Summary
Bu el yazması ile yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) fare retinanın vivo içinde görüntüleme için bir protokol açıklar. Retina ganglion hücrelerinin (RGC) peripapillary bölgede çeşitli tarama ve açıklanan yaklaşımlar miktarının üzerinde duruluyor.
Abstract
Yapısal değişiklikler retina göz hastalıkları ortak belirtileri vardır. Optik Koherens tomografi (OCT) sağlar onların kimlik vivo içinde— hızlı, sürekli ve yüksek çözünürlükte. Bu iletişim kuralı fare retina OCT görüntülemede optik neuropathies (OPN) eğitim için güçlü bir araç olarak açıklar. OCT sistem ortak post mortem histolojik deneyleri Interferometry tabanlı, non-invaziv bir alternatiftir. Retina kalınlığı, retina incelme veya kalınlaşma gibi değişiklikleri, izleme imkanı sağlayan hızlı ve doğru bir değerlendirmesini sağlar. Biz Opa1delTTAG fare çizgi örnekle görüntüleme işlemi ve analiz mevcut. İnceden inceye gözden geçirmek üç tür önerilen, iki miktar yöntemi ile: Standart ve ev yapımı Çap pergeli. İkinci Radyal taramalar sırasında peripapillary retina üzerinde kullanım için en iyisidir; daha kesin olarak, ince yapıları analiz etmek için tercih edilir. Burada açıklanan tüm yaklaşımlar retina ganglion hücrelerinin (RGC) için tasarlanmış ama diğer hücre popülasyonlarının kolayca uyarlanabilir. Sonuç olarak, OCT fare modeli fenotipleme etkilidir ve tedavi müdahaleler güvenilir değerlendirme için kullanılacak potansiyeline sahiptir.
Introduction
OCT retina yapıları1optik sinir başı (ONH) de dahil olmak üzere, incelenmesi kolaylaştıran bir tanı aracıdır. Yıllar boyunca bu hastalık progresyon insanlar2,3, hem de kemirgen4,5güvenilir bir göstergesi haline gelmiştir. 2-µm Aksiyel çözünürlükte retina katmanları kesitsel görüntüler oluşturmak için Interferometry kullanır. Çoğunlukla RGC organları içeren ganglion hücre katmanı tarafından (un), takip RGC akson, içeren retina Sinir lifi Katmanı (RNFL), en içteki katmanıdır. Sonraki iç Pleksiform tabaka (IPL), RGC dendrites İki kutuplu, yatay ve amacrine hücre aksonlar buluştuğu olduğunu. Bunlar, yatay hücresi ile birlikte iç nükleer tabaka (INL) formu, ve onların çıkıntılar photoreceptor akson dış Pleksiform tabaka (OPL) içinde bağlantı. Bu photoreceptor hücre organları ile dış nükleer tabaka (yalnız), arkasından ve photoreceptor katmandan iç segment/dış kesimi olarak da adlandırılan dış sınırlayıcı membran tarafından (OLM), ayrılmış (IS / OS) katmanı. Son olarak, son gözlemlenebilir katmanlar halinde fare retina retina pigment epiteli (RPE) ve (C) koroid vardır. Yalnız RNFL normal farelerde ölçülecek çok ince; Böylece, RNFL/un analiz yerine tercih4,5' tir. Başka bir olasılık ikinci IPL ek olarak içeren GC karmaşık katmanı, kalın ve böylece daha kolay hale OCT üzerinde ölçmek için4tarar. Sonuç olarak, OCT içinde OPNs gibi retina, patolojik durumunu içgörü sağlayabilir.
Alternatif olarak, fare retina kalınlığı genellikle post mortem Histoloji ile analiz edilir. Ancak, bu tekniği yüzler sınırlamalar doku koleksiyonu, fiksasyon, kesme, Boyama, montaj, vb dolayısıyla, ince kalınlık değişiklikler gibi bazı kusurları ile ilgili tespit edilemez. Son olarak, çünkü aynı fare, birkaç zaman sınanamıyor puan, hayvan sayısı büyük ölçüde artar, aksine OCT için çalışma. Sonuçta, yineleme için invasiveness olmayan, yüksek çözünürlüklü, olasılık, zaman zaman ve rahatlık-in kullanma OCT teknoloji izleme yapmak yönteminin seçimi retina hastalığı çalışmalarda.
Fare modelleri gen hataları tanımlamak ve moleküler mekanizmaları retinopathies6temel aydınlatmak için kullanılır. OPN bir Optik siniri önemli hasar ile retinopati (açık), yaklaşık 1.2 milyon RGC akson yapıldığı şeklidir. OPN ON odaklı veya görme alanı kaybı ve daha sonra körlük önde gelen diğer bozuklukları, doğuştan veya değil7, ikincil olabilir. RGC kaybı OPN karakteristik özellikleri vardır ve hasar, hangi insan Ekim RNFL ve2,3inceltme un görülebilir. Bu arada, OPN Patofizyoloji hala kötü anlaşılmaktadır ve dolayısıyla fare retina test gerek kalır.
Bu el yazması görüntüleme ve retina tabakası kalınlığı, Opa1delTTAG fare çizgi8,9, baskın optik Atrofi (DOA)10modeli örneği kullanarak miktar açıklanmaktadır. RGC patofizyolojisi değerlendirmek için Radyal, dikdörtgen ve Anüler taramalar sayısal. Bu standart kaliperler OCT yazılım tarafından sağlanan veya bir açık kaynak görüntü işleme programı için geliştirilmiş bir ev yapımı makro ile yapıldı. Standart Çap pergeli işlemek zor ve kez daha kalın RNFL/un, daha kolay, tekrarlanabilir ve daha kesin ev yapımı Kumpasları iken. Makroyu otomatik olarak algılanan bir katman, 5 puan ve peripapillary bölgesinde ONH her iki tarafında sabit pozisyonlarda için bir ölçüm yapar. OCT tarama edinme retina konumlandırma RGCs odaklanarak belirtmek için açıklamak için sunulan Protokolü hedefidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
deneysel protokol Institut national de la santé tarafından kabul edildi et de la recherche médicale (INSERM; Montpellier, Fransa), Avrupa direktifleri ile tutarlıdır ve ARVO deyimiyle oftalmik araştırma hayvanlarda kullanım için uygundur. Etik Languedoc Roussillon nezaket içinde hayvan deneme (CEEALR; nuCEEA-LR-12123) sözleşme uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. ekipman kurulumu ve öncesi görüntüleme hazırlık
Not: Burada, OCT spektral etki alanı (SD) oftalmik görüntüleme sistemi ( şekil 1A) kullanarak fare retina üzerinde gerçekleştirildi. SD-Ekim aparatı bir üs ve bir hayvan görüntüleme Dağı (AIM) olan bir kemirgen hizalama sahne (RAS) ( şekil 1B) oluşur. Bankası bilgisayar OCT motoru, SD-Ekim sonda ve fare özgü lens içerir. Sonda Z-çevirmen içerir amacı monte edilir. RAS fare ile X - ve Y-çevirmen, tablo sayesinde döndürülmüş ve swiveled, kaset konumlandırma ve burun bandı olan çıkarılabilir ısırık çubuk için kullanılır. İkincisi de bir açık kaynak görüntü işleme programı ile yapılabilir, ancak üreticisi tarafından sağlanan yazılımı toplama ve analizi OCT dosyaların için sağlar.
- Sıkıca sonda AIM yerleştirin.
- Fare özgü lens için sonda bağlayın.
- Belirli objektifi (burada, 086 güç ve 964 konumunda) başvuru kol ayarlarını.
- Yapma fare özel lens emin yeterince uzak kaset, burun bandı kaset üzerine olan ısırık çubuk eklemek.
Not: Objektif ve kaset arasındaki mesafe amaç arka tarafında bulunan Z-çevirmen vida ile ayarlanabilir. Piyasada bulunan bir elastik bant burun grubudur ve onun gerginlik fare boyutuna bağlı olarak ayarlanması gereken. - Güç kaynağı (sağ alt köşesinde sepeti) ve sonra bilgisayarı açın. Görüntüleme programını başlatmak için
- çift tıklatın üstünde üstünde belgili tanımlık perde uygun kısa.
Not: Bu objektif türüne bağlıdır; Burada, fare Retina. - Yeni bir klinik çalışma oluşturun ve istenen iletişim kuralları ekleyin. Aksi takdirde, mevcut klinik çalışma ve/veya iletişim kuralları kullanın.
- Seçerek yeni bir çalışma eklemek " eğitim NameŔ " IDŔ " tedavi kol özellikleri " (burada, " Uncategorized "); ve önceden tanımlanmış " protokolleri tarama ", varsa.
- Seç bir " adli " içinde " klinik çalışmada " bölüm.
Not: için yeni bir " sınav " gidin, " Kur sınav & doktorlar " onu tanımlamak için - Ekle yeni bir hasta hasta/sınav içinde bölüm yanında tıkırtı üstünde eklemek hasta; girme " numarası ", " adı ", " soyadı ", " seks ", ve " Doğum tarihi " (isteğe bağlı).
Not: sadece her fare test etmeden önce daha uygun, bunu. Kimliği 10 karakter uzunluğunda olduğundan emin olun. Fare için her iki gözde için refraktif hata 0, Aksiyel uzunluğu 23.0. - Tıklayın " eklemek sınavı " ve istenen seçin " protokol " ekleyerek " önceden inceden inceye gözden geçirmek " listesi (burada, sağ gözü) ilk ölçülecektir göz ile başlayan veya taramalar özelleştirerek.
- Bir tarama özelleştirmek için bir şablon olarak varolan bir tarama kullanmak ve düzenlemek veya sıfırdan oluşturmak " özel tarama Ekle " seçeneği. Tüm taramalar listesine ekledikten sonra yeni bir iletişim kuralını kullanarak tanımlamak " Enter " yeni iletişim kuralı adı " seçeneği (OS: yuvarlak pencere uğursuz, sol göz; OD: yuvarlak pencere dexter, değil göz).
Not: Burada, protokol üç tarar içerir.: (i) bir Radyal inceden inceye gözden geçirmek, 1.4 mm çapında, 0 mm yatay ve düşey uzaklıklar, 1.000 satırlık A-taramalar/B-Tara, B-taramalar/hacim 100, 1 kare/B-Tara, etkin olmayan A-taramalar/B-tarama 80 satır ve 1 birim; (ii) bir dikdörtgen tarama, 1.4 mm Uzunluk ve genişlik, 0° açı, 0 mm yatay ve düşey uzaklıklar, A-taramalar/B-Tara, 100 B-inceden inceye gözden geçirmek, 1 kare/B-Tara, etkin olmayan A-taramalar/B-tarama 80 satır ve 1 birim 1.000 satırlık; ve (iii) bir annüler inceden inceye gözden geçirmek, 0,4 mm minimum ve 0,6 mm maksimum çapı, 0 mm yatay ve düşey uzaklıklar, A-taramalar/B-Tara, B-taramalar/Cilt 3, 48 çerçeveler/B-Tara, etkin olmayan A-taramalar/B-tarama 80 satır ve 1 birim 1.000 satırlık.
2. Fare hazırlık
- göz dilatasyon ve immobilizasyon
- en az 15 dk önce veri toplama, fare gözlerinin içine % 10 phenylephrine göz damlası aşılamak, aşırı kaldırmak ve % 0.5 tropicamide göz damlası aşılamak.
Not: İlk dilatasyon aynı anda oturum sırasında test tüm fareler için yapılabilir. Sıvı oda sıcaklığında olduğundan emin olun. - Hemen sonra ikna genel anestezi (Adım 2.2), %0,4 oxybuprocaine hidroklorid göz damlası, 3 için yerinde tutarak yönetmek anestezi ve gözleri hareketsiz için s. Daha sonra damla silin ve gözleri de genişlemiş tespit etmek için %10 phenylephrine ve % 0.5 tropicamide korumak yineleyin.
Not: sıvıların oda sıcaklığında ve fare oxybuprocaine yutmak değil emin olun.
- en az 15 dk önce veri toplama, fare gözlerinin içine % 10 phenylephrine göz damlası aşılamak, aşırı kaldırmak ve % 0.5 tropicamide göz damlası aşılamak.
- Genel anestezi
- ketamin (20 mg/mL) ve xylazine (1.17 mg/mL) anestezik bir çözüm salin hazır olun. En fazla 2 hafta 4 ° C'de mağaza.
- Test önce yaklaşık 5 dk intraperitoneally enjekte anestezik çözüm vücut kitle, yaş ve fare boyutunu bağlı olarak 1 gram başına 5-10 µL.
Not: Genç ve/veya ince fareler ihtiyacı daha az anestezik, çekim daha az zaman anestezi, ama aynı zamanda daha hızlı uyandırmak için. Burada, 8 µL/g (160 mg/kg ketamin bas, xylazine 9.33 mg/kg). - İsteğe bağlı olarak, yapışkan göz damlası veya kornea kuruluğu önlemek için oftalmik bir jel gözlerle yağlamak.
3. Fare konumlandırmasını
- viskoz glikol tabanlı göz gözlerle damla kornea hidrasyon sağlamak için Lubricate.
Not: gözleri sınav sırasında kuru görünüyorsa, göz damlası yeniden uygulamak. - Fare sabıkası sıcak tutmak için cerrahi gazlı bez sarın.
- Bir sünger veya pamuk fitil kullanmak oftalmik bir jel ile % 0.3 mellose her gözün üzerine ince bir tabaka uygulanır, ışık kırılma en aza indirmek için kaçının opaklıklar ve güvenli kornea hidrasyon. Bunu yaparken de, kirpik ve bıyık çekil.
- Fareyi kasete, kafa düz ve işaretleme ileri ile konumlandırma.
- Yavaşça ısırık bar kelepçe açın ve bar ağzına yerleştirin; sabitleyin için burun bandı kullanın.
Not: ısırık bar kaset ortasında olduğundan emin olun. - Bir pamuk rulo doğru () sol altında sağ (sol) gözü test yer.
- Klip hedefleyen ucunu fare özgü lens üzerinde tutarak, bu doğru göz Z-çevirmen vida saat yönünün tersine çevirerek getir.
- Döndürme ve kaset yedirdikten ve çevirerek ısırık bar ve X-çevirmen vidalar, önceden belirlenen farenin konumunu; sağ gözü göz doğrudan objektif ve böylece için için hedeftir gözleri ve objektifin optik eksenleri Hizala.
Not: fare çok yüksek veya çok düşük ise, Y-çevirmen vida ilk kullanılmalıdır. - İlk taramada seçin " sınav ", tıklayın " başlatmak amaçlayan " ve retina görüntüleme için daha fazla el ile ayarlamaları yapın.
- Z-çevirmen vidayı kullanarak hareket retina dikey olarak sol panelindeki ( 2 rakam, yatay B-tarama hizalama) ve yatay olarak rsağ panel ( 2 rakam, dikey B-tarama hizalama).
- ONH yukarı veya aşağı hareket ettirerek doğru kapı aynası ortasında ONH getirmek için kaset döndürün. Isırık bar vidalı sağ panosunda retina düzeltmek için kullanın. ONH sol panelin ortasında konumlandırmak için kaset dönebilen.
- X-çevirmen vida sol panelde retina düzeyi için kullanın. Her modülatör büyük fonksiyonu göz önünde bulundurarak daha da retina ONH merkezileştirmek için konumunu ayarlamak.
Not: gerekirse, ONH yukarı ve aşağı sağ panelde taşımak için Y-çevirmen vida kullanın. Pozisyon taramalar arasında herhangi bir zamanda rafine olabilir.
4. SD-Ekim Imaging Retina ve ONH
- ayarlamaları ile içerik sonra tıklayın " başlatmak anlık görüntü " SD-Ekim Taramaya başlamak için.
- Bir 3D görüntüleme gerekli değilse, Öcü seçeneğinin işaretini kaldırın.
- Tarama ve raporu kaydetmek.
- Sonraki taramaları ile ilerle.
- İkinci göz görüntü için objektif geri çeker sonra kaset buna göre ve adımları 3.6-4.3 tekrarlayın.
5. Satın alma tamamlama
- ne zaman satın alma tamamlandıktan, kaset fareden kaldırmak, oftalmik jel ile % 0.3 mellose her göz için geçerlidir ve yukarı uyandırmak ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin
- Son satın alma sonra yazılımı kapatın ve bilgisayarı veya OCT Makinası (güç kaynağı button) kapatma.
- Dezenfektan ile kaset temiz.
6. Analiz
- retina tabakası kalınlığı ölçümü için üretici tarafından sağlanan otomatik bölümleme yazılımı kullanın.
- Tıklayın " hasta ", istenen seçin " sınav " dan sonra liste ve tıkırtı üstünde " bir daha gözden geçirme sınav " seçenek.
- İstenen tarama klasör simgesini sağ tıklatarak istediğiniz OCT verileri OCT yazılım üzerine yüklemek.
- Hemen üzerinde B-Tara'yı tıklatın; Kumpasları Çap pergeli; ölçme 10 etkinleştirerek yapılandırmak ve onların adları, açılar ve renkleri girin.
- İstenen gövde üzerinde B tarama; sağ tıklatarak seçtiğiniz yer o buna göre ölçüm için retina üzerine.
Not: Bu, birbirlerinden eşit uzaklıkta her tarafında 5 Çap pergeli ONH üzerinde ortalanmış taramalar için ayarlayın. Peripapillary analiz için kumpas çok ileri ONH yerleştirilmedi emin olun. Radyal taramak için OCT yazılım tarafından seçilen 10 fotoğraf oranı analiz. Sayıları bulunabilir " raporları " klasörü. - Kaydetmek sonuçları analiz için bir elektronik tablo yazılım programında B Ultrasonda sağ tıklatıp'i tıklatarak " sağlamaları ".
Not: Sonuçları tarama veri ile aynı klasörde bulunabilir.
- Alternatif olarak, ev yapımı Kaliper makroyu kullanmak " Mr Retina aracı ", bir açık kaynak görüntü işleme programı için Gelişmiş (malzemeleri tablo görmek).
- Emin olun " Mr Retina aracı " ve " çokgen bölüm aracı değiştirmek " makroları etkin. Resim yükleyin. Ölçüm başlatmak için m düğmesini tıklayın.
Not: Makroyu otomatik olarak bir 0.2 mm uzunluğundaki oluşturur kaset ONH her iki tarafında ölçme. Her kaset 5 ölçüm noktaları Kumpasları bu işlevi içerir. Yanal konumlarını değiştirilemez ve peripapilla Radyal taramaları için özelleştirilmiş. Kasetleri yatay konumunu RNFL/un kalınlığını ölçmek için önceden, ancak bunun yerine GC karmaşık katman ölçmek için kolayca değiştirilebilir. Tarama kalitesi kötüdür, yatay konumu ayarlanması gerekiyor veya resmi analizinden dışlanmaları gerekir. - Yatay ayarlama için e butonuna tıklayın. Yeni açılan " ROI Yöneticisi " pencere, ilk kaset seçin.
- 'I tıklatın mavi çokgen düğmesini tıklatın ve resim ölçülen katman sınırları tıklayarak ilk kaset konumunu ayarlamak. İlk içinde seçerek
- tekrar için ikinci kaset " ROI Yöneticisi " pencere ve o zaman tıkırtı üstünde uygun imge. R çubuğunda yeniden ölçmek için. Sonuçlarda görüntülemek " ölçümleri " penceresi.
Not: Sonuçları herhangi bir zamanda bir elektronik yazılım programı kopyalanabilir. Onlar doğru kaset (r), sol kaset (l) ve toplam için aşağıdaki değerleri içerir: Intden - entegre yoğunluk içinde kaset; : Alanı mm 2 ölçü; Len: kasete mm içinde gövde uzunluğu; Anlamına: demek kaset içinde sinyal yoğunluğu; ve Std: sinyalin ortalama yoğunluğunun standart hata. - Sonraki görüntü ile ilerle.
- Daha fazla analiz verileri bir elektronik yazılım programı.
Not: katman ortalama kalınlığı bulmak için on Len değerler alır.
- Emin olun " Mr Retina aracı " ve " çokgen bölüm aracı değiştirmek " makroları etkin. Resim yükleyin. Ölçüm başlatmak için m düğmesini tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-Ekim teknoloji retina hayal ve histoloji için benzer, ancak daha hızlı kalınlığı analizi ve daha ayrıntılı (şekil 3) sağlar. Wildtype C57Bl/6 fare ile düz-se bile bir SD-Ekim tarama kalitesini sunulan (şekil 3A, sağ) iyi olarak retina enine kesit (şekil 3A, sol) bir görüntü değil, daha fazla katman (Örneğin, OLM) görüntüler. Ayrıca, bu sadece yaklaşık 40 gün veya hafta histolojik analizler için karşı fare hazırlık dahil olmak üzere min, alır. Son olarak, işleme ve boyama, haematoxylin, Eozin ve safran, gibi, dokusuna zarar ve hatalı veri toplama neden gerektirmez. Retina katmanları Ekim kolayca ölçülebilir kapsayacak RNFL/un, IPL, INL, OPL, yalnız, IS / OS, RPE ve C (şekil 3B), bu nedenle tüm retina karmaşık bir çalışma için izin. Bu nedenle, hastalığı geliştirme yapısal retina değişiklikleri yansıtır. OPNs söz konusu olduğunda, bu RGCs ve ON ve böylece RNFL/un ve IPL için geçerlidir.
DOA en yaygın OPNs biri ve RGC dejenerasyon ve RNFL11kaybı ile karakterizedir. OPA1 gen12mutasyonların nedeniyle görme bozukluğu ve körlüğe yol açar. İnsan tekrarlayan c.2708delTTAG mutasyon taşır, Opa1delTTAG fare modeli kullanarak Opa1 haplo-yetmezlik vizyon bir seks-bağımlı bir şekilde8,9engel keşfedilmiştir. Bu ilerici kalinlasma GC karmaşık Katmanı (şekil 4A) ve peripapillary RNFL (şekil 4B, 4 C) Opa1+ /- dişi içinde gösterdi retina kalınlığı OCT ölçümleri temelinde tespit edilmiştir. Bu deneylerde, dikdörtgen taramalar için standart kaliperler ile bir açık kaynak görüntü işleme programı Anüler taramalar için hesaplamalar yapıldı. Radyal taramalar için hangi kez bir daha düşük kalite ve retina analizi, ev yapımı bir makro için başına 10 resim en az geliştirilmiştir üretmek vardır. Standart ve ev yapımı kaliperleri (şekil 4 d) karşılaştırılması anlamlı derecede düşük kalınlığı RNFL/un ve GC karmaşık katmanları ikincisi ile ölçülen gösterdi. Standart Çap pergeli çok kalın ve katman kenarlığın üzerine yerleştirmek daha zor olmasıdır. Bu nedenle, özellikle Radyal inceden inceye gözden geçirmek üstünde ince tabakalar için standart Çap pergeli kullanmaktan kaçınmak en iyisidir.
Özetlemek gerekirse, birkaç zaman puan arasında tekrar edilebilir fare görsel fenotipleme için SD-Ekim sağlar. Ancak, OCT tarama türü ve ölçme yöntemi incelenen hastalık ve retina tabakası söz konusu için böylece adapte olmalıdır. Yine de, OCT retina yapısı hataları belirlemek için yeterli bilgi sağlar. Ancak, bu daha fazla temel mekanizmaları tam bir anlayış sağlamak için başka bir yöntemle analiz gerekir.
Şekil 1: SD-Ekim oftalmik görüntüleme sistemi. (A)Bankası ve SD-Ekim cihazın parçaları AIM-RAS bakış. Amaç-RAS bileşenlerinin (B) genel bakış. Re: bilgisayar, B: güç kaynağı, C: OCT motoru başvuru kol, D: SD-Ekim sonda, E: fare özgü lens, F: Z-çevirmen, G: AIM-RAS masa, H: Y-çevirmen, ı: kaset (değiştirici), J: ısırık bar, K-burun bandı, L: kaset döner, M: X-çevirmen ve N: amaçlayan ipucu. Bu figute Şekil 2' deki gibi renk kodlu pembe olarak işaretlenmiş retina pozisyonun modülatörler ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Retina konumlandırma. (Solda) yatay ve dikey (sağda) görünümünü B-tarama hizalama. Okları renk kodlu modülatörler tarafından indüklenen hareketlerine karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Retina katmanları. (A)Wildtype haematoxylin, Eozin ve safran (sol) Boyama ve SD-Ekim (sağda); sonra retina Histoloji fare Ölçek çubuğu: 50 µm. (B) retina kalınlığı ölçümleri için 3 aylık wildtype fareler; n = 14, ± SEM, yani ölçek çubuğu: 50 µm. GC: ganglion hücre, RNFL/un: Retina Sinir lifi tabakası/ganglion hücre katmanı, IPL: iç Pleksiform tabaka, INL: iç nükleer tabaka, OPL: dış Pleksiform tabaka, dit: dış nükleer tabaka, IS / OS: photoreceptor iç kesimleri/dış segmentleri, RPE: Retina pigment epiteli ve C: koroid. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: örnek SD-Ekim ölçümleri. (A) GC karmaşık katman kalınlığı dikdörtgen taramaları standart kaliperler ile ölçülen ONH merkezli; Opa1delTTAG fare çizgi, n = 4, ± SEM, demek ** p < 0,01 bir öğrenci t-testi ile değerlendirildi. (B) Peripapillary RNFL RNFL alan hesaplama alanı olarak belirlenen halka seklinde taramaları SD-Ekim (C) Peripapillary RNFL kalınlıkta; Opa1delTTAG dişi fareler, n = 5-11, ± SEM, demek * p < 0,05 Öğrenci t-testi ile değerlendirildi. (D) RNFL/un ve GC karmaşık katman kalınlığı 3 veya 10 taramalar için standart veya ev yapımı kaliperler sırasıyla ölçülen Radyal taramaları; wildtype fareler, n = 8, ± SEM, demek ** p < 0,01, *** p < 0,001 Öğrenci t-testi ile değerlendirildi. RNFL/un - retina Sinir lifi tabakası/ganglion hücre katmanı, GC: ganglion hücre. Rakamlar A-C Sarzi ve ark. adapte 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT sistemi, görüntüleme yöntemi, bir non-invaziv vivo içinde yüksek çözünürlüklü retina çapraz section gibi tarama sağlar. Böylece, başlıca avantajı insanlar fare modelleri için rutin olarak uygulanan protokoller aktarılması için harika bir fırsat ile detaylı analiz için potansiyel var.
Örneğin Opa1delTTAG mutasyona uğramış fareler, SD-Ekim DOA patofizyolojisi9yeni keşifler için izin RNFL ve GC karmaşık tabakası kalınlığı bir artış gösterdi sonuçlanır. Sadece histolojik analizi ile mümkün olmazdı. Buna karşılık, Histoloji aksine annüler veya Radyal OCT inceden inceye gözden geçirmek tüm retina görselleştirmek imkanı sağlar. Ayrıca, daha zaman alıcı ve pahalı, hayvanların çalışmaları birkaç zaman puan ile artan sayıda göz önüne alındığında. Aslında, SD-Ekim DOA, Müller hücre9yeni retina hücre tipinde suçlu yolunu açtı. Bu tek hücreli çözünürlük de belirli hücre kimlikleri sistemi ile mümkün olduğu gerçeği rağmen yapıldı. Aksine, peripapillary bölgesinin kalınlığı odaklı ve/veya genel devlet odaklı analiz hücresel bozulma tespit için büyük ölçüde yeterli oluyor. Histoloji ile ek araştırmalar sonra ne aramaya hakkında net bir fikir ile yapılabilir. Bu nedenle, aynı yöntemi de tedavi müdahaleler önlemek veya retina dejenerasyonu fren için değerlendirilmesi için uygulanabilir.
Daha da geliştirmek belgili tanımlık yarar, Ekim için ev yapımı Çap pergeli geliştirilmiş ve bir çok daha yüksek duyarlılığa ve standart olanlar vardı. Standart RNFL/un kalın olmasına rağmen bazı takımlar bu zaten, ama daha büyük katmanları13için kullanın. Burada, biz karşılaştırmalı analizi RGCs 10 Radyal tarama retina peripapillary bölgedeki tüm / içinde duruldu. Yalnız RNFL Radyal tarar her iki şekilde de ölçülebilir değil. Bu katman çok ince ve belirsiz; Bu nedenle, RNFL/un ve GC karmaşık katman yerine ölçüldü. Aynı zamanda, fare fenotipleme için yararlı kanıtlanmış Anüler taramaları kullanarak RNFL ölçme başarılı olduk. Ancak, güvenilirlik tartışmalı olabilir. Bütün bu yaklaşımlar, inceden inceye gözden geçirmek ONH üzerinde ortalamak için ve gölgeler ve opaklıklar olmadan retina görselleştirmek için kritik adım oldu. Eski kolaylıkla retina konumlandırma açısından Protokolü adımları izleyerek ayarlanabilir. İkinci kornea ve kristal geçirgenliği bağlıdır. Örneğin, oftalmik jel düzensiz yaymak, tarama bulanık ve/veya retina bükülmüş görünür. Bu sorunu gidermek için bu düzgün jel yeniden uygulamak için yeterli olurdu. Kristal opak tarama karanlık veya eksik ise. Çözüm burada tarama tekrarlamak olacaktır başka bir gün, kristal saydamlığını döndürürse. Başka bir sebeple bir kötü kaliteli tarama bıyık ya da kirpik gibi engeller varlığıdır. Bunlar kolayca bir kenara bırakarak ve biraz uygulayarak kaldırılabilmesi için onları tutmak için göze ait jel. Ekipman Cinsi, tarama türü, açı ve diğer parametreler açısından farklı analitik diğer yaklaşımlar de mevcut ve analiz görüntülerin değişen numaraları vardır. Sonuç kalitesi hala beklentinizi karşılamıyorsa bu dikkate alınmalıdır. Örneğin, Liu ve ark. Radyal tarar çeşitli açılardan13, sadece bir, Radyal tarama ile karşılaştırıldığında biraz daha kalın katmanları raporlama aldı. Yine de, OCT edinme ve analitik yaklaşımlar bu el yazması önerilen peripapillary fare retina RGCs analiz etmek için uygundur.
Sonuç olarak, OCT büyük potansiyeli olan bir teknolojidir. Retina yapısı ince değişiklikleri tespiti sağlar — özellikle OPNs bakımdan RGCs dahil olmak üzere — ve vizyon bilim için vazgeçilmez olmaktadır. Bu nedenle, sunulan Protokolü OPN fare modeli fenotipleme için de roman terapiler değerlendirilmesi için pratiktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser desteklenen INSERM, Université Montpellier, Retina Fransa, sendika National des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), dernek Sendromu de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France ve mükemmellik laboratuvar EpiGenMed programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al.
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).
- Lenaers, G., et al.
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
