT 's. Alt i alt, ikke-invasiv, høj opløsning, mulighed for gentagelse, tid overvågning i time og brugervenligheden af OCT teknologi gør det den foretrukne metode i retinal sygdom undersøgelser.

Musemodeller bruges til at identificere gendefekter og at belyse molekylære mekanismer bag retinopathies⁶. OPN er en form for retinopati med betydelige skader på synsnerven (på), som består af cirka 1,2 millioner RGC axoner. OPN kan være fokuseret på ON eller kan være sekundært til andre sygdomme, medfødte eller ikke⁷, fører til visuelle felt tab og senere, blindhed. Karakteristiske træk ved OPN er RGC tab og på skader, der kan observeres i menneskelige OLT som RNFL og GCL udtynding^2,3. I mellemtiden, OPN Patofysiologi er stadig dårligt forstået, og dermed behovet for at teste mus nethinder forbliver.

Dette manuskript beskriver imaging og kvantificering af retinale lagtykkelse, ved hjælp af eksemplet med Opa1^delTTAG mus linje^8,9, en model af dominerende optic atrofi (DOA)¹⁰. For at vurdere RGC Patofysiologi, var radial, rektangulære og ringformede scanninger kvantificeret. Dette blev gjort med standard calipre leveres af OCT software eller med en hjemmelavet makro udviklet til en open source billed oparbejdelse program. Standard calipre er vanskeligt at manipulere og ofte tykkere end RNFL/GCL, mens de hjemmelavede calipre er nem at bruge, reproducere og mere præcis. Makroen udfører en måling for et automatisk detekterede lag, i 5 point og på faste holdninger på begge sider af ONH i peripapillary-regionen. Målet med præsenteres protokollen er at beskrive OCT scan erhvervelse for at angive retinal positionering, med fokus på RGCs.

Protocol

eksperimentel protokollen blev godkendt af Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Frankrig), er i overensstemmelse med de europæiske direktiver, og brug af dyr i oftalmologiske forskning i overensstemmelse med sætningen ARVO. Det blev udført under aftalen af Languedoc Roussillon Comity af etik i dyre eksperimenter (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. opsætning af udstyr og Pre-tænkelig forberedelse

NOTE: her, OCT blev udført på mus nethinder bruger spektrale domain (SD) oftalmologiske imaging system ( figur 1A). SD-OCT apparatet består af en base og en dyr imaging mount (AIM) med en gnaver justering fase (RAS) ( figur 1B). Basen omfatter computeren, OCT motor, SD-okt sonden og mus-specifik linse. Sonden er monteret på den målsætning, der omfatter Z-oversætter. RAS bruges til musen positionsbestemmelse tak til tabellen med X - og Y-oversætteren, kassette, der kan drejes og drejes, og linjen flytbare bid med næse band. Softwaren, der leveres af producenten giver mulighed for erhvervelse og analyse af OCT filer, selv om sidstnævnte kan også gøres med en open-source image behandlingsprogram.

1. Fast placere sonden i målet.
2. Tilsluttes sonden mus-specifik linse.
3. Justere indstillingerne reference arm for specifikke objektivet (her, magt på 086 og stilling på 964).
4. Sikre at mus-specifik linse er tilstrækkelig afstand fra kassetten, vedhæfte baren bite næsen bandet på kassetten.
   Bemærk: Afstanden mellem linsen og kassetten kan justeres med Z-oversætter skruen, placeret på bagsiden af målet. Næse band er et kommercielt tilgængelige elastik, og dens spænding skal justeres afhængigt af størrelsen af musen.
5. Tænd strømforsyningen (nederste højre hjørne af vognen), og derefter computeren.
6. At lancere billedbehandlingsprogram, dobbeltklik på den relevante genvej på skærmen.
   Bemærk: Dette afhænger af hvilken type linse; her, med musen nethinden.
7. Opret en ny klinisk undersøgelse og tilføje de ønskede protokoller. Ellers skal du bruge den eksisterende kliniske undersøgelse og/eller protokoller.
   1. Tilføj en ny undersøgelse ved at vælge den " studere NameŔ " IDŔ " behandling Arm specifikationer " (her, " Uncategorized "); og foruddefinerede " Skan protokoller ", hvis de findes.
8. Vælg en " censur " i den " kliniske undersøgelse " afsnit.
   Bemærk: For en ny " censur ", gå til " Setup eksaminatorer & læger " til at definere det.
9. Tilføj en ny Patient i patienten/eksamen sektion ved at klikke på Tilføj patienten, at indtaste den " ID ", " navnet ", " efternavn ", " sex ", og " fødselsdato " (valgfri).
   Bemærk: Gør dette lige før test hver mus, hvis mere bekvem. Sørg for, at ID er længere end 10 tegn. For musen, brydningsfejl for begge øjne er 0 og aksial længde er 23,0.
10. Klik på " tilføje eksamen " og vælg det ønskede " protokol " ved at tilføje " Preset scanner " fra listen, begyndende med øjet, der vil blive målt første (her, det højre øje), eller ved at tilpasse scanninger.
11. Tilpasses en skanne, enten bruge en eksisterende scanning som en skabelon og redigere den, eller oprette den fra bunden gennem den " tilføje brugerdefineret scanning " indstilling. Når du har tilføjet alle scanninger til listen, definere en ny protokol bruger den " Enter " nye protokolnavn " indstilling (OS: oculus uhyggelige, venstre øje; OD: oculus dexter, højre øje).
    Bemærk: Her, protokollen indebærer tre scanninger: (i) en radial scanning med en 1,4 mm diameter, 0 mm vandrette og lodrette forskydninger, 1.000 linjer af A-scanninger/B-scan, 100 B-scanninger/volumen, 1 frame/B-scan, 80 linjer af inaktive A-scanninger/B-scan og 1 bind; (ii) en rektangulær scanning med en 1,4-mm længde og bredde, 0° vinkel, 0 mm vandrette og lodrette forskydninger, 1.000 linjer af A-scanninger/B-scan, 100 B-scanninger, 1 frame/B-scan, 80 linjer af inaktive A-scanninger/B-scan og 1 bind; og (iii) en ringformet scanning, med en 0,4-mm minimum og 0,6 mm maksimale diameter, 0 mm vandrette og lodrette forskydninger, 1.000 linjer af A-scanninger/B-scan, 3 B-scanninger/volumen, 48 frames/B-scan, 80 linjer af inaktive A-scanninger/B-scan og 1 bind.

2. Musen forberedelse

1. øje dilatation og immobilisering
   1. mindst 15 min før dataopsamling, indgyde 10% phenylephrin øjendråber ind i musen øjnene, fjerne overskydende og indgyde 0,5% tropicamid øjendråber.
      Bemærk: Den første dilatation kan gøres på én gang for alle de mus, der vil blive testet i sessionen. Sørg for, at væsker har stuetemperatur.
   2. Umiddelbart efter inducerende generel anæstesi (trin 2.2), administrere 0,4% Oxybuprocain hydrochlorid øjendråber, at holde dem på plads for 3 s bedøver og immobilisere øjne. Bagefter tørres af dråberne og Gentag instillation af 10% phenylephrin og 0,5% tropicamid til at fastslå, at øjnene er godt udspilede.
      Bemærk: Sørg for at væsker har stuetemperatur og at musen ikke sluge Oxybuprocain.
2. Generel anæstesi
   1. forberede et bedøvelsesmiddel løsning af ketamin (20 mg/mL) og xylazin (1,17 mg/mL) i saltvand. Opbevares ved 4 ° C i højst 2 uger.
   2. Ca. 5 min. før testning, intraperitoneal indsprøjtes 5-10 µL af bedøvelsesmiddel løsning pr. 1 g af body mass, afhængig af alder og størrelse af musen.
      Bemærk: Unge og/eller tynd mus behov mindre bedøvelsesmiddel, tager mindre tid til bedøver, men også vække hurtigere. Her, 8 µL/g (160 mg/kg af ketamin, 9,33 mg/kg af xylazin).
   3. Valgfrit, smøre øjnene med viskøse øjendråber eller en oftalmologiske gel til at undgå cornea tørhed.

3. Musen positionering

1. smøre øjnene med tyktflydende glykol-baseret øje dråber til at give hornhinde hydrering.
   Bemærk: Hvis øjne virke tørre under eksamen, ansøge igen Øjendråberne.
2. Wrap musen i en ark af kirurgisk gaze til at holde det varmt.
3. Ved hjælp af en svamp eller bomuld væge, Påfør et tyndt lag af en oftalmologiske gel med 0,3% hypromellose på hvert øje, for at minimere lys brydning, undgå opaciteter og sikre hornhinde hydrering. Mens du gør det, flytte øjenvipper og whiskers afsat.
4. Placer musen i kassette, med hovedet lige og pegende fremad.
5. Forsigtigt åbne bid baren klemme og Placer baren i munden; brug næsen bandet til at sikre positionen.
   Bemærk: Sikre, at bid bar midt i kassetten.
6. Sted en bomuld roll under højre (venstre) side, hvis højre (venstre) øjet er ved at blive testet.
7. Samtidig med at de clip-on sigter tip om mus-specifik linse, bringe det mod øjet af roterende Z-oversætter skrue mod uret.
8. Af roterende og swiveling kassetten og ved at dreje bid bar og X-oversætter skruer, pre-indstille placeringen af musen; Målet er at have højre øje ser direkte ind i linsen og dermed tilpasse de optiske akser i øjnene og linsen.
   Bemærk: Hvis musen er for høj eller for lav, Y-oversætter skruen bør anvendes først.
9. Vælg den første scanning i den " eksamen ", klik på " Start sigter ", og foretage yderligere manuelle justeringer for retinal imaging.
   1. Ved hjælp af Z-oversætter skruen, flytte nethinden vertikalt i venstre panel ( figur 2, vandret B-scan justering) og vandret på rhøjre panel ( figur 2, lodrette B-scan justering).
   2. Roterer kassette for at bringe ONH i højre panel ved at flytte ONH op eller ned. Brug bid bar skrue til at glatte nethinden på højre panel. Swivel kassette for at placere ONH i midten af panelet til venstre.
   3. Bruge X-oversætter skruen til niveau nethinden på panelet til venstre. Holde i sindet hver modulator, store funktion yderligere justere placeringen af nethinden til at centralisere ONH.
      Bemærk: Brug Y-oversætter skrue til at flytte ONH op og ned på det højre panel, hvis nødvendigt. Holdning kan raffineres til enhver tid mellem scanninger.

4. SD-okt Imaging ONH og nethinden

1. når indhold med tilpasningerne, skal du klikke på " Start Snapshot " at begynde SD-okt scanning.
   1. Hvis der ikke kræves en 3D imaging, fjerne markeringen af indstillingen OCU.
2. Gemme skanne og betænkning.
3. Fortsæt med de næste scanninger.
4. Til billede det andet øje, efter tilbagetrækningskraften linsen, drej kassetten i overensstemmelse hermed og gentage trin 3,6-4,3.

5. Erhvervelse færdiggørelse

1. Hvornår købet er afsluttet, fjerne musen fra kassetten, anvende oftalmologiske gel med 0,3% hypromellose til hvert øje, og Placer musen på en varme plade til at vågne op.
2. Efter den sidste erhvervelse, lukke software og Sluk computeren og OCT maskine (levering afbryderknappen).
3. Rense kassette med desinfektionsmiddel.

6. Analyse

1. til retinal lag tykkelse måling, bruge automatiserede segmentering software leveret af fabrikanten.
   1. Klik på den " patienten ", vælge den ønskede " eksamen " fra så liste, og klik på den " anmeldelse eksamen " indstilling.
   2. Indlæse de ønskede OCT data på OCT software ved at højreklikke på mappeikonet i den ønskede scan.
   3. Højre klik på B-scan; konfigurere calipre ved at aktivere op til 10 måling calipre; og angive deres navne, vinkler og farver.
   4. At vælge den ønskede caliper ved at højreklikke på B-scan; placere det i overensstemmelse hermed på nethinden for måling.
      Bemærk: For scanninger centreret om ONH, indstille 5 calipre på hver side af det, lige langt fra hinanden. For peripapillary analysen, Sørg for at caliper ikke er placeret for langt fra ONH. For radial scanning, analysere 10 billeder pr scan, der blev valgt af OCT software. Deres numre kan findes i den " rapporter " mappe.
   5. Gemme resultaterne til analyse i et regnearksprogram ved at højreklikke på B-scan og klikke på " gemme resultaterne ".
      Bemærk: Resultaterne kan findes i samme mappe som den scanning data.
2. Alternativt kan du anvende makroen hjemmelavet caliper " Mr nethinden værktøj ", udviklet til et open source billede behandlingsprogram (se tabel materialer).
   1. Sørg for, at den " Mr nethinden værktøj " og den " ændre afsnit af polygonværktøjet " makroer er aktive. Indlæse billedet. Klik på m-knappen for at starte målingen.
      Bemærk: Makroen automatisk opretter en 0,2 mm lange måling kassette på begge sider af ONH. Hver kassette indeholder 5 målepunkter, der fungerer som calipre. Deres sideleje er uforanderlig og er tilpasset til peripapilla i de radiale scanninger. Den vandrette placering af kassetter er foruddefineret for at måle RNFL/GCL tykkelse, men det er let kan ændres til at måle GC komplekse lag i stedet. Hvis scanningskvalitet er dårlig, den vandrette placering skal justeres, eller billedet skal udelukkes fra analysen.
   2. For vandret justering, klik på knappen e. I den nyåbnede " ROI Manager " vindue, Vælg den første kassette.
   3. Klik på den blå polygon-knappen og justere placeringen af den første kassette ved at klikke på grænsen af det målte lag i billedet.
   4. Repeat for anden kassette ved først at vælge det i den " ROI Manager "-vinduet og derefter klikke på den passende billede. Klik på knappen r at måler igen. Se resultaterne i den " målinger " vindue.
      Bemærk: Resultaterne kan kopieres til et regnearksprogram på ethvert tidspunkt. De indeholder følgende værdier for højre kassette (r), venstre kassette (l) og total: Intden - integreret tæthed i kassette; Område: område af målingen i mm ²; Len: længden af caliper i kassette, i mm; Middelværdi: betyde intensitet af signalet i kassette; og Std: standard fejl af den gennemsnitlige intensitet af signalet.
   5. Fortsæt med det næste billede.
   6. Yderligere analysere data i et regnearksprogram.
      Bemærk: For at finde den gennemsnitlige tykkelse af lag, tage ti Len værdier.

Representative Results

SD-okt-teknologi gør det muligt for retinal imagining og tykkelse analyse, der er sammenlignelig med histologi, men er hurtigere og mere detaljeret (figur 3). Som præsenteret med vildtype C57Bl/6 mus, selv om kvaliteten af en SD-okt-scanning (figur 3A, højre) er ikke så god som et billede af en retinal tværsnit (figur 3A, venstre), det visualiserer flere lag (fx OLM). Desuden, det tager kun ca. 40 min., herunder mus forberedelse, versus dage eller uger for histologiske analyse. Endelig, det ikke kræver behandling og farvning, såsom haematoxylin, eosin og safran, som kan skade væv og forårsage indsamling af fejlagtige oplysninger. Retinal lagene let målelige i OLT omfatter RNFL/GCL, IPL, INL, OPL, ger, IS / OS, ÅV og C (figur 3B), derfor giver mulighed for en kompleks undersøgelse af hele nethinden. Som sådan, afspejler retinal strukturændringer udvikling af sygdom. I tilfælde af OPNs gælder dette for RGCs og videre, og dermed den RNFL/GCL og IPL.

DOA er en af de mest almindelige OPNs og er karakteriseret ved RGC degeneration og tab af RNFL¹¹. På grund af mutationer i OPA1 gen¹²fører det til synshandicap og blindhed. Ved hjælp af Opa1^delTTAG musemodel, der bærer den menneskelige tilbagevendende c.2708delTTAG mutation, blev det opdaget, at Opa1 haplo-insufficiens hindrer vision i en sex-afhængig måde^8,9. Dette blev fastsat på grundlag af OCT målinger af retinale tykkelse, som viste en progressiv fortykkelse af GC komplekse lag (figur 4A) og peripapillary RNFL (figur 4B, 4 C) i Opa1^+/- hunner. I disse eksperimenter, blev beregninger udført med de standard calipre for rektangulære scanninger og med en open source billedbehandling program for de ringformede scanninger. For radial scanninger, som ofte er af en lavere kvalitet og producere et minimum af 10 udskriftsbilleder pr. nethinden for analyse, en hjemmelavet makro blev udviklet. En sammenligning af de standard og hjemmelavet calipre (figur 4D) viste en markant lavere tykkelse på RNFL/GCL og GC komplekse lag målt med sidstnævnte. Dette skyldes, at de standard calipre er meget tykkere og mere vanskeligt at placere på grænsen af lag. Derfor er det bedst at undgå at bruge de standard calipre for tynde lag, især på radial scanninger.

For at opsummere, SD-OLT giver mulighed for musen visuelle fænotyper, der kan gentages på tværs af flere tidspunkter. Dog skal OCT scanningstype og måle metode tilpasses til de undersøgte sygdom, og dermed den retinale lag pågældende. Ikke desto mindre giver OCT tilstrækkelige oplysninger til at identificere fejl i retinal struktur. Men dette skal yderligere analyseres med en anden metode til at give en komplet forståelse af de underliggende mekanismer.

Figur 1: SD-okt oftalmologiske Imaging System. (A) oversigt over base og mål-RAS dele af enheden SD-okt. (B) oversigt over komponenterne mål-RAS. A: computer, B: strømforsyning, C: OCT motor reference arm, D: SD-okt sonde, E: mus-specifik linse, F: Z-oversætter, G: mål-RAS tabel, H: Y-oversætter, I: kassette (rotator), J: bid bar, K-næse band, L: kassette swivel, M: X-Oversætter og N: sigter tip. Denne figute er farvekodede som i figur 2, med ikke-modulatorer af retinale position markeret med lyserødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: placering nethinden. Vandret (venstre) og lodrette (højre) visning af B-scan justering. Pile svarer til bevægelser induceret af de farvekodede modulatorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: retinale lag. (A) vildtype musen nethinden histologi efter haematoxylin, eosin, og safran farvning (venstre) og SD-okt (højre); skalalinjen: 50 µm. (B) Retinal tykkelsesmålinger for 3 måneder gamle vildtype mus; n = 14, mener ± SEM, skalalinjen: 50 µm. GC: ganglion celle, RNFL/GCL: retinale nerve fiber lag/ganglion cellelag, IPL: inderste plexiform lag, INL: nukleare inderst, OPL: ydre plexiform lag, ger.: nukleare yderlag, IS / OS: fotoreceptor indre segmenter/ydre segmenter, ÅV: retinale pigment epitel og C: årehinden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: eksemplarisk SD-okt målinger. (A) GC komplekse lagtykkelse i rektangulære scanninger centreret om ONH, målt med de standard calipre; Opa1^delTTAG mus linje, n = 4, mener ± SEM, ** p < 0,01 vurderet med Student's t-test. (B) Peripapillary RNFL i SD-oktober (C) Peripapillary RNFL tykkelse i ringformede scanninger, bestemt som RNFL område beregning pr. felt; Opa1^delTTAG hunmus, n = 5-11, mener ± SEM, * p < 0,05 vurderet med Student's t-test. (D) RNFL/GCL og GC komplekse lagtykkelse i radial scanninger, målt med de standard eller hjemmelavet calipre for 3 eller 10 scanninger, henholdsvis; vildtype mus, n = 8, mener ± SEM, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vurderet med Student's t-test. RNFL/GCL - retinal nerve fiber lag/ganglion cellelag, GC: ganglion celler. Tal A-C tilpasset fra Sarzi et al. ⁹. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

OCT system, en non-invasiv i vivo billeddannelse metode, giver høj opløsning retinal section-lignende scanninger. Herigennem, dens største fordel er dens potentiale for detaljeret analyse, med den vidunderlige mulighed for at omsætte protokoller rutinemæssigt anvendes på mennesker til musemodeller.

I eksemplet af Opa1^delTTAG mutant mus resultater SD-okt viste en stigning på RNFL og GC komplekse lagtykkelse, hvilket gav mulighed for yderligere udforskning af DOA Patofysiologi⁹. Det ville ikke have været muligt udelukkende med histologiske analyse. I sammenligning giver histologi ikke mulighed for at visualisere hele nethinden, i modsætning til ringformede eller radiale OCT scanninger. Desuden er det mere tidskrævende og dyrt, i betragtning af det øgede antal dyr i studier med flere tidspunkter. Faktisk banede SD-okt vejen at anklage en ny retinal celletype i DOA, Müller celle⁹. Dette skete på trods af, at hverken encellede opløsning eller specifikke celle identifikationer er muligt med systemet. Tværtimod, er den tykkelse-fokuseret og/eller generelle tilstand-fokuserede analyse af regionen peripapillary stort set nok til at opdage cellulær forringelse. Yderligere undersøgelser med histologi kan derefter gennemføres med en klar idé om, hvad man skal kigge efter. Samme metode kan derfor også anvendes til evaluering i terapeutiske indgreb til at forhindre eller bremse retinal degeneration.

Yderligere at forbedre nytten i OLT, hjemmelavet calipre blev udviklet og havde en meget højere præcision end standard dem. Selv om standarden er tykkere end RNFL/GCL, bruge nogle hold den alligevel, men for større lag¹³. Her, fokuseret vi den sammenlignende analyse på RGCs i 10 radial scanninger pr. nethinden, alle i regionen peripapillary. RNFL alene var ikke målbare på de radiale scanninger enten måde. Dette lag var for tynde og vage; Derfor, RNFL/GCL og GC komplekse lag blev målt i stedet. På samme tid lykkedes det os i måling af RNFL ved hjælp af ringformede scanninger, som viste sig gavnlig for musen fænotyper. Pålidelighed kan dog være kontroversielle. I alle disse tilgange blev den kritiske trin center scanninger på ONH og visualisere nethinden uden skygger og opaciteter. Førstnævnte kan nemt justeres ved at følge trinene i protokollen med hensyn til placering af nethinden. Sidstnævnte afhænger transmittans af hornhinden og den krystallinske. For eksempel, hvis den oftalmologiske gel er fordelt ujævnt, scanningen er sløret og nethinden vises bøjet. For at rette dette, ville det være tilstrækkeligt at korrekt ansøge igen gel. Hvis den krystallinske er uigennemsigtig, er scanningen mørke eller ufuldstændige. Løsningen ville være at gentage scanningen en anden dag, hvis gennemsigtigheden af den krystallinske returnerer. En anden mulig årsag til en dårlig kvalitet scanning er tilstedeværelsen af hindringer såsom whiskers eller øjenvipper. Disse kan let fjernes ved at tilsidesætte og anvende lidt af den oftalmologiske gel til at holde dem på plads. Andre analytiske tilgange, der adskiller sig med hensyn til udstyrstype, scanningstype, vinkel og andre parametre findes så godt og har varierende antal analyserede billeder. Dette skal betragtes som hvis resultatet kvalitet er stadig ikke tilfredsstillende. For eksempel tog Liu et al. radial scanninger på flere vinkler¹³, i forhold til vores radial scanninger på kun én rapportering lidt tykkere lag. Ikke desto mindre er OCT erhvervelse og analytiske tilgange, der foreslås i dette håndskrift egnet til at analysere RGCs i peripapillary mus nethinden.

Afslutningsvis, er OCT en teknologi med stort potentiale. Det giver mulighed for påvisning af subtile ændringer i de retinale struktur – herunder RGCs, især med hensyn til OPNs — og viser sig uundværlig til vision videnskab. Derfor er præsenteres protokollen praktisk for OPN musen model fænotyper, såvel som for vurderingen af nye behandlingsformer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3" x 3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0.9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant