Summary
इस पांडुलिपि उच्च संकल्प वर्णक्रमीय डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-अक्टूबर) के साथ माउस रेटिना की vivo इमेजिंग में के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । यह peripapillary क्षेत्र में रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGC) पर केंद्रित है, कई स्कैनिंग और बढ़ाता दृष्टिकोण के साथ वर्णित है ।
Abstract
रेटिना में संरचनात्मक परिवर्तन नेत्र रोगों के आम अभिव्यक्ति कर रहे हैं । ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) vivo मेंउनकी पहचान-तेजी से, दोहराए, और एक उच्च संकल्प पर सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में माउस रेटिना में अक्टूबर इमेजिंग ऑप्टिक न्यूरोपैथी (OPN) का अध्ययन करने के लिए । OCT प्रणाली एक interferometry आधारित, गैर इनवेसिव आम पोस्ट मार्टम ऊतकीय परख के लिए वैकल्पिक है । यह रेटिना की मोटाई का एक तेज और सटीक आकलन प्रदान करता है, संभावना परिवर्तन ट्रैक करने के लिए अनुमति देता है, जैसे रेटिना thinning या और अधिक मोटा होना. हम Opa1delTTAG माउस लाइन के उदाहरण के साथ इमेजिंग प्रक्रिया और विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं । तीन प्रकार के स्कैन का प्रस्ताव है, दो ठहराव विधियों के साथ: मानक और घर का बना कैलिपर्स । उत्तरार्द्ध रेडियल स्कैन के दौरान peripapillary रेटिना पर उपयोग के लिए सबसे अच्छा है; अधिक सटीक होने के नाते, पतले संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए बेहतर है । यहां वर्णित सभी दृष्टिकोण रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGC) के लिए डिजाइन किए हैं, लेकिन आसानी से अन्य कोशिका आबादी के लिए अनुकूलनीय हैं. अंत में, अक्टूबर माउस मॉडल phenotyping में कुशल है और क्षमता के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप के विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
Introduction
अक्टूबर एक नैदानिक उपकरण है कि रेटिना संरचनाओं की परीक्षा1, ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ONH) सहित, की सुविधा है । वर्षों से यह मनुष्यों में रोग प्रगति के एक भरोसेमंद संकेतक बन गया है2,3, साथ ही साथ में कुतर4,5. यह एक 2-µm अक्षीय संकल्प पर रेटिना परतों के पार अनुभागीय छवियों को बनाने के लिए interferometry का उपयोग करता है । अंतरतम परत रेटिना तंत्रिका फाइबर परत (RNFL), युक्त RGC axons, जो नाड़ीग्रंथि कोशिका परत (GCL), ज्यादातर RGC निकायों युक्त द्वारा पीछा किया जाता है । अगले भीतरी plexiform परत (आईपीएल), जहां RGC dendrites द्विध्रुवी, क्षैतिज, और amacrine सेल axons से मिलने है । ये, क्षैतिज कोशिकाओं के साथ मिलकर, भीतरी परमाणु परत (आईएनएल) के रूप में, और उनकी दखलंदाजी बाहरी plexiform लेयर (OPL) में photoreceptor axons के साथ जुड़ती है । इसके बाद बाहरी परमाणु परत (केव), photoreceptor कोशिका निकायों के साथ, और बाहरी सीमित झिल्ली (OLM) द्वारा photoreceptor परत से अलग किया जाता है, जिसे भीतरी सेगमेंट/बाहरी सेगमेंट (is/OS) परत भी कहा जाता है । अंत में, माउस रेटिना में अंतिम चौकस परतों रेटिना वर्णक उपकला (RPE) और रंजित (सी) हैं. अकेले RNFL आम तौर पर भी चूहों में मापा जा पतली है; इस प्रकार, RNFL/GCL का विश्लेषण करने के बजाय बेहतर है4,5। एक और संभावना GC जटिल परत है, जो आईपीएल के अलावा बाद में शामिल है, यह मोटा है और इस तरह भी आसान को मापने के लिए OCT4स्कैन कर रहा है । नतीजतन, OCT रेटिना की रोग की स्थिति, जैसे OPNs में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
वैकल्पिक रूप से, माउस रेटिना की मोटाई अक्सर पोस्ट मार्टम प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण किया जाता है । हालांकि, इस तकनीक के चेहरे ऊतक संग्रह, निर्धारण, काटने, धुंधला, बढ़ते, आदि से संबंधित सीमाओं इसलिए, कुछ दोषों, जैसे सूक्ष्म मोटाई परिवर्तन, पता नहीं किया जा सकता । अंत में, क्योंकि एक ही माउस कई समय बिंदुओं पर परीक्षण नहीं किया जा सकता, अध्ययन प्रति पशुओं की संख्या बहुत बढ़ जाती है, OCT के लिए विपरीत । सभी के सभी, गैर इनवेसिव, उच्च संकल्प, पुनरावृत्ति के लिए संभावना है, समय में समय की निगरानी, और अक्टूबर प्रौद्योगिकी के उपयोग में आसानी यह रेटिना रोग अध्ययन में पसंद की विधि बनाते हैं ।
माउस मॉडल जीन दोषों की पहचान करने के लिए और आणविक retinopathies अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है6। OPN ऑप्टिक तंत्रिका को पर्याप्त क्षति के साथ रेटिनोपैथी का एक रूप है (पर), जो लगभग १,२००,००० RGC axons से बना है । OPN पर केंद्रित किया जा सकता है या अंय विकारों, अजन्मा या नहीं7के लिए माध्यमिक जा सकता है, दृश्य क्षेत्र हानि और बाद में, अंधापन के लिए अग्रणी । OPN की विशेषता लक्षण RGC नुकसान पर और नुकसान है, जो RNFL और GCL thinning के रूप में मानव OCT में मनाया जा सकता है2,3। इस बीच, OPN के pathophysiology अभी भी खराब समझ है, और इसलिए माउस रेटिना परीक्षण की जरूरत बनी हुई है ।
इस पांडुलिपि इमेजिंग और रेटिना परत मोटाई के ठहराव का वर्णन करता है, Opa1delTTAG माउस लाइन8,9, प्रमुख ऑप्टिक शोष (DOA)10के एक मॉडल के उदाहरण का उपयोग कर । RGC pathophysiology, रेडियल, आयताकार, और कुंडलाकार स्कैन का आकलन करने के लिए मात्रा थे । यह या तो मानक कैलिपर्स OCT सॉफ्टवेयर या एक घर का बना एक खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के लिए विकसित स्थूल के साथ द्वारा प्रदान के साथ किया गया था । मानक कैलिपर्स में हेरफेर करने के लिए मुश्किल है और अक्सर RNFL/GCL से मोटा है, जबकि घर का बना कैलिपर्स उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, प्रतिलिपि, और अधिक सटीक । मैक्रो peripapillary क्षेत्र में ONH के दोनों किनारों पर, एक स्वचालित रूप से पता लगाए गए परत के लिए, 5 बिंदुओं में और निश्चित स्थिति में, एक माप निष्पादित करता है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य RGCs पर ध्यान देने के साथ, रेटिना पोजीशनिंग निर्दिष्ट करने के लिए अक्टूबर स्कैन अधिग्रहण का वर्णन है ।
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Protocol
- के मकसद में जांच को मजबूती से जगह ।
- माउस-विशिष्ट लेंस को जांच से कनेक्ट करें ।
- विशिष्ट लेंस के लिए संदर्भ बांह सेटिंग्स समायोजित (यहां, बिजली पर ०८६ और स्थिति में ९६४) ।
- बनाने यकीन है कि माउस विशेष लेंस कैसेट से पर्याप्त दूर है, कैसेट पर नाक बैंड के साथ काटने के बार देते हैं ।
नोट: लेंस और कैसेट के बीच की दूरी Z-अनुवादक पेंच, उद्देश्य के पीछे स्थित के साथ समायोजित किया जा सकता है । नाक बैंड एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लोचदार बैंड है, और उसके तनाव माउस के आकार के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए । - बिजली की आपूर्ति पर बारी (गाड़ी के निचले दाएं कोने) और फिर कंप्यूटर ।
- इमेजिंग प्रोग्राम शुरू करने के लिए, स्क्रीन पर उपयुक्त शॉर्टकट पर डबल क्लिक करें ।
नोट: यह लेंस के प्रकार पर निर्भर करता है; यहां, माउस रेटिना. - एक नया नैदानिक अध्ययन बनाने के लिए और वांछित प्रोटोकॉल जोड़ें । अंयथा, मौजूदा नैदानिक अध्ययन का उपयोग करें और/
- & #34 को चुनकर एक नए अध् ययन में जोड़ें; अि नाम & #34;; & #34; ID & #34;; & #34; उपचार शाखा निर्दिष्टीकरण & #34; (यहां, & #34; uncategorized & #34;); और पूर्वनिर्धारित & #34; स्कैन चलत & #34;, यदि वे मौजूद हैं.
- चयन आण & #34; परीक्षक & #34; म & #34; क्लिनिकल अययन & #34; खंड.
नोट: के लिए एक नया & #34; परीक्षक & #34;, जाने & #34; Setup परीक्षकों & #38; फिजीशियन & #34; इसे परिभाषित करने के लिए.
रोगी जोड़ें पर क्लिक करके रोगी/परीक्षा अनुभाग में एक नया रोगी जोड़ें - ; प्रवेश & #34; आईडी & #34;, & #34; नाम & #34;, & #34; वाही & #34;, & #34; सेक्स & #34;, व & #34;d एते जन्म & #34; (ऐच्छिक).
नोट: यह सिर्फ प्रत्येक माउस के परीक्षण से पहले, यदि अधिक सुविधाजनक है । सुनिश्चित करें कि ID 10 वर्णों से अधिक नहीं है । माउस के लिए, दोनों आंखों के लिए अपवर्तन दोष 0 है और अक्षीय लंबाई २३.० है । - & #34 पर क्लिक करें; जोड़ परीक्षा & #34; र चय द इि & #34;P rotocol & #34; जोड़कर & #34;P रिसेट स्कैन & #34; सूची से, आँख कि पहले मापा जाएगा के साथ शुरू (यहाँ, दाईं आंख), या स्कैन को अनुकूलित करके.
- स्कैन को अनुकूलित करने के लिए, या तो टेम्पलेट के रूप में मौजूदा स्कैन का उपयोग करें और उसे संपादित करें, या & #34 के माध्यम से इसे स्क्रैच से बनाएँ; कस्टम स्कैन & #34; विकल्प जोड़ें. सभी स्कैन को सूची में जोड़ने के बाद, & #34 का उपयोग कर एक नया प्रोटोकॉल निर्धारित करें; Enter & #34; नया प्रोटोकॉल नाम & #34; विकल्प (OS: oculus भयावह, बायां नेत्र; OD: oculus दायां, दाहिनी आंख).
नोट: यहाँ, प्रोटोकॉल तीन स्कैन शामिल हैं: (i) एक रेडियल स्कैन, एक १.४ मिमी व्यास, 0 मिमी क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर ऑफसेट के साथ, एक स्कैन के १,००० लाइनों/बी-स्कैन, १०० बी स्कैन/खंड, 1 फ्रेम/बी-स्कैन, निष्क्रिय की ८० लाइनों a-स्कैन/बी-स्कैन, और 1 मात्रा; (ii) एक आयताकार स्कैन, एक १.४ मिमी लंबाई और चौड़ाई के साथ, 0 & #176; कोण, 0 मिमी क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर ऑफसेट, १,००० लाइनों a-स्कैन/b-स्कैन, १०० b-स्कैन, 1 फ़्रेम/b-स्कैन, ८० निष्क्रिय की पंक्तियां a-स्कैन/b-स्कैन, और 1 वॉल्यूम; और (iii) एक कुंडलाकार स्कैन, एक ०.४ मिमी न्यूनतम और ०.६ मिमी अधिकतम व्यास के साथ, 0 मिमी क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर ऑफसेट, १,००० लाइनों के एक-स्कैन/बी-स्कैन, 3 बी-स्कैन/खंड, ४८ तख्ते/बी-स्कैन, ८० निष्क्रिय की लाइनें a-स्कैन/b-स्कैन, और 1 मात्रा.
- नेत्र फैलाव और स्थिरीकरण
- डेटा प्राप्ति से पहले कम से 15 मिनट, 10% phenylephrine आंख बूंदों माउस आंखों में टपकाना, अतिरिक्त निकालें, और ०.५% tropicamide आई ड्रॉप टपकाना ।
नोट: पहला फैलाव सभी चूहों कि सत्र में परीक्षण किया जाएगा के लिए एक बार में किया जा सकता है । सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ कमरे के तापमान पर हैं । - तुरंत सामान्य संज्ञाहरण उत्प्रेरण के बाद (चरण २.२), प्रशासन ०.४% oxybuprocaine हाइडरोक्लॉराइड नेत्र गिरता है, उन्हें जगह में रखने के लिए 3 एस के लिए anesthetize और आँखें मैटीरियल. बाद में, बूंदों से पोंछ और 10% phenylephrine और ०.५% tropicamide के जगाकर दोहराने कि आंखों अच्छी तरह से फैली हुई है पता लगाने के लिए ।
नोट: सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ कमरे के तापमान पर हैं और माउस oxybuprocaine. निगल नहीं करता है
- डेटा प्राप्ति से पहले कम से 15 मिनट, 10% phenylephrine आंख बूंदों माउस आंखों में टपकाना, अतिरिक्त निकालें, और ०.५% tropicamide आई ड्रॉप टपकाना ।
- सामान्य संज्ञाहरण
- खारा में संवेदनाहारी (20 मिलीग्राम/एमएल) और ketamine (१.१७ मिलीग्राम/एमएल) के एक xylazine समाधान तैयार करें । दुकान पर 4 & #176; ग अधिकतम 2 सप्ताह के लिए ।
- परीक्षण से पहले लगभग 5 मिनट, intraperitoneally इंजेक्षन 5-10 & #181; एल शरीर द्रव्यमान का 1 जी प्रति संवेदनाहारी समाधान के, उम्र और माउस के आकार पर निर्भर करता है.
नोट: युवा और/या पतले चूहे कम संवेदनाहारी की जरूरत है, anesthetize करने के लिए कम समय ले, लेकिन यह भी तेजी से जगाने । यहां, 8 & #181; L/जी (१६० मिलीग्राम/ketamine का किलो, ९.३३ mg/xylazine का किग्रा). - वैकल्पिक रूप से, चिपचिपा नेत्र बूंदों या corneal सूखापन से बचने के लिए एक नेत्र जेल के साथ आंखों चिकनाई ।
- चिपचिपा ग्लाइकोल के साथ आंखों चिकनाई-आधारित आंख बूंदें corneal जलयोजन प्रदान करने के लिए ।
नोट: यदि परीक्षा के दौरान आंखें सूख जाती हैं, तो आंखों की बूँदें फिर से लागू हो जाती हैं । - यह गर्म रखने के लिए सर्जिकल धुंध के एक पत्रक में माउस लपेट ।
- एक स्पंज या कपास बाती का उपयोग कर, प्रत्येक आंख पर ०.३% hypromellose के साथ एक नेत्र जेल की एक पतली परत लागू होते हैं, प्रकाश अपवर्तन को कम करने, opacities से बचने के लिए, और सुरक्षित corneal जलयोजन । ऐसा करते समय बरौनी और मूंछों को एक तरफ ले जाएं ।
- स्थिति कैसेट में माउस, सिर के साथ सीधे और आगे की ओर इशारा करते हुए ।
- धीरे से काटने बार दबाना खोलने और मुंह में पट्टी जगह; स्थिति को सुरक्षित करने के लिए नाक बैंड का उपयोग करें ।
नोट: यह सुनिश्चित करें कि काटने पट्टी कैसेट के बीच में है । - सही (बाएँ) पक्ष के तहत एक कॉटन रोल प्लेस अगर सही (बाएँ) आँख परीक्षण किया जा रहा है.
- जबकि क्लिप-माउस विशेष लेंस पर लक्ष्य टिप पर रखते हुए, यह जेड-अनुवादक पेंच सुइयों घूर्णन द्वारा आंख की ओर ले आओ ।
- घूर्णन और कैसेट कुंडा द्वारा और काटने पट्टी और एक्स-अनुवादक शिकंजा मोड़ द्वारा, पूर्व माउस की स्थिति निर्धारित; लक्ष्य के लिए सही आंख सीधे लेंस में देखो है, और इस तरह आंखों के ऑप्टिकल अक्षों और लेंस संरेखित करने के लिए है ।
नोट: यदि माउस बहुत अधिक या बहुत कम है, वाई-अनुवादक पेंच पहले इस्तेमाल किया जाना चाहिए । - & #34 में पहला स्कैन चुनें; परीक्षा & #34;, & #34 पर क्लिक करें; लक्ष्य प्रारंभ & #34;, और रेटिना इमेजिंग के लिए किसी भी आगे मैनुअल समायोजन करना.
- Z-अनुवादक पेंच का उपयोग करते हुए, रेटिना को बाएं फलक पर अनुलंब रूप में ले जाएं (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , क्षैतिज बी-स्कैन संरेखण) और क्षैतिज रूप से आर पराइट पैनल (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , कार्यक्षेत्र बी-स्कैन संरेखण).
- को घुमाने के लिए कैसेट को दाएँ फलक के बीच में ONH को ऊपर या नीचे ONH ले जाकर घुमाएँ. सही पैनल पर रेटिना को सीधा करने के लिए काटने के बार पेंच का प्रयोग करें । कैसेट को बाएँ फलक के मध्य में ONH की स्थिति में फेरना.
- बाएँ पैनल पर रेटिना स्तर के लिए एक्स-अनुवादक पेंच का उपयोग करें । प्रत्येक मॉडुलन के प्रमुख समारोह को ध्यान में रखते हुए, आगे ONH केंद्रस्थ करने के लिए रेटिना की स्थिति को समायोजित.
नोट: यदि आवश्यक हो, तो ONH ऊपर और नीचे सही पैनल पर ले जाने के लिए Y-अनुवादक पेंच का उपयोग करें । स्थिति स्कैन के बीच किसी भी समय परिष्कृत किया जा सकता है ।
- समायोजन के साथ सामग्री एक बार, & #34 पर क्लिक करें; स्नैपशॉट & #34 प्रारंभ करने के लिए, SD-oct स्कैनिंग शुरू करने के लिए ।
- यदि किसी 3d इमेजिंग की आवश्यकता नहीं है, तो OCU विकल्प को अनचेक करें.
- स्कैन और रिपोर्ट सहेजें ।
- अगले स्कैन के साथ आगे बढ़ें । छवि को
- दूसरी आंख, लेंस वापस लेने के बाद, कैसेट के अनुसार बारी और दोहराने के कदम ३.६-४.३ ।
- जब अधिग्रहण पूरा हो गया है, कैसेट से माउस को हटा दें, प्रत्येक आंख को ०.३% hypromellose के साथ नेत्र जेल लागू होते हैं, और एक हीटिंग प्लेट पर माउस को जगाने के लिए जगह है ।
- पिछले अधिग्रहण के बाद, सॉफ्टवेयर बंद करो और कंप्यूटर और OCT मशीन (बिजली की आपूर्ति बटन) बंद ।
- साफ-सफाई के साथ कैसेट.
- रेटिना परत मोटाई माप के लिए, निर्माता द्वारा प्रदान किए गए स्वचालित फॉल्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें.
- पर क्लिक & #34;P atient & #34; , इि & #34; परीक्षा & #34; से तत्कालीन सूची, और & #34 पर क्लिक करें; समीक्षा परीक्षा & #34; विकल्प.
- इच्छित स्कैन में फ़ोल्डर चिह्न पर राइट-क्लिक करके oct सॉफ्टवेयर पर वांछित oct डेटा लोड । B-स्कैन पर
- दायां क्लिक करें; कैलिपर्स को 10 मापने कैलिपर्स तक सक्षम करके कॉंफ़िगर करना; और उनके नाम, कोण और रंग दर्ज करें । B-स् कैन पर राइट-क्लिक करके वांछित कैलिपर चुनना
- ; इसे तदनुसार माप के लिए रेटिना पर रखें ।
नोट: ONH पर केंद्रित स्कैन के लिए, यह के प्रत्येक पक्ष पर 5 कैलिपर्स सेट, एक दूसरे से equidistant । peripapillary विश्लेषण के लिए, सुनिश्चित करें कि कैलिपर ONH से बहुत दूर नहीं रखा गया है । रेडियल स्कैनिंग के लिए, 10 तस्वीरें स्कैन कि अक्टूबर सॉफ्टवेयर के द्वारा चुना गया प्रति विश्लेषण । इनकी संख्या & #34; report & #34; फोल्डर में पायी जा सकती है. - एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में विश्लेषण के लिए परिणाम सहेजें B-स्कैन और क्लिक पर राइट-क्लिक करके & #34; save result & #34; .
नोट: परिणाम स्कैनिंग डेटा के रूप में एक ही फ़ोल्डर में पाया जा सकता है ।
- वैकल्पिक रूप से, घर का उपयोग करें कैलिपर स्थूल, & #34; एमआरआई रेटिना उपकरण & #34;, एक खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के लिए विकसित (सामग्री की तालिका देखें).
- सुनिश्चित करें कि & #34; एमआरआई रेटिना टूल & #34; और द & #34; बहुभुज अनुभाग उपकरण & #34 संशोधित करें; मैक्रोज़ सक्रिय हैं । छवि लोड । माप प्रारंभ करने के लिए m बटन पर क्लिक करें.
नोट: मैक्रो स्वचालित रूप से एक ०.२ mm-ONH के दोनों किनारों पर लंबे मापने कैसेट बनाता है । प्रत्येक कैसेट 5 अंक मापने कि कैलिपर्स के रूप में कार्य शामिल हैं । उनकी पार्श्व स्थिति unविनिमेय है और रेडियल स्कैन में peripapilla के लिए अनुकूलित है । कैसेट की क्षैतिज स्थिति RNFL/GCL मोटाई को मापने के लिए पूर्वनिर्धारित है, लेकिन इसके बजाय GC जटिल परत को मापने के लिए आसानी से परिवर्तनीय है । यदि स्कैन गुणवत्ता खराब है, तो क्षैतिज स्थिति समायोजित करने की आवश्यकता है, या चित्र को विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए ।
क्षैतिज समायोजन के लिए - , ई बटन पर क्लिक करें । नए खोले गए & #34; रोि धक & #34; विंडो, पहली कैसेट चुनें.
- नीले बहुभुज बटन पर क्लिक करें और चित्र में मापा परत की सीमाओं पर क्लिक करके पहली कैसेट की स्थिति को समायोजित.
- पहले इसे चुन कर दूसरी कैसेट के लिए दोहराएं & #34; रॉय मैनेजर & #34; विंडो और उसके बाद उपयुक्त छवि पर क्लिक करें । पुन: मापने के लिए r बटन पर क्लिक करें । परिणाम देखें & #34; माप & #34; window.
नोट: किसी भी समय किसी स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में परिणामों की प्रतिलिपि बनाई जा सकती है । वे सही कैसेट (आर), छोड़ दिया कैसेट (एल), और कुल: Intden-कैसेट के भीतर एकीकृत घनत्व के लिए निंनलिखित मूल्य होते हैं; क्षेत्र: माप का क्षेत्र, मिमी 2 में; लेन: कैसेट के भीतर कैलिपर की लंबाई, मिमी में; मतलब: कैसेट के भीतर संकेत की तीव्रता मतलब; और एसटीडी: सिग्नल के माध्य तीव्रता के मानक त्रुटि. - अगली छवि के साथ आगे बढ़ें ।
- आगे एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में डेटा का विश्लेषण ।
नोट: परत की मोटाई मतलब खोजने के लिए, दस लेन मूल्यों ले लो ।
- सुनिश्चित करें कि & #34; एमआरआई रेटिना टूल & #34; और द & #34; बहुभुज अनुभाग उपकरण & #34 संशोधित करें; मैक्रोज़ सक्रिय हैं । छवि लोड । माप प्रारंभ करने के लिए m बटन पर क्लिक करें.
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Representative Results
एसडी अक्टूबर प्रौद्योगिकी रेटिना कल्पना और मोटाई विश्लेषण है कि प्रोटोकॉल के बराबर है सक्षम बनाता है, लेकिन तेजी से और अधिक विस्तृत है (चित्रा 3) । wildtype C57Bl/6 चूहों के साथ प्रस्तुत के रूप में, हालांकि एक एसडी-OCT स्कैन की गुणवत्ता (आंकड़ा 3ए, सही) एक रेटिना पार की एक छवि के रूप में के रूप में अच्छा नहीं है खंड (आंकड़ा 3ए, छोड़ दिया), यह अधिक परतों (जैसे, OLM) visualizes. इसके अलावा, यह केवल के बारे में ४० मिनट लेता है, माउस तैयारी सहित, बनाम दिन या ऊतकीय विश्लेषण के लिए सप्ताह । अंत में, यह इस तरह के haematoxylin, eosin, और भगवा, जो ऊतक नुकसान और गलत डेटा के संग्रह के कारण हो सकता है के रूप में प्रसंस्करण और धुंधला की आवश्यकता नहीं है । रेटिना परतों को आसानी से अक्टूबर में मापने योग्य RNFL/GCL, आईपीएल, आईएनएल, OPL, केव, है/ओएस, RPE, और सी (चित्र बी), इसलिए पूरे रेटिना का एक जटिल अध्ययन के लिए अनुमति देता है । जैसे, संरचनात्मक रेटिना परिवर्तन रोग विकास को प्रतिबिंबित । OPNs के मामले में, यह RGCs और पर लागू होता है, और इस तरह RNFL/GCL और आईपीएल ।
DOA सबसे आम OPNs में से एक है और RGC अध कि और RNFL11के नुकसान की विशेषता है । OPA1 जीन12में उत्परिवर्तनों के कारण, यह दृश्य हानि और अंधापन की ओर जाता है । Opa1delTTAG माउस मॉडल है, जो मानव आवर्तक सी 2708delTTAG उत्परिवर्तन किया जाता है का उपयोग कर, यह पता चला था कि Opa1 haplo कमी एक सेक्स पर निर्भर तरीके से दृष्टि में बाधा8,9। यह रेटिना की मोटाई के OCT माप के आधार पर निर्धारित किया गया था, जो जीसी जटिल परत (चित्रा 4a) और peripapillary RNFL (चित्रा 4B, 4c) में Opa1+/ इन प्रयोगों में, गणना आयताकार स्कैन के लिए मानक कैलिपर्स के साथ और कुंडलाकार स्कैन के लिए एक खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ किया गया था. रेडियल स्कैन, जो अक्सर एक कम गुणवत्ता के है और विश्लेषण के लिए रेटिना प्रति 10 छवियों की एक ंयूनतम उत्पादन के लिए, एक घर का बना स्थूल विकसित किया गया था । मानक और घर का बना कैलिपर्स की तुलना (चित्रा 4d) RNFL/GCL और जीसी जटिल परतों के बाद के साथ मापा की एक काफी कम मोटाई दिखाया । इसका कारण यह है कि मानक कैलिपर्स ज्यादा मोटे होते हैं और लेयर की सीमा पर जगह बनाना ज्यादा मुश्किल होता है. इसलिए, पतली परतों के लिए मानक कैलिपर्स, विशेष रूप से रेडियल स्कैन पर उपयोग करने से बचने के लिए सबसे अच्छा है ।
संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, माउस विज़ुअल phenotyping के लिए SD-OCT की अनुमति देता है जिसे कई समय बिंदुओं में दोहराया जा सकता है । हालांकि, OCT स्कैन प्रकार और मापने विधि जांच रोग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और इस प्रकार प्रश्न में रेटिना परत । फिर भी, अक्टूबर पर्याप्त जानकारी प्रदान करता है रेटिना संरचना में दोषों की पहचान । हालांकि, यह आगे एक और विधि के साथ विश्लेषण के लिए अंतर्निहित तंत्र की एक पूरी समझ प्रदान करना चाहिए ।
चित्र 1: SD-OCT नेत्र इमेजिंग सिस्टम. (A) SD-OCT डिवाइस के आधार और उद्देश्य-रास भागों का ओवरव्यू । (ख) उद्देश्य-रास घटकों का अवलोकन । A: कंप्यूटर, B: विद्युत आपूर्ति, C: oct इंजन संदर्भ एआरएम, डी: SD-oct जांच, E: माउस-विशिष्ट लेंस, एफ: जेड अनुवादक, जी: AIM-रास सारणी, एच: Y-अनुवादक, मैं: कैसेट (रोटेटर), जंमू: काटो बार, कश्मीर – नाक बैंड, एल: कैसेट कुंडा, एम: एक्स-अनुवादक, और एन: लक्ष्य टिप । इस figute रंग-कोडित के रूप में चित्रा 2में, रेटिना की स्थिति के गैर-मॉडुलन के साथ गुलाबी में चिह्नित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: स्थिति रेटिना । B-स्कैन संरेखण के क्षैतिज (बाएँ) और अनुलंब (दाएँ) दृश्य. तीर रंग कोडित संग्राहक द्वारा प्रेरित आंदोलनों के अनुरूप है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: रेटिना परतों. (A) Wildtype माउस रेटिना प्रोटोकॉल के बाद haematoxylin, eosin, और भगवा धुंधला (बाएं) और SD-OCT (right); स्केल बार: ५० µm. (B) 3 माह पुराने wildtype चूहों के लिए रेटिना की मोटाई माप; n = 14, ± SEM मतलब, स्केल बार: ५० µm. GC: नाड़ीग्रंथि cell, RNFL/GCL: रेटिना तंत्रिका फाइबर परत/नाड़ीग्रंथि सेल परत, आईपीएल: इनर plexiform लेयर, आईएनएल: इनर न्यूक्लियर लेयर, OPL: आउटर plexiform लेयर, केव: बाहरी परमाणु परत, IS/OS: photoreceptor भीतरी सेगमेंट/ सेगमेंट, RPE: रेटिना वर्णक उपकला, और सी: रंजित. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: अनुकरणीय एसडी-अक्टूबर माप. (A) ONH पर केंद्रित आयताकार स्कैन में GC जटिल परत मोटाई, मानक कैलिपर्स के साथ मापा; Opa1delTTAG माउस लाइन, n = 4, मतलब ± SEM, * * p & #60; ०.०१ छात्र के टी-टेस्ट के साथ मूल्यांकन किया । (ख) Peripapillary RNFL एसडी-OCT. (ग) में Peripapillary RNFL मोटाई कुंडलाकार स्कैन, प्रति क्षेत्र RNFL क्षेत्र गणना के रूप में निर्धारित; Opa1delTTAG मादा चूहों, n = 5-11, मतलब ± SEM, * p & #60; ०.०५ ने छात्र के टी-टेस्ट के साथ मूल्यांकन किया । (D) RNFL/GCL, रेडियल स्कैन में GC जटिल परत मोटाई, क्रमशः 3 या 10 स्कैन के लिए मानक या घर का बना कैलिपर्स के साथ मापा; wildtype चूहों, n = 8, मतलब ± SEM, * * p & #60; ०.०१, * * * p & #60; ०.००१ विद्यार्थियों के टी-टेस्ट के साथ मूल्यांकन किया । RNFL/GCL-रेटिना तंत्रिका फाइबर परत/नाड़ीग्रंथि सेल लेयर, जीसी: नाड़ीग्रंथि सेल । आंकड़े ए-सी Sarzi एट अल से अनुकूलित । 9. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
अक्टूबर प्रणाली, एक गैर vivo इमेजिंग विधि में इनवेसिव, उच्च संकल्प रेटिना पार अनुभाग की तरह स्कैन प्रदान करता है. इस प्रकार, इसका मुख्य लाभ विस्तृत विश्लेषण के लिए अपनी क्षमता है, अद्भुत प्रोटोकॉल स्थानांतरित करने के लिए नियमित रूप से माउस मॉडल के लिए मनुष्यों के लिए लागू अवसर के साथ ।
Opa1delTTAG उत्परिवर्ती चूहों के उदाहरण में, एसडी अक्टूबर परिणाम RNFL और जीसी जटिल परत मोटाई, जो DOA pathophysiology9के आगे की खोज के लिए अनुमति की वृद्धि दिखाई । यह ऊतकीय विश्लेषण के साथ पूरी तरह से संभव नहीं होता । इसकी तुलना में, प्रोटोकॉल कुंडलाकार या रेडियल अक्टूबर स्कैन के विपरीत, पूरे रेटिना कल्पना करने के लिए संभावना प्रदान नहीं करता है । इसके अलावा, यह अधिक समय लेने वाली और महंगा है, कई समय अंकों के साथ पढ़ाई में जानवरों की संख्या में वृद्धि को देखते हुए । वास्तव में, एसडी अक्टूबर DOA में एक नया रेटिना सेल प्रकार ठहराना के लिए मार्ग प्रशस्त, म्यूलर सेल9. यह तथ्य यह है कि न तो एकल सेल संकल्प और न ही विशिष्ट सेल पहचान प्रणाली के साथ संभव है के बावजूद किया गया था । इसके विपरीत, मोटाई-केंद्रित और/या peripapillary क्षेत्र के सामांय राज्य केंद्रित विश्लेषण काफी हद तक सेलुलर गिरावट का पता लगाने के लिए पर्याप्त है । प्रोटोकॉल के साथ अतिरिक्त जांच तो क्या देखने के लिए की एक स्पष्ट विचार के साथ आयोजित किया जा सकता है । इसलिए, एक ही विधि भी उपचारात्मक हस्तक्षेप के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता को रोकने या ब्रेक रेटिना अध...
आगे OCT की उपयोगिता में सुधार करने के लिए, घर का बना कैलिपर्स विकसित किए गए थे और मानक वालों की तुलना में एक बहुत अधिक सटीक था । हालांकि मानक RNFL/GCL से मोटा है, कुछ टीमों को वैसे भी उपयोग करते हैं, लेकिन बड़े परतों13के लिए । यहां, हम रेटिना प्रति 10 रेडियल स्कैन में RGCs पर तुलनात्मक विश्लेषण ध्यान केंद्रित, peripapillary क्षेत्र में सभी । अकेले RNFL रेडियल स्कैन पर मध्यम श्रेणी का नहीं था या तो रास्ता । यह परत बहुत पतली और अस्पष्ट थी; इसलिए, RNFL/GCL और GC जटिल परत के बजाय मापा गया था । एक ही समय में, हम कुंडलाकार स्कैन का उपयोग कर RNFL को मापने में सफल रहा है, जो माउस phenotyping के लिए फायदेमंद साबित हुआ । हालांकि, विश्वसनीयता विवादास्पद हो सकता है । इन सभी दृष्टिकोणों में, महत्वपूर्ण कदम ONH पर स्कैन केंद्र और छाया और opacities बिना रेटिना कल्पना करने के लिए किया गया था । पूर्व आसानी से रेटिना की स्थिति के संदर्भ में प्रोटोकॉल के चरणों का पालन करके समायोजित किया जा सकता है । बाद कॉर्निया और क्रिस्टलीय के संप्रेषण पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, यदि नेत्र जेल असमान फैला हुआ है, स्कैन धुंधला है और/या रेटिना लगता है तुला । इसे ठीक करने के लिए, यह ठीक से फिर से जेल लागू करने के लिए पर्याप्त होगा । यदि क्रिस्टलीय अपारदर्शी है, स्कैन अंधेरे या अधूरा है । यहां समाधान के लिए एक और दिन स्कैन दोहराना होगा, अगर क्रिस्टलीय रिटर्न की पारदर्शिता । एक खराब गुणवत्ता स्कैन के लिए एक और संभावित कारण ऐसी मूंछ या बरौनी के रूप में बाधाओं, की उपस्थिति है । ये आसानी से अलग सेट और नेत्र जेल के एक छोटे से लागू करने के लिए उंहें जगह में पकड़ द्वारा हटाया जा सकता है । अंय विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण है कि उपकरण प्रकार, स्कैन प्रकार, कोण के संदर्भ में अलग है, और अंय मापदंडों के रूप में अच्छी तरह से मौजूद है और विश्लेषण छवियों की संख्या बदलती है । परिणाम गुणवत्ता अभी भी संतोषजनक नहीं है, तो यह माना जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, लियू एट अल. कई कोणों पर रेडियल स्कैन लिया13, हमारे रेडियल स्कैन की तुलना में केवल एक पर, थोड़ा मोटा परतों की रिपोर्टिंग । फिर भी, अक्टूबर अधिग्रहण और विश्लेषणात्मक इस पांडुलिपि में प्रस्तावित दृष्टिकोण peripapillary माउस रेटिना में RGCs का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल हैं ।
अंत में, अक्टूबर महान क्षमता के साथ एक तकनीक है । यह रेटिना संरचना में सूक्ष्म परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम बनाता है-RGCs सहित, विशेष रूप से OPNs के संबंध में-और दृष्टि विज्ञान के लिए अपरिहार्य साबित होता है. इसलिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल OPN माउस मॉडल phenotyping के लिए व्यावहारिक है, साथ ही साथ उपंयास चिकित्सा के मूल्यांकन के लिए ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम Inserm, विश्विद्यालय मोंटेपेल्लियर, रेटिना फ्रांस, यूनियन नेशनल डेस Aveugles एट Déficients Visuels (UNADEV), एसोसिएशन सिंड्रोम डे Wolfram, स्नेहा डालो ला सूक्ष्म Médicale, शौकीनों डी फ्रांस, और उत्कृष्टता की प्रयोगशाला द्वारा समर्थित किया गया था EpiGenMed कार्यक्रम.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al.
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).
- Lenaers, G., et al.
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
