Summary
Det här protokollet beskriver analys av blinkande yta-förbättrade Raman spridning på grund av den slumpmässig promenaden av en enda molekyl på en silver yta med power lagar.
Abstract
Från en enda molekyl på en silver nanoaggregate junction observeras blinkande yta-förbättrade Raman spridning (SERS). Här, ett protokoll presenteras på hur du förbereder dem SERS aktiva silver nanoaggregate, spela in en video av vissa blinkande ställen i mikroskopiska bilden och analysera blinkande statistiken. I den här analysen återger en makt lag sannolikhetsfördelningar för ljusa händelser i förhållande till deras varaktighet. Sannolikhetsfördelningar för mörka händelser som monteras av en makt lag med en exponentiell funktion. Parametrarna för den makt lag representerar molekylär beteende både ljusa och mörka. Slumpmässig promenad modellen och hastigheten på molekylen över hela silver ytan kan uppskattas. Det är svårt att uppskatta även när du använder medelvärden, autokorrelation funktioner och super-upplösning SERS imaging. I framtiden bör makt lag analyser kombineras med spectral imaging, eftersom ursprunget till blinkar inte kan bekräftas genom denna analysmetod ensam.
Introduction
Surface-förbättrade Raman spridning (SERS) är mycket känsliga Raman-spektroskopi från en noble metallyta. Eftersom Raman spektrumet innehåller detaljerad information om molekylär struktur som bygger på de vassa topp positionerna, genom de vibrationella lägen av funktionella grupper i molekylerna, kan informationen av en enda molekyl på en metallyta undersökas med SERS1,2,3. Från en silver nanoaggregate med en adsorbate på nivån singel-molekyl observeras en blinkande signal1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16och spektrumet fluktuerar1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Blinkar kan induceras av en enda molekyl som slumpmässigt flyttar in och ut ur ett förstärkt elektromagnetiska (EM)-fält vid en nanometer-storlek silver nanoaggregate korsning. Blinkande anses därför enkla bevis för singel-molekyl detektering, jämfört med en teknik som använder en Poisson-fördelningen av SERS stödnivåer och en bi-analyt2,3,17. De detaljerade mekanismerna av blinkande och fluktuerande spektrumet, vilket starkt kan beror på molekylära beteende på Ag ytan, är emellertid fortfarande kontroversiellt.
I tidigare studier, har blinkande SERS analyserats med hjälp av funktionen autokorrelation som kan beräkna diffusion koefficient och koncentrationen av molekyler rör sig in och ut ur en förbättrad EM fält12,13,14 . Dessutom har en normaliserad standardavvikelse poäng, vilket motsvarar instabilitet i den totala intensiteten, hämtats från tidsprofilen för signal15. Dock kan dessa analytiska tillvägagångssätt baseras på beteendet hos ett fåtal molekyler. Däremot i en super-upplösning imaging av blinkande SERS, kan singel-molekyl beteende i ett förstärkt EM-fält vara identifierade16. Men kan dessa tekniker få sådana parametrar endast i en förbättrad EM-fältet. Den slumpmässiga beteenden av en enda molekyl inom ett brett intervall (exempelvis i blinkande SERS) kan representeras som en makt lag i stället för en genomsnittlig4,5,6,7,8 ,9,10,11, liknar blinkande fluorescens från en enda semiconductor quantum dot (QD)18,19. Med hjälp av en makt lag analys4,5,6,7,8,9,10,11, molekylär beteende kan uppskattas både i ljusa staten (i fältet förbättrad EM) och mörka statligt10; det vill säga kan uppförandet av molekylen över silver yta uppskattas.
För denna teknik, är silver kolloidal nanoaggregates används4,5,6,7,8,9,10,11. Dessa nanoaggregates visar olika lokaliserade ytan plasmon resonans (LSPR) band som starkt påverkar förbättrade elektromagnetiska fält när de är glada över vissa våglängder. SERS-aktiva silver nanopartiklar finns i kolloidal suspension, och vissa data kan således omedelbart erhållas. När det gäller enkla nanostrukturer, som har specifika storlekar, former och arrangemang, kan LSPR beroendet av SERS blinkar dölja andra dependences7; nämligen om den bra eller dåligt nanostrukturen till LSPR används parametrar kommer att vara konstant, och de andra dependences döljs därför. Makt lagen analys har använts för att upptäcka olika beroenden av den blinkande SERS från silver kolloidal nanoaggregates4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provberedning
-
Beredning av kolloidal Silvernanopartiklar 20
- För att fabricera kolloidal Silvernanopartiklar, Lös 0,030 g silvernitrat och 0,030 g trinatrium citrat dihydrat i 150 mL vatten i en 200 mL rund botten kolv.
- Kombinera kolven med en återloppskylare (Dimroth).
- Rör om lösningen i kolven med en magnetisk omrörare och rör bar. Värm sedan, omrörning lösningen i kolven i ett oljebad vid 150 ° C i 60 min.
Obs: Lösningen kommer vända gult, sedan mjölkaktig grå. - Cool suspensionen i rumstemperatur, och hålla suspensionen i kolven täckt med aluminiumfolie i kylskåp.
Obs: Protokollet kan pausas vid denna punkt. Använd de kolloidala nanopartiklarna, efter förvaring i kylskåp, inom en månad.
-
Beredning av provet för flerfärgad blinkar utsläpp 11
- För att klara ett objektglas, handtvätta en glasplatta med tvål och skölj med vatten.
- Lägga till 0.1% poly-L-lysin vattenlösning glasskivan och ta bort lösningen med en fläkt.
- Lägga till silver kolloidal suspensionen glasskivan och ta bort avstängningen med en fläkt.
- Bifoga ett släppområde på glasskivan med en flytande blockerare penna.
- Släppa destillerat vatten på glasskivan och täck den med en annan glasplatta skapa ett objektglas och hindra vatten från att avdunsta.
-
Beredning av provet för monotont färgade blinkande SERS 7 , 8 , 9 , 10
- För att klara ett objektglas, handtvätta en glasplatta med tvål och skölj med vatten.
- Blanda silver kolloidal suspensionen med thiacyanine eller thiacarbocyanine färgämne (25 eller 4 µM, respektive) och en NaCl (10 mM) vattenlösning i volymförhållandet 2:1:1.
- Släppa prov fjädringen på glasskivan och ta bort avstängningen med en fläkt.
- Bifoga ett släppområde på glasskivan med en flytande blockerare penna.
- Släppa en vattenlösning av NaCl (1 M) på glasskivan att immobilisera Silvernanopartiklar, och täck den med en annan glasplatta till skapa en Mikroskop bild tallrik och hindra lösningen från att avdunsta.
2. observation av blinkande Silvernanopartiklar
-
Belysning av prov
- Placera provet glasplattan förberett protokollet 1.2 eller 1.3 på scenen av en inverterade mikroskopet.
- Belysa provet glasskivan med vitt ljus genom ett mörkt fält kondensor, och fokus på olika färgade fläckar (blå, grön, gul och röd) på glasskivan med hjälp av en objektiv (X 60).
- Belysa provet glasskivan med ett försvagat beam, levereras i en vinkel på 30° i förhållande till ytan prov från en diodlaser pumpade halvledar (DPSS) continuous-wave (cw) genom en störning filtrerar.
- Använd laserbestrålning för att iaktta den silver nanoaggregates som monotona färgade fläckar i en samma färg som omgivande, flytta området laser belysning till mitten av vyn, och fokusera på platserna på glasplattan genom att justera scenen i z-riktningen.
-
Observation av blinkande
- Infoga en lång-pass-filtret efter objektivet, och belysa provet glasplattan använder en DPSS cw-laserstråle som levereras i en vinkel på 30° i förhållande till provets yta genom en störning filtrerar.
- Hitta den blinkande ställen som visas i figur 1 (se även Figur S1 i det kompletterande materialet) genom att flytta scenen i x - och y-anvisningarna.
- Spela in video av blinkande fläckar med inverterade mikroskopet, kopplad till en kyld digital kostnad – tillsammans enhet (CCD) kamera, som har en tidsupplösning av 61-120 ms, i 20 min.
3. analys av blinkande SERS
-
Härledning av tidsprofil från video
- Öppna videofilen i det program som styr kamerans CCD.
- Markera den blinkande fläckar och mörka området genom att dra områden som separat täcker regioner med och utan fläckar i videobilden.
- För att härleda signal intensiteten tidsprofiler från blinkande fläckar och mörka områden i videon, Välj Temporal analys i analysoch klicka på Beräkna i fönstret Temporal analys .
- Spara data som en textfil.
-
Analys av tidsprofilen
- Platta till en baslinje på tidsprofilen genom att subtrahera tidsprofilen från mörkt område eller montering med polynom funktion, som visas i siffror 2A och 2B.
- Utvärdera en i genomsnitt baslinjen intensitet som består av cirka 2000 poäng, jagbasoch en standardavvikelse på baslinjen stödnivåer, σ, som visas i figurerna 2 c och 2D.
- Särskilja ljusa händelser från mörka händelser med större intensitet än en tröskel jagbas + 3σ och registrerar varaktigheten av varje händelse. I figur 3, till exempel registrera händelsen från 0 till 3.5476 s som den mörka händelsen (med en löptid på t = 3.5476 s), och registrera händelsen från 3.5476 till 4.0981 s som den ljusa händelsen (med en löptid på t = 0.5505 s). Upprepa proceduren som visas i tabell 1.
- Räkna antalet ljusa och mörka händelser för varje varaktighet, som uttrycks i den första och andra raden i tabell 2.
- Summera antalet händelser för varje varaktighet, med undantag för händelser som är kortare än varaktighet t. Som uttrycks i den andra och tredje raden i tabell 2, till exempel summera antalet händelser för varje varaktighet (förutom händelserna för t = 0.0612 s) som 41 + 18 + 9 +...; Resultatet är lika med summan för t = 0.1223 s, dvs 103.
- Dela summor av varje längd och normalisera dem. Som anges i tabell 2, exempelvis dela summeringen för varaktighet t = 0.0612 s av varaktighet 0.0612 s. Resultatet är 3,351.5791. Sedan dividera resultatet med summan av resultaten i den fjärde raden i tabell 2. Sannolikhetsfördelningen härleds för att vara 0.64494.
- Rita sannolikhetsfördelningar för den ljusa händelser Ppå(t) mot deras varaktighet t i en logaritm-logaritmen graf, och passa Log10Ppå(t) av loggen10 (
) att härleda den makt lag exponent αpå för en specifik blinkar plats. Om Ppå(t) monteras av , monterade raden avviker från tomterna vid små värden på Ppå(t), som visas med den streckade linjen i figur 4A. - Rita sannolikhetsfördelningar för mörka händelser Poff(t) mot deras varaktighet t i en logaritm-logaritmen graf, och passa Log10Poff(t) av Log10(
att härleda den makt lag exponent αoff och den trunkering tid τ från samma blinkande plats. Om Poff(t) monteras av , monterade kurvan avviker från tomterna vid små värden på Poff(t). - Upprepa 3.2.1 till 3.2.8 för andra blinkande fläckarna i videon.
att härleda den makt lag exponent αoff och den trunkering tid τ från samma blinkande plats. Om Poff(t) monteras av Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Från den silver nanoaggregates med poly-L-lysin förberedd av protocol 1.2, observeras mångfärgad blinkande fläckar från SERS och surface-förbättrade fluorescens, som visas i figur 1-11. Däremot observerades monotont blinkande fläckar från SERS för den silver nanoaggregates med dye molekylerna förberedd av protocol 1.37,8,9,10. Det finns två typer av ”negativa” resultat: kontinuerlig resultat eller resultat där ingen SERS observeras. Tidigare och senare resultaten kan orsakas av höga eller låga koncentrationer av molekyler på kolloidalt silver ytan, respektive.
Signalerna från en enda silver nanoaggregate visar olika intensitet vid olika tidpunkter, som visas i figur 2B. Detta skiljer sig från den blinkande fluorescensen av en enda QD. Histogrammen för fluorescensintensiteten visar två distinkta toppar, som företräder staterna ljusa och mörka18. Tidsprofilen över en lång rad liknar sin expansion i en kort räckvidd, som i figur 34. Detta benämns som ”själv-likheten' eller 'fractal'; objektens egenskaper anses nämligen liknande om deras längdskalor är expanderad.
I en logaritm-logaritmen graf ritas sannolikhetsfördelningar för ljusa och mörka händelser mot deras varaktigheter som en linje och kurva, respektive, som visas i figur 4 (i motsats till den blinkande från en enda QD)19. I diagrammet motsvarar lutningen på linjen makt lag exponenten. Däremot är ju kortare trunkering tid utifrån det faktum att den makt lag för mörka staten trunkeras vid kortare svansar. För mörka SERS evenemanget, är sannolikhetsfördelningar ibland monterade av en makt lag snarare än av en exponentiell funktion. Mycket lång trunkering gånger med stora fel är ibland härledda9,10. Det är dock inte ett ”negativt” resultat att en makt lag med en exponentiell funktion inte kan återge sannolikhetsfördelningar för en mörk SERS händelse.
Den makt lag exponenter αon/off och trunkering gånger τ härledas från enskilda Silvernanopartiklar Visa olika värden, som visas i figur 5. Från de många power lag exponenterna, är i genomsnitt med ett standardfel härrör och jämfört med andra värden i olika förhållanden. När det gäller trunkering gånger, kan av median i stället för genomsnittet vara lämpliga för jämförelse. Lyckligtvis, en uppsjö av data kan samlas in från flera videor av blinkande, eftersom ungefärligt ett dussin blinkande ställen kan observeras samtidigt i videon.
Figur 1: representativa bilder av den blinkande SERS. Mångfärgad blinkande ställen observeras från silver nanoaggregates med poly-L-lysin. Skalstapeln = 10 µm. Detta är taget med ett inverterat Mikroskop kopplat till en färg CCD kamera genom en lång pass filtrera (se motsvarande videofilmen i Figur S1 kompletterande material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: (A) representativa tidsprofilen för signalintensitet från blinkande spot. (B) den tidsprofil vars baslinje har varit plattas ut genom att subtrahera tidsprofilen från det mörka området och/eller montering via ett polynom funktion. Reproducerad med tillstånd från Royal Society of Chemistry8. (C) utvidgningen av torget i (B), nämligen tidsprofilen baslinje. (D) Schematisk täthet av stödnivåerna baslinjen punkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa tidsprofilen signalintensitet från blinkande spot och tröskelvärdet för definitionen av ljusa och mörka händelser (horisontell linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa sannolikhetsfördelningar för blinkande ställen plottas mot deras varaktighet. (A) sannolikhetsfördelningar för ljusa händelser konspirerat mot deras varaktighet i en logaritm-logaritmen graf. Fast och streckade linjer passande resultat med hjälp av ekvationer som Log10Ppå(t) = Log10(
) och Ppå(t) = , respektive. (B) sannolikhetsfördelningar för mörka händelser plottas mot deras varaktighet i en logaritm-logaritmen graf. De kan monteras som en kurva som ges av en makt lag med en exponentiell funktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa histogrammen för parametrar som härrör från den makt lag. (A) Histogram av makt lag exponenter för ljusa händelser. (B) Histogram av makt lag exponenter för mörka händelser. ()C) Histogram av trunkering gånger i makt lag med en exponentiell funktion för de mörka händelserna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1: representativa film av blinkande SERS. Mångfärgad blinkande ställen observeras från silver nanoaggregates med poly-L-lysin. Detta täcker en yta på 50 µm × 40 µm och togs med ett inverterat Mikroskop kopplat till en färg CCD kamera genom en lång pass filter. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Figur S2: representativa svepelektronmikroskop bild av silver nanoaggregate bildas genom tillägg av poly-L-lysin eller NaCl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S3: konventionella Raman spektrum för thiacarbocyanine pulver, och representativa temporal-fluktuerat SERS spektra från en enda silver nanoaggregate med thiacarbocyanine. Reproducerad med tillstånd från Royal Society of Chemistry8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Händelse | Start tid/s | Slutet tid/s | Varaktighet/s |
| mörka | 0,0000 | 3.5476 | 3.5476 |
| ljusa | 3.5476 | 4.0981 | 0.5505 |
| mörka | 4.0981 | 5.8720 | 1.7738 |
| ljusa | 5.8720 | 5.9331 | 0.0612 |
| mörka | 5.9331 | 6.3613 | 0.4282 |
| ljusa | 6.3613 | 6.4836 | 0.1223 |
| mörka | 6.4836 | 6.6671 | 0.1835 |
| ljusa | 6.6671 | 6.7895 | 0.1223 |
| mörka | 6.7895 | 7.0341 | 0.2447 |
| ljusa | 7.0341 | 7.0953 | 0.0612 |
| mörka | 7.0953 | 8.3798 | 1.2845 |
| ljusa | 8.3798 | 8.4409 | 0.0612 |
| mörka | 8.4409 | 8.6856 | 0.2447 |
| ljusa | 8.6856 | 8.7468 | 0.0612 |
| mörka | 8.7468 | 9.6643 | 0.9175 |
| ljusa | 9.6643 | 9.9089 | 0.2447 |
| mörka | 9.9089 | 9.9701 | 0.0612 |
| ljusa | 9.9701 | 10.3371 | 0.3670 |
| mörka | 10.3371 | 10.3983 | 0.0612 |
Tabell 1: representativa tabell över mörka eller ljusa händelse, händelse starttid, sluttid för händelsen och händelsen varaktighet. Dessa härleddes från figur 3.
| Varaktighet/s | Lol händelse | Summering | (Summation)/(Duration) | Sannolikhetsfördelningen/s-1 |
| 0.0612 | 102 | 205 | 3351.5791 | 0.64494 |
| 0.1223 | 41 | 103 | 841.9821 | 0.16202 |
| 0.1835 | 18 | 62 | 337.8828 | 0.06502 |
| 0.2447 | 9 | 44 | 179.8408 | 0.03461 |
| 0.3058 | 4 | 35 | 114.4442 | 0.02202 |
| 0.3670 | 3 | 31 | 84.4707 | 0.01626 |
| 0.4282 | 3 | 28 | 65.3967 | 0.01258 |
| 0.4893 | 4 | 25 | 51.0911 | 0.00983 |
| 0.5505 | 1 | 21 | 38.1481 | 0.00734 |
| 0.6117 | 1 | 20 | 32.6983 | 0.00629 |
| 0.6728 | 5 | 19 | 28.2395 | 0.00543 |
| 0.7340 | 2 | 14 | 19.0740 | 0.00367 |
| 0.9786 | 1 | 12 | 12.2619 | 0.00236 |
| 1.0398 | 1 | 11 | 10.5789 | 0.00204 |
| 1.1621 | 2 | 10 | 8.6048 | 0.00166 |
| 1.3456 | 1 | 8 | 5.9452 | 0.00114 |
| 1.4068 | 1 | 7 | 4.9758 | 0.00096 |
| 1.9573 | 1 | 6 | 3.0655 | 0.00059 |
| 2.0796 | 1 | 5 | 2.4043 | 0.00046 |
| 2.2631 | 1 | 4 | 1.7675 | 0.00034 |
| 2.4466 | 1 | 3 | 1.2262 | 0.00024 |
| 2.8136 | 1 | 2 | 0.7108 | 0.00014 |
| 2.9359 | 1 | 1 | 0.3406 | 0,00007 |
Tabell 2: Representativa tabell av längd, antalet händelser för varje varaktighet, summering av antalet händelser för längre varaktighet, summor dividerat med varje varaktighet och deras normaliserade sannolikhetsfördelningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Från silver nanoaggregate korsningen avges SERS. Således behöver vi förbereda nanoaggregates i stället för kolloidala nanopartiklar, som är täckta med citrat anjoner. Silver aggregat bildas från saltningen ut effekten som skapas genom tillsats av poly-L-lysin, som har -NH3+ och är ursprunget till SERS, eller Na+ kationer från NaCl, som visas i Figur S2 av kompletterande material. Dessutom för att belysa de många ställena i området brett, levereras ofokuserad laserstrålen i en vinkel på 30° i förhållande till provet ytan, genom en lins som inte är kopplat till mikroskopet. Det finns en möjlighet att området observation inte är upplyst. Vi anpassar och flytta området laser att belysa området observation med hög förstoring. Efter denna optimering syns monotona fläckar i samma färg omgivningen. Dessa är viktiga steg för blinkande SERS observation.
Här diskuteras frågor som kräver uppmärksamhet för makt lag analys. Det första påverkar tröskelvärdet för definitionen av ljusa och mörka händelser blinkande analysen. När tröskeln ökas, tenderar den makt lag exponenter och trunkering gånger att öka samt4,5,9. När de exponenter (αpå och αoff) och trunkering gånger uppvisar olika trender, kan beroendet av den blinkande SERS upptäckas. Andra, mindre makt lag exponenten representerar brantare lutningen på linjen ges av makt lagen i logaritm-logaritmen grafen, som representerar den lägsta sannolikheten för en lång varaktighet för ljusa eller mörka händelse7. Eftersom de ljusa händelserna inte kan fortsätta för långa löptider, ritas färre punkter för de ljusa händelserna i grafen än de är för mörka händelserna. Sedan, αpå värdena tenderar att vara mindre än den αoff, värden7, till skillnad från den blinkande från en enda QD (αoff = αpå = -1,5)18. För det tredje, exponenterna endast bli något större än-110, eftersom sannolikhetsfördelningen ges av:
,
vars täljare mitt sikt (härrör från protokollet 3.2.5; se den tredje raden i tabell 2) tenderar att minska på längre löptider t, eftersom även antalet ljusa och mörka händelser för längre löptider tenderar att minskas med faktumen att molekylerna flytta slumpmässigt och kan knappast bo i en icke-emissive stat eller emissive staten (korsningen av nanoaggregate) under en lång tid, som uttrycks i den andra raden i tabell 2. Den makt lag exponent α = -1,5 eller -1, kan härledas från det faktum att molekylen slumpmässigt promenader på den silver yta - eller two-dimensionally, respektive4,5,18. Däremot förkortas trunkering tiden genom en snabbare molekylär slumpmässig promenad eller högre energi barriär från en icke-emissive emissive staten4,5,19. Det noteras att procentsatserna av händelser vars sannolikhetsfördelningen inte kan reproduceras av en makt lag med en exponentiell funktion är viktiga data9,10, eftersom reproduktion misslyckande påbörjar från mycket långa trunkering gånger.
I tidigare studier12,13,14användes autokorrelation funktion också för blinkande SERS. Den autokorrelation funktion, som användes för fluorescens korrelation spektroskopi, representerade på Diffusionskoefficienterna och koncentrationer av fluorescerande molekyler rör sig in och ut ur ett fokusområde21,22. För blinkar SERS, dock kan ingen enkel funktion återge den autokorrelation funktion14. Detta tyder på en komplex process för blinkande SERS, eftersom en autokorrelation funktion kan identifiera vissa periodicitet. I en annan kvantitativ analys härrör en normaliserad standardavvikelse Poäng från en profil för tid av signal15. En stor poäng anges instabilitet i totala intensitet. Dessa analys synsätt kan vara lämplig för uppförandet av några molekyler, i stället för en enda molekyls beteende. Dessutom användes de genomsnittliga varaktigheterna för ljusa händelser för analys av blinkande SERS4,14. Dessa kunde avslöja beteendet hos molekylen i en förbättrad EM fältet, liknar den super-upplösning imaging SERS16. Genomsnitt för mörka händelser kunde emellertid inte härledas; nämligen de totala varaktigheterna mörka SERS händelser från enda silver nanoaggregates minskade med en ökning av antalet händelser4, medan den totala varaktigheten för ljusa SERS händelser ökade. Därför kunde endast molekylär uppförandet av ljusa SERS händelser undersökas av dessa tekniker. Med hjälp av en makt lag analys, däremot, molekylär beteendet för mörka staten (det vill säga på silver yta, med undantag för korsningar av silver nanoaggregates) kan beräknas i termer av makt lag exponent αoff och trunkering tiden10 . Detta är en väsentlig skillnad från tidigare tekniker.
För att bekräfta att den blinkande framkallas av SERS, mäts skalan från den silver nanoaggregate i mitten av en utsikt genom ett hål, som visas i Figur S3 i det kompletterande materialet. Det är dock inte mätt från alla blinkande ställen7,8,9,10,11. För poly-L-lysin11hänförs blinkar i en lång våglängd område inte till SERS, men till ytan-förbättrade fluorescens, som också har sitt ursprung i förbättrad EM fält som SERS. Dessutom är det kontroversiellt att ansluta fluktuerade spektra med blinkande. Detta är en begränsning av den nuvarande tekniken.
I framtiden, bör blinka SERS analyseras i termer av varje topp. Det vill säga bör makt lag analysen kombineras med spectral imaging. Med hjälp av en bi-analyt teknik17, där unika vibrationella signaturer observeras från blandade analyter, har ursprunget till singel-molekyl SERS bekräftats. Dock undersökas molekylär beteende inte avsevärt, på grund av tidsupplösningen. Nyligen, har olika beteendet hos varje ursprung upptäckts när det gäller de trunkering gånger, genom att observera Varje blinkande fläckarna genom varje optiska filter och makt lag analys11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Författaren tack Prof. Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) och Dr. T. Itoh (nationella institutet för avancerad industriell vetenskap och teknik) för deras fruktbar diskussion av detta arbete. Detta arbete stöds av KAKENHI (bidrag för vetenskaplig forskning C) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (nr 16K 05671).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nitrate, 99.8% | Wako | 194-00832 | |
| Trisodium citrate dihydrate, 99. % | Wako | 191-01785 | |
| Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine | Hayashibara Biochemical Laboratories | NK-2703 | a kind of thiacyanine dyes |
| 3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt | Hayashibara Biochemical Laboratories | SMP-9 | a kind of thiacarobocyanine dyes |
| Sodium chloride, 99.5% | Wako | 191-01665 | |
| Dimroth condenser | Iwaki | 61-9722-22 | perchased from AS ONE |
| Magnetic stirrer | Corning | DC-420D | |
| Oil bath | Advantech | OS-220 | |
| Glass plate | Matsunami | S-1112 | Microscope slide |
| Blower | Hozan | Z-288 | Air duster |
| Liquid blocker pen | Daido Sangyo | LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Objective lens | Olympus | LCPlanFl 60× | NA 0.7 |
| Dark field condenser | Olympus | U-DCD | NA 0.8–0.92 |
| Cooled digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-AG | controlled by software Aqua Cosmos |
| Software for the cooled digital CCD camera | Hamamatsu | AquaCosmos | used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video |
| Color CCD camera | ELMO | TNC-C920 | not used for analysis |
| DPSS laser | RGB laser system | NovaPro532-75 | λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2) |
| Interference filter | Semrock | LL01-532-12.5 | |
| Long pass filter | Semrock | BLP01-532R-25 | |
| Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events | home-maid | programmed by C++ | |
| Software for the fitting by a power law | LightStone | Origin6.1 |
References
- Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
- Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
- Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
- Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
- Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
- Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303 (2005).
- Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
- Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
- Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
- Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
- Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
- Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
- Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
- Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
- Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703 (2012).
- Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
- Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
- Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
- Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704 (2005).
- Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
- Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).
