Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo

Summary

Dit manuscript wordt een protocol voor de beeldvorming in vivo van het netvlies van de muis met hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) beschreven. Het richt zich op netvlies peesknoopcellen (regering van Cambodja) in de peripapillary regio, met verschillende scannen en kwantificeren van de aanpak beschreven.

Abstract

Structurele veranderingen in de retina zijn gemeenschappelijke uitingen van oogheelkundige ziekten. Optische coherentie tomografie (OCT) kan hun identificatie in vivo— snel, herhaaldelijk en met een hoge resolutie. Dit protocol beschrijft OCT beeldvorming in het netvlies van de muis als een krachtig hulpmiddel om te studeren optic neuropathieën (OPN). De OCT-systeem is een interferometrie gebaseerde, niet-invasieve alternatief voor gemeenschappelijke postmortaal histopathologisch testen. Het biedt een snelle en nauwkeurige beoordeling van retinale dikte, de mogelijkheid voor het bijhouden van wijzigingen, zoals netvlies uitdunnen of verdikking. Wij presenteren de beeldvorming proces en analyse met het voorbeeld van de Opa1^delTTAG muis lijn. Drie soorten scans worden voorgesteld, met kwantificering op twee manieren: standaard en zelfgemaakte remklauwen. De laatste is het beste voor gebruik op het netvlies peripapillary tijdens radiale scans; Being nauwkeuriger, verdient de voorkeur voor het analyseren van dunner structuren. Alle benaderingen die hier worden beschreven zijn ontworpen voor retinale peesknoopcellen (regering van Cambodja) maar zijn gemakkelijk aan te passen aan andere cel populaties. Kortom, OCT is efficiënt in mouse model fenotypering en heeft het potentieel om te worden gebruikt voor de betrouwbare beoordeling van therapeutische interventies.

Introduction

OCT is een diagnostisch hulpprogramma dat de behandeling van retinale structuren^{1 vergemakkelijkt}, met inbegrip van de kop van de oogzenuw (ONH). Door de jaren heen is het geworden tot een betrouwbare indicator van progressie van de ziekte in mensen^2,3, evenals in knaagdieren^4,5. Het maakt gebruik van interferometrie transversale om afbeeldingen te maken van retinale lagen met een 2-µm axiale resolutie. De binnenste laag is de retinale zenuw vezel laag (RNFL), met axonen van de regering van Cambodja, die wordt gevolgd door de ganglion cellaag (GCL), met meestal regering van Cambodja organen. Volgende halte is de Meervormige binnenlaag (IPL), waar de regering van Cambodja dendrites bipolaire, horizontaal en amacrine cel axonen ontmoeten. Deze, samen met horizontale cellen, vormen de nucleaire binnenlaag (l), en hun uitsteeksels verbinden met fotoreceptor axonen in de Meervormige buitenlaag (OPL). Dit wordt gevolgd door de nucleaire buitenlaag (ONL), met fotoreceptor cel organen, en is gescheiden van de fotoreceptor laag door de beperkende buitenmembraan (OLM), ook wel genoemd het innerlijke segment/buitenste segment (IS / OS) laag. Ten slotte, de laatste waarneembare lagen in het netvlies van de muis zijn de retinale pigment epitheel (RPE) en het vaatvlies (C). De RNFL alleen is normaal te dun om te worden gemeten in muizen; analyseren van de RNFL/GCL is dus, in plaats daarvan beter^4,5. Een andere mogelijkheid is de complexe laag van GC, waarin de laatste naast de IPL, waardoor het dikker en dus nog makkelijker te meten LGO scant⁴. Bijgevolg, OCT kan inzicht geven in de pathologische status van het netvlies, zoals in OPNs.

De dikte van het netvlies van de muis is ook vaak geanalyseerd met post-mortem histologie. Echter, deze techniek gezichten beperkingen met betrekking tot weefsel collectie, fixatie, snijden, kleuring, montage, etc. dus, sommige gebreken, zoals de dikte van de subtiele veranderingen, kunnen niet worden gedetecteerd. Ten slotte, omdat het dezelfde muis kan niet worden getest op verschillende tijd punten, het aantal dieren per studie sterk toeneemt, in tegenstelling tot voor LGO. Al met al, de niet-invasiviteit, hoge resolutie, mogelijkheid voor herhaling, tijd toezicht op tijd, en gebruiksgemak van de OCT-technologie maken het de methode van keuze in netvlies ziekte studies.

Muismodellen worden gebruikt om te identificeren gene gebreken en ophelderen van de moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de retinopathies⁶. OPN is een vorm van retinopathie met aanzienlijke schade aan de oogzenuw (ON), die is samengesteld uit ongeveer 1,2 miljoen regering van Cambodja axonen. OPN kan worden gericht op de ON of kan ondergeschikt zijn aan andere aandoeningen, aangeboren of niet⁷, hetgeen leidt tot verlies van het gezichtsveld en later, blindheid. Karakteristieke eigenschappen van OPN zijn verlies van de regering van Cambodja en op schade, die kan worden waargenomen in menselijke LGO als RNFL en GCL uitdunnen van^2,3. Ondertussen, de pathofysiologie van OPN is nog steeds slecht begrepen, en vandaar de noodzaak voor het testen van muis netvlies blijft.

Dit manuscript beschrijft de beeldvorming en de kwantificering van retinale laagdikte, met behulp van het voorbeeld van de Opa1^delTTAG muis lijn^8,9, een model van de dominante optic atrofie (DOA)¹⁰. Om te beoordelen pathofysiologie van de regering van Cambodja, werden radiaal, rechthoekige en ringvormige scans gekwantificeerd. Dit werd gedaan met de standaard remklauwen verstrekt door de software van de OCT, hetzij met een zelfgemaakte macro ontwikkeld voor een open-source beeldverwerking programma. De standaard remklauwen zijn moeilijk te manipuleren en vaak dikker dan de RNFL/GCL, terwijl de zelfgemaakte remklauwen makkelijk te gebruiken, reproduceerbare en nauwkeuriger zijn. De macro wordt een meting uitgevoerd voor een automatisch gedetecteerde laag, in 5 punten en op vaste posities, aan beide zijden van de ONH in de peripapillary-regio. Het doel van het voorgestelde protocol is te beschrijven van OCT scan overname wilt retinale positionering, met een focus op RGCs.

Protocol

de experimenteel protocol is goedgekeurd door het Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Frankrijk), is in overeenstemming met de Europese richtlijnen, en voldoet aan de ARVO instructie voor het gebruik van dieren in Ophthalmic onderzoek. Het werd uitgevoerd onder het akkoord van de Languedoc Roussillon internationale courtoisie van ethiek in dier experimenten (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. apparatuur Setup en pre imaging voorbereiding

Opmerking: hier, OCT werd uitgevoerd op muis netvlies met behulp van de oogheelkundige imaging systeem van spectrale domein (SD) ( figuur 1A). Het SD-OCT-apparaat bestaat uit een basis en een dierlijke imaging mount (AIM) met een knaagdier uitlijning stadium (RAS) ( figuur 1B). De base bevat de computer, de OCT-motor, de SD-OCT-sonde en de muis-specifieke lens. De sonde is gemonteerd op het doel, waaronder de Z-vertaler. Het RAS wordt gebruikt voor muis positionering dankzij de tabel met de X - en Y-vertaler, de cassette die kan worden gedraaid en gedraaid, en de verwisselbare beet bar met de band van de neus. De software die wordt geleverd door de fabrikant zorgt voor de overname en de analyse van OCT bestanden, hoewel de laatste kan ook worden gedaan met een open-source image processing programma.

1. Stevig de sonde in het doel plaats.
2. De muis-specifieke lens verbinden met de sonde.
3. De referentie arm instellingen aanpassen voor de specifieke lens (hier, macht bij 086 en positie op 964).
4. Ervoor dat de muis-specifieke lens is voldoende afstand van de cassette, hechten de balk beet met de band van de neus op de cassette.
   Opmerking: De afstand tussen de lens en de cassette kan worden aangepast met de Z-vertaler schroef, gelegen aan de achterzijde van het doel. De neus-band is een commercieel beschikbare elastische band, en de spanning moet worden aangepast afhankelijk van de grootte van de muis.
5. De voeding (rechts onderin de winkelwagen) en vervolgens de computer inschakelen.
6. Te lanceren van het imaging-programma, dubbelklik op de juiste snelkoppeling op het scherm.
   Opmerking: Dit is afhankelijk van het type van lens; hier, muis Retina.
7. Maakt een nieuwe klinische studie en voeg de gewenste protocollen. Anders, gebruik van de bestaande klinische studie en/of protocollen.
   1. Toevoegen van een nieuwe studie door te kiezen voor de " studie NameŔ " IDŔ " behandeling Arm specificaties " (hier " Uncategorized "); en vooraf gedefinieerde " scannen protocollen ", als ze bestaan.
8. Kies een " examinator " in de " klinische studie " sectie.
   Opmerking: voor een nieuwe " examinator ", ga naar " Setup examinatoren & artsen " te definiëren van IT
9. Toevoegen een nieuwe patiënt in de patiënt/examen sectie door te klikken op toevoegen patiënt; invoeren de " ID ", " naam ", " achternaam ", " sex ", en " geboortedatum " (optioneel).
   Let op: Doe dit net voor het testen van elke muis, als handiger. Zorg ervoor dat de ID niet dan 10 tekens bevatten is. Voor de muis, de refractieve fout voor beide ogen is 0 en de axiale lengte is 23,0.
10. Klik op " examen toevoegen " en selecteer de gewenste " Protocol " door toe te voegen " Preset scant " vanuit de lijst begint met het oog dat zal eerst worden gemeten (hier, het rechter oog) of door het aanpassen van de scans.
11. Voor het aanpassen van een scan, een bestaande scan gebruiken als een sjabloon en bewerken of maken van kras door middel van de " toevoegen aangepaste Scan " optie. Na alle de scans aan de lijst toe te voegen, definiëren een nieuw protocol met de " Enter " nieuwe protocolnaam " optie (OS: oculus sinister, linker oog; OD: oculus dexter, rechter oog).
    Opmerking: Hier, het protocol omvat drie scans: (i) een radiale scan, met een diameter van 1.4 mm, 0 mm horizontale en verticale verschuivingen, 1.000 lijnen van A-scans/B-scan, 100 B-scans/volume, 1 frame/B-scan, 80 lijnen voor inactieve A-scans/B-scan, en 1 deel; (ii) een rechthoekige scan, met een 1.4-mm lengte en breedte, hoek van 0°, 0 mm horizontale en verticale verschuivingen, 1.000 lijnen van A-scans/B-scan, 100 B-scans, 1 frame/B-scan, 80 lijnen voor inactieve A-scans/B-scan, en 1 deel; en (iii) een ringvormige scannen, met een minimum- en 0.6 mm maximale diameter van 0.4 mm, 0-mm horizontale en verticale verschuivingen, 1.000 lijnen van A-scans/B-scan, 3 B-scans/volume, 48 frames/B-scan, 80 lijnen voor inactieve A-scans/B-scan, en 1 deel.

2. Voorbereiding van de muis

1. Eye dilatatie en immobilisatie
   1. ten minste 15 minuten vóór de data-acquisitie, inboezemen dalingen van het oog van de phenylephrine van 10% in de ogen van de muis, het verwijderen van de overtollige en indruppelen van oogdruppels 0,5%-tropicamide.
      Opmerking: De eerste maagdilatatie kan worden gedaan in één keer voor alle de muizen die in de sessie zal worden getest. Zorg ervoor dat de vloeistoffen bij kamertemperatuur.
   2. Onmiddellijk na inducerend narcose (stap 2.2), beheer van 0,4% oxybuprocaine hydrochloride oogdruppels, bewaar ze in de plaats voor 3 s tot anesthetize en immobiliseren van de ogen. Daarna veeg de druppels en herhaal de instillation van 10% phenylephrine en 0,5% tropicamide om na te gaan dat de ogen zijn goed uitgezet.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de vloeistoffen bij kamertemperatuur en dat de muis niet de oxybuprocaine slikken doet.
2. Narcose
   1. een verdoving oplossing van ketamine (20 mg/mL) en xylazine (1,17 mg/mL) in een zoutoplossing bereiden. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.
   2. Ongeveer 5 min vóór het testen, injecteren intraperitoneally 5-10 µL van verdoving oplossing per 1 g lichaamsmassa, afhankelijk van de leeftijd en de grootte van de muis.
      Opmerking: Young en/of dunne muizen noodzaak minder verdoving, neem minder tijd om te anesthetize, maar ook sneller ontwaken. Hier, 8 µL/g (160 mg/kg van ketamine, 9.33 mg/kg xylazine).
   3. Eventueel smeren de ogen met viskeuze oogdruppels of een oogheelkundige gel te vermijden hoornvlies droogheid.

3. Positionering van de muis

1. Lubricate de ogen met viskeuze glycol gebaseerde oog daalt tot het verstrekken van hoornvlies hydratatie.
   Opmerking: Als de ogen droog tijdens het examen lijken, opnieuw toepassen de oogdruppels.
2. De muis teruglopen in een blad van chirurgische gaas te houden het warm.
3. Met behulp van een spons of katoen wick, breng een dunne laag van een oogheelkundige gel met 0,3% hypromellose op elk van beide ogen, Vermijd om te minimaliseren lichtbreking, opaciteit en veilige hoornvlies hydratatie. Terwijl doen, verplaatsen de wimpers en snorharen opzij.
4. Plaats van de muis in de cassette, met het hoofd rechte en wijzen naar voren.
5. Voorzichtig openen van de klem van de balk beet en de staaf van de plaats in de mond; de neus band gebruiken om de positie veilig.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de beet-bar in het midden van de cassette is.
6. Plaats een katoenen rollen onder de juiste (links) als het rechteroog (links) wordt getest.
7. Terwijl de clip-on gericht tip over de muis-specifieke lens, breng het naar het oog door het draaien van de Z-vertaler schroef linksom.
8. Door roteren en draaibare van de cassette en door te draaien aan de bar van de beet en de X-vertaler schroeven, voorgeprogrammeerde de positie van de muis; het doel is dat het rechteroog uiterlijk direct in de lens, en dus op de optische assen van de ogen en de lens uitlijnen.
   Opmerking: Als de muis te hoog of te laag is, de Y-vertaler schroef dient eerst.
9. Kiezen van de eerste scan in de " examen ", klik op " beginnen gericht ", en maak verder handmatige aanpassingen voor retinale imaging.
   1. Met behulp van de schroef van de Z-vertaler, beweeg het netvlies verticaal op het linker paneel ( Figuur 2, B-scan horizontale uitlijning) en horizontaal op de rvlucht paneel ( Figuur 2, B-scan verticale uitlijning).
   2. Draaien de cassette door te brengen de ONH in het midden van het rechter paneel de ONH omhoog of omlaag verplaatsen. De schroef van de balk beet rechtzetten van het netvlies op het juiste paneel gebruiken De cassette als u wilt plaatsen de ONH in het midden van het linker paneel draaibaar.
   3. Gebruiken de schroef X-vertaler naar het niveau van het netvlies op het linker paneel. Rekening houdend met de belangrijke functie van elke modulator, verder aanpassen van de positie van het netvlies te centraliseren de ONH.
      Opmerking: Gebruik de Y-vertaler schroef om de ONH omhoog en omlaag op het juiste paneel, indien nodig. De positie op elk gewenst moment tussen scans kan worden verfijnd.

4. SD-OCT Imaging van de ONH en netvlies

1. zodra inhoud met de aanpassingen, klikt u op " beginnen momentopname " om te beginnen met het scannen van de SD-OCT.
   1. Als een 3D-beeldbewerking niet vereist is, schakelt u de optie OCU.
2. De scan en het rapport opslaan.
3. Doorgaan met de volgende scans.
4. Naar het image van het tweede oog, na het intrekken van de lens, zet de cassette dienovereenkomstig en herhaal stappen 3.6-4.3.

5. Voltooiing van de overname

1. wanneer de overname voltooid is, verwijder de muis uit de cassette, oogheelkundige gel met 0,3% hypromellose aan elk van beide ogen, van toepassing en plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmingsplaat up. wakker
2. Na de laatste overname, sluit de software en schakel de computer en de OCT machine (levering machtsknoop).
3. Reinigen van de cassette met een ontsmettingsmiddel.

6. Analyse

1. voor de retinale laag dikte meting, gebruiken de automatische segmentatie software door de fabrikant verstrekte.
   1. Klik op de " patiënt ", kies de gewenste " examen " dan lijst, en klik op de " Review examen " optie.
   2. De gewenste OCT-gegevens op de OCT software laden door met de rechtermuisknop op het mappictogram in de gewenste scan.
   3. Rechts klik op de B-scan; configureren de remklauwen doordat maximaal 10 meten remklauwen; en hun namen, hoeken en kleuren invoeren.
   4. Kiezen van de gewenste remklauw door een met de rechtermuisknop op de B-scan; het dienovereenkomstig plaats op het netvlies voor meting.
      Opmerking: Voor de scans gecentreerd op de ONH, ingesteld 5 remklauwen aan weerskanten van het, gelijke afstanden van elkaar. Bij de analyse van de peripapillary, door ervoor te zorgen dat de remklauw niet ver van de ONH wordt geplaatst. Voor radiale scannen, analyseren 10 foto's per scan die werden gekozen door de OCT-software. Hun nummers kunnen worden gevonden in de " rapporten " map.
   5. De resultaten voor analyse opslaan in een spreadsheet-softwareprogramma door rechts te klikken op de B-scan en te klikken op " resultaten opslaan ".
      Opmerking: De resultaten kunnen gevonden worden in de zelfde omslag zoals het scannen gegevens.
2. Ook gebruiken de zelfgemaakte remklauw macro, " MRI netvlies Tool ", ontwikkelde voor een open-source image processing program (Zie de tabel van materialen).
   1. Zorg ervoor dat de " MRI netvlies Tool " en de " vormgereedschap sectie wijzigen " macro's actief zijn. Laden van de afbeelding. Klik op de m-toets om te beginnen met de meting.
      Opmerking: De macro automatisch één 0.2 mm lang cassette aan beide zijden van de ONH meten. Elke cassette bevat 5 meetpunten die functie als remklauwen. Hun zijligging is onveranderlijk en is aangepast voor de peripapilla in de radiale scans. De horizontale positie van de cassettes vooraf is gedefinieerd voor het meten van de dikte van de RNFL/GCL, maar het is gemakkelijk aanpasbaar voor het meten van de GC complexe laag in plaats daarvan. Als de scankwaliteit slecht is, de horizontale positie moet worden aangepast of de afbeelding moet worden uitgesloten van de analyse.
   2. Voor horizontale aanpassing, klik op de e-knop. In de onlangs geopende " ROI Manager " venster, kies de eerste cassette.
   3. Klik op de blauwe veelhoek knop en pas de positie van de eerste cassette door te klikken op de grenzen van de gemeten laag in de afbeelding.
   Herhaal deze stappen voor de tweede
   4. cassette door eerste kiezen in de " ROI Manager " venster en vervolgens te klikken op het juiste beeld. Klik op de r-toets om opnieuw op te meten. Bekijk de resultaten in de " metingen " venster.
      Opmerking: De resultaten kunnen worden gekopieerd naar een spreadsheetprogramma van de software op elk gewenst moment. Ze bevatten de volgende waarden voor de juiste cassette (r), linker cassette (l) en totaal: Intden - geïntegreerde dichtheid binnen de cassette; Gebied: gebied van de meting, in mm ²; Len: lengte van de remklauw binnen de cassette, in mm; Gemiddelde: bedoel intensiteit van het signaal binnen de cassette; en SOA: de standaardfout van het gemiddelde intensiteit van het signaal.
   5. Doorgaan met de volgende afbeelding.
   6. Verder analyseren van de gegevens in een werkblad softwareprogramma.
      Opmerking: Om te zoeken naar de gemiddelde dikte van de laag, de tien-Len waarden aannemen.

Representative Results

De SD-OCT-technologie kan retinale verbeelden en dikte analyse die vergelijkbaar is met de histologie, maar is sneller en meer gedetailleerde (Figuur 3). Zoals gepresenteerd met wildtype C57Bl/6 muizen, hoewel de kwaliteit van een SD-OCT scan (figuur 3A, rechts) is niet zo goed als die van een afbeelding van een retinale dwarsdoorsnede (figuur 3A, links), het visualiseert meer lagen (bijvoorbeeld OLM). Bovendien duurt het slechts ongeveer 40 min, met inbegrip van de voorbereiding van de muis, versus dagen of weken voor histologisch analyse. Tot slot, het vereist geen verwerking en vlekken, zoals haematoxylin, eosine en saffraan, die kan schade aan het weefsel en het verzamelen van foutieve gegevens veroorzaken. Het netvlies lagen gemakkelijk meetbaar in LGO omvatten de RNFL/GCL IPL, l, OPL, ONL, IS / OS, RPE en C (figuur 3B), waardoor voor een complexe studie van het gehele netvlies. Als zodanig, weerspiegelen structurele retinale veranderingen ziekte ontwikkeling. In het geval van OPNs geldt dit voor de RGCs en de ON, en dus de RNFL/GCL en IPL.

DOA is één van de gemeenschappelijkste OPNs en wordt gekenmerkt door degeneratie van de regering van Cambodja en het verlies van het RNFL¹¹. Als gevolg van mutaties in het gen OPA1 ¹²leidt het tot visuele handicap en blindheid. Met behulp van de^delTTAG muismodel van Opa1, die de menselijke terugkerende c.2708delTTAG mutatie draagt, werd ontdekt dat Opa1 haplo-insufficiëntie visie in een sex-afhankelijke manier^{8,9 belemmert}. Dit werd vastgesteld op basis van OCT metingen van retinale dikte, en die een progressieve verdikking van de GC complexe laag (figuur 4A) en de peripapillary RNFL (figuur 4B, 4 C) in Opa1^+/- vrouwtjes toonde. In deze experimenten, werden de berekeningen gedaan met de standaard remklauwen voor rechthoekige scans en met een open-source programma voor het ringvormige scans voor beeldverwerking. Voor radiale scans, die zijn vaak van een lagere kwaliteit en produceren die een minimum van 10 beelden per netvlies p.a., een zelfgemaakte macro werd ontwikkeld. Een vergelijking van de standaard en zelfgemaakte remklauwen (Figuur 4 d) bleek een aanzienlijk lagere dikte van de RNFL/GCL en complexe lagen GC gemeten met de laatste. Dit is omdat de standaard remklauwen zijn veel dikker en moeilijker om te plaatsen op de grens van de laag. Daarom is het beste gebruik van de standaard remklauwen voor dunne lagen, vooral op het radiale scans te vermijden.

Om samen te vatten, zorgt de SD-OCT voor de visuele fenotypering muis, die op verschillende tijdstippen kan worden herhaald. Echter moeten het scantype OCT en de meetmethode worden aangepast aan de onderzochte ziekte, en dus de retinale laag in kwestie. Niettemin, OCT biedt voldoende informatie om te identificeren van de gebreken in het netvlies structuur. Echter, dit moet worden verder geanalyseerd met een andere methode om te zorgen voor een compleet begrip van de onderliggende mechanismen.

Figuur 1: SD-OCT Ophthalmic Imaging systeem. (A) overzicht van de base en doel-RAS delen van de SD-OCT-apparaat. (B) overzicht van de onderdelen van de doel-RAS. A: computer, B: voeding, C: OCT motor referentie arm, D: SD-OCT sonde, E: muis-specifieke lens, F: Z-vertaler, G: doel-RAS tabel, H: Y-vertaler, I: cassette (rotator), J: beet bar, K-band van de neus, L: cassette draaibare M: X-Vertaler en N: gericht tip. Deze figute is kleurgecodeerde zoals in Figuur 2, met niet-modulatoren van het netvlies standpunt gemarkeerd in roze. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: positionering van het netvlies. Horizontaal (links) en verticaal (rechts) uitzicht op de uitlijning van de B-scan. De pijlen overeen met bewegingen geïnduceerd door de gekleurde modulatoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: netvlies lagen. (A) Wildtype muis netvlies histologie na haematoxylin, eosine, en saffraan kleuring (links) en SD-OCT (rechts); schaal bar: 50 µm. (B) retinale diktemetingen voor 3 maand-oude wildtype muizen; n = 14, betekenen ± SEM, schaal bar: 50 µm. GC: ganglion cel, RNFL/GCL: netvlies zenuw vezel laag/ganglion cellaag, IPL: Meervormige binnenlaag, l: nucleaire binnenlaag, OPL: Meervormige buitenlaag, ONL: nucleaire buitenlaag, IS / OS: fotoreceptor innerlijke segmenten/buitenste segmenten, RPE: retinale pigment epitheel en C: vaatvlies. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: voorbeeldige SD-OCT metingen. (A) GC complexe laagdikte in rechthoekige scans gecentreerd op de ONH, gemeten met de standaard remklauwen; Opa1^delTTAG muis lijn, n = 4, ± SEM, bedoel ** p < 0,01 beoordeeld met de Student t-test. (B) Peripapillary RNFL in SD-oktober (C) Peripapillary RNFL dikte in ringvormige scans, bepaald als de berekening van de RNFL oppervlakte per veld; Opa1^delTTAG vrouwelijke muizen, n = 5-11, betekenen ± SEM, * p < 0.05 beoordeeld met de Student t-test. (D) RNFL/GCL en GC complexe laagdikte in radiale scans, gemeten met de standaard of zelfgemaakte remklauwen voor 3 of 10 scans, respectievelijk; wildtype muizen, n = 8 wordt ± SEM, bedoel ** p < 0,01, *** p < 0.001 beoordeeld met de Student t-test. RNFL/GCL - netvlies zenuw vezel laag/ganglion cellaag, GC: ganglion cel. Cijfers A-C aangepast van Sarzi et al. ⁹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De OCT-systeem, een niet-invasieve in vivo imaging methode, biedt hoge resolutie Retina Cross-Country-section-achtige scans. Het belangrijkste voordeel is dus het potentieel voor gedetailleerde analyse, met de prachtige kans tot omzetting protocollen routinematig toegepast op mensen Muismodellen.

In het voorbeeld van Opa1^delTTAG mutant muizen resultaten SD-OCT sprake van een toename van RNFL en GC complexe laagdikte, waardoor voor de verdere verkenning van DOA pathofysiologie⁹. Het zou niet mogelijk geweest uitsluitend met histologische analyse. In vergelijking biedt histologie niet de mogelijkheid om te visualiseren het hele netvlies, in tegenstelling tot ringvormige of radiale OCT scans. Bovendien is het meer tijdrovende en dure, gezien het verhoogde aantal dieren in studies met verschillende tijdstippen. In feite, SD-OCT geëffend om te beschuldigen van een nieuwe Retina celtype in DOA, de Müller cel⁹. Dit werd gedaan ondanks het feit dat noch de specifieke cel identificaties als de eencellige resolutie mogelijk met het systeem. Integendeel, is de dikte-gericht en/of algemene staat gerichte analyse van de peripapillary-regio grotendeels genoeg om het detecteren van cellulaire verslechtering. Aanvullende onderzoeken met histologie kunnen vervolgens worden uitgevoerd met een duidelijk idee van wat te zoeken. Dezelfde methode kan daarom ook worden toegepast op de evaluatie van therapeutische interventies te voorkomen of te remmen Retina degeneratie.

Om het nut van OCT verder te verbeteren, zelfgemaakte remklauwen zijn ontwikkeld en had een veel hogere precisie dan de standaard ones. Hoewel de standaard dikker dan de RNFL/GCL is, sommige teams gebruiken hoe dan ook, maar voor grotere lagen¹³. Hier, we gericht de vergelijkende analyse op RGCs in 10 radiale scans per netvlies, allemaal in de peripapillary-regio. De RNFL alleen was niet meetbaar op de radiale scans bakboord. Deze laag was te dun en vaag; Daarom werden de RNFL/GCL en de GC complexe laag in plaats daarvan gemeten. Op hetzelfde moment, is het gelukt in het meten van de RNFL met behulp van de ringvormige scans, die gunstig voor muis fenotypering bewezen. De betrouwbaarheid kan echter controversieel. In al deze benaderingen was de kritieke stap naar het midden van de scans op de ONH en visualiseren van het netvlies zonder schaduwen en opaciteit. De voormalige kan gemakkelijk aangepast worden door het volgen van de stappen van het protocol op het gebied van de positionering van het netvlies. De laatste hangt af van de doorlaatbaarheid van het hoornvlies en de kristallijnen. Bijvoorbeeld, als de oogheelkundige gel is ongelijk verdeeld, de scan is wazig en/of het netvlies verschijnt gebogen. Om dit te verhelpen, zou het genoeg goed opnieuw toepassen van de gel. Als de kristallijne ondoorzichtig is, wordt de scan is donker of onvolledig. De oplossing hier zou herhalen van de scan een andere dag, als de transparantie van de kristallijne retourneert. Een andere mogelijke reden voor een scan van slechte kwaliteit is de aanwezigheid van obstakels, zoals snorharen of wimpers. Deze kunnen gemakkelijk verwijderd worden door vernietiging en toepassing van een beetje van de oogheelkundige gel om hen op zijn plaats houden. Andere analytische benaderingen die in termen van apparatuur type, scantype, hoek en andere parameters verschillen ook bestaan en hebben verschillende nummers van geanalyseerde beelden. Dit moet worden beschouwd als de Resultaatskwaliteit nog steeds niet bevredigend is. Bijvoorbeeld, vond Liu et al. radiale scans in verschillende hoeken¹³, in vergelijking met onze radiale scans op slechts één, rapportage lichtjes dikker lagen. Niettemin, de verwerving van de OCT en analytische benaderingen voorgesteld in dit manuscript zijn geschikt voor het analyseren van RGCs in het netvlies van de muis peripapillary.

Kortom, is OCT een technologie met een groot potentieel. Hierdoor de detectie van subtiele veranderingen in de structuur van de retinale — met inbegrip van de RGCs, vooral met betrekking tot de OPNs — en onmisbaar voor visie wetenschap bewijst. Het gepresenteerde protocol is daarom praktisch voor OPN muis model fenotypering, alsook wat betreft de evaluatie van nieuwe therapieën.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3" x 3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0.9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant