Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור ויוו ההדמיה של הרשתית עכבר עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (SD-אוקטובר). הוא מתמקד תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר) באזור peripapillary, עם מספר סריקה וכימות הגישות שתוארו.
Abstract
שינויים מבניים ברשתית הם ביטויים נפוצים במחלות אופטלמולוגיות. טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) מאפשר את זיהוי ויוו– במהירות, שוב ושוב ו ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר הדמיה OCT ברשתית עכבר בתור כלי רב עוצמה כדי ללמוד אופטיים צווארית (OPN). מערכת OCT היא חלופה מבוססת על אינטרפרומטריה, לא פולשנית נפוצות לאחר המוות מבחני היסטולוגית. הוא מספק הערכה מהיר ומדויק של עובי הרשתית, מתן אפשרות לעקוב אחר שינויים, כגון דילול או עיבוי רשתית. אנו מציגים את תהליך וניתוח הדמיה עם הדוגמה של הקו העכברdelTTAG Opa1. שלושה סוגי סריקות מוצעים, עם שתי שיטות כמת: מחוגה סטנדרטי, תוצרת בית. האחרון הוא הטוב ביותר עבור שימוש על הרשתית peripapillary במהלך סריקות רדיאלי; להיות מדויקת יותר, עדיף ניתוח דק יותר מבנים. כל הגישות המתוארות כאן מיועדים תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר), אבל הם בקלות לצורכי אוכלוסיות תאים אחרים. לסיכום, OCT הוא יעיל בהעכבר דגם phenotyping ויש לו פוטנציאל לשמש להערכה אמינה של התערבויות טיפוליות.
Introduction
הטה א הוא כלי אבחון המאפשרת הבחינה של מבנים ברשתית1, לרבות ראש עצב הראייה (ONH). השנים זה הפך מחוון מהימן של התקדמות המחלה בני אדם2,3, כמו גם מכרסמים4,5. היא משתמשת אינטרפרומטריה ליצור תמונות חתך של שכבות הרשתית ברזולוציה צירית 2-מיקרומטר. השכבה הפנימית ביותר היא סיב העצב ברשתית השכבה (RNFL), המכיל אקסונים מהרשות לשיקום האסיר, אשר מלווה את השכבה תא גנגליון (שזכתה), המכיל בעיקר מהרשות לשיקום האסיר גופות. הבא הוא plexiform השכבה הפנימית (IPL), שבו מהרשות לשיקום האסיר דנדריטים נפגשים אקסונים תא דו-קוטבי אופקי, אמקרין. אלה, יחד עם תאים אופקיים, טופס גרעיני השכבה הפנימית (להיכנס), וחבר בליטות שלהם עם קולט אור אקסונים בשכבה plexiform החיצונית (OPL). זה ואחריו את הגרעין השכבה החיצונית (גרת), עם הגופים תא קולט אור, מופרדת מן השכבה קולט אור באמצעות הגבלת הממברנה החיצונית (OLM), הנקרא גם על קטע קטע פנימי/חיצוני (IS / OS) שכבה. לבסוף, הרבדים הנצפה האחרון ברשתית העכבר הן את אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) דמית (C). RNFL לבד בדרך כלל דק מדי כדי למדוד עכברים; לכן, מנתחים את RNFL/שזכתה במקום הוא עדיף4,5. אפשרות אחרת היא השכבה מורכבים GC, אשר מכיל שהאחרון בנוסף IPL, מקל עבה ולכן אפילו למדוד ב- OCT סורק4. כתוצאה מכך, OCT יכול לספק תובנה מצב פתולוגי של הרשתית, כמו למשל ב- OPNs.
לחלופין, עובי הרשתית העכבר לעיתים קרובות ניתוח עם היסטולוגיה אחרי המוות . עם זאת, מגבלות פרצופים זו טכניקה הנוגעים אוסף רקמה, קיבוע, חיתוך, מכתים, הרכבה, וכדומה ומכאן, כמה פגמים, כגון שינויים עובי עדין, לא ניתן לאתרם. בסופו של דבר, כי העכבר אותו אין אפשרות לבדוק על כמה זמן נקודות, מספר החיות לאדם ללמוד רבות עולה, בניגוד OCT. בסך הכל, האפשרות הלא-invasiveness, ברזולוציה גבוהה, על החזרה, זמן ניטור בזמן, קלות השימוש של הטכנולוגיה OCT להגיע לשיטת הבחירה בלימודי מחלות רשתית
העכבר מודלים משמשים כדי לזהות פגמים הגן התירי המנגנונים המולקולריים שבבסיס retinopathies6. OPN הוא צורה של רטינופתיה עם נזק משמעותי עצב הראייה (ב), אשר מורכב של-1.2 מיליון אקסונים מהרשות לשיקום האסיר. OPN ניתן התמקדו ON או יכול להיות משני הפרעות, מולדת או לא7, אחרים מובילה לאובדן שדה ראייה, מאוחר יותר, עיוורון. התכונות האופייניות של OPN אובדן מהרשות לשיקום האסיר, על נזק, אשר יכול להיות שנצפו באוקטובר אנושי וגם RNFL שזכתה דליל2,3. בינתיים, הפתופיזיולוגיה של OPN הוא עדיין ממעטים להבין, ומכאן הצורך בדיקת רשתית העכבר נשאר.
כתב יד זה מתאר את הדמיה של כימות של עובי שכבת הרשתית, באמצעות הדוגמה של Opa1delTTAG עכבר קו8,9, דגם של ניוון אופטיים דומיננטי (מא ח)10. כדי להעריך פתופסיולוגיה מהרשות לשיקום האסיר, סריקות רדיאלי, מלבני, טבעתי היו לכמת. זה נעשה עם מחוגה הסטנדרטי שסופק על-ידי התוכנה OCT או עם מאקרו תוצרת בית שפותחו עבור תוכנית עיבוד תמונה פתוח. הרכיבים מאוזנים סטנדרטיים הם קשה לתמרן לעיתים קרובות עבה יותר RNFL/שזכתה, ואילו הרכיבים מאוזנים תוצרת בית קל לשימוש, הדירים מדויקת יותר. המאקרו מבצעת מדידה עבור שכבת זוהה אוטומטית, 5 נקודות ו עמדות קבועות, משני צידי ONH באזור peripapillary. המטרה של פרוטוקול הציג היא לתאר את רכישת סריקה OCT כדי לציין מיקום ברשתית, עם דגש על RGCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נסיוני אושרה על-ידי santé הלאומי דה לה אינסטיטוט et de la médicale רשרש (Inserm; מונפלייה, צרפת), עולה בקנה אחד עם הוראות האירופית, תואם ההצהרה ארוו עבור שימוש של החיות במחקר אופטלמולוגיות. התבצע תחת ההסכם של לנגדוק רוסיון Comity של המוסר בניסויים חיה (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).
1. התקנת ציוד והכנות מראש הדמיה
הערה: כאן, בוצעה OCT רשתית העכבר באמצעות תחום ספקטרלי (SD) אופטלמולוגיות הדמיה מערכת ( איור 1 א'). המנגנון SD-אוקטובר מורכב בסיס של הר הדמיה בעלי חיים (AIM) עם שלב יישור מכרסמים (RAS) ( איור 1B). הבסיס כולל את המחשב, המנוע OCT, החללית SD-אוקטובר העדשה העכבר ספציפיים. המכשיר מותקן אל המטרה, אשר כוללת את Z-מתרגם. RAS משמש עבור העכבר מיצוב הודות הטבלה עם X - ו Y-המתרגם, בקלטת כי ניתן לסובב הסתובבה, ובר נשלף ביס עם הלהקה האף. התוכנה שסיפק היצרן מאפשר רכישה ומכירה ניתוח של קבצים OCT, למרות שהאחרון יכול להיעשות גם באמצעות תוכנית עיבוד התמונה פתוח.
- בחוזקה למקם את המכשיר המטרה.
- להתחבר העדשה העכבר ספציפיים החללית.
- להתאים את ההגדרות הזרוע הפניה עבור העדשה ספציפי (כאן, כוח-086 ומעמד -964).
- מוודא כי העכבר הספציפיים עדשה מגיע רחוק מספיק הקלטת, לצרף הבר ביס עם הלהקה אף על גבי הקלטת.
הערה: המרחק בין העדשה את הקלטת עשויה להיות מותאם עם הבורג Z-מתרגם, שנמצא בגב המטרה. הלהקה אף הוא רצועה אלסטית זמינים מסחרית, המתח שלו צריך להיות מותאם בהתאם לגודל של העכבר. - להפעיל את אספקת החשמל (בפינה הימנית התחתונה של העגלה), ולאחר מכן המחשב.
- להשיק את התוכנית הדמיה, לחץ פעמיים על קיצור הדרך המתאימה במסך.
הערה: זה תלוי בסוג של העדשה; . הנה, עכבר רשתית. - ליצור מחקר קליני חדש ולהוסיף את הפרוטוקולים הרצוי. אחרת, השתמש קיים מחקר קליני ו/או פרוטוקולים של.
- להוסיף מחקר חדש על-ידי בחירה " ללמוד NameŔ " IDŔ " מפרט בזרוע הטיפול " (כאן, " Uncategorized "); ומוגדרות מראש " פרוטוקולים סריקה ", אם הם קיימים.
- בחר " בוחן " ב " מחקר קליני " סעיף.
הערה: עבור חדש " בוחן ", אני הולך " ההתקנה הבוחנים & רופאים " כדי להגדיר את זה
סעיף - הוסף מטופל חדש בבחינה/המטופל על ידי לחיצה על הוסף חולה; הזנת " מזהה ", " שם ", " שם המשפחה ", " סקס ", ו " תאריך לידה " (אופציונלי).
הערה: לעשות זאת לפני בדיקות כל עכבר, אם יותר נוח. ודא כי המזהה הוא לא יותר מ- 10 תווים. על העכבר, השגיאה השבירה עבור שתי העיניים הוא 0, והוא אורך צירית 23.0. - לחץ על " הבחינה להוסיף " ובחר את הרצוי " פרוטוקול " על-ידי הוספת " מראש סורק " מהרשימה, מתחיל עם העין זה נמדד קודם (כאן, העין הימנית), או על-ידי התאמה אישית של הסריקות.
- כדי להתאים אישית סריקה, השתמש בסריקה קיים כתבנית, לערוך אותו, או ליצור אותו מאפס דרך " להוסיף סריקה מותאמת אישית " אפשרות. לאחר הוספת כל הסריקות לרשימה, הגדר באמצעות פרוטוקול חדש " Enter " שם פרוטוקול חדש " אפשרות (OS: אוקולוס מרושע, שמאל עין; OD: אוקולוס דקסטר, נכון העין).
הערה: כאן, הפרוטוקול כוללת שלושה סריקות: סריקה רדיאלי (i), עם קוטר 1.4 מ מ, מ מ 0 קיזוז אופקי ואנכי, 1,000 שורות של A-סריקות/B-סריקה, 100 B-סריקות/נפח, 1 מסגרת/B-סריקה 80 שורות של לא פעיל A-סריקות/B-סריקה, כרך 1; (ii) סריקה מלבני, עם 1.4 מ מ אורך, רוחב, 0° זווית, 0-מ מ קיזוז אופקי ואנכי, 1,000 שורות של A-סריקות/B-סריקה, B 100-סריקות, 1 מסגרת/B-סריקה 80 שורות של לא פעיל A-סריקות/B-סריקה, כרך 1; (iii) טבעתי לסרוק, עם 0.4 מ מ המרבי מינימום ו- 0.6-מ מ קוטר, קיזוז אופקי ואנכי 0-מ מ, 1,000 שורות של A-סריקות/B-סריקה, 3 B-סריקות/נפח, 48 מסגרות/B-סריקה 80 שורות של לא פעיל A-סריקות/B-סריקה, כרך 1-
2. העכבר הכנה
- רשמו את הנייח
- לפחות 15 דקות לפני ייבוא נתונים, להקנות 10% phenylephrine טיפות עיניים בעיניים בעכבר להסיר את עודף, להחדיר טיפות עיניים tropicamide 0.5%-
הערה: הרחבה הראשונה יכול להיעשות בבת אחת עבור כל העכברים שנבחנו בהפעלה. ודא הנוזלים בטמפרטורת החדר. - מיד לאחר גרימת הרדמה כללית (שלב 2.2), לנהל 0.4% oxybuprocaine הידרוכלוריד טיפות עיניים, לשמור אותם במקום 3 s עזים ומתנגד, לשתק את העיניים. לאחר מכן, לנגב את הטיפות וחזור על החדרה של 10% tropicamide phenylephrine ו- 0.5% לוודא כי העיניים טוב מורחבים.
הערה: ודא כי הם הנוזלים בטמפרטורת החדר, כי העכבר ולא לבלוע את oxybuprocaine.
- לפחות 15 דקות לפני ייבוא נתונים, להקנות 10% phenylephrine טיפות עיניים בעיניים בעכבר להסיר את עודף, להחדיר טיפות עיניים tropicamide 0.5%-
- הרדמה כללית
- להכין פתרון הרדמה קטמין (20 מ"ג/מ"ל), חריגות השירותים הווטרינריים (1.17 mg/mL) בתוך תמיסת מלח. חנות ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 2 שבועות.
- כ 5 דקות לפני בדיקה, להזריק intraperitoneally µL 5-10 של הרדמה פתרון לכל 1 g של מסת הגוף, בהתאם הגיל והגודל של העכבר.
הערה: צעיר ו/או עכברים דק צורך פחות הרדמה, לקחת פחות זמן עזים ומתנגד, אבל גם להתעורר מהר יותר. כאן, µL 8/g (160 מ"ג/ק"ג של קטמין, 9.33 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים). - אופציונלית, לשמן את העיניים עם טיפות עיניים צמיגה או של ג'ל עיניים כדי למנוע יובש הקרנית.
3. מיקום העכבר
- Lubricate העיניים בעין מבוססת-גליקול צמיגה טיפות כדי לספק לחות הקרנית.
הערה: אם העיניים נראה יבש במהלך הבחינה, להחיל מחדש את טיפות העיניים. - לעטוף את העכבר בתוך פיסת גזה כירורגית כדי לחמם את זה.
- באמצעות פתיל ספוג או כותנה, למרוח שכבה דקה של ג'ל עיניים עם hypromellose 0.3% על כל עין, כדי למזער השתברות האור, להימנע opacities, הידרציה הקרנית המאובטח. תוך כדי כך, להזיז את הריסים שפם הצידה.
- מיקום העכבר בקלטת, עם העבר לנמענים ישר והמצביע ראש.
- בעדינות פתח את המלחציים בר ביס, מניחים את הבר בפה; השתמש הלהקה האף כדי לאבטח את המיקום.
הערה: ודא לבר נשיכה זו באמצע הקלטת. - המקום כותנה לגלגל תחת בצד הנכון (שמאל) אם העין הימנית (שמאל) נבחנת.
- תוך שמירה על העדשה העכבר ספציפיים העצה מכוון על הבגד, תביא את זה לכיוון העין על ידי סיבוב הבורג Z-מתרגם נגד כיוון השעון.
- על ידי סיבוב ושינוי מחוזרים בקלטת על ידי הפיכת הבר ביס ו- X-מתרגם את הברגים, מראש להגדיר את המיקום של העכבר; המטרה היא עין ימין נראה ישירות לתוך העדשה, ובכך כדי ליישר את הצירים אופטי של עיני העדשה.
הערה: אם העכבר אינו גבוה מדי או נמוך מדי, הבורג Y-מתרגם אמור לשמש הראשון. - לבחור את הסריקה הראשונה " מבחן ", לחץ על " להתחיל מכוון ", ולא לערוך כיוונונים ידניים נוספים עבור הדמיה ברשתית.
- באמצעות הבורג Z-מתרגם, להעביר הרשתית אנכית בלוח השמאלי ( איור 2, יישור אופקי B-scan) אופקית על ה-rלוח בסדר ( איור 2, יישור אנכי B-scan).
- סובב את הקלטת כדי להביא את ONH באמצע הפאנל הנכון על-ידי הזזת את ONH למעלה או למטה. השתמש את הבורג בר ביס כדי ליישר את הרשתית בלוח השמאלי. המסתובב את הקלטת כדי למקם את ONH במרכז החלונית השמאלית.
- להשתמש הבורג X-מתרגם ברמת הרשתית על החלונית השמאלית. במחשבה הפונקציה העיקרית של כל אפנן, להתאים את המיקום של הרשתית כדי לרכז את ONH.
הערה: השתמש הבורג Y-מתרגם כדי להעביר את ONH למעלה ולמטה בלוח השמאלי, במידת הצורך. המיקום יכול להיות מעודן בכל עת בין הסריקות.
4. SD-אוקטובר הדמיה של ONH ושל רשתית
- ברגע תוכן עם ההתאמות, לחץ על " בזק להתחיל " כדי להתחיל את הסריקה SD-OCT.
- אם הדמיה תלת-ממדית אינה נחוצה, בטל את האפשרות OCU.
- להציל את הסריקה ואת הדו ח.
- להמשיך עם הצילומים הבא.
- לשיקוף את העין השנייה, לאחר היציבה העדשה, להפוך את הקלטת בהתאם וחזור על שלבים 3.6-4.3-
5. השלמת רכישת
- השלמת הרכישה, להסיר את העכבר מ בקלטת, להחיל אופטלמולוגיות ג'ל עם 0.3% hypromellose לעין כל, ומקם את העכבר על צלחת חימום להעיר למעלה
- לאחר הרכישה האחרונה, לסגור את התוכנה, כבה את המחשב ואת מכונת OCT (לחצן אספקת כוח).
- לנקות את הקלטת עם חומר חיטוי.
6. ניתוח
- עבור המידה עובי שכבת הרשתית, להשתמש בתוכנה אוטומטית פילוח שסיפק היצרן.
- לחץ על " חולה ", לבחור את הרצוי " הבחינה " מתוך רשימה, ואז לחץ על " סקירה מבחן " אפשרות.
- לטעון את הנתונים הרצויים OCT על גבי התוכנה OCT על-ידי לחיצה ימנית על סמל התיקייה הרצויה שנסרקו.
- ממש לחצו על B-scan; לקבוע את התצורה של הרכיבים מאוזנים על ידי הפעלת עד 10 מדידה מחוגה; והזן שמות, זוויות והצבעים שלהם.
- בחירה של caliper המבוקש על ידי לחיצה ימנית על B-scan; למקם אותו בהתאם על הרשתית למדידה.
הערה: על הצילומים שבמרכזה של ONH, הגדרת מחוגה 5 מכל צד של זה, קו מקביל אחד מהשני. הניתוח של peripapillary, ודא כי caliper ממוקמת לא רחוק מדי ONH. לסריקה רדיאלי, לנתח 10 תמונות לפי הסריקה, אשר נבחרו על ידי תוכנת OCT. המספרים שלהם ניתן למצוא " דוחות " תיקיה. - לשמור את התוצאות עבור ניתוח בתוכנית תוכנת הגיליון האלקטרוני על-ידי לחיצה על B-scan ולחיצה " לשמור תוצאות ".
הערה: התוצאות ניתן למצוא באותה תיקיה שבה הנתונים סריקה.
- לחילופין, להשתמש במאקרו caliper תוצרת בית, " MRI רשתית כלי ", התפתחה עבור תוכנית עיבוד התמונה פתוח (ראה טבלה של החומרים).
- לוודא " MRI רשתית כלי " ו " לשנות מצולע סעיף כלי " מאקרו פעילים. טען את התמונה. לחץ על לחצן m כדי להתחיל את המדידה.
הערה: המאקרו יוצר באופן אוטומטי אחת 0.2 מ מ באורך מדידה קלטת משני צידי ONH. שכל קלטת מכיל 5 נקודות מדידה שהפונקציה כמו מחוגה. עמדתם לרוחב שאינו ניתן לשינוי, הוא מותאם אישית עבור peripapilla סריקות רדיאלי. המיקום האופקי של הקלטות מראש כדי למדוד את עובי RNFL/שזכתה, אבל זה בקלות לשינוי כדי למדוד את השכבה מורכבים GC במקום. אם איכות הסריקה הוא עני, המיקום האופקי צריכה תיקון או התמונה זקוקה ייכללו הניתוח. - התאמת אופקי, לחץ על הלחצן e. ב שנפתח " רועי מנהל " חלון, בחר את הקלטת הראשונה.
- לחץ על המצולע כחול לחצן ולהתאים את המיקום של קלטת הראשונה על-ידי לחיצה על גבולות השכבה נמדד בתמונה.
- חוזר לרגע קלטת על-ידי בחירת הראשון זה " רועי מנהל " חלון ו ולחיצה על התמונה המתאימה. לחץ על הלחצן ' r ' למדוד מחדש. להציג את התוצאות ב- " מדידות " החלון.
הערה: התוצאות עשוי להעתיק תוכנית גיליון אלקטרוני בכל עת. הם מכילים את הערכים הבאים עבור קלטת נכון (r), שמאלה קלטת (l), סה כ: Intden - צפיפות משולב בתוך בקלטת; : איזור המדידה, מ מ 2; לן: אורך caliper בתוך בקלטת, מ מ; אומר: כלומר עוצמת האות בתוך בקלטת; ו Std: שגיאת תקן של עוצמת האות רשע. - להמשיך עם התמונה הבאה.
- עוד יותר לנתח את הנתונים בגיליון האלקטרוני תוכנה.
הערה: כדי למצוא את עובי השכבה מרושע, לקחת לן עשרה ערכים.
- לוודא " MRI רשתית כלי " ו " לשנות מצולע סעיף כלי " מאקרו פעילים. טען את התמונה. לחץ על לחצן m כדי להתחיל את המדידה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-אוקטובר הטכנולוגיה מאפשרת מדמיין ברשתית, ניתוח עובי דומה לדקל היסטולוגיה, אך הוא מהיר יותר, מפורט יותר (איור 3). כפי שהוצג עם עכברים wildtype C57Bl/6, למרות שאיכות בסריקה SD-אוקטובר (איור 3A, מימין) אינה טוב כמו זה של תמונה של חתך ברשתית (איור 3 א, שמאלה), הוא מדמיין יותר שכבות (למשל, OLM). יתר על כן, זה לוקח רק כ- 40 דקות, כולל הכנה העכבר, לעומת ימים או שבועות לבדיקה היסטולוגית. בסופו של דבר, זה לא דורש ועיבוד מכתים, כגון haematoxylin, אאוזין זעפרן, אשר עלול לגרום נזק לרקמת ולגרום האוסף של נתונים שגויים. שכבות הרשתית למדידה בקלות באוקטובר להקיף את RNFL/שזכתה IPL, להיכנס, OPL, גרת, IS / OS, RPE ו- C (איור 3B), ולכן התרת מחקר מורכבות של הרשתית כולו. ככזה, שינויים מבניים ברשתית לשקף התפתחות המחלה. במקרה של OPNs, זה חל RGCs ו- ON, ובכך RNFL/שזכתה ו IPL.
מא ח הוא אחד OPNs הנפוץ ביותר והוא מאופיין על ידי ניוון מהרשות לשיקום האסיר ואובדן של ה RNFL11. עקב מוטציות גנים OPA1 12, זה מוביל לקות ראייה ועיוורון. שימוש במודל עכברdelTTAG Opa1, אשר נושא את המוטציה c.2708delTTAG חוזרים ונשנים אנושי, התגלה כי Opa1 האפלו-אי ספיקה מעכבת חזון באופן יחסי מין תלוית8,9. זה נקבע על סמך OCT מדידות של עובי הרשתית, אשר הראה עיבוי הדרגתי של GC מורכבים בשכבה (איור 4A), את peripapillary RNFL (איור 4B, 4 C) Opa1+ /- נקבות. בניסויים אלה, החישובים נעשו עם הרכיבים מאוזנים סטנדרטי עבור סריקות מלבני, עם תמונה פתוח עיבוד תוכנית על הסריקות טבעתי. עבור סריקות רדיאלי, אשר לעיתים קרובות הן של איכות נמוכה יותר התוצרת שפותחה מינימום של 10 תמונות לכל הרשתית לניתוח, מאקרו תוצרת בית. השוואה בין הרכיבים מאוזנים סטנדרטי, תוצרת בית (איור 4D) הראה נמוך באופן משמעותי עובי RNFL/שזכתה ו GC ברבדים נמדד עם האחרון. זה בגלל הרכיבים מאוזנים סטנדרטיים הם הרבה יותר עבה וקשה יותר למקם הגבול של השכבה. לכן, עדיף להימנע משימוש הרכיבים מאוזנים סטנדרטי עבור שכבות דק, במיוחד על סריקות רדיאלי.
לסיכום, ה-SD-OCT מאפשר phenotyping חזותי העכבר שיכול לחזור על פני מספר נקודות זמן. עם זאת, שיטת סוג הסריקה OCT ומדידת חייב להיות מותאם המחלה ובדוקים, ובכך השכבה ברשתית המדובר. למרות זאת, OCT מספק די מידע כדי לזהות פגמים במבנה הרשתית. עם זאת, זה יש נוספת לנתח בשיטה אחרת כדי לספק הבנה מלאה של המנגנונים המשמשת כבסיס.
איור 1: מערכת הדמיה אופטלמולוגיות SD-OCT. מבט כולל על בסיס של AIM-ראס חלקי המכשיר SD-אוקטובר (A). מבט כולל על הרכיבים AIM-ראס (B). ת: מחשב, ב': אספקת החשמל, c: OCT מנוע הפניה הזרוע, בדיקה d: SD-אוקטובר, עדשה העכבר ספציפיים: E, f: Z-מתרגם, ז': המטרה-ראס שולחן, ח': Y-מתרגם, i: קלטת (rotator), j: ביס בר, K – האף הלהקה, l: קלטת המסתובב, מ' X-מתרגם ו n: מכוון עצה. Figute הזה מסומן בצבע כמו באיור 2, עם אי-מאפננים של העמדה ברשתית מסומן בוורוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מיצוב הרשתית. אופקי (משמאל) ונוף אנכי (מימין) של היישור B-scan. החצים תואמות תנועות שנגזרות את מאפננים מקודדות לפי צבעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שכבות הרשתית. (א) Wildtype העכבר היסטולוגיה הרשתית לאחר haematoxylin, אאוזין, זעפרן מכתים (שמאל) ו SD-אוקטובר (מימין); סרגל קנה מידה: 50 עובי הרשתית המידות מיקרומטר. (B) עבור עכברים בן חודש wildtype 3; n = 14, כלומר ± SEM, סולם בר: 50 מיקרומטר. GC: תא גנגליון, RNFL/שזכתה: סיבי עצב ברשתית שכבת תאים שכבה/גנגליון, IPL: השכבה הפנימית plexiform, להיכנס: השכבה הפנימית גרעינית, OPL: השכבה החיצונית plexiform, גרת: השכבה החיצונית גרעינית, IS / OS: קולט אור פנימי מקטעים/החיצוני מגזרים, RPE: אפיתל הפיגמנט ברשתית, ו- c: דמית העין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: SD למופת-אוקטובר מדידות. (א) GC עובי השכבה מורכבים מלבני סריקות שבמרכזה ONH, נמדד עם הרכיבים מאוזנים רגיל; קו העכברdelTTAG Opa1, n = 4, זאת אומרת ± SEM, * * p < 0.01 העריך עם מבחן t של סטודנט. (B) RNFL Peripapillary עובי RNFL Peripapillary SD-אוקטובר (C) סריקות טבעתי, נחוש כחישוב אזור RNFL לכל שדה; Opa1delTTAG עכברים הנשי, n = 5-11, זאת אומרת ± SEM, * p < 0.05 העריך עם מבחן t של סטודנט. עובי השכבה מורכבים (D) RNFL/שזכתה ו- GC סריקות רדיאלי, נמדד עם מחוגה רגילה או תוצרת בית עבור סריקות 3 או 10, בהתאמה; עכברים wildtype, n = 8, זאת אומרת ± SEM, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 העריך עם מבחן t של סטודנט. RNFL/שזכתה - סיב העצב ברשתית שכבת תאים שכבה/גנגליון, GC: תא גנגליון. דמויות C A-מקורי. Sarzi et al. 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת OCT, יישום לא פולשנית ויוו הדמיה שיטה, מספק cross section דמוי הרשתית ברזולוציה גבוהה. לכן, היתרון העיקרי שלו הוא הפוטנציאל לניתוח נתונים היסטוריים, עם הזדמנות נפלאה לבצע חילוף פרוטוקולים באופן שגרתי חלה על בני אדם למודלים העכבר.
בדוגמה של Opa1delTTAG עכברים מוטנטים, SD-אוקטובר התוצאות הראו עלייה של RNFL ו GC מורכבת שכבת עובי, אשר אפשרה לחקר נוספת של מא ח פתופסיולוגיה9. זה לא היה אפשרי אך ורק עם ניתוח היסטולוגית. לשם השוואה, היסטולוגיה אינו מספק את האפשרות לדמיין הרשתית כולו, בניגוד סריקות OCT טבעתי או רדיאליים. יתר על כן, זה יותר זמן רב ויקרות, בוחנים את שיעור מוגבר של חיות מחקרים עם מספר נקודות זמן. למעשה, SD-אוקטובר סלל את הדרך להפליל את סוג התא רשתית חדש ב מא ח, תא מולר9. זה נעשה למרות העובדה רזולוציה תא בודד וגם ההזדהויות תא מסוים הם אפשרי עם המערכת. להפך, עובי ממוקד ו/או כללי ממוקדות המדינה ניתוח של האזור peripapillary הוא במידה רבה מספיק לזהות הידרדרות הסלולר. חקירות נוספות עם היסטולוגיה יכול להתבצע לאחר מכן עם מושג ברור על מה לחפש. לכן, ניתן להחיל באותה השיטה גם את הערכת התערבויות טיפוליות כדי למנוע או לבלום ניוון הרשתית.
כדי לשפר את השירות של OCT, calipers תוצרת בית פותחו והיה רבה לדיוק גבוה יותר מאשר תקן אלה. אף-על-פי הסטנדרט הוא עבה יותר RNFL/שזכתה, צוותים להשתמש בה בכל מקרה, אבל עבור שכבות גדולות13. כאן, התמקדנו בניתוח השוואתי RGCs 10 סריקות רדיאלי לכל הרשתית, כולם באזור peripapillary. RNFL לבד לא היה מדיד בסריקות רדיאלי, בכל מקרה. שכבה זו היה דק מדי, מעורפל; לכן, את RNFL/שזכתה ואת השכבה מורכבים GC נמדדו במקום. במקביל, הצלחנו במדידת את RNFL באמצעות סריקות טבעתי, אשר הוכיח מועיל כדי phenotyping העכבר. עם זאת, האמינות עשוי להיות שנוי במחלוקת. כל הגישות הללו היה השלב הקריטי כדי למרכז את הסריקות על ONH וכדי להמחיש הרשתית ללא צללים, אטימות. לשעבר ניתן להתאים בקלות על-ידי ביצוע השלבים הבאים של הפרוטוקול מבחינת המיקום של הרשתית. האחרון תלוי להדמיה של הקרנית, את גבישי. לדוגמה, אם הג'ל אופטלמולוגיות היא התפשטה לצר, הסריקה היא מטושטשת ו/או הרשתית מופיע עקום. כדי לתקן זאת, זה יהיה מספיק כדי כראוי להחיל מחדש את הג'ל. אם גבישי הוא אטום, הסריקה הוא כהה או לא שלם. הפתרון כאן יהיה לחזור על הסריקה ביום אחר, אם מחזיר השקיפות של גבישי. סיבה אפשרית נוספת סריקה באיכות רע היא הנוכחות של מכשולים, כגון שפם או ריסים. אלה ניתן להסיר בקלות על-ידי הגדרת הצידה והחלת קצת של הג'ל אופטלמולוגיות להחזיק אותם במקום. גישות אחרות אנליטיים שונים מבחינת סוג ציוד, סוג הסריקה, זווית ופרמטרים אחרים קיימות גם ויש מספר משתנה של תמונות שנותחה. זה יש לקחת בחשבון אם איכות התוצאה עדיין אינה משביעת רצון. למשל, ליו ואח לקח סריקות רדיאלי-מספר זוויות13, בהשוואה סריקות רדיאלי שלנו-רק אחד, דיווח שכבות מעט עבה יותר. למרות זאת, OCT רכישה ומכירה גישות אנליטיות הציע בכתב היד מתאימים לניתוח RGCs ברשתית העכבר peripapillary.
לסיכום, OCT היא טכנולוגיה עם פוטנציאל גדול. היא מאפשרת זיהוי שינויים עדינים במבנה הרשתית — כולל את RGCs, במיוחד ביחס OPNs — ומוכיח הכרחית עבור חזון המדע. לכן, פרוטוקול הציג הוא פרקטי עבור OPN העכבר דגם phenotyping, כמו גם לגבי ההערכה של טיפולים חדשניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Inserm אוניברסיטת מונפלייה, צרפת רשתית, האיחוד הלאומי des Aveugles et Fondation Déficients Visuels (UNADEV), אגודת תסמונת דה וולפרם, למזוג לה Médicale רשרש, Fondation דה פראנס, מעבדה של מצוינות תוכנית EpiGenMed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al.
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).
- Lenaers, G., et al.
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
