Summary
Ce manuscrit décrit comment incision-comme des lésions sur des monocouches de cellules épithéliales cultivées idéalement modèle embobiné guérison in vitro, permettant pour l’imagerie confocale ou microscopie à balayage de laser, et qui peuvent fournir de haute qualité données quantitatives et qualitatives pour l’étude de comportement de la cellule tant les mécanismes impliqués dans la migration.
Abstract
La migration cellulaire est un aspect obligatoire pour la cicatrisation des plaies. Création artificielle plaies sur des modèles animaux de recherche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, tandis que potentiellement manque de précision. In vitro culture de lignées de cellules épithéliales fournit une plate-forme appropriée pour des recherches sur le comportement migratoire de cellule dans la cicatrisation des plaies et l’impact des traitements sur ces cellules. La physiologie des cellules épithéliales est souvent étudiée dans des conditions non-confluent ; Toutefois, cette approche ne peut pas ressembler à conditions de cicatrisation naturelle. Perturbant l’intégrité de l’épithélium par des moyens mécaniques, génère un modèle réaliste, mais peut faire obstacle à l’application des techniques moléculaires. En conséquence, les techniques de microscopie basée sont optimales pour l’étude de la migration de cellules épithéliales in vitro. Nous détaillons ici deux méthodes spécifiques, le dosage zéro blessure artificiel et le dosage avant migration artificielle, qui peut obtenir des données quantitatives et qualitatives, respectivement, sur les performances migratoires des cellules épithéliales.
Introduction
La migration cellulaire est nécessaire pour la cicatrisation des plaies, car elle est responsable de la fermeture définitive de l’écart épithélial et de la restauration de la surface perturbée1. Effectuant des blessures artificielles dans des modèles animaux permet la réplication de ce processus complexe en proches des conditions physiologiques2. Toutefois, cette approche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, qui potentiellement manquent de précision pour l’étude des processus distincts, étant donné la nature complexe du processus de cicatrisation.
In vitro culture de lignées de cellules épithéliales fournit une alternative utile aux modèles animaux pour des recherches sur le rôle que ces cellules jouent dans la cicatrisation des plaies et les effets du traitement sur le comportement migratoire de cellule. La physiologie des cellules épithéliales est souvent étudiée par des techniques moléculaires à l’aide de cultures non-anastomosé3,4,5,6; Cependant, la rupture de l’intégrité de l’épithélium est habituellement obtenue par fines incisions mécaniques. En culture cellulaire, cela implique qu’un nombre négligeable de cellules peut-être être exposé à l’écart de la plaie, et qu’ils représentent un échantillon trop petit pour les techniques de biologie moléculaire. Cependant, ces lésions peuvent être étudiées à l’échelle microscopique, en profitant des propriétés migrateurs innées de certaines lignées de cellules épithéliales, comme le poumon de vison Epithelial cell (Mv1Lu) ou la cellule spontanément immortalisées humain des kératinocytes (HaCaT) lignes.
Ici, nous avons décrit une méthode de microscopie qui convient obtenir des données quantitatives sur la migration des cellules épithéliales dans le contexte de la cicatrisation3,4,7,8. Par ailleurs, nous présentons des méthodes supplémentaires qui sont utiles pour étudier les changements qualitativement moléculaires et morphologiques qui se produisent sur des monocouches épithéliales pendant la migration. Dans l’ensemble, ces méthodes fournissent un cadre pour étudier la dynamique et les changements morphologiques impliqués avec le comportement de cellules épithéliales et de réponse aux traitements durant la cicatrisation.
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Protocol
1. artificiel plaie gratter dosage pour des études quantitatives
- Préparation de monocouches de cellules
- Travaillant dans des conditions stériles, des graines et la croissance des cellules épithéliales Mv1Lu ou HaCaT dans des flacons de culture utilisant le milieu additionné de sérum. Actualiser le support une fois toutes les 24-48 h. Lorsque les cellules atteignent 80 % confluence, détacher les cellules en utilisant une méthode appropriée, c'est-à-dire, la trypsinisation9.
Remarque : Mv1Lu et HaCaT des lignées de cellules épithéliales sont cultivées à l’aide de milieu de culture EMEM et DEMEM, respectivement, additionné de 2 mM de L-Glutamine et incubé à 37 ° C, avec une atmosphère contrôlée de 5 % de CO2. Chaque lignée cellulaire doit être dosée minutieusement afin de déterminer la concentration cellulaire et le calendrier nécessaires pour atteindre la pleine confluence. Généralement pour les cellules Mv1Lu ou HaCaT, 2-4 x 104 ou 4-6 x 104 cellules/puits, respectivement, sont ensemencées dans un flacon de culture de2 175 cm, et à 80 % confluence donne jusqu'à 35 x 106 Mv1Lu ou cellules HaCaT 1 x 107 . - En soit une plaque de 12 puits ou 24 puits de culture, graines dans chaque puits 2 mL de cellules. Actualiser les moyens une fois chaque 24-48 h. s’assurer que nombre de cellules sont suffisamment élevées pour atteindre le confluent de 100 % après 2 ou 3 jours.
- Lorsque les cellules atteignent la confluence, enlevez le milieu additionné de sérum et laver deux fois avec un milieu sans sérum frais. Garder les cellules dans un milieu sans sérum pendant 24 h avant le grattage.
NOTE : Des cellules Mv1Lu ou HaCaT n’ont pas d’exigences de substrat spécial ; Toutefois, pour les lignées de cellules sensibles à la détacher spontanément dans des conditions de milieu sans sérum, revêtement avant de la surface de plaque de culture à l’aide d’une solution de la poly-L-lysine faudrait10.
- Travaillant dans des conditions stériles, des graines et la croissance des cellules épithéliales Mv1Lu ou HaCaT dans des flacons de culture utilisant le milieu additionné de sérum. Actualiser le support une fois toutes les 24-48 h. Lorsque les cellules atteignent 80 % confluence, détacher les cellules en utilisant une méthode appropriée, c'est-à-dire, la trypsinisation9.
- Monocouche rayer
- Travaillant dans un environnement stérile, gratter la couche de culture faisant glisser fermement l’extrémité étroite d’un 20 µL ou embout de micropipette stérile µL 200, selon la largeur désirée de gratter. Gardez la pointe perpendiculaire à la surface de culture afin d’optimiser l’homogénéité de l’écart.
- Placer les plaques de culture sur une surface sombre de suivre clairement la monocouche de cellules. Si nécessaire, effectuer deux rayures perpendiculaires (en forme de croix) sur chaque puits d’étudier jusqu'à 4 zones de migration.
- Laver les cellules individuelles en retirant doucement doucement en ajoutant un milieu sans sérum frais et milieu de culture. Répéter deux fois, ou jusqu'à ce que plus les seules cellules ont été supprimées.
- Travaillant dans un environnement stérile, gratter la couche de culture faisant glisser fermement l’extrémité étroite d’un 20 µL ou embout de micropipette stérile µL 200, selon la largeur désirée de gratter. Gardez la pointe perpendiculaire à la surface de culture afin d’optimiser l’homogénéité de l’écart.
- Collecte de données et procédure expérimentale
- Prendre jusqu'à 4 images de référence avant traitement centrés sur le fossé scratch de chaque bien en utilisant un microscope à contraste de phase inversée intégrant une caméra CCD. Sélectionnez les domaines d’intérêt en alignant le bord du champ du microscope jusqu'à l’intersection adjacente de rayures.
Remarque : En règle générale, les images sont acquises à l’aide d’un grossissement de 10 x et une taille d’image de 1 280 x 1 024 pixels. Sélection des zones d’intérêt tel que décrit ci-dessus permet pour une localisation facile et validation des mesures jusqu'à 4 / puits. - Une fois que toutes les images sont acquises, désigner des puits de traitement ; échange d’un milieu frais qui contient les traitements sélectionnés au milieu dans les puits.
NOTE : Alternativement, produits chimiques ou des composés qui ne dérangent pas homogénéité de milieu de culture, les traitements peuvent être inoculés directement dans le milieu de culture. - Incuber la plaque rayée (37 ° C avec une atmosphère contrôlée contenant 5 % de CO2) tant que les conditions sous observation portée 90 % gratter des écarts. Éviter la fermeture complète.
Remarque : Des écarts Total annule collection photo post-traitement comme territoires de référence ne sont pas détectables et la référence de temps pour la fermeture de l’espace ne peut être établie. Dans le cas des cellules Mv1Lu ou HaCaT, 16-19 h sont nécessaires pour atteindre le confluent de 90 %. - Arrêter la migration cellulaire en fixant les cellules ; doucement, remplacer le milieu de culture expérimental avec 1 mL de 4 % de formol dans du PBS. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Laver les cellules pour enlever l’excès de formol ; remplacer doucement la solution dans les puits avec du PBS frais. Répétez au moins deux fois.
Remarque : À ce stade, après scellage, plaques peuvent être stockés à 4 ° C indéfiniment. - Prendre des images de référence après le traitement de chaque puits dans les zones de référence originale capturés après grattage. Utiliser le même équipement (microscope à contraste de phase optique inversée intégrant une caméra CCD) et des réglages d’image correspondante (grossissement et résolution numérique ou la densité).
Remarque : Pour les cellules qui migrent individuellement et de combler la lacune indépendamment de la formation d’un front cohérent (par exemple, cellules humaines du cancer du sein MDA-MB-231), les images du temps peuvent permettre le calcul des vitesses de migration des cellules individuelles.
- Prendre jusqu'à 4 images de référence avant traitement centrés sur le fossé scratch de chaque bien en utilisant un microscope à contraste de phase inversée intégrant une caméra CCD. Sélectionnez les domaines d’intérêt en alignant le bord du champ du microscope jusqu'à l’intersection adjacente de rayures.
- Analyse d’image et de la quantification de la migration
- À l’aide de logiciels (par exemple, ImageJ) de traitement d’image, définir les limites de déficit zéro et déterminer la surface d’écart pour jusqu'à quatre mesures en images avant le traitement. Enregistrer les données sous forme de « surface de prétraitement gap » (PRÉGAP). Répétez la même procédure pour les photos après le traitement. Enregistrer les données sous forme de « surface de post-traitement gap » (POSTGAP).
- Ouvrez l’image enregistrée à l’aide de ImageJ. Dans le menu « image », définir le type d’image de 8 bits. Dans le menu de « processus », aller au sous-menu « filtres » et appliquer le filtrage « variance ».
- Dans le menu « image », entrez « ajuster » sous-menu et seuil définie en noir et blanc (B & W), assurez-vous que « Fond sombre » n’est pas sélectionnée. Dans le menu de « processus », aller au sous-menu « binaire » et sélectionnez « combler les trous ».
- Dans le menu « analyser », sélectionnez « définir les mesures » et activer « zone ». Puis dessinez la zone mesurable suivant le contour bord migrateurs, délimitant ainsi l’écart.
- Dans le menu « analyser », sélectionner « analyser les particules » et enregistrer les valeurs « superficie totale » pour la surface de la zone dessinée.
- Introduire des valeurs de superficie totale PRÉGAP et POSTGAP dans une feuille de calcul pour quantifier la migration absolue pour chaque série d’échantillons individuels comme la différence des mesures de surface de gap : PREGAP − POSTGAP [unités arbitraires]. En outre, normaliser les données de migration absolue de chaque condition d’échantillons témoins : (échantillon / contrôle) * 100 [%].
Remarque : Pour les cellules qui migrent individuellement et de combler la lacune indépendamment de la formation d’un front cohérent (par exemple, cellules humaines du cancer du sein MDA-MB-231), la migration absolue peut être calculée en comptant les cellules envahir une centrale soit en bande le contrôle ou les échantillons traités. - Tracer les sorties de quantification (voir Figure 1). Effectuer une analyse statistique si nécessaire.
- À l’aide de logiciels (par exemple, ImageJ) de traitement d’image, définir les limites de déficit zéro et déterminer la surface d’écart pour jusqu'à quatre mesures en images avant le traitement. Enregistrer les données sous forme de « surface de prétraitement gap » (PRÉGAP). Répétez la même procédure pour les photos après le traitement. Enregistrer les données sous forme de « surface de post-traitement gap » (POSTGAP).
2. artificiel Migration avant dosage d’études topographiques
- Préparation de monocouches de cellules
- Travaillant dans des conditions stériles, placer une couche de lamelles rondes stérilisé en plaques de culture vide jusqu'à ce que la surface de la plaque est entièrement recouvert.
NOTE : Jusqu'à 12 et 33 lamelles couvre-objet d’ajustement sur 5 cm et plaques de 10 cm de diamètre, respectivement. - Sur la plaque de culture, les semences délicatement un volume suffisant de cellules à une concentration qui permet de confluence de 100 % après 2 ou 3 jours. Assurez-vous que sans lamelle superpose à lamelles voisine et empêchent les lamelles de flottant en appliquant une pression douce avec une pointe de micropipette stérile. Actualiser le support toutes les 24-48 h.
Remarque : Chaque lignée cellulaire doit être dosée minutieusement afin de déterminer la concentration cellulaire et le calendrier nécessaires pour atteindre la pleine confluence. Généralement pour les cellules Mv1Lu ou HaCaT, 2-3 x 106 ou 2.5-4 x 106 cellules/10 plaque de cm de diamètre, respectivement, sont semés. Pour les plus petites plaques, nombre de cellules doit être réduit. - Lorsque les cellules atteignent la confluence, supprimez le milieu additionné de sérum et remplacez-les par un milieu sans sérum frais. Garder les cellules dans un milieu sans sérum pendant 24 h avant la blessure artificielle est effectuée.
NOTE : Des cellules Mv1Lu ou HaCaT n’ont pas d’exigences de substrat spécial ; Toutefois, pour les lignées de cellules susceptibles de se détacher spontanément dans des conditions de milieu sans sérum, revêtement avant de la surface de la culture à l’aide d’une solution de la poly-L-lysine faudrait10.
- Travaillant dans des conditions stériles, placer une couche de lamelles rondes stérilisé en plaques de culture vide jusqu'à ce que la surface de la plaque est entièrement recouvert.
- Monocouche blessant
- Utilisez des pinces stériles, déplacez doucement une lamelle sur une plaque propre 10 cm contenant un milieu sans sérum frais. Éviter d’endommager la monocouche en organisant la lamelle dans la périphérie avec des pincettes. Éviter une pression excessive qui pourrait entraîner le bris de la lamelle couvre-objet.
- Créer des blessures artificielles en faisant glisser une lame de rasoir stérilisée dans une ligne transversale sur le centre les lamelles. Faites glisser les 3-4 mm arrière-et-vient, afin d’éliminer complètement la bande centrale monocouche. Veillez à ce qu’aucun débris cellulaires ne reste attaché aux bords blessés.
Remarque : sur un diamètre de 12 mm ronde lamelle couvre-objet, l’incision est faite à la mi de la lamelle. Veillez à laisser une traînée de cellules en face de la façade principale assez grande (au moins 2 mm de largeur) pour éviter le basculement de la lamelle dans les étapes suivantes. - Transfert des lamelles blessés avec des cellules vers le haut, une plaque propre 6 puits contenant au moins 2 mL sans sérum milieu frais. Monter jusqu'à 4 lamelles/puits blessés.
- Laver délicatement deux fois à base de frais un milieu sans sérum pour éliminer les cellules individuelles.
- Échantillonnage et procédure expérimentale
- Doucement l’échange d’un milieu frais qui contient les traitements sélectionnés au milieu dans les puits.
NOTE : Alternativement, produits chimiques ou des composés qui ne dérangent pas homogénéité de milieu de culture, les traitements peuvent être inoculés directement dans le milieu de culture. Procéder avec prudence pour éviter tout potentiel détachement cellulaire. - Maintenir la plaque à l’intérieur d’un incubateur de cellules (37 ° C, 5 % de CO2) pour le moment expérimental désiré.
- Arrêter la migration cellulaire en fixant les cellules ; doucement, remplacer le milieu de culture expérimental avec 1 mL de 4 % de formol dans du PBS. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
Remarque : Pour les temps de parcours des expériences, enlever les échantillons de la plaque de culture et fixez-les dans une assiette pour éviter les vapeurs de formol qui affectent les autres, en cours des conditions expérimentales. - Laver les cellules pour enlever l’excès de formol ; remplacer doucement la solution dans les puits avec du PBS frais. Répétez au moins deux fois.
Remarque : À ce stade, après scellage, plaques peuvent être stockés à 4 ° C indéfiniment.
- Doucement l’échange d’un milieu frais qui contient les traitements sélectionnés au milieu dans les puits.
- Immunofluorescence (IF) et l’analyse topologique
- Effectuer une coloration IF et l’imagerie des lamelles individuelles comme décrit ailleurs3,4,11.
- Permeabilize pendant 10 min en immergeant les lamelles dans une solution de Triton X-100 de 0,3 % dans du PBS.
- Bloc pendant 30 min à l’aide de la solution de blocage suivante : 0,3 % d’albumine sérique Bovine ; Sérum de veau fœtal de 10 % ; 5 % de lait écrémé ; 0,3 solution de Triton X-100 % dans du PBS.
Remarque : Bloquant la solution sans lait peut être préparé à l’avance et conservé à-20 ° C. - Incuber pendant 1 heure à température ambiante à l’intérieur d’une chambre humide, avec des anticorps primaire dilué dans une solution de blocage sans lait. Placer les lamelles à l’envers dans le 15 µL de solution d’anticorps pour assurer la distribution correcte.
Remarque : La dilution de travail des anticorps est variable et dépendra de l’anticorps en cours d’utilisation. Par exemple, les anticorps de lapin anti-c-Jun nécessite une dilution au 1/100. - Laver trois fois en plongeant les lamelles dans une solution de Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS.
- Incuber les lamelles couvre-objet en anticorps secondaire dilué dans un tampon bloquant sans lait pendant 30 min.
Remarque : La dilution de travail des anticorps est variable et dépendra de l’anticorps en cours d’utilisation. Par exemple, la chèvre-anti-lapin (488) nécessite une dilution au 1/400 pour une résolution optimale. Les autres réactifs étiquetage telles que la phalloïdine et Hoechst 33258 peuvent être ajoutés au tampon d’incubation à ce stade. - Laver trois fois en plongeant les lamelles dans une solution de Triton X-100 de 0,1 % dans du PBS.
- Monter les lamelles envers une 10 µL montage média chute (p. ex., Vectashield) placé sur une lame de microscope. Laissez les lames dans l’obscurité à température ambiante durant la nuit pendant le durcissement moyen de montage. Par la suite, conserver à 4 ° C dans l’obscurité indéfiniment.
- Obtenir épifluorescence ou images de microscopie confocale des changements structurels qui se produisent à l’extrémité avant migration.
NOTE : Études topologiques peuvent être effectuées par la mosaïque de photos de l’avant migration à la monocouche intérieure. Études semi-quantitatifs sont possibles par analyse de logiciels basés sur les intensités de fluorescence locale.
- Effectuer une coloration IF et l’imagerie des lamelles individuelles comme décrit ailleurs3,4,11.
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Representative Results
Plaie artificiel Scratch test pour des études quantitatives : évaluer le facteur de croissance épidermique (EGF) Promotion de la Migration :
EGF est un inducteur bien connu de la prolifération de cellules épithéliales et de migration et donc un témoin positif de quantification de la promotion de la migration. Les monocouches de cellules Mv1Lu et HaCaT ont été utilisées dans les essais de zéro blessure et photos avant le traitement ont été obtenus. Après inoculation avec 10 ng/mL EGF, les cellules ont été incubées pendant 19 h avant fixation et photos après le traitement. La prolifération a été réduite au minimum en maintenant des conditions de famine de sérum. Jeux de pré- et post-traitement des images ont été analysés par ImageJ et les domaines de la lacune centrale ont été déterminés. L’expérience a été réalisée en double exemplaire, inscrivant quatre mesures pour chaque puits. Quantification de la migration absolue a été calculée comme la différence des surfaces : (PREGAP − POSTGAP). Il y avait un plus grand potentiel migratoire dans les cellules stimulées Mv1Lu (Figure 1 a) par rapport aux cellules HaCaT stimulées (Figure 1 b). Les différences sont expliquées par les sources de la cellule, étant de la muqueuse des cellules épithéliales et la peau de kératinocytes, respectivement.
Test avant Migration artificielle d’études topographiques : Variations de Conformation du cytosquelette et Expression spatiale de C-Jun :
La migration cellulaire implique des changements continus et profondes de la structure du cytosquelette afin de soutenir le déplacement de la cellule. Les monocouches de cellules HaCaT ont été utilisées dans les essais de migration avant dans des conditions de contrôle et de stimulation. Traitement avec EGF potentialise la dynamique du cytosquelette, qui est observée par IF et laser microscopie (LSM ; Figure 2 a). Traitement de l’EGF se traduit également par la robuste kinases Mitogen-Activated protéine (carte) de signalisation et de la surexpression de c-JUN. Mosaïque d’images LSM permettant la configuration de répartition spatiale. Augmentation de l’expression de c-JUN à cellules adjacentes à la migration avant peut être facilement révélée par analyse d’image logiciel ; ici, nous avons implémenté une échelle arc-en-ciel pour la couche verte, qui correspond à c-JUN étiquetage (Figure 2 b).
Figure 1. Promotion de la migration de l’EGF dans les cellules Mv1Lu et HaCaT. Images de microscopie à contraste de phase de la zone blessée de Mv1Lu (A) et des cellules HaCaT (B) ont été prises dans des conditions de contrôle et par rapport aux images des cellules traitées avec 10 ng/mL EGF à 19 h dans des conditions de milieu sans sérum. Micrographies représentant montrent l’étendue de gap scratch et fermeture obtenus après la blessure avec une pointe de micropipette 20 µL. Grossissement = x 10 ; Echelle = 100 µm. Cell migration a été quantifiée et représentée comme variation des différences entre les traitements et les échantillons de contrôle pour chaque dosage (unités arbitraires ; zone UA). L’intrigue est représentatif des huit mesures indépendantes pour chaque condition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Filaments d’actine et les modifications de l’expression de c-JUN promues par EGF dans la migration des cellules HaCaT. (A) une nuit 10 ng/mL EGF traitement favorise des changements profonds dans la conformation des filaments d’actine dans les cellules HaCaT migration. Les cellules à l’avant de la migration des conditions de contrôle dépeindre un cytosquelette de filaments d’actine solidement structuré, tandis que les cellules traitées avec EGF show organisation filaments actine pauvre à l’avant de la migration. Grossissement = x 63 ; Echelle = 20 µm. F-actine est de couleur rouge, et Hoechst est représenté par une couleur bleue. (B) lorsque l’immuno-fluorescence est utilisé en combinaison avec l’imagerie de la LSM pour étudier l’expression de c-JUN post-traitement 10 ng/mL EGF sur la migration des cellules HaCaT, carrelage révèlent les patrons d’expression spatiale. Images de fluorescence c-Jun (vert) ont été convertis en pseudo-couleur pour montrer l’intensité de la coloration de c-Jun. L’échelle de couleurs arc-en-ciel représente intensité de fluorescence pour c-Jun, correspondant à la carte des couleurs sur les panneaux de droite pour l’EGF et le contrôle. Coloration conjointement avec la phalloïdine (rouge) et Hoechst-33258 (bleu) a été utilisée pour montrer la structure cellulaire et noyaux, respectivement. Des images ont été prises par un microscope confocal. Noter les niveaux d’expression croissante de nucléaire c-Jun dans les zones presque l’avant migration. Echelle = 40 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Sur la peau ou les muqueuses perturbation, fonction de barrière est restaurée par les actions de nombreux types de cellules, y compris les fibroblastes ou les cellules épithéliales et immunitaires. Conjointement, ces cellules subissent un complexe processus impliquant l’apoptose, prolifération, différenciation et surtout, des fibroblastes et epithelial cell migration, qui est le mécanisme ultime responsable de la restauration du tissu perturbé et le fermeture de l’écart épithéliale superficielle1,12 ainsi, étudier la migration cellulaire permet de décrire avec précision le comportement physiologique des cellules épithéliales, tout en déterminant également le potentiel immunomodulateur des traitements de la plaie la guérison.
Effectuant des blessures artificielles sur des modèles animaux de recherche différentes permet la réplication de ce processus complexe en proches des conditions physiologiques2et donc l’évaluation de certains états pathologiques ou les effets des produits pharmaceutiques 13de traitements. Toutefois, cette approche entraîne souvent coûteuse et compliquée de la logistique, ainsi que lourdes procédures expérimentales qui peuvent générer des données dans un mode différé13. Au contraire, culture in vitro de cellules fournit un cadre plus commode pour les recherches sur le comportement des cellules impliquées dans la processus de cicatrisation. Alors que la culture de cellules primaires de cellules épithéliales constitue une option viable, il peut être difficile à obtenir et gérer les cellules, qui peuvent compliquer la collecte de données. Par exemple, en plus de la restriction de basse-passage typique des cultures primaires, des kératinocytes humains primaires doivent un fibroblaste alimentation couche pour la croissance in vitro3. Au contraire, les lignées cellulaires épithéliales bien établies, comme Mv1Lu ou HaCaT, constituent un modèle de recherche sans obstacle que comportement des fonctionnalités et caractéristiques telles que celles de la culture primaire des cellules3,4, 14,15. Précisément, pour l’étude de la cicatrisation des plaies, ces deux lignées conservent des traits essentiels dans leur capacité à migrer et arrêter la prolifération due à l’inhibition de contact cellule-cellule à confluence16,17.
Les dosages gratter sont une méthode fiable et polyvalente pour quantifier les capacités migratoires des différents types de cellules, en particulier épithéliales et les cellules cancéreuses. Dans le cas des cellules cancéreuses, la méthode de zéro a été proposée pour l’évaluation du potentiel invasif. Toutefois, cette approche est insuffisante comme indicateur pour pouvoir invasif par rapport à des méthodes plus spécifiques en s’appuyant sur l’expression des métalloprotéases nécessaires pour pénétrer dans la matrice extracellulaire18,19. Au contraire, les gratter les dosages sont fiables permettant d’évaluer la performance migratoire des cellules épithéliales et l’effet des différents traitements sur ce trait. Contrairement aux lignées de cellules cancéreuses, qui présentent souvent mauvaise cohésion et la capacité de croître sur plusieurs couches, Mv1Lu, HaCaT et d’autres cellules épithéliales lignes forme étroitement associé « croissance », qui se dilatent leurs marges dans un processus selon les deux prolifération, mais plus important encore sur migration des cellules. Par conséquent, conditions de densité cellulaire Sub confluentes ou clairsemés sont classiquement utilisées pour étudier les effets des différents traitements sur la physiologie migrateur ; surtout quand les techniques de la biologie moléculaire ultérieures sont appliquées, comme cette cellule environnement minimise l’inhibition de contact tout en maximisant le rapport activement liés à la migration des cellules. Toutefois, pour les cellules épithéliales, des conditions de non-confluent présentent le risque d’exclure l’influence importante de l’inhibition de contact préexistante, par exemple sous la forme de régulation épigénétique. Ainsi, afin d’étudier la cicatrisation des plaies, conditions confluentes confèrent une fidélité accrue du modèle.
Pour obtenir des estimations précises, facteurs concomitants qui affectent la conformation de la couche de cellules épithéliales ou contribuant à l’immigration doivent être adressées. Tandis que la confluence est souhaitée, il est important d’éviter la densité cellulaire excessive ou cultures multicouches, étant donné que ces conditions peuvent affecter négativement. Donc, la prolifération est généralement contrôlée par la famine dans un milieu sans sérum ou par l’addition de produits chimiques comme la mitomycine C, dont irréversiblement arrêter la prolifération cellulaire par ADN réticulation3,20, 21. l’utilisation de l’une ou l’autre dépend du comportement des lignées de cellules spécifiques ; Mitomycine C est particulièrement indiquée lorsque réduit la supplémentation de sérum est nécessaire pour éviter le détachement cellulaire massive. C’est le cas pour les cellules HEK-293 t, où des revêtement de la surface de la culture à l’aide de la poly-L-lysine est une bonne option pour éviter tout traitement Mytomycin C. La libération de facteurs inflammatoires pouvant altérer la migration doit également être abordée. Différentes stratégies ont été utilisées, principalement issu des inserts silicone pour imiter la perturbation de la surface épithéliale obtenue avec le dosage zéro22. Alors que les insertions produisent des lacunes existantes qui permettent la migration cellulaire après avoir enlevé le morceau de silicone, la méthode zéro s’appuie directement sur la suppression de certains de la couche épithéliale de générer l’écart. Préférence sur comment générer l’écart s’appuie sur la capacité des encarts pour protéger le revêtement de surface de culture (p. ex., plaque de culture ou poly-L-lysine) contre les dommages causés au cours de Scratch, tout en minimisant la libération de facteurs des cellules endommagées qui peut compromettre la cellule culture comportement23. Bien que ces caractéristiques peuvent être utiles pour certains paramètres expérimentaux, c'est-à-dire évaluer la capacité des cellules cancéreuses à migrer, dans notre expérience, nous avons trouvé des inconvénients importants pour l’utilisation des insertions en études de cicatrisation. Les cellules Mv1Lu sont capables d’attacher à la surface extérieure insert silicone, qui se traduit par déchirement involontairement de la monocouche cellulaire lors du retrait des pièces silicone. En outre, bien que les cellules HaCaT n’attachent pas de silicone, nous avons trouvé une capacité diminuée pour ces cellules migrent dans insert générées lacunes. À cette mesure, l’inflammation et la migration sont étroitement associés les réponses, et ceux-ci semblent être critiques réunis dans le cadre de la cicatrisation dans les cellules HaCaT. En outre, étant donné qu’appliquant une antenne en plastique pour gratter la surface de culture n’a aucune conséquence apparente sur la capacité des cellules à repeupler l’écart, dans le cas de cellules HaCaT, un tel comportement suggère que les restes de matrice extracellulaire dans le fossé peuvent guider migration en pareillement dans le derme à une blessure physique.Toutefois, la principale source de variation reste la procédure éraflure elle-même, que l’utilisation d’une antenne en plastique pour faire la plaie ne rend pas toujours le même écart de taille. Nous avons observé des variations pouvant atteindre 20 % chez les différents échantillons, due à l’incohérence de la pression et la position de la pointe au moment du scratch. Ces variations peuvent être traitées en blessant la monocouche avec un objet plus rigide ; Cependant, toute rayure sur la surface en plastique mettrait en péril la libre circulation des cellules. Donc, les variations dans le zéro initial doivent être prises en compte pour calculer des migrations ; en général, en augmentant le nombre de mesure selon la condition.
En plus de la quantification, appliquer des procédures blessantes ainsi que les techniques classiques de IF peut évaluer qualitativement les mécanismes moléculaires de la migration cellulaire. La capacité des cellules épithéliales à croître sur le couvre-objet est connue ; dans le passé, les variations de la rayure assays cellules impliquées migration sur exposés à des conditions différentes, suivies de la fixation et coloration pour comparaison dans la plaie-zéro montage expérimental24lamelles couvre-objet. Ici, nous avons constaté que la création de grandes lacunes en monocouches qui poussent sur les lamelles permet pour prolonger le temps expérimental cours3,4,7. En outre, dans ces expériences, si augmente les capacités de détection de la procédure potentiellement étudier les mécanismes cellulaires et subcellulaires précis n’intervient, et c’est seulement limité par la disponibilité des anticorps destinés à cette technique et le cellules d’intérêt. Échantillons sur les lamelles couvre-objet utilisé car si sont montées sur des lames de microscope, qui permettent une conservation prolongée. Cela contribue à l’application de configurations expérimentales qui nécessitent des études longues périodes, comme les approches « carrelage » présenté ici et d’ailleurs3,4,7. Alors que la stratégie de la « mosaïque » intègre les patrons spatiaux avec des données temporelles pour reconstituer les mécanismes impliqués dans la migration, la mise en œuvre d’outils d’analyse de logiciels peut fournir semiquantitative évaluations fondées sur la fluorescence locale intensité et enrichir la qualité de l’information obtenue. Dans notre expérience, le carrelage offre également la possibilité d’étudier des données de cellule-position pour l’expression des protéines dans ce type de test. Cette information de position s’est avérée être crucial de comprendre et de mieux traduire les effets de différents agents sur la migration cellulaire, en particulier dans les configurations où la position des cellules épithéliales est très importante de déterminer son comportement migrateur3 ,4,14,15.
Les deux procédures décrites démontrent la grande commodité de mise en œuvre simple, mais aussi produire des données de qualité. Ainsi, ces approches basées sur des études de microscopie, offrent un cadre unique et puissant pour étudier la dynamique et les changements morphologiques impliqués dans le comportement des cellules épithéliales et réponse aux traitements pendant la cicatrisation.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous voulons rendre grâce pour les membres plus âgés du laboratoire qui aident à améliorer et affiner ces techniques à son état actuel : Dr Celia Martinez-Mora ; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Cañada et Dr Antonia Alcaraz-García. Nous sommes redevables à l’hôpital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de soutenir fortement le développement de ces techniques. Aussi, l’Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I + D + I et Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant no : PI13/00794) ; www.ISCIII.es. Fondos FEDER « Una manera de hacer Europa ». Nous remercions également Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca et FFIS d’assistance et de soutien administratif. Enfin, nous voulons donner Merci Dr Isabel Martínez-Argudo et la Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo pour leur aimable soutien à céder volontairement le Biomédecine et laboratoire de biotechnologie de rendre possible la partie filmée du présent document.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
