Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die in-Vivo Bildgebung der Netzhaut Maus mit hochauflösenden spektralen Bereich optische Kohärenztomographie (SD-OCT). Es konzentriert sich auf die retinalen Ganglienzellen (RGC) in der peripapillären Region mit mehreren scannen und Quantifizierung der beschriebenen Ansätze.
Abstract
Strukturelle Veränderungen in der Netzhaut sind gemeinsame Manifestationen von Augenkrankheiten. Optische Kohärenztomografie (OCT) ermöglicht die Identifikation in Vivo– schnell, wiederholt und mit einer hohen Auflösung. Dieses Protokoll beschreibt OCT-Bildgebung in der Netzhaut Maus als ein leistungsfähiges Werkzeug zur optische Neuropathien (OPN) zu studieren. Das OCT-System ist eine Interferometrie-basierte, nicht-invasive Alternative zur gemeinsamen post-mortem histologischen Untersuchungen. Freuen Sie sich auf eine schnelle und genaue Bewertung der Netzhautdicke, die Möglichkeit zum Nachverfolgen von Änderungen, wie z. B. Netzhaut dünner oder dicker. Wir präsentieren die bildgebenden Verfahren und Analyse am Beispiel der Opa1DelTTAG Mauslinie. Drei Arten von Scans angeboten, mit zwei Quantifizierungsmethoden: standard und hausgemachte Bremssättel. Letzteres ist am besten für den Einsatz auf der peripapillären Netzhaut bei radialen Scans; genauer gesagt wird, ist für die Analyse dünner Strukturen vorzuziehen. Alle hier beschriebenen Ansätze eignen sich für retinalen Ganglienzellen (RGC) aber sind leicht anpassbar an andere Zell-Populationen. Zusammenfassend, OCT ist in Maus-Modell Phänotypisierung effizient und hat das Potenzial für die verlässliche Bewertung therapeutischer Interventionen verwendet werden.
Introduction
OCT ist ein Diagnosetool, das erleichtert die Prüfung der retinalen Strukturen1, einschließlich des Sehnervenkopfes (ONH). Im Laufe der Jahre ein verlässlicher Indikator des Fortschreitens der Krankheit im Menschen2,3, sowie in Nagetieren4,5geworden. Interferometrie verwendet, um Schnittbilder der Netzhaut Schichten bei einer axialen Auflösung von 2 µm zu erstellen. Die innerste Schicht ist der retinalen Nervenfaserschicht Layer (RNFL), mit RGC Axone, gefolgt von der Ganglion Zellschicht (GCL), mit meist RGC Körper. Als nächstes ist die innere plexiformen Schicht (IPL), wo RGC Dendriten bipolare, Horizontal und amakrinen Zellen Axone treffen. Diese, zusammen mit horizontalen Zellen bilden die nukleare Innenschicht (INL), und ihre Vorsprünge mit Photorezeptor Axone in der äußeren plexiformen Schicht (OPL) verbinden. Dies wird gefolgt von der nuklearen Außenschicht (ONL) mit Photorezeptor Zellkörpern und ist von der Photorezeptor-Schicht durch die äußere begrenzende Membran (OLM), auch genannt das innere Segment/äußere Segment getrennt (IS / OS) Schicht. Schließlich sind die letzten beobachtbaren Schichten der Netzhaut Maus das retinale Pigmentepithel (RPE) und die Aderhaut (C). Die RNFL allein ist in der Regel zu dünn, um bei Mäusen gemessen werden; so ist die Analyse der RNFL/GCL stattdessen bevorzugt4,5. Eine weitere Möglichkeit ist die GC komplexe Schicht, die letztere neben dem IPL enthält, dadurch dicker und somit auch leichter zu messen am Okt.4scannt. Infolgedessen bieten Einblick in den pathologischen Status der Netzhaut, wie z. B. OCT in OPNs.
Alternativ wird die Dicke der Netzhaut Maus oft mit post-mortem Histologie analysiert. Jedoch können diese Technik Gesichter Einschränkungen in Bezug auf Gewebe Sammlung, Fixierung, schneiden, färben, Montage, etc. daher einige Mängel, wie subtil Dicke Veränderungen erkannt werden. Schließlich, da die gleiche Maus nicht auf einige Zeit getestet werden kann zeigt, die Anzahl der Tiere pro Studie stark erhöht, im Gegensatz zu für OCT. Alles in allem die nicht-Invasivität, hochauflösend, Möglichkeit zur Wiederholung, Zeitüberwachung in Zeit und Benutzerfreundlichkeit der OCT-Technologie machen es die Methode der Wahl in Netzhauterkrankung Studien.
Maus-Modellen dienen, Gendefekten zu identifizieren und molekularen Mechanismen, die Retinopathies6aufzuklären. OPN ist eine Form der Retinopathie mit erheblicher Schaden am Sehnerv (ON), die besteht aus ca. 1,2 Millionen RGC Axone. OPN kann kann fokussiert werden, den ein oder sekundär zu anderen Erkrankungen, angeborene oder nicht7, führt zum Verlust des Gesichtsfeldes und später, Blindheit. Wesenszüge der OPN sind RGC Verlust und Schaden, die beobachtet werden im menschlichen OAT als RNFL und GCL Verdünnung2,3. Unterdessen die Pathophysiologie der OPN ist immer noch schlecht verstanden, und daher die Notwendigkeit, Maus Netzhaut testen bleibt.
Dieses Manuskript beschreibt die Bildgebung und Quantifizierung der Netzhaut Schichtdicke, am Beispiel der Opa1DelTTAG Maus Linie8,9, ein Modell der dominanten Optikusatrophie (DOA)10. RGC Pathophysiologie zu bewerten, wurden radiale, rechteckig und ringförmigen Scans quantifiziert. Dies geschah entweder mit standard-Bremssättel der OCT-Software oder mit einem hausgemachten Makro für eine Open-Source Bildbearbeitungsprogramm entwickelt. Die standard-Bremssättel sind schwer zu manipulieren und oft dicker als die RNFL/GCL, während die hausgemachte Bremssättel einfach zu bedienen, reproduzierbare und präziser sind. Das Makro führt eine Messung für eine automatisch erkannten Schicht, in 5 Punkten und an einer festen Position auf beiden Seiten des ONH in der peripapillären Region. Das Ziel des vorliegenden Protokolls soll OCT Scan Erwerb dahingehend retinalen Positionierung, mit einem Fokus auf Routinggruppenconnectors zu beschreiben.
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Protocol
der experimentelle Protokoll wurde genehmigt durch das Institut national De La Santé et De La recherche Médicale (Inserm; Montpellier, Frankreich), steht im Einklang mit den EU-Richtlinien und erfüllt die ARVO-Anweisung für den Einsatz von Tieren in der Augenheilkunde. Es erfolgte unter der Vereinbarung des Languedoc Roussillon Comity of Ethics in Tier-Experimente (CEEALR; NuCEEA-LR-12123).
1. Geräte-Setup und Pre-Imaging Vorbereitung
Hinweis: Hier erfolgte OCT auf Maus Netzhaut mit der spektralen Bereich (SD) ophthalmologische imaging-System ( Abbildung 1A). Das SD-OCT-Gerät besteht aus einer Basis und ein Tier bildgebenden Mount (AIM) mit einem Nagetier Ausrichtung Stadium (RAS) ( Abbildung 1 b). Die Basis enthält der Computer, der OCT-Motor, der SD-OCT-Sonde und das Maus-spezifische Objektiv. Die Sonde wird auf das Ziel beinhaltet die Z-Übersetzer montiert. Die RAS dient zur Positionierung Dank der Tabelle mit der X - und Y-Übersetzer, die Kassette, die gedreht und geschwenkt, Maus und der abnehmbare Biss-Bar mit der Nase Band. Vom Hersteller bereitgestellte Software ermöglicht die Erfassung und Analyse von OCT-Dateien, obwohl Letzteres auch mit einem Open-Source Bildbearbeitungsprogramm durchgeführt werden kann.
- Die Sonde mit dem Ziel, einen festen Platz.
- Die Maus-spezifische Objektiv an der Sonde anschließen.
- Die Referenz Arm Einstellungen für die jeweilige Objektiv (hier: Power bei 086 und Position im 964).
- Um sicherzustellen, dass die Maus-spezifischen Objektiv ist ausreichend weit von der Kassette, befestigen Sie die Biss-Bar mit der Nase-Band auf der Kassette.
Hinweis: Der Abstand zwischen der Linse und die Kassette kann mit der Z-Übersetzer-Schraube auf der Rückseite des Ziels angepasst werden. Die Nase-Band ist eine handelsübliche Gummiband, und seine Spannung sollte je nach Größe der Maus eingestellt werden. - Schalten Sie die Stromversorgung (untere rechte Ecke des Wagens) und dann den Computer.
- , Image-Programm zu starten, doppelklicken Sie auf die entsprechende Verknüpfung auf dem Bildschirm.
Hinweis: Dies richtet sich nach der Art der Linse; hier, Maus Netzhaut. - Erstellen Sie eine neue klinische Studie und fügen Sie die gewünschten Protokolle. Andernfalls verwenden Sie die vorhandenen klinischen Studie bzw. Protokolle.
- Fügen Sie eine neue Studie durch die Wahl der " studieren NameŔ " IDŔ " Behandlung Arm Spezifikationen " (hier " Uncategorized "); und vordefinierte " Scan-Protokolle ", wenn sie vorhanden sind.
- Wählen Sie eine " Prüfer " in der " klinischen Studie " Abschnitt.
Hinweis: für eine neue " Prüfer ", gehen Sie zu " Setup Prüfer & Ärzte " it. definieren - Hinzufügen einen neuen Patienten in der Patient/Prüfung Bereich durch Klick auf Hinzufügen Patient; Eingabe der " ID ", " Namen ", " Name ", " Sex ", und " Geburtsdatum " (optional).
Hinweis: Dies nur vor dem testen jede Maus Wenn bequemer. Stellen Sie sicher, dass die ID nicht länger als 10 Zeichen. Für die Maus, die Fehlsichtigkeit für beide Augen ist 0 und der axialen Länge 23,0. - Klicken Sie auf " hinzufügen Prüfung " und wählen Sie die gewünschte " Protokoll " durch Zugabe von " Preset scannt " aus der Liste, beginnend mit dem Auge, das zuerst gemessen wird (hier: das rechte Auge) oder durch Anpassen der Scans.
- Einen Scan anpassen ein vorhandenen Scans als Vorlage verwenden und bearbeiten oder erstellen sie von Grund auf durch die " Hinzufügen benutzerdefinierter Scan " Option. Nach dem alle Scans zur Liste hinzufügen, definieren einen neuen Protokoll mit den " Enter " neue Protokollname " Option (OS: Oculus sinister, linke Auge; OD: Oculus dexter, rechten Auge).
Hinweis: Hier das Protokoll beinhaltet drei Scans: (i) eine radial Scan mit einem Durchmesser von 1,4 mm, 0 mm horizontalen und vertikalen Versatz, 1.000 Zeilen A-Scans/B-Scan, 100 B-Scans/Volumen, 1 Frame/B-Scan, 80 Zeilen von inaktiven A-Scans/B-Scan und 1 Volumen; (Ii) eine rechteckige Scan mit einer 1,4-mm-Länge und Breite, 0°-Winkel, 0 mm horizontaler und vertikaler Versatz, 1.000 Zeilen A-Scans/B-Scan, 100 B-Scans, 1 Frame/B-Scan, 80 Zeilen von inaktiven A-Scans/B-Scan und 1 Volumen; und (Iii) eine ringförmige Scan mit einem 0,4 mm Mindest- und 0,6 mm Durchmesser, 0 mm horizontalen und vertikalen Versatz, 1.000 Zeilen A-Scans/B-Scan, 3 B-Scans/Volumen, 48 Frames/B-Scan, 80 Zeilen von inaktiven A-Scans/B-Scan und 1 Volumen.
2. Maus-Vorbereitung
- Auge Dilatation und Immobilisierung
- mindestens 15 min vor der Datenerfassung, 10 % Phenylephrin-Augentropfen in die Augen der Maus zu vermitteln, entfernen Sie das überschüssige und 0,5 % Tropicamid Augentropfen einzuflößen.
Hinweis: Die erste Dilatation kann gleichzeitig für alle Mäuse erfolgen, die in der Sitzung getestet werden. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeiten bei Zimmertemperatur sind. - Unmittelbar nach dem induzieren Vollnarkose (Schritt 2.2) verwalten 0,4 % Oxybuprocaine Hydrochlorid Augentropfen, halten sie in Platz für 3 s zu betäuben und die Augen zu immobilisieren. Danach wischen Sie die Tropfen und wiederholen die Instillation von 10 % Phenylephrin und 0,5 % Tropicamid zu vergewissern, dass die Augen gut geweitet sind.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeiten bei Zimmertemperatur und die Maus nicht die Oxybuprocaine schlucken.
- mindestens 15 min vor der Datenerfassung, 10 % Phenylephrin-Augentropfen in die Augen der Maus zu vermitteln, entfernen Sie das überschüssige und 0,5 % Tropicamid Augentropfen einzuflößen.
- Vollnarkose
- bereiten Sie eine Narkose Lösung von Ketamin (20 mg/mL) und Xylazin (1,17 mg/mL) in Kochsalzlösung. Shop bei 4 ° C für maximal 2 Wochen.
- Ca. 5 min vor der Prüfung, intraperitoneal 5-10 µL Narkose Lösung pro 1 g Körpergewicht, je nach Alter und Größe der Maus Spritzen.
Hinweis: Jung und/oder dünne Mäuse brauchen weniger Betäubungsmittel, nehmen weniger Zeit zu betäuben, aber auch schneller zu wecken. Hier 8 µL/g (160 mg/kg Ketamin, Xylazin 9,33 mg/kg). - Optional, schmieren die Augen mit viskosen Augentropfen oder eine ophthalmologische Gel zu Hornhaut Trockenheit zu vermeiden.
3. Maus positionieren
- schmieren die Augen mit viskosen Glykolbasis Auge fällt auf die um Hornhaut Flüssigkeitszufuhr zur Verfügung zu stellen.
Hinweis: Wenn die Augen während der Prüfung trocken erscheinen, erneut anwenden Augentropfen. - Wickeln Sie die Maus in einem Blatt der chirurgischen Gaze um es warm zu halten.
- Mit einem Schwamm oder Baumwolle Docht einer ophthalmologischen Gel mit 0,3 % Hypromellose auf jedes Auge dünn auftragen, um die Lichtbrechung zu minimieren, vermeiden, Linsentrübungen und sichere Hornhaut Flüssigkeitszufuhr. Dabei schieben Sie die Wimpern und Schnurrhaare zur Seite.
- Positionieren Sie den Mauszeiger in die Kassette mit den Kopf gerade und zeigen nach vorn.
- Sanft öffnen Sie die Snack Bar Halterung und setzen Sie den Stab in den Mund, die Nase Band verwenden, um die Position zu sichern.
Hinweis: Sicherstellen, dass die Biss-Bar in der Mitte der Kassette ist. - Ort eine Baumwolle Rollen unter der rechten (linken) Seite, wenn die Rechte (linke) Auge getestet wird.
- Unter Beibehaltung der Clip-on mit dem Ziel Spitze auf der Maus-spezifische Linse, bringen es auf das Auge durch die Z-Übersetzer-Schraube gegen den Uhrzeigersinn drehen.
- Durch Drehen und Schwenken der Kassette und durch Drehen der Snack-Bar und die X-Übersetzer-Schrauben voreingestellt die Position der Maus, Ziel ist es, das rechte Auge aussehen direkt in die Linse und damit haben die optischen Achsen der Augen und die Linse ausrichten.
Hinweis: Wenn die Maus zu hoch oder zu niedrig ist, die Y-Übersetzer-Schraube sollte verwendet werden zuerst. - Wählen Sie den ersten Scan in der " Prüfung ", klicken Sie auf " starten mit dem Ziel ", und weitere manuelle Anpassungen für retinale Bildgebung.
- Mit der Z-Übersetzer-Schraube die Netzhaut vertikal verschieben, auf der linken Seite ( Abbildung 2, horizontale B-Scan-Ausrichtung) und horizontal auf der rIght-Panel ( Abbildung 2, vertikale B-Scan-Ausrichtung).
- Drehen die Kassette, ONH in der Mitte der rechten Seite bringen, indem die ONH oben oder unten verschieben. Verwenden Sie die Biss Bar Schraube, um die Netzhaut auf der rechten Seite zu begradigen. Die Kassette ONH in der Mitte der linken Position schwenken.
- Verwenden die X-Übersetzer-Schraube, um die Netzhaut auf der linken Seite zu ebnen. Unter Berücksichtigung der Hauptfunktion des jedes Modulator weiter passen Sie die Position der Netzhaut, die ONH zentralisieren.
Hinweis: Verwenden Sie die Y-Übersetzer-Schraube um die ONH auf der rechten Seite oben und unten bewegen, wenn nötig. Die Position kann jederzeit zwischen den Scans verfeinert werden.
4. SD-OCT-Bildgebung des ONH und Netzhaut
- einmal mit den Einstellungen zufrieden, klicken Sie auf " starten Snapshot " SD-OCT Scan beginnen.
- Wenn eine 3D-Bildgebung nicht erforderlich ist, deaktivieren Sie die Option OCU.
- Des Scans und den Bericht zu speichern.
- Gehen Sie mit den nächsten Scans.
- Um das zweite Auge Bild, nach dem Ausfahren des Objektivs, drehen Sie die Kassette entsprechend und wiederholen Sie die Schritte 3.6-4.3.
5. Abschluss der Akquisition
- Wenn die Übernahme beendet ist, entfernen Sie die Maus aus der Kassette, ophthalmologische Gel mit 0,3 % Hypromellose für jedes Auge auftragen und platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte, wake up
- Nach dem letzten Erwerb, schließen Sie die Software und schalten Sie den Computer und das OCT-Gerät (Power Supply-Taste).
- Die Kassette mit Desinfektionsmittel reinigen.
6. Analyse
- für die Netzhaut Schicht Dickenmessung, verwenden die automatische Segmentierung Software vom Hersteller bereitgestellte.
- Klicken Sie auf die " Patient ", wählen Sie die gewünschte " Prüfung " aus dann Liste, und klicken Sie auf die " Review Exam " Option.
- Laden Sie die gewünschte OCT-Daten auf die OCT-Software mit der rechten Maustaste auf das Ordner-Symbol in den gewünschten Scan.
- Rechts klicken Sie auf der B-Scan; die Bremssättel durch die Aktivierung von bis zu 10 Messen Bremssättel; konfigurieren und geben Sie ihren Namen, Winkel und Farben.
- Wählen die gewünschte Bremssattel durch einen Rechtsklick auf der B-Scan; legen sie entsprechend auf die Netzhaut für Messung.
Hinweis: Für die Scans auf die ONH zentriert, set 5 Bremssättel auf jeder Seite von ihm, gleich weit von einander entfernt. Stellen Sie für die Analyse peripapilläre sicher, dass der Bremssattel nicht zu weit aus der ONH platziert wird. Analysieren Sie für radiale scannen, 10 Bilder pro Scan, die durch die OCT-Software ausgewählt wurden. Ihre Nummern finden Sie der " Berichte " Ordner. - Speichern Sie die Ergebnisse zur Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm durch einen Rechtsklick auf der B-Scan und klicken " Ergebnisse sichern ".
Hinweis: Die Ergebnisse finden Sie in den gleichen Ordner wie die Scandaten.
- Alternativ verwenden Sie das hausgemachte Bremssattel-Makro " MRI Netzhaut Tool ", entwickelt für eine Open-Source Bildbearbeitungsprogramm (siehe Tabelle of Materials).
- Ist darauf zu achten, dass die " MRI Netzhaut Tool " und die " ändern-Polygon-Schnitt-Werkzeug " Makros sind aktiv. Laden Sie das Bild. Klicken Sie auf die m-Taste, um die Messung zu starten.
Hinweis: Das Makro erstellt automatisch eine 0,2 mm langen Kassette auf beiden Seiten der ONH messen. Jede Kassette enthält 5 Messpunkte diese Funktion als Bremssättel. Die Seitenlage ist unveränderlich und ist für die Peripapilla in den radialen Scans angepasst. Die horizontale Position der Kassetten ist vorgegeben, um die RNFL/GCL-Dicke zu messen, aber es kann leicht geändert werden, stattdessen die GC komplexe Ebene zu messen. Die Scanqualität ist schlecht, die horizontale Position angepasst werden muss, ob das Bild muss aus der Analyse ausgeschlossen werden. - Für horizontale Ausrichtung, klicken Sie auf die Schaltfläche "e". In der neu eröffneten " ROI Manager " Fenster, wählen Sie die erste Kassette.
- Klicken Sie auf das blaue Polygon Taste und passen Sie die Position der ersten Kassette durch Klicken auf die Grenzen der gemessenen Ebene in das Bild.
- Wiederholen diesen Vorgang für die zweite Kassette mit der ersten Wahl in der " ROI Manager " Fenster und klicken Sie dann auf das entsprechende Bild. Klicken Sie auf die R-Taste erneut messen. Zeigen Sie die Ergebnisse in der " Messungen " Fenster.
Hinweis: Die Ergebnisse können jederzeit in ein Tabellenkalkulationsprogramm kopiert. Sie enthalten die folgenden Werte für die richtige Kassette (R), links Kassette (l) und Gesamt: Intden - integrierte Dichte innerhalb der Kassette; Gebiet: Gebiet der Messung in mm 2; Len: Länge des Bremssattels innerhalb der Kassette in mm; Mittelwert: meine Intensität des Signals innerhalb der Kassette; und Std: Standardfehler der mittleren Intensität des Signals. - Fahren Sie mit dem nächsten Bild.
- Weiter analysieren der Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
Hinweis: Um die durchschnittliche Dicke der Schicht zu finden, die zehn Len Werte annehmen.
- Ist darauf zu achten, dass die " MRI Netzhaut Tool " und die " ändern-Polygon-Schnitt-Werkzeug " Makros sind aktiv. Laden Sie das Bild. Klicken Sie auf die m-Taste, um die Messung zu starten.
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Representative Results
Die SD-OCT-Technologie ermöglicht retinalen vorstellen und Wanddicke-Analyse, die Histologie vergleichbar, jedoch schneller und genauere (Abbildung 3). Wie mit Wildtyp C57Bl/6 Mäusen, obwohl die Qualität eines SD-OCT Scans dargestellt (Abb. 3A, rechts) ist nicht so gut wie die eines Bildes von einem retinalen Querschnitt (Abbildung 3A, links), es visualisiert mehr Schichten (z. B. OLM). Darüber hinaus dauert es nur ca. 40 min, einschließlich Maus Vorbereitung, im Vergleich zu Tagen oder Wochen zur histologischen Untersuchung. Schließlich erfordert es keine Verarbeitung und Färbung, z. B. Hämatoxylin Eosin und Safran, die das Gewebe beschädigen und dazu führen, dass die Auflistung von fehlerhaften Daten. Die Netzhaut Schichten leicht messbar im OAT umfassen die RNFL/GCL, IPL, INL, OPL, ONL, IS / OS, RPE und C (Abb. 3 b), so dass daher für eine komplexe Untersuchung der gesamten Netzhaut. So spiegeln strukturelle Netzhautveränderungen Krankheitsentwicklung. Dies gilt im Falle von OPNs Routinggruppenconnectors und weiter, und so die RNFL/GCL und IPL.
DOA ist eines der am häufigsten verwendeten OPNs und zeichnet sich durch RGC Degeneration und den Verlust der RNFL11. Aufgrund von Mutationen in den OPA1 gen12führt es zu Sehbehinderung und Blindheit. Mit der Opa1DelTTAG -Maus-Modell, das die menschliche wiederkehrende c.2708delTTAG Mutation trägt, stellte sich heraus, dass Opa1 Haplo-Insuffizienz Vision in einem Sex-abhängigen Weise8,9behindert. Dies wurde auf der Grundlage von OCT Messung der Netzhautdicke, bestimmt, die eine progressive Verdickung der GC komplexe Ebene (Abb. 4A) und peripapilläre RNFL (Abbildung 4 b, 4 C) bei Opa1+ / Frauen zeigte. In diesen Experimenten wurden die Berechnungen mit den standard Bremssätteln für rechteckige Scans und OpenSource-Bildverarbeitungs-Programm für die ringförmigen Scans durchgeführt. Für radiale Scans, die sind oft von geringer Qualität und Produkte, die ein Minimum von 10 Bildern pro Retina für Analyse, eine hausgemachte Makro entwickelt wurde. Ein Vergleich der standard und hausgemachte Bremssättel (Abbildung 4) zeigte eine deutlich geringere Dicke RNFL/GCL und GC komplexen Schichten gemessen mit der letzteren. Und zwar deshalb, weil die standard-Bremssättel sind viel dicker und schwerer, an der Grenze der Ebene zu platzieren. Daher empfiehlt es sich, vermeiden die Verwendung der standard-Bremssättel für dünne Schichten, vor allem auf radial-Scans.
Zusammenfassend lässt sich sagen, ermöglicht die SD-OCT Maus visuelle Phänotypisierung, die über mehrere Zeitpunkten wiederholt werden kann. Jedoch müssen die OCT-Scan-Typ und Messverfahren der untersuchten Krankheit und damit die Netzhaut betreffende Lage angepasst. Dennoch bietet OCT ausreichende Informationen, um Fehler in der Netzhaut Struktur zu identifizieren. Jedoch muss dies mit einer anderen Methode, um ein vollständiges Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen bieten weiter analysiert werden.
Abbildung 1: SD-OCT Ophthalmic Imaging System. (A) Überblick über die Basis und Ziel-RAS Geräteteile SD-OCT. (B) Übersicht über die Ziel-RAS-Komponenten. A: Computer, B: Stromversorgung, C: OCT Motor Referenzarm, D: SD-OCT Sonde, E: Maus-spezifische Objektiv, F: Z-Übersetzer, G: Ziel-RAS-Tisch, H: Y-Übersetzer, I: Kassette (Rotator), J: Snack Bar, K – Nase Band, L: Kassette Schwenk, M: X-Übersetzer und N: mit dem Ziel Tipp. Dieser Figute ist farblich gekennzeichnet, wie in Abbildung 2, mit Modulatoren der Netzhaut in rosa markierten Stelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Positionierung der Netzhaut. Horizontal (links) und vertikale (rechts) Blick auf die B-Bild-Ausrichtung. Die Pfeile entsprechen Bewegungen durch die farbcodierten Modulatoren induziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Netzhaut Schichten. (A) Wildtyp Maus Netzhaut Histologie nach Hämatoxylin Eosin, und Safran färben (links) und SD-OCT (rechts); Maßstabsleiste: 50 µm. (B) Netzhautdicke Messungen für 3 Monate alten Wildtyp-Mäusen; n = 14, bedeuten ± SEM, Maßstabsleiste: 50 µm. GC: Ganglion Zelle, RNFL/GCL: retinalen Nervenfaserschicht Schicht/Ganglion Zellschicht, IPL: innere plexiformer Schicht, INL: nukleare Innenschicht, OPL: äußeren plexiformen Schicht, ONL: nukleare Außenschicht, IS / OS: Photorezeptor inneren Segmente/äußere Segmente, RPE: retinale Pigmentepithel und C: Aderhaut. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: beispielhafte SD-OCT Messungen. (A) GC komplexe Schichtdicke in rechteckigen Scans auf ONH, gemessen mit der standard-Bremssättel zentriert; Opa1DelTTAG Mauslinie, n = 4, bedeuten ± SEM, ** p < 0,01 mit der Student t-Test bewertet. (B) Peripapillary RNFL von SD-OCT (C) Peripapillary RNFL Dicke in ringförmigen Scans, als der RNFL Flächenberechnung pro Feld bestimmt; Opa1DelTTAG weiblichen Mäusen, n = 5-11, bedeuten ± SEM * p < 0,05 mit der Student t-Test bewertet. (D) RNFL/GCL und GC komplexe Schichtdicke in radial-Scans, gemessen mit der Standard- oder hausgemachte Bremssättel für 3 oder 10 Scans, beziehungsweise; Wildtyp-Mäusen, n = 8, bedeuten ± SEM, ** p < 0,01, *** p < 0,001 bewertet mit der Student t-Test. RNFL/GCL - retinalen Nervenfaserschicht Schicht/Ganglion Zellschicht, GC: Ganglion Zelle. Figuren A-C adaptiert von Sarzi Et al. 9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das OCT-System, eine nicht-invasive in Vivo bildgebendes Verfahren, bietet hochauflösende Retina Langlauf-Absatz-wie Scans. So ist sein Hauptvorteil sein Potenzial für detaillierte Analyse, die wunderbare Möglichkeit, Protokolle, die routinemäßig angewendet auf den Menschen zu Mausmodellen umzusetzen.
Im Beispiel von Opa1DelTTAG mutierten Mäusen führt SD-OCT zeigten eine Zunahme der RNFL und GC komplexe Schichtdicke, die für die weitere Erforschung der DOA Pathophysiologie9erlaubt. Es wäre nicht möglich, allein mit histologischen Untersuchung gewesen. Im Vergleich dazu bietet Histologie nicht die Möglichkeit, die gesamte Netzhaut, im Gegensatz zu ringförmigen oder radialen OCT Scans zu visualisieren. Darüber hinaus ist es aufwändiger, angesichts der gestiegenen Zahl der Tiere in Studien mit mehreren Zeitpunkten. In der Tat ebnete SD-OCT den Weg für eine neue Netzhaut Zelltyp in DOA, Müller Zelle9zu belasten. Dies geschah trotz der Tatsache, dass einzellige Auflösung weder bestimmte Zelle Identifikationen mit dem System möglich sind. Im Gegenteil, ist die Dicke ausgerichtete und/oder allgemeine Zustand ausgerichtete Analyse der peripapillären Region groß genug, um zelluläre Verschlechterung zu erkennen. Weitere Untersuchungen mit Histologie können dann mit einer klaren Vorstellung von dem, was Sie suchen durchgeführt werden. Daher kann die gleiche Methode auch angewendet werden, zur Bewertung der therapeutischen Interventionen zu verhindern oder zu bremsen Netzhautdegeneration.
Um das Dienstprogramm Okt. weiter zu verbessern, hausgemachte Bremssättel wurden entwickelt und hatte eine viel höhere Präzision als die Standard Zimmer. Obwohl der Standard dicker als die RNFL/GCL ist, verwenden einige Teams es sowieso, aber für größere Schichten13. Hier haben wir die vergleichende Analyse auf Routinggruppenconnectors in 10 radiale Scans pro Retina, alle in der peripapillären Region. Die RNFL allein war nicht messbar auf die radiale Scans oder so. Diese Schicht war zu dünn und vage; Daher wurden stattdessen RNFL/GCL und der GC komplexe Schicht gemessen. Zur gleichen Zeit ist es uns gelungen, Messung der RNFL mit ringförmigen Scans, die vorteilhaft für Maus Phänotypisierung bewiesen. Die Zuverlässigkeit kann jedoch umstritten sein. In all diesen Ansätzen war die entscheidende Schritt um die Scans auf die ONH zentrieren und die Netzhaut ohne Schatten und Trübungen zu visualisieren. Erstere können leicht angepasst werden, indem Sie die Schritte des Protokolls in Bezug auf die Positionierung der Netzhaut. Letzteres hängt von der Durchlässigkeit der Hornhaut und der kristallinen. Zum Beispiel wenn das ophthalmologische Gel ungleichmäßig verteilt ist, der Scan ist verschwommen und/oder die Netzhaut erscheint gebogen. Um dieses Problem zu beheben, wäre es genug, um richtig das Gel erneut anwenden. Wenn die kristallinen undurchsichtig ist, ist der Scan dunkel oder unvollständig. Die Lösung hier wäre den Scan wiederholen, einen anderen Tag, wenn die Transparenz der kristallinen zurückgibt. Ein weiterer möglicher Grund für eine schlechte Qualität Scan ist das Vorhandensein von Hindernissen, wie z. B. Schnurrhaare oder Wimpern. Diese können leicht entfernt werden, indem beiseite und ein wenig des ophthalmologischen Gels um sie zu fixieren. Andere analytische Ansätze, die sich in Bezug auf die Geräte-Typ, Scan-Typ, Winkel und andere Parameter unterscheiden gibt es auch und haben eine unterschiedliche Anzahl von analysierten Bilder. Dies muss berücksichtigt werden, wenn die Qualität noch nicht zufriedenstellend ist. Zum Beispiel nahm Liu Et Al. radial Scans bei mehreren Winkeln13, im Vergleich zu unserer radial-Scans in nur einem Berichterstattung etwas dickere Schichten. Dennoch eignen sich die OCT-Akquisition und analytischen Ansätze vorgeschlagen, in diesem Manuskript für die Analyse von Routinggruppenconnectors in der peripapillären Maus Netzhaut.
Zusammenfassend ist die OCT eine Technologie mit großem Potenzial. Es ermöglicht die Erkennung von subtilen Veränderungen in der Netzhaut Struktur – einschließlich der Routinggruppenconnectors, besonders in Bezug auf die OPNs – und unverzichtbar für die Vision Wissenschaft beweist. Daher ist das vorgestellte Protokoll praktisch für OPN Maus Modell Phänotypisierung, sowie die Evaluierung neuartiger Therapien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Inserm, Université Montpellier, Netzhaut-Frankreich, Union nationale des Aveugles et Déficients konkretes (UNADEV), Verband-Syndrom de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France und dem Laboratory of Excellence EpiGenMed Programm.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
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- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
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