Summary
هذه المخطوطة يصف كيف شق مثل الآفات على الخلايا الظهارية مثقف مونولاييرس مريح نموذج الجرح الشفاء في المختبر، مما يسمح للتصوير بواسطة [كنفوكل] أو الفحص المجهري بالليزر، والتي يمكن أن توفر جودة عالية البيانات الكمية والنوعية لدراسة سلوك الخلية والآليات المعنية بالهجرة.
Abstract
الهجرة الخلية جانب إلزامي لالتئام الجروح. إنشاء اصطناعية الجروح في نماذج حيوانية للبحث غالباً ما تكون النتائج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، بينما يحتمل أن تفتقر إلى الدقة. الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية منبرا مناسباً للبحث عن سلوك الخلية المهاجرة في التئام الجروح وأثر العلاجات في هذه الخلايا. غالباً ما يتم دراسة فسيولوجيا الخلايا الظهارية في ظروف غير روافد؛ بيد هذا النهج قد لا تشبه الجرح الطبيعية شفاء الظروف. تعطيل تكامل ظهارة بالوسائل الميكانيكية يولد نموذج واقعي، ولكن يمكن أن تعوق تطبيق التقنيات الجزيئية. ونتيجة لذلك، الأمثل لدراسة الهجرة الخلية الظهارية تقنيات الفحص المجهري على أساس في المختبر. هنا نحن التفصيل طريقتين محددة والمقايسة الصفر الجرح مصطنعة والمقايسة الجبهة الهجرة المصطنعة، التي يمكن الحصول على البيانات الكمية والنوعية، على التوالي، على أداء الخلايا الظهارية المهاجرة.
Introduction
الهجرة الخلية المطلوب لالتئام الجروح، كما أنها مسؤولة عن الإغلاق النهائي للفجوة الظهارية وترميم السطح تعطلت1. أداء الجروح الاصطناعية في نماذج حيوانية يسمح بتكرار هذه العملية المعقدة بالقرب من الظروف الفسيولوجية2. ومع ذلك، غالباً ما يؤدي هذا النهج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، التي يحتمل أن تكون تفتقر إلى الدقة لدراسة عمليات متميزة، بسبب الطبيعة المعقدة لعملية التئام الجروح.
الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية يوفر بديلاً مفيداً لنماذج حيوانية للبحث في الدور الذي تؤديه هذه الخلايا في التئام الجروح وآثار العلاج على سلوك الخلية المهاجرة. وكثيراً ما هو درس فسيولوجيا الخلايا الظهارية من التقنيات الجزيئية باستخدام غير روافد الثقافات3،4،،من56؛ ومع ذلك، عادة ما يتحقق الإخلال بسلامة ظهارة بغرامة شقوق الميكانيكية. في الخلية والثقافة، وهذا يعني أن عدد لا يذكر من الخلايا يمكن أن تتعرض إلى الفجوة الجرح، وهي تمثل عينة صغيرة جداً لتقنيات البيولوجيا الجزيئية. ومع ذلك، يمكن دراسة هذه الآفات على المستوى المجهري، مع استفادة خصائص بعض خطوط الخلايا الظهارية، مثل الخلية "الظهارية المنك الرئة" (Mv1Lu) أو الخلايا keratinocyte الإنسان عفويا مخلدة (هاكات) الفطرية المهاجرة خطوط.
هنا وصفت لنا طريقة للفحص المجهري مناسب للحصول على بيانات كمية عن هجرة الخلايا الظهارية في سياق الجرح الشفاء3،4،،من78. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم الطرق الإضافية التي قد تكون مفيدة لدراسة التغيرات الجزيئية نوعيا والمورفولوجية التي تحدث في مونولاييرس طلائي أثناء الترحيل. عموما، هذه الأساليب توفر إطارا لدراسة ديناميات والتغييرات الشكلية التي تشارك مع سلوك الخلايا الظهارية واستجابة للعلاج أثناء التئام الجروح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-اصطناعية الجرح المقايسة الصفر للدراسات الكمية
- إعداد أحادي الطبقة الخلية
- العمل تحت ظروف معقمة، البذور وتنمو الخلايا الظهارية Mv1Lu أو هاكات في قوارير الثقافة باستخدام مصل تكمل المتوسطة. تحديث المتوسط مرة كل 24-48 h. بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80%، فصل الخلايا باستخدام الطريقة المناسبة، أي، تريبسينيزيشن9.
ملاحظة: Mv1Lu هاكات تستزرع خطوط الخلايا الظهارية المتوسطة الثقافة اللور وديميم، باستخدام على التوالي، تكملها مم 2 لتر-الجلوتامين والمحتضنة في 37 درجة مئوية مع جو التي تسيطر عليها شركة 5%2. يجب أن جزيئي كل خط الخلية دقيق لتحديد تركيز الخلية والتوقيت المطلوب للوصول إلى كامل كونفلوينسي. عادة للخلايا Mv1Lu أو هاكات، 2-4 × 104 أو 4-6 × 104 خلايا/حسنا، على التوالي، هي المصنفة في قارورة ثقافة2 سم 175، وفي 80% التقاء غلات تصل إلى 35 × 106 Mv1Lu أو 1 × 107 هاكات الخلايا. - في أما صفيحة ثقافة جيدا 12 أو 24، حسنا، البذور في كل بئر 2 مل خلايا. تحديث المتوسط مرة كل 24-48 h. ضمان خلية أرقام عالية بما يكفي للتوصل إلى التقاء 100% بعد 2 أو 3 أيام.
- بعد الخلايا إلى التقاء، إزالة المتوسطة يكمل المصل ويغسل مرتين مع متوسطة جديدة خالية من المصل. إبقاء الخلايا في المتوسط خالية من المصل ح 24 قبل الخدش.
ملاحظة: الخلايا Mv1Lu أو هاكات لا تملك متطلبات الركيزة الخاصة؛ ومع ذلك، لخطوط الخلايا عرضه لفصل تلقائياً في ظروف خالية من المصل، ينبغي قبل طلاء السطح لوحة الثقافة باستخدام حل بولي-L-يسين10.
- العمل تحت ظروف معقمة، البذور وتنمو الخلايا الظهارية Mv1Lu أو هاكات في قوارير الثقافة باستخدام مصل تكمل المتوسطة. تحديث المتوسط مرة كل 24-48 h. بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80%، فصل الخلايا باستخدام الطريقة المناسبة، أي، تريبسينيزيشن9.
- أحادي الطبقة الخدش
- العمل في بيئة معقمة، الصفر أحادي الطبقة الثقافة بسحب نهاية ضيقة من 20 ميكروليتر أو نصيحة ميكروبيبيتي العقيمة 200 ميليلتر، اعتماداً على العرض المطلوب بالصفر بشدة. الاحتفاظ نصيحة عمودياً على سطح الثقافة تحقيق أقصى قدر من التجانس الفجوة.
- وضع لوحات الثقافة فوق سطح الظلام بوضوح رصد أحادي الطبقة الخلية. إذا لزم الأمر، تنفيذ اثنين من خدوش عمودي (على شكل الصليب) على كل بئر لدراسة ما يصل إلى 4 مناطق الهجرة.
- يغسل خلايا منفصلة عن طريق إزالة بلطف الثقافة المتوسطة والمتوسطة خالية من المصل الطازج إضافة بلطف. كرر مرتين، أو حتى أزيلت معظم الخلايا فاتحة.
- العمل في بيئة معقمة، الصفر أحادي الطبقة الثقافة بسحب نهاية ضيقة من 20 ميكروليتر أو نصيحة ميكروبيبيتي العقيمة 200 ميليلتر، اعتماداً على العرض المطلوب بالصفر بشدة. الاحتفاظ نصيحة عمودياً على سطح الثقافة تحقيق أقصى قدر من التجانس الفجوة.
- جمع البيانات وإجراء تجريبي
- التقاط صور المرجع قبل العلاج يصل إلى 4 تتمحور حول الفجوة الصفر من كل أيضا استخدام مجهر مقلوب مرحلة تباين دمج كاميرا CCD. حدد مجالات الاهتمام بمحاذاة حافة الحقل المجهر على تقاطع المتاخمة الخدوش.
ملاحظة: عادة، الصور يتم الحصول عليها باستخدام تكبير 10 x وحجم صورة 1,280 x 1,024 بكسل. تحديد مجالات الاهتمام كما هو موضح أعلاه يساعد للتعريب سهلة والتحقق من القياسات تصل إلى 4 كل بئر. - حالما يتم الحصول على جميع الصور، تعين معاملة الآبار؛ تبادل المتوسطة في الآبار مع المتوسطة الطازجة يحتوي على علاجات مختارة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، للمواد الكيميائية أو المركبات التي لا تخل تجانس الثقافة المتوسطة، علاجات يمكن تلقيح مباشرة في المتوسط الثقافة. - احتضان لوحة خدش (37 درجة مئوية، مع جو الخاضعة للرقابة التي تحتوي على 5% CO2) حتى الشروط تحت مراقبة الوصول إلى 90% إغلاق الفجوة الصفر. تجنب الإغلاق الكامل.
ملاحظة: إغلاق الفجوة الإجمالية يبطل جمع الصورة بعد العلاج حسب المجالات المرجعية لا يمكن الكشف عنها ولا يمكن إنشاء مرجع وقت لإغلاق الفجوة. في حالة الخلايا Mv1Lu أو هاكات، المطلوبة للوصول إلى التقاء 90% ح 16-19. - وقف الهجرة الخلية عن طريق تحديد الخلايا؛ استبدال بلطف المتوسطة الثقافة التجريبية مع 1 مل من 4% فورمالين في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
- تغسل الخلايا لإزالة الفورمالين الزائدة؛ استبدال الحل في الآبار بلطف مع برنامج تلفزيوني جديد. كرر مرتين على الأقل.
ملاحظة: في هذه المرحلة، وبعد الختم، لوحات يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. - تأخذ الصور مرجع بعد العلاج لكل بئر من المناطق المرجع الأصلي أسروا بعد الخدش. استخدام نفس معدات (مجهر التباين المرحلة الضوئية المقلوب تتضمن كاميرا CCD) ومطابقة إعدادات الصورة (التكبير والقرار/الكثافة الرقمية).
ملاحظة: الصور الوقت-الدورة التدريبية للخلايا التي تهاجر منفردة وسد الفجوة في معزل عن تشكيل جبهة متماسكة (مثل، جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 خلايا سرطان الثدي البشرية)، قد تسمح حساب سرعة الهجرة الخلية الفردية.
- التقاط صور المرجع قبل العلاج يصل إلى 4 تتمحور حول الفجوة الصفر من كل أيضا استخدام مجهر مقلوب مرحلة تباين دمج كاميرا CCD. حدد مجالات الاهتمام بمحاذاة حافة الحقل المجهر على تقاطع المتاخمة الخدوش.
- تحليل الصور والتحديد الكمي للهجرة
- باستخدام البرمجيات (مثل، إيماجيج) ومعالجة الصور، تحديد حدود الصفر الفجوة وتحديد سطح الفجوة لقياسات تصل إلى أربعة في صور قبل العلاج. تسجيل البيانات كما "الفجوة ما قبل المعالجة السطحية" (PREGAP). كرر الإجراء نفسه للصور بعد العلاج. تسجيل البيانات كما "الفجوة بعد المعالجة السطحية" (بوستجاب).
- قم بفتح الصورة المسجلة باستخدام إيماجيج. في القائمة "صورة"، قم بتعيين نوع الصورة إلى 8 بت. في القائمة "عملية"، انتقل إلى القائمة الفرعية "عوامل تصفية" وتطبيق التصفية "الفرق".
- في القائمة "صورة"، أدخل "ضبط" القائمة الفرعية وتعيين العتبة إلى أبيض وأسود (ب & ث)، تأكد من عدم تحديد "خلفية داكنة". في القائمة "عملية"، انتقل إلى القائمة الفرعية "ثنائي"، وحدد "سد الثغرات".
- في القائمة "تحليل"، حدد "تعيين قياسات" وتفعيل "المنطقة". قم برسم منطقة قابلة للقياس بعد ترحيل كفاف الحافة ومن ثم تحديد الفجوة.
- في القائمة "تحليل"، حدد "تحليل الجزيئات" وتسجيل قيم "المساحة الإجمالية" لسطح المنطقة المرسومة.
- إدخال قيم المساحة الكلية PREGAP وبوستجاب في جدول بيانات لقياس الهجرة المطلقة لكل مجموعة من العينات الفردية كالفرق بين القياسات السطحية الفجوة: − PREGAP بوستجاب [وحدات التعسفي]. بالإضافة إلى ذلك، تطبيع بيانات الهجرة المطلقة لكل شرط لعينات التحكم: (عينة/الرقابة) * 100 [%].
ملاحظة: للخلايا التي تهاجر منفردة وسد الفجوة في معزل عن تشكيل جبهة متماسكة، (مثلاً، جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 خلايا سرطان الثدي البشرية)، الهجرة المطلقة يمكن حسابها من عد الخلايا الغازية وسط الشريط أما في عنصر التحكم أو العينات المعالجة. - ارسم النواتج الكمي (انظر الشكل 1). إجراء تحليل إحصائي إذا لزم الأمر.
- باستخدام البرمجيات (مثل، إيماجيج) ومعالجة الصور، تحديد حدود الصفر الفجوة وتحديد سطح الفجوة لقياسات تصل إلى أربعة في صور قبل العلاج. تسجيل البيانات كما "الفجوة ما قبل المعالجة السطحية" (PREGAP). كرر الإجراء نفسه للصور بعد العلاج. تسجيل البيانات كما "الفجوة بعد المعالجة السطحية" (بوستجاب).
2. اصطناعية الهجرة المقايسة الجبهة للدراسات الطوبوغرافية
- إعداد أحادي الطبقة الخلية
- تعمل في ظروف معقمة، وضع طبقة واحدة من كوفيرسليبس جولة معقمة في لوحات الثقافة فارغة حتى تغطي السطح صفيحة تماما.
ملاحظة: ما يصل إلى 12 و 33 كوفيرسليبس احتواءه على 5 سم ولوحات قطرها 10 سم، على التوالي. - على لوحة الثقافة، بلطف البذور حجم مناسب للخلايا بتركيز تتيح التقاء 100% بعد 2 أو 3 أيام. تأكد من ساترة لا يتراكب مع كوفيرسليبس المجاورة ومنع كوفيرسليبس من الطفو بتطبيق ضغط لطيف مع تلميح ميكروبيبيتي عقيمة. تحديث المتوسط كل ح 24-48.
ملاحظة: كل خط الخلية يجب أن يكون جزيئي دقيق لتحديد تركيز الخلية والتوقيت المطلوب للوصول إلى كامل كونفلوينسي. عادة للخلايا Mv1Lu أو هاكات، 2-3 × 106 أو 2.5-4 × 106 خلايا/10 سم-قطر صفيحة، على التوالي، من المصنف. لوحات أصغر، يجب تقليص أرقام الخلية. - بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء، إزالة المتوسطة يكمل المصل واستبدل بمتوسطة جديدة خالية من المصل. إبقاء الخلايا في المتوسط خالية من المصل ح 24 قبل أن يتم تنفيذ الجرح مصطنعة.
ملاحظة: الخلايا Mv1Lu أو هاكات لا تملك متطلبات الركيزة الخاصة؛ ومع ذلك، لخطوط الخلايا عرضه لفصل تلقائياً في ظروف خالية من المصل، ينبغي قبل طلاء السطح الثقافة باستخدام حل بولي-L-يسين10.
- تعمل في ظروف معقمة، وضع طبقة واحدة من كوفيرسليبس جولة معقمة في لوحات الثقافة فارغة حتى تغطي السطح صفيحة تماما.
- إصابة أحادي الطبقة
- استخدام ملاقط معقمة، تحرك بلطف ساترة لصفيحة نظيفة 10 سم تحتوي على متوسطة جديدة خالية من المصل. تجنب إتلاف أحادي الطبقة بعقد ساترة على الهامش مع ملاقط. تجنب الضغط المفرط الذي يمكن أن يسفر عن الكسر ساترة.
- إنشاء الجروح الاصطناعية عن طريق سحب شفرة حلاقة معقمة في خط عرضية فوق مركز كوفيرسليبس. اسحب 3-4 مم ذهابا وإيابا، من أجل إزالة تماما في قطاع أحادي الطبقة الوسطى. تأكد من أن يظل لا حطام خلية المرفقة إلى حواف الجرحى.
ملاحظة: في قطره 12 ملم جولة ساترة، يتم إجراء الشق على منتصف ساترة. تأكد من ترك مسحه من الخلايا المقابلة للجبهة الرئيسية كبيرة بما يكفي (على الأقل من 2 مم) لتجنب إمالة من ساترة في الخطوات التالية. - نقل الجرحى كوفيرسليبس مع الخلايا التي تواجه، على صفيحة نظيفة 6-جيدا تحتوي على مالا يقل عن 2 مل جديدة خالية من المصل وسيلة. يصلح كوفيرسليبس الجرحى يصل إلى 4/جيدا.
- تغسل بلطف مرتين استخدام الطازجة المتوسطة خالية من المصل لإزالة خلايا منفصلة.
- الإجراء التجريبي وأخذ العينات
- تبادل المتوسطة في الآبار مع المتوسطة الطازجة يحتوي على علاجات مختارة بلطف.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، للمواد الكيميائية أو المركبات التي لا تخل تجانس الثقافة المتوسطة، علاجات يمكن تلقيح مباشرة في المتوسط الثقافة. المضي قدما بحذر لتجنب أي مفرزة خلية المحتملة. - تبقى اللوحة داخل حاضنة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2) لتوقيت التجريبية المطلوبة.
- وقف الهجرة الخلية عن طريق تحديد الخلايا؛ استبدال بلطف المتوسطة الثقافة التجريبية مع 1 مل من 4% فورمالين في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
ملاحظة: لوقت إجراء التجارب بالطبع، إزالة العينات من لوحة الثقافة وإصلاحها في لوحة منفصلة لتجنب أبخرة الفورمالين التي تؤثر على ظروف تجريبية أخرى، والجارية. - تغسل الخلايا لإزالة الفورمالين الزائدة؛ استبدال الحل في الآبار بلطف مع برنامج تلفزيوني جديد. كرر مرتين على الأقل.
ملاحظة: في هذه المرحلة، وبعد الختم، لوحات يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
- تبادل المتوسطة في الآبار مع المتوسطة الطازجة يحتوي على علاجات مختارة بلطف.
- الفلورة (إذا كان) وتحليل طوبولوجي
- أداء إذا تلطيخ والتصوير في كوفيرسليبس الفردية كوصف في مكان آخر3،،من411.
- بيرميبيليزي لمدة 10 دقائق قبل غمر كوفيرسليبس في حل X-100 تريتون 0.3% في برنامج تلفزيوني.
- كتلة مدة 30 دقيقة باستخدام حل حظر التالية: 0.3% "ألبومين المصل البقري"؛ 10% مصل بقرى الجنين؛ اللبن المقشود 5%؛ 0.3 الحل X-100 تريتون % في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: حجب الحل دون حليب يمكن إعدادها مسبقاً والمخزنة في-20 درجة مئوية. - احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة، مع جسم الابتدائي المخفف في حل حظر خالية من الحليب. وضع في كوفيرسليبس رأسا في حل جسم 15 ميليلتر لضمان التوزيع السليم.
ملاحظة: إضعاف العامل جسم متغير وسوف تعتمد على الجسم في الاستخدام. على سبيل المثال، يتطلب الأجسام المضادة-ج-يونيو أرنب إضعاف 1/100. - أغسل ثلاث مرات بالغمس كوفيرسليبس في حل X-100 تريتون 0.1% في برنامج تلفزيوني.
- احتضان كوفيرسليبس في جسم الثانوي المخفف في المخزن المؤقت حظر خالية من الحليب لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: إضعاف العامل جسم متغير وسوف تعتمد على الجسم في الاستخدام. على سبيل المثال، يتطلب الماعز-مكافحة-الأرنب (488) إضعاف 1/400 للقرار الأمثل. يمكن إضافة الكواشف وضع العلامات الأخرى مثل فالويدين و 33258 هويشت إلى المخزن المؤقت الحضانة في هذه المرحلة. - أغسل ثلاث مرات بالغمس كوفيرسليبس في حل X-100 تريتون 0.1% في برنامج تلفزيوني.
- جبل كوفيرسليبس رأسا في 10 ميليلتر تركيب وسائل الإعلام قطره (مثلاً، فيكتاشيلد) على شريحة مجهر. اترك الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لتصلّب متوسطة المتصاعدة. وبعد ذلك، تخزن في 4 درجات مئوية في الظلام إلى أجل غير مسمى.
- الحصول على ابيفلوريسسينسي أو صور مجهرية [كنفوكل] للتغيرات الهيكلية التي تحدث في الحافة الأمامية ترحيل.
ملاحظة: يمكن إجراء الدراسات الطوبوغرافية التي تجانب الصور من الجبهة ترحيل لأحادي الطبقة الداخلية. دراسات شبه كمي ممكن عن طريق تحليل البرمجيات القائمة على كثافة الأسفار المحلية.
- أداء إذا تلطيخ والتصوير في كوفيرسليبس الفردية كوصف في مكان آخر3،،من411.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الجرح اصطناعية المقايسة الصفر للدراسات الكمية: تقييم عامل نمو البشرة (لو) الترويج للهجرة:
لو محفز معروفة انتشار الخلايا الظهارية والهجرة، وبالتالي عنصر تحكم إيجابية للتحديد الكمي لتشجيع الهجرة. واستخدمت مونولاييرس خلية Mv1Lu وهاكات في فحوصات الصفر الجرح وتم الحصول على صور قبل العلاج. بعد التطعيم مع 10 نانوغرام/مل مماثلة، كانت الخلايا المحتضنة ح 19 قبل التثبيت وصور بعد العلاج. أبقى الانتشار إلى الحد أدنى من الحفاظ على ظروف المجاعة المصل. حللت قبل وبعد العلاج مجموعات من الصور باستخدام إيماجيج، وتم تحديد مجالات الفجوة المركزية. تم تشغيل هذه التجربة في التكرارات، تسجيل القياسات الأربع لكل بئر. تم حساب التقدير الكمي للهجرة المطلقة كفرق السطوح: (PREGAP − بوستجاب). هناك إمكانات هجرة أكبر في حفز الخلايا Mv1Lu (الشكل 1A) مقارنة بحفز الخلايا هاكات (الشكل 1B). الاختلافات موضحة حسب المصادر الخلية، يجري الغشاء المخاطي للخلايا الظهارية والجلد الكيراتينيه، على التوالي.
الهجرة اصطناعية المقايسة الجبهة للدراسات الطوبوغرافية: الاختلافات في تشكيل سيتوسكيليتال والتعبير المكاني من ج-يونيو:
الهجرة الخلية ينطوي على تغييرات المستمر والعميق لهيكل cytoskeleton بغية الحفاظ على الخلية التشرد. واستخدمت هاكات خلية مونولاييرس في فحوصات الجبهة الهجرة في ظروف المراقبة والتحفيز. المعاملة مع لو يقوي التي تعالج ديناميكية cytoskeletal، التي يتم مراقبتها من قبل إذا والليزر الفحص المجهري (LSM؛ الشكل 2 (أ)). كما يؤدي معاملة مماثلة قوية مؤنزم ميتوجيناكتيفاتيد البروتين (خريطة) مما يشير إلى و overexpression ج-يونيو. تجانب الصور LSM يسمح بتكوين الأنماط المكانية. يمكن كشف زيادة التعبير عن ج-يونيو في الخلايا المجاورة للجبهة ترحيل بسهولة بتحليل الصور البرمجيات؛ هنا، قمنا بتنفيذ نطاق قوس قزح للقناة الخضراء، التي تتوافق مع ج-يونيو وضع العلامات (الشكل 2).
رقم 1. تشجيع هجرة مماثلة في خلايا Mv1Lu وهاكات. الصور مجهرية المرحلة-على النقيض من منطقة الجرحى من Mv1Lu (A) وأخذت تحت ظروف مراقبة الخلايا هاكات (ب) ومقارنة لصور الخلايا تعامل مع 10 نانوغرام/مل مماثلة ح 19 في ظروف خالية من المصل. ميكروجرافس الممثل تظهر مدى الفجوة الصفر والإغلاق التي تم الحصول عليها بعد إصابة مع تلميح ميكروبيبيتي 20 ميليلتر. التكبير = x 10؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. خلية الهجرة كان كمياً وتمثيله كتباين مجال الاختلافات بين العلاجات وعينات مراقبة لكل فحص (وحدات التعسفي؛ الاتحاد الأفريقي). المؤامرة هو الممثل لثمانية مقاييس مستقلة لكل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. خيوط الأكتين وتغييرات التعبير ج-يونيو تعززها مماثلة في ترحيل هاكات الخلايا. (A) بين عشية وضحاها 10 نانوغرام/مل لو العلاج يعزز تغييرات عميقة في المطابقة خيوط الأكتين في ترحيل هاكات الخلايا. تصوير cytoskeleton خيوط أكتين الهيكل المتﻻصق بشدة الخلايا في مقدمة شروط مراقبة الهجرة، بينما الخلايا تعامل مع لو تبين منظمة خيوط أكتين الفقيرة في الجزء الأمامي من الهجرة. التكبير = x 63؛ شريط المقياس = 20 ميكرومتر. واكتين المرمزة باللون الأحمر، وهو يمثل هويشت بلون أزرق. (ب) عندما يتم استخدام المناعية-الأسفار في تركيبة مع التصوير LSM لدراسة التعبير ج-يونيو بعد 10 نانوغرام/مل لو العلاج على ترحيل هاكات الخلايا، التراكيب تبليط تكشف عن أنماط التعبير المكاني. تم تحويل صور الأسفار ج-يونيو (الأخضر) إلى الألوان الزائفة لإظهار كثافة تلطيخ ج-يونيو. جدول ألوان قوس قزح يمثل كثافة الأسفار ج-يونيو، المقابلة كولورمابس على لوحات حق مماثلة والتحكم. واستخدمت تلطيخ يشترك مع فالويدين (أحمر) وهويشت-33258 (أزرق) لإظهار بنية الخلية ونوى، على التوالي. وأخذ صور مجهر [كنفوكل]. ملاحظة تزايد مستويات التعبير من يونيو ج النووية في المناطق التي تقترب من الجبهة ترحيل. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الجلد أو الأغشية المخاطية التعطيل، يتم استعادة وظيفة حاجز الأعمال التي تقوم بها العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الليفية أو الخلايا الظهارية ومحصنة. مربوط، تخضع هذه الخلايا معقدة العملية التي تنطوي على المبرمج وانتشارها، والتمايز، والأهم من ذلك، تنتجها الخلايا الليفية وطلائي خلايا الهجرة، وهي المسؤولة عن ترميم الأنسجة تعطلت الآلية في نهاية المطاف، إغلاق الفجوة الظهارية السطحية1،12 هكذا، دراسة الهجرة الخلية يساعد على دقة وصف السلوك الفسيولوجية للخلايا الظهارية، بينما أيضا تحديد الإمكانات مودولاتوري علاجات للجرح الشفاء.
أداء الجروح الاصطناعية في نماذج حيوانية بحوث مختلفة يسمح بتكرار هذه العملية المعقدة بالقرب من الظروف الفسيولوجية2، ومن ثم تقييم بعض الحالات المرضية أو آثار الأدوية 13من العلاجات. ومع ذلك، غالباً ما يؤدي هذا النهج في اللوجستيات مكلفة ومعقدة، فضلا عن الإجراءات التجريبية المرهقة التي قد تولد البيانات في أزياء تأخر13. على العكس من ذلك، أن زراعة الخلايا في المختبر يوفر إطارا أكثر ملاءمة للبحث في سلوك الخلايا التي تشارك في عملية التئام الجرح. بينما زراعة الخلايا الأولية للخلايا الظهارية يشكل خياراً قابلاً للتطبيق، يمكن أن يكون من الصعب الحصول على والتعامل مع الخلايا، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعقيد جمع البيانات. على سبيل المثال، بالإضافة إلى تقييد مرور منخفضة نموذجية من الثقافات الأولية، تحتاج الكيراتينيه البشرية الأولية تنتجها الخلايا الليفية تغذية طبقة للنمو في المختبر3. على العكس من ذلك، خطوط الخلايا الظهارية راسخة الثقافة، مثل Mv1Lu أو هاكات، تشكل نموذجا بحوث خالية من العقبات أن سلوك الميزات والخصائص مثل تلك الموجودة في الثقافة الأولية الخلايا3،4، ،من 1415. تحديداً، للدراسة لالتئام الجروح، تحتفظ هذه الخلية اثنان الخطوط السمات الحاسمة في قدرتها على الهجرة، ووقف انتشار بسبب إعاقة الاتصال خلية إلى خلية عند التقاء16،17.
فحوصات الصفر طريقة موثوقة وتنوعاً للتحديد الكمي للقدرات المهاجرة من أنواع الخلايا المختلفة، لا سيما الظهارية والخﻻيا السرطانية. في حالة الخلايا السرطانية، قد اقترح طريقة الصفر لتقييم الإمكانات الغازية. ومع ذلك، يقصر هذا النهج كمؤشر اختزاع عند مقارنتها بأساليب أكثر تحديداً الاعتماد على التعبير عن ميتالوبروتيسيس اللازمة لاختراق ال18،المصفوفة خارج الخلية19. على العكس من ذلك، الصفر فحوصات يمكن الاعتماد عليها لتقييم أداء الخلايا الظهارية المهاجرة وتأثير العلاجات المختلفة على هذه السمات. وعلى النقيض من خطوط خلايا السرطان، التي كثيرا ما تظهر ضعف التماسك والقدرة على النمو في عدة طبقات، Mv1Lu، هاكات، والخلايا الظهارية خطوط شكل محكم المرتبطة "النمو الجزر الأخرى"، وتوسيع الهوامش في عملية الاعتماد على حد سواء الانتشار، ولكن الهجرة الخلية الأهم على المزيد. ونتيجة لذلك، ظروف كثافة متفرق أو شبه المتلاقية خلية تستخدم تقليديا لدراسة آثار المعالجات المختلفة على فسيولوجيا المهاجرة؛ خاصة عندما يتم تطبيق تقنيات البيولوجيا الجزيئية اللاحقة، كهذه الخلية البيئة يقلل من تثبيط الاتصال بينما تعظيم نسبة نشاط ترحيل الخلايا. ومع ذلك، للخلايا الظهارية، الظروف غير روافد تشكل خطر استبعاد أهمية التأثيرات تثبيط الاتصال الموجودة من قبل، وعلى سبيل المثال في شكل لائحة جينية. وهكذا، تمنح الظروف المتلاقية دراسة التئام الجروح وزيادة الدقة من الطراز.
للحصول على تقديرات دقيقة، ينبغي معالجة العوامل المصاحبة التي تؤثر على تشكيل طبقة الخلايا الظهارية أو المساهمة في الهجرة. في حين أن المطلوب هو التقاء، من المهم تجنب كثافة الخلايا المفرط أو الثقافات المتعددة الطبقات، ونظرا لهذه الظروف قد تؤثر تأثيراً سلبيا على. ولذلك، عادة يتم التحكم انتشار المجاعة في وسائل الإعلام الحرة المصل أو بإضافة مواد كيميائية مثل "ج ميتوميسين"، الذي لا رجعة فيه وقف تكاثر الخلايا بالحمض النووي كروسلينكينج3،20، 21. استخدام واحدة أو أخرى تعتمد على سلوك خطوط الخلايا المحددة؛ خاصة يشار ميتوميسين ج عندما خفضت مكملات مصل مطلوب لتجنب مفرزة خلية ضخمة. هذا هو الحال بالنسبة للخلايا HEK 293T، حيث قبل طلاء السطح الثقافة باستخدام بولي-L-يسين هو خيار جيد لتجنب معاملة ميتوميسين ج. الإفراج عن العوامل المثيرة التي يمكن أن تغير الهجرة أيضا تحتاج إلى معالجتها. وقد استخدمت استراتيجيات مختلفة، تستند أساسا إلى إدراج السيليكون لتقليد تعطيل سطح الظهارية تحقيقه مع المقايسة الصفر22. في حين إدراج توليد الثغرات الموجودة من قبل أن تسمح للهجرة الخلية بعد إزالة قطعة السيليكون، يعتمد الأسلوب الصفر مباشرة في إزالة بعض من أحادي الطبقة الظهارية لتوليد الفجوة. الأفضلية على كيفية توليد الثغرة تعتمد على قدرة إدراج لحماية طلاء السطح الثقافة (أي، لوحة الثقافة أو بولي-L-يسين) من الضرر خلال خدش، مع التقليل أيضا الإفراج عن العوامل من الخلايا التالفة التي قد حل وسط في خلية ثقافة السلوك23. على الرغم من أن هذه الخصائص قد تكون مفيدة لبعض الإعدادات تجريبية، أي تقييم قدرة الخلايا السرطانية على ترحيل، تجربتنا وجدنا في عيوب كبيرة لاستخدام إدراج في الجرح الشفاء الدراسات. خلايا Mv1Lu قادرون على إرفاق سيليكون إدراج السطح الخارجي، مما يؤدي إلى تمزق المونولاير الخلية عند إزالة قطعة السيليكون عن غير قصد. أيضا، على الرغم من عدم إرفاق هاكات خلايا السيليكون، وجدنا قدرة المنقوصة لهذه الخلايا على الهجرة إلى الثغرات المولدة بواسطة إدراج. لأن مدى والتهاب والهجرة هي الردود المرتبطة بها أحكام، وهذه تبدو وكأنها حاسمة معا في سياق التئام الجروح في الخلايا هاكات. وعلاوة على ذلك، منذ تطبيق تلميح بلاستيك للخدش على سطح الثقافة لا نتيجة واضحة على قدرة الخلايا إعادة ملء هذه الفجوة، وفي حالة الخلايا هاكات، مثل هذا السلوك يوحي أن مخلفات المصفوفة خارج الخلية في الفجوة قد توجيه الهجرة في بطريقة مماثلة الأدمة في جرح طبيعية.بيد أن المصدر الرئيسي لتباين يظل الخدش الإجراء نفسه، كما لا تجعل استخدام تلميح البلاستيكية جعل الجرح دائماً نفس حجم الفجوة. وقد لاحظنا اختلافات تصل إلى 20% بين العينات المختلفة، بسبب عدم اتساق ضغط والموقف من غيض من الصفر في الوقت. يمكن معالجة هذه الاختلافات بجرح في أحادي الطبقة مع كائن أكثر تشدداً؛ ومع ذلك، أي الصفر على سطح البلاستيك يهدد بالحركة الحرة للخلايا. لذا، الاختلافات في البداية الأولى يجب أن تؤخذ في الاعتبار لحساب الهجرة؛ بشكل عام، بزيادة عدد قياس كل حالة.
بالإضافة إلى التقدير الكمي، يمكن تطبيق الإجراءات مما أدى إلى جرح جنبا إلى جنب مع الأساليب الكلاسيكية إذا نوعيا تقييم العمليات الجزيئية للهجرة الخلية. القدرة على الخلايا الظهارية تنمو على كوفيرسليبس نعرف جيدا؛ في الماضي، فحوصات تنويعات الصفر تشارك الخلايا المهاجرة في كوفيرسليبس التي تتعرض لظروف مختلفة متبوعاً بتحديد وتلطيخ للمقارنة ضمن الإعداد التجريبية الجرح-الصفر24. وهنا، وجدنا أن نخلق فجوات واسعة في مونولاييرس المتزايد على كوفيرسليبس يسمح بتمديد الوقت التجريبي الدورات3،4،7. وعلاوة على ذلك، في هذه التجارب، إذا شملت زيادة قدرات الكشف عن الإجراء الذي يحتمل أن تكون دراسة أي من الآليات الخلوية وسوبسيلولار دقيقة، وأنه محدود فقط بوجود أجسام مضادة مناسبة لهذا الأسلوب الخلايا ذات الاهتمام. العينات في كوفيرسليبس المستخدمة إذا هي التي شنت على شرائح المجهر، مما يسمح بالحفاظ على الموسعة. وهذا يساعد تطبيق تجريبي على الأجهزة التي تتطلب فترات طويلة من الدراسة، مثل النهج "تجانب" التي عرضت هنا وفي أماكن أخرى3،،من47. في حين أن استراتيجية "تجانب" يدمج الأنماط المكانية مع البيانات الزمانية لإعادة بناء الآليات المعنية بالهجرة، تنفيذ أدوات تحليل البرمجيات يمكن توفير تقييمات شبه كمي استناداً إلى الأسفار المحلية كثافة، وإثراء نوعية المعلومات التي تم الحصول عليها. في تجربتنا، التجانب كما يوفر إمكانية دراسة معلومات الخلية الموضعية للتعبير عن البروتينات في هذا النوع من التحليل. تبين هذه المعلومات الموضعية أمرا بالغ الأهمية لفهم وترجمة أفضل آثار عوامل مختلفة على الهجرة الخلية، لا سيما في الأجهزة حيث موضع الخلايا الظهارية مهم جداً لتحديد سلوك المهاجرة3 4، ،،من1415.
توضح الإجراءات كلا وصف راحة كبيرة بالتنفيذ غير معقدة، فضلا عن إنتاج بيانات نوعية. وهكذا، هذه النهج التي تستند إلى دراسات مجهرية، توفر إطارا فريدة وقوية لدراسة ديناميات والتغييرات الشكلية التي تشارك في سلوك الخلايا الظهارية واستجابة للعلاج أثناء التئام الجروح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أنه لا يوجد أي تعارض في المصالح.
Acknowledgments
نحن نريد أن نعطي بفضل كبار أعضاء المختبر التي تساعد في تحسين وصقل هذه التقنيات إلى حالته الفعلية: د. سيليا مارتينيز-مورا؛ أنا الدكتور مروويك والدكتور كاتالينا رويز-كانيادا والدكتور أنطونيا الكاراز-غارسيا. ونحن مدينون لمستشفى Clínico الجامعي فيرجن de la اريتشاكا لدعم تطوير هذه التقنيات بشدة. كما دي معهد الصحة كارلوس الثالث، Sanitarias فوندو للبحوث. خطة استاتال أنا + د + أنا ومعهد دي السعود كارلوس الثالث-Subdirección العامة دي تقييم y Investigación de la الحكوميتين (منحة رقم: PI13/00794)؛ www.isciii.es-FEDER Fondos "أونا manera de hacer Europa". ونشكر أيضا جامعة دي مورسيا، إيميب-اريتشاكا وفيس للدعم الإداري والمساعدة. وأخيراً، نحن نريد أن نعطي خاصة بفضل الدكتورة إيزابيل مارتينيز-أرجودو وفي كلية العلوم عليه ص Bioquímica، حرم تكنولوجيا البحار de la مومنتم دي أرماس، جامعة قشتالة لامانشا، توليدو لدعمهم الطيبة في التنازل عن طيب خاطر الطب الحيوي ومختبر التكنولوجيا الحيوية تجعل من الممكن تصوير جزء من هذه الورقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
