Summary
이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.
Abstract
셀 이동은 상처 치유에 대 한 의무적 측면 이다. 인공 생성 상처 연구 동물 모델에 비용과 복잡 한 실험 절차에 자주 결과 정밀도에서 잠재적으로 부족 한 동안. 상피 세포의 생체 외에서 문화는 상처 치유와이 세포에 치료의 영향에 셀 철새 행동 연구를 위한 적합 한 플랫폼을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 조건;에서 공부 그러나,이 방법은 자연 상처 치유 조건 닮은 하지 않을 수 있습니다. 기계적 방법으로 상피 무결성을 방해 현실적인 모델을 생성 하지만 분자 기술 응용 프로그램을 방해 수 있습니다. 따라서, 현미경 기반 기술을 상피 세포 이동 공부에 대 한 최적의 생체 외에서. 여기 우리는 두 가지 구체적인 방법, 인공 상처 스크래치 분석 결과 및 인공 마이그레이션 전면 분석 결과, 상피 세포의 이동 성능에 각각, 양적 및 질적 데이터를 얻을 수 있는 선발.
Introduction
셀 이동은 상피 갭의 최종 폐쇄와 방해 표면1의 복원에 대 한 책임은 상처 치유, 필요 합니다. 생리 적인 조건2근처에이 복잡 한 과정의 복제 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 종종 비용과 복잡 한 실험 절차, 잠재적으로 상처 치유 과정의 복잡 한 특성으로 인해 개별 프로세스의 연구에 대 한 정밀 부족 발생 합니다.
상피 세포의 생체 외에서 문화는 역할이이 세포에 상처 치유와 셀 철새 행동 치료의 효과 연구를 위한 동물 모델에 대 한 유용한 대안을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 문화3,4,,56;를 사용 하 여 분자 기술로 공부 그러나, 상피 무결성 중단 일반적으로 정밀한 기계 절 개 함으로써 이루어집니다. 세포 배양에서이 셀의 무시할 수 상처 격차에 노출 될 수 있습니다 그리고 그들은 분자 생물학 기술에 대 한 너무 작은 샘플을 나타내는 의미 합니다. 그러나, 이러한 병 변 밍 크 폐 상피 세포 (Mv1Lu) 또는 자발적으로 불멸 하 게 인간의 keratinocyte (HaCaT) 셀 등 일부 상피 세포 라인의 타고 난 철새 속성의 활용, 미세한 규모에서 공부 될 수 있다 라인입니다.
여기 우리는 상처 치유3,4,,78의 맥락에서 상피 세포의 마이그레이션에 양적 데이터를 얻기 위해 적당 한 현미경 검사 법에 대 한 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 마이그레이션 중 상피 monolayers에 발생 질적으로 분자와 형태학 상 변화를 공부 도움이 되는 추가 방법을 제시. 전반적으로, 이러한 메서드는 상처 치유 하는 동안 역학과 상피 세포 행동 및 치료에 대 한 응답으로 관련 된 형태학 상 변화를 공부 하는 프레임 워크를 제공 합니다.
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Protocol
1. 인공 상처 스크래치 분석 결과 양적 연구
- 세포 단층 준비
- 무 균 조건 하에서 작업, 씨 그리고 혈 청-보충 매체를 사용 하 여 문화 플라스 크에 Mv1Lu 또는 HaCaT 상피 세포 성장. 한 번 모든 24-48 h 매체를 새로 고침 합니다. 셀 도달 80% 합류, 후는 적절 한 방법, 즉, trypsinization9를 사용 하 여 셀을 분리 합니다.
참고: Mv1Lu 및 EMEM 및 DEMEM 문화 매체를 사용 하 여 상피 세포를 교양 HaCaT 각각 2 m L-글루타민, 보완 및 5% CO2의 제어 분위기 37 ° C에서 알을 품. 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-4 x 104 또는 4-6 x 104 셀/글쎄, 각각은 시드 175 cm2 문화 플라스 크에 고 합류 하 80%에서 최대 35 x 106 Mv1Lu 또는 1 x 107 HaCaT 세포 생성 합니다. - 12 잘 또는 24-잘 문화 접시에 각 잘 셀의 2 mL에에서 씨. 일단 모든 24-48 h. 확인 셀 숫자는 2 ~ 3 일 후 100% 합류에 도달 충분히 높은 매체를 새로 고침 합니다.
- 셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체와 두 번 세척. 긁 적 전에 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀을 계속.
참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리에 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 접시 표면의 고려 되어야 한다10.
- 무 균 조건 하에서 작업, 씨 그리고 혈 청-보충 매체를 사용 하 여 문화 플라스 크에 Mv1Lu 또는 HaCaT 상피 세포 성장. 한 번 모든 24-48 h 매체를 새로 고침 합니다. 셀 도달 80% 합류, 후는 적절 한 방법, 즉, trypsinization9를 사용 하 여 셀을 분리 합니다.
- 단층 긁 적
- 메 마른 환경에서 working, 단단히 20 µ L 또는 원하는 스크래치 폭에 따라 200 µ L 살 균 micropipette 팁의 좁은 끝을 드래그 하 여 문화 단층 스크래치. 팁 유지 간격 동질성을 극대화 하기 위해 문화 표면에 수직.
- 명확 하 게 셀 단층을 모니터링 하는 어두운 표면 문화 접시를 놓습니다. 필요한 경우 각 잘 4 마이그레이션 분야까지 공부에 두 수직 흠집 (십자가 모양)을 수행 합니다.
- 부드럽게 문화 매체와 부드럽게 추가 신선한 혈 청 무료 매체를 제거 하 여 분리 된 세포를 씻어. 두 번, 반복 또는 가장 첨부 되지 않은 세포 제거 되었습니다 때까지.
- 메 마른 환경에서 working, 단단히 20 µ L 또는 원하는 스크래치 폭에 따라 200 µ L 살 균 micropipette 팁의 좁은 끝을 드래그 하 여 문화 단층 스크래치. 팁 유지 간격 동질성을 극대화 하기 위해 문화 표면에 수직.
- 실험 절차 및 데이터 수집
- 잘 사용 하 여 각 CCD 카메라를 통합 하는 반전된 단계 대조 현미경에서 스크래치 간격을 중심으로 최대 4 전처리 참조 이미지를 가져가 라. 스크래치의 인접 한 교차점으로 현미경 필드의 가장자리를 정렬 하 여 관심 영역을 선택 합니다.
참고: 일반적으로, 이미지는 인수 10 배 확대와 1280 x 1024 픽셀 이미지 크기를 사용 하 여. 쉽게 지역화 및 잘 당 최대 4 측정의 유효성 검사에 대 한 도움이 됩니다 위에서 설명한 대로 관심 영역을 선택 합니다. - 일단 모든 이미지는 인수 지정 치료 우물; 선택 된 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다.
참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접. - 관측 범위 90% 스크래치 간격 폐쇄 조건까지 긁힌된 플레이트 (37 ° C 5% CO2를 포함 하는 제어 분위기)를 품 어. 완전 폐쇄를 하지 마십시오.
참고: 총 간격 폐쇄 무효화 치료 후 사진 모음 참조 영역 감지 되지 않습니다 하 고 갭 닫는 시간 참조를 설정할 수 없습니다. Mv1Lu 또는 HaCaT 세포의 경우 16-19 h 90% 합류에 도달 해야 합니다. - 셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어
- 초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다.
참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한. - 긁 적 후 캡처한 원본 참조 영역에서 각의 후 처리 참조 이미지를 가져가 라. 사용 하 여 동일한 장비 (거꾸로 광학 단계 대조 현미경 통합 CCD 카메라)와 일치 그림 설정 (확대 및 디지털 해상도/밀도).
참고: 개별적으로 마이그레이션 하 고 일관 된 정면 (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울 셀에 대 한 시간 코스 이미지는 개별 셀 마이그레이션 속도의 계산을 수 있습니다.
- 잘 사용 하 여 각 CCD 카메라를 통합 하는 반전된 단계 대조 현미경에서 스크래치 간격을 중심으로 최대 4 전처리 참조 이미지를 가져가 라. 스크래치의 인접 한 교차점으로 현미경 필드의 가장자리를 정렬 하 여 관심 영역을 선택 합니다.
- 이미지 분석 및 마이그레이션의 정량화
- 이미지 프로세싱 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)를 사용 하 여 스크래치 간격 한계를 정의 하 고 치료 전 사진에 최대 4 개의 측정 간격 표면 결정. "표면 전처리 격차"로 데이터 기록 (PREGAP). 치료 후 사진에 대 한 동일한 절차를 반복 합니다. "후 처리 간격 표면"으로 데이터를 기록 (POSTGAP).
- ImageJ를 사용 하 여 기록 된 이미지를 엽니다. "이미지" 메뉴에서 이미지 형식 8 비트 설정. "프로세스" 메뉴에서 "필터" 메뉴에가 고 "분산" 필터링 적용.
- "이미지" 메뉴에서 "조정" 하위 메뉴 및 설정된 임계값 흑인과 백인을 입력 (B & W), "어두운 배경"을 선택 하지 않은 있는지 확인 하십시오. "프로세스" 메뉴에서 "바이너리" 하위 메뉴에가 고 "구멍 채우기"를 선택 합니다.
- "분석" 메뉴에서 "측정 설정"을 선택 하 고 "지역"를 활성화 합니다. 다음 따라서 격차를 구분 마이그레이션 가장자리 윤곽을 따라 측정 영역을 그립니다.
- "분석" 메뉴에서 "입자 분석"을 선택 하 고 그려진된 영역 표면에 대 한 "전체 영역" 값을 기록 합니다.
- PREGAP 및 POSTGAP 총 면적 값 간격 표면 측정의 차이 개별 샘플의 각 집합에 대 한 절대 마이그레이션 척도를 스프레드시트에 소개: PREGAP − POSTGAP [임의 단위]. 또한, 각 조건 제어 샘플의 절대 마이그레이션 데이터를 정상화: (샘플 / 제어) * 100 [%].
참고: 셀을 개별적으로 마이그레이션할 일관 된 정면, (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울, 절대 마이그레이션 산출 될 수 있다 계산 셀 중앙에 침입 하 여 스트립에 컨트롤 또는 치료 샘플입니다. - ( 그림 1참조) 부 량 출력을 플롯 합니다. 필요한 경우 통계 분석을 수행 합니다.
- 이미지 프로세싱 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)를 사용 하 여 스크래치 간격 한계를 정의 하 고 치료 전 사진에 최대 4 개의 측정 간격 표면 결정. "표면 전처리 격차"로 데이터 기록 (PREGAP). 치료 후 사진에 대 한 동일한 절차를 반복 합니다. "후 처리 간격 표면"으로 데이터를 기록 (POSTGAP).
2. 인공 마이그레이션 지형 연구에 대 한 전면 분석 결과
- 세포 단층 준비
- 무 균 조건에서 작업 플레이트의 표면이 완전히 덮여 때까지 빈 문화 접시에 소독된 라운드 coverslips의 1 개의 층을 놓습니다.
참고: 12와 33 coverslips까지에 맞게 5 cm, 10 cm 직경 접시, 각각. - 문화 접시에 2 ~ 3 일 후 100% 합류를 허용 하는 농도에서 세포의 적절 한 볼륨을 씨앗 부드럽게. 아니 coverslip 겹치는 인접 coverslips 다는 것을 확인 하 고 살 균 micropipette 팁 부드러운 압력을 적용 하 여 부동에서 coverslips를 방지 합니다. 모든 24-48 h 매체를 새로 고칩니다.
참고: 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 될 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-3 x 106 또는 2.5-4 x 106 세포/10 cm 직경 접시, 각각은 시드. 작은 접시에 대 한 셀 숫자 축소 되어야 합니다. - 셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체를 바꿉니다. 인위적인 상처를 수행 하기 전에 셀 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 계속.
참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리의 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 표면의 고려 되어야 한다10.
- 무 균 조건에서 작업 플레이트의 표면이 완전히 덮여 때까지 빈 문화 접시에 소독된 라운드 coverslips의 1 개의 층을 놓습니다.
- 단층 부상
- 깨끗 한 10 cm 접시 신선한 혈 청 무료 매체를 포함 하는 coverslip 이동 조심 스럽게 멸 균 핀셋을 사용 하 여. 핀셋으로 주변에는 coverslip를 눌러는 단층을 손상 하지 마십시오. Coverslip 파손에서 발생할 수 있는 과도 한 압력을 피하십시오.
- coverslips의 중심에 가로 라인에 소독된 면도날을 끌어 인공 상처를 만듭니다. 뒤로-및-앞뒤, 완전히 중앙 단층 스트립을 제거 하려면 3-4 m m를 끕니다. 아무 셀 파편 계속 부상된 가장자리에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
참고: 12 m m 직경에 coverslip, 라운드 절 개에서 이루어집니다는 중반에 coverslip의. 셀의 충분히 큰 메인 전면 반대 (적어도 2 m m 폭)의 다음 단계에 coverslip 기울이기 피하기 위해 행진을 두고 있는지 확인 합니다. - 깨끗 한 6 잘 플레이트 포함 최소 2 mL 신선한 혈 청 자유로운 매체를, 직면 하는 세포와 부상된 coverslips를 전송 합니다. 최대 4 부 coverslips/잘 맞습니다.
- 부드럽게 씻어 두 번 사용 하 여 신선한 혈 청 자유로운 매체 분리 된 세포를 제거 하.
- 실험 절차 및 샘플링
- 부드럽게 선택한 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다.
참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접. 어떤 잠재적인 세포 분리를 피하기 위해 주의 함께 진행 합니다. - 원하는 실험 타이밍에 대 한 (37 ° C, 5% CO2) 셀 인큐베이터 안에 접시를 유지.
- 셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어
참고: 시간 과정 실험, 문화 접시에서 샘플을 제거 하 고 다른, 지속적인 실험 조건에 영향을 주는 포 르 말린 가스를 피하기 위해 별도 접시에 그들을 수정. - 초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다.
참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한.
- 부드럽게 선택한 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다.
- 면역 형광 검사 (IF) 및 토폴로지 분석
- 만약 얼룩이 수행 하 고 영상으로 개별 coverslips에 설명 다른3,,411.
- PBS에서 0.3% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips를 immersing 하 여 10 분 동안 permeabilize.
- 다음 차단 솔루션을 사용 하 여 30 분 동안 블록: 0.3% 소 혈 청 알 부 민; 10% 태아 둔감 한 혈 청; 5% 탈지 우유; 0.3 PBS에서 % 트라이 톤 X-100 솔루션.
참고: 우유 없이 솔루션 차단 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 저장 - 1 차적인 항 체 우유 무료 차단 솔루션에 희석 된 촉촉한 챔버 내부 실내 온도에서 1 h에 대 한 품 어. 거꾸로 15 µ L 항 체 솔루션을 적절 한 배포에는 coverslips를 놓습니다.
참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 토끼 6 월 안티-c 항 체는 1/100 희석이 필요합니다. - PBS에는 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.
- 30 분 동안 우유 무료 차단 버퍼에 희석 이차 항 체에 coverslips를 품 어.
참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 염소-안티-토끼 (488) 최적 해상도 대 한 1/400 희석을 요구 한다. Phalloidin, Hoechst 33258 등 다른 표기 시 약이이 단계에서 인큐베이션 버퍼에 추가할 수 있습니다. - PBS에서 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.
- Coverslips는 10 µ L 장착 미디어 드롭 (예, Vectashield)는 현미경 슬라이드에 배치에 거꾸로 탑재 합니다. 장착 매체 강화 위해 하룻밤 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 둡니다. 나중에, 어둠 속에서 4 ° C에서 무기한 저장 합니다.
- Epifluorescence 또는 마이그레이션 앞쪽 가장자리에서 발생 하는 구조 변경의 confocal 현미경 이미지를 얻을.
참고: 토폴로지 연구 기와 내부 단층 마이그레이션 앞에서 사진을 하 여 수행할 수 있습니다. 반 양적 연구는 로컬 형광 강렬에 소프트웨어를 기반으로 분석 하 여 가능 합니다.
- 만약 얼룩이 수행 하 고 영상으로 개별 coverslips에 설명 다른3,,411.
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Representative Results
양적 연구에 대 한 인공 상처 스크래치 분석 결과: 마이그레이션의 표 피 성장 인자 (EGF) 승진 평가:
EGF는 상피 세포 확산 및 마이그레이션, 그리고 이렇게 측정 마이그레이션 프로 모션에 대 한 긍정적인 통제의 유명한 유도. Mv1Lu 및 HaCaT 세포 monolayers 상처 스크래치 분석 실험에서 사용 되었다 고 치료 전 사진을 입수 했다. 10 ng/mL EGF와 함께 접종 후 셀 고정 및 치료 후 사진 전에 19 h incubated 했다. 확산은 혈 청 기아 상태를 유지 하 여 최소한으로 유지 되었다. 그림의 전처리 및 후 처리 집합 ImageJ를 사용 하 여 분석 했다 그리고 중앙 간격 영역 결정 했다. 실험은 중복 등록 하는 각 음에 대 한 4 개의 측정에서에서 실행 되었다. 절대적인 이동의 정량화 표면의 차이로 계산 했다: (PREGAP − POSTGAP). 거기 자극된 HaCaT 세포 (그림 1B)에 비해 자극된 Mv1Lu 셀 (그림 1A)에서 큰 철새 잠재력을 했다. 차이점 그리고 각각 keratinocytes, 피부 점 막 상피 세포를 되 고 셀 소스에 의해 설명 했다.
지형 연구 인공 마이그레이션 전면 분석 결과: Cytoskeletal 구조와 C-6 월의 공간 표현:
셀 마이그레이션 셀 변위를 유지 하기 위해서는 골격 구조에 대 한 지속적이 고 깊은 변화를 포함 한다. HaCaT 세포 monolayers 제어 및 자극 조건 마이그레이션 전면 분석 실험에서 사용 되었다. EGF와 치료 potentiates cytoskeletal 역학, 경우에 의해 관찰 되 고 레이저 스캔 현미경 (LSM; 그림 2A)입니다. EGF 치료는 또한 강력한 Mitogen-Activated 단백질 (지도) kinases 신호 및 c 6 월 overexpression에 결과. LSM 이미지 기와 공간 패턴의 구성에 대 한 수 있습니다. 마이그레이션 앞에 인접 한 셀에 c-6 월의 증가 식 수 쉽게 밝혀에 의해 소프트웨어 이미지 분석; 여기, 우리는 c-6 월 라벨 (그림 2B)에 해당 무지개 규모 녹색 채널에 대 한 구현.
그림 1입니다. EGF Mv1Lu 및 HaCaT 세포에 의해 이동의 승진. Mv1Lu의 부상 영역의 단계 대조 현미경 이미지 (A) 및 (B) HaCaT 세포 제어 조건에서 촬영 되었고 10 ng/mL EGF 19 h에 대 한 혈 청 자유로운 상태에서 치료 하는 셀의 이미지에 비해. 대표 현미경 스크래치 격차와 20 µ L micropipette 팁 부상 후 얻은 폐쇄의 정도 표시 합니다. 확대 = 10 x; 눈금 막대 = 100 µ m. 셀 마이그레이션 정량 되었고 치료와 각 분석 결과 (임의 단위;에 대 한 제어 샘플 지역 차이의 변형으로 표현 AU)입니다. 줄거리는 각 조건에 대 한 8 개의 독립적인 측정의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 말라 필 라 멘 트와 EGF 마이그레이션 HaCaT 세포에 의해 추진 하는 c-6 월 식 변경. (A) 하룻밤 10 ng/mL EGF 처리 마이그레이션 HaCaT 세포에 걸 필 라 멘 트의 구조에 심오한 변화를 촉진. 셀 마이그레이션 전면의 제어 조건에 밀접 하 게 구조화 된 걸 필 라 멘 트의 골격을 묘사, EGF 셀 치료 하는 동안 가난한 걸 필 라 멘 트 조직 마이그레이션 앞에. 확대 = 63 x; 눈금 막대 = 20 µ m. F-말라 색된 빨강은 및 Hoechst는 파란색으로 표시 됩니다. (B) 면역 형광은 함께 사용 LSM 이미징 마이그레이션 HaCaT 세포에 10 ng/mL EGF 치료 후 c-6 월 식 공부 때 기와 작곡 공개 공간 식 패턴. C 6 월 형광 (녹색)의 이미지는 c 6 월 착 색의 강도 표시 하려면 의사 색상으로 변환 했다. 무지개 색조는 c-6 월에 해당 하는 오른쪽 패널에 colormaps EGF와 컨트롤에 대 한 형광 강도를 나타냅니다. Hoechst 33258 (블루) phalloidin (레드)와 공동 얼룩이 보여 셀 구조와 핵, 각각 사용 되었다. 이미지는 confocal 현미경에 의해 촬영 됐다. 마이그레이션 전면 근접 지역에서 핵 c-6 월의 증가 식 수준을 note합니다 눈금 막대 = 40 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
피부 또는 점 막 파열, 수많은 종류의 세포, 섬유 아 세포 또는 상피와 면역 세포를 포함 하 여 행동에 의해 장벽 기능 복원 됩니다. 이 세포는 복잡 한을 받아야 하는 conjointly, apoptosis, 확산, 차별화, 그리고 중요 한 것은, 섬유 관련 된 프로세스 및 상피 세포 궁극적인 메커니즘 방해 조직의 복원에 대 한 책임은 마이그레이션 및 표면 상피 간격1,12 따라서, 세포 이동 공부 폐쇄 정확 하 게 또한 상처에 대 한 치료의 modulatory 잠재력을 결정 하면서 상피 세포의 생리 적인 동작을 설명 하는 데 도움이 치유.
생리 적인 조건2, 근처에이 복잡 한 과정의 복제 및 따라서 일부 병 적인 조건 평가 또는 제약의 효과 대 한 수 있습니다 다른 연구 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 처리13. 그러나,이 방법은 비용과 복잡 한 물류 지연된 패션13데이터를 생성할 수 있습니다 부담 실험 절차에 종종 결과. 그와 반대로, 체 외에서 세포 배양 상처 치유 과정에에서 관련 된 세포의 행동을 연구 하기 위한 더 편리한 프레임 워크를 제공 합니다. 실행 가능한 옵션을 구성 하는 기본 세포 배양 상피 세포의, 하는 동안 데이터 수집을 복잡 하 게 수 있습니다 셀을 처리 하 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 기본 문화권의 전형적인 낮은 통행 제한, 뿐만 아니라 기본 인간의 keratinocytes 생체 외에성장3레이어를 먹이 섬유가 필요 합니다. 그와 반대로, Mv1Lu 또는 HaCaT, 처럼 잘 설립 된 상피 세포 문화 라인 그 기능 동작 및 특성 주 문화 셀3,4,같은 장애물 없는 연구 모델 구성 , 1415. 정확 하 게, 상처 치유의 연구를 위해이 두 셀 라인은 마이그레이션 및 합류16,17시 셀 접촉 저해로 인해 확산을 중지 하는 기능에 중요 한 특성을 유지 합니다.
스크래치 분석 실험은 다른 세포 유형, 특히 상피 및 암 세포의 이동성 기능을 측정 하는 안정적이 고 다양 한 방법. 암 세포의 경우 스크래치 방법은 침략 적인 잠재력의 평가 대 한 제안 되었습니다. 그러나,이 방법은 기질18,19침투에 필요한 metalloproteases의 표현에 좀 더 구체적인 방법에 비교 될 때 침입에 대 한 지표로 서 짧은 망 한다. 그와 반대로, 스크래치 분석 실험은 상피 세포의 철새 성능과이 특성에 다른 처리의 효과 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는. 암 세포 선, 달리 표시 하는 자주 가난한 응집과 여러 레이어, Mv1Lu, HaCaT, 및 다른 상피 세포 라인 밀접 하 게 관련 된 폼 "성장 섬", 둘 다에 따라 프로세스에서 그들의 여백을 확장에 성장 하는 능력 확산, 하지만 더 중요 한 것은 셀 마이그레이션입니다. 따라서, 스파스 또는 하위 confluent 셀 밀도 조건은 통상 철새 생리학;에 다른 처리의 효과 연구에 대 한 사용 됩니다. 이후 분자 생물학 기술을 적용 하는 경우에 특히이 셀으로 환경 최소화 접촉 억제 세포 적극적으로 마이그레이션 비율을 극대화 하는 동안 합니다. 그러나, 상피 세포에 대 한 비 합칠 조건 제외 후 성적인 규칙의 형태로 예를 들어 중요 한 기존의 접촉 저해 영향의 위험을 포즈. 따라서, 공부 하 고 상처 치유, confluent 조건 부여 모델의 향상 된 품질.
정확한 견적을 얻으려면, 부수적인 요인 상피 세포 층의 구조에 영향을 미치는 또는 마이그레이션에 기여를 해결 해야 합니다. 합류, 원하는 하는 동안 과도 한 세포 밀도 또는 다중된 문화, 이러한 조건을 수 있습니다 부정적인 영향을 피하기 위해 중요 하다. 따라서, 확산은 일반적으로 제어 기근 혈 청 자유로운 미디어에 의해 나 레스터 DNA 가교3,20, 에 의해 세포 증식을 체포 미토마이신 C, 같은 화학 물질의 추가 의해 21. 특정 셀 라인;의 동작에 의존 하는 하나 또는 다른을 사용 하 여 미토마이신 C는 특히 나타난다 감소 될 때 혈 청 보충 대규모 세포 분리를 방지 하는 데 필요한. 그는 HEK 293T 세포에 대 한 경우, 미리 코팅 폴 리-L-리 신을 사용 하 여 문화 표면 Mytomycin C 치료를 피하기 위해 좋은 옵션입니다. 또한 마이그레이션을 변경할 수 있는 염증 성 요인의 릴리스 해결 될 필요가 있다. 다른 전략, 주로 상피 표면 스크래치 분석 결과22달성의 장애를 모방 하기 위해 실리콘 삽입에 따라 사용 되었습니다. 삽입 실리콘 조각을 제거한 후 셀 마이그레이션 허용 하는 기존의 격차를 생성 하는 동안 스크래치 방법 의존 직접 격차를 생성 하는 상피 단층의 일부를 제거 합니다. 격차를 생성 하는 방법에 기본 설정 수 있습니다 손상 된 세포에서 요인의 방출을 최소화 하면서 긁 적 동안 손상에서 (즉, 문화 접시 또는 폴 리-L-리 신) 문화 표면 코팅을 보호 하기 위해 삽입의 능력에 의존 셀 문화 행동23를 손상 한다. 이러한 특성은 일부 실험 설정 즉, 마이그레이션, 암 세포의 능력을 평가에 유용할 수 있습니다 있지만 우리의 경험에서 우리가 발견 상당한 단점 삽입을 사용 하 여 상처 치유 연구에에서 대 한. Mv1Lu 셀을 실리콘 조각의 제거에 따라 셀 단층의 실수로 찢 어 실리콘 삽입 외부 표면에 연결 할 수 있다. 또한, HaCaT 세포 실리콘에 첨부 하지 않습니다, 하지만 우리 삽입 생성 간격으로 마이그레이션하려면 이러한 셀 저하 능력을 발견. 그 정도, 염증 및 마이그레이션 밀접 하 게 관련 된 응답 이며 이러한 상처 치유 HaCaT 세포의 맥락에서 함께 중요 한 것 같습니다. 또한, HaCaT 세포의 격차를 다시 하는 세포의 능력에 명백한 결과 문화 표면 긁힘에 대 한 플라스틱 팁 적용 이후 그런 행동 제안 격차에서 기질 나머지 마이그레이션 가이드 수 있습니다. 자연적인 상처에서 진 피와 비슷한 패션.그러나, 변이의 주요 소스는 상처를 만들기 위해 플라스틱 팁 사용 항상 같은 크기 차이 렌더링 하지 않습니다 서 긁 절차 자체, 남아 있다. 우리는 압력의 불일치 및 처음의 때에 팁의 위치 다른 샘플 중 최대 20% 변화를 관찰. 이 변이 더 엄격한 개체; 단층 부상 하 여 해결할 수 있습니다. 그러나, 플라스틱 표면에 어떤 스크래치 셀의 자유 운동을 위태롭게 것 이다. 그래서, 초기 스크래치 변화에 고려 되어야 한다 계정 마이그레이션; 계산 하 일반적으로, 여 조건 당 측정의 수 증가.
정량화, 이외에 고전적인 경우 기술 함께 부상 절차 적용 세포 이동의 분자 프로세스 질적으로 평가할 수 있습니다. 상피 세포의 기능을 coverslips에 성장 하는 것은 잘 알고; 과거에는, 스크래치의 변형을 포함 된 셀 뒤에 고정 하 고 상처-처음 실험 설치24시간 비교를 위해 얼룩이 다른 조건에 노출 하는 coverslips에 마이그레이션 분석 실험. 여기, 우리는 monolayers coverslips에 있는 넓은 간격을 만드는 실험 시간 코스3,,47확장 하기 위한 수 있습니다 발견. 이러한 실험, 증가 잠재적으로 정확한 세포 및 subcellular 메커니즘을 연구 하는 절차의 감지 기능 포함, 그리고 그것은이 기술에 대 한 적합 한 항 체의 가용성에 의해 제한 됩니다 경우에 또한, 그리고 관심의 세포입니다. 경우 사용 하는 coverslips에 샘플 확장된 보존에 대 한 허용 하는 현미경 슬라이드에 거치 된다. 이 에이즈 "기와" 접근 전시 여기와 다른3,,47처럼 긴 연구 기간을 필요로 하는 실험 설정의 응용 프로그램. "기와" 전략 통합 재구성 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 임시 데이터 공간 패턴, 하는 동안 소프트웨어 분석 도구 구현 기반 로컬 형광 반 정량적 평가 제공할 수 있습니다. 강도, 더 얻은 정보의 품질을 풍부 하 게. 우리의 경험에서는, 기와 또한 단백질 분석 실험의이 종류에서의 식에 대 한 셀 위치 정보를 공부 하 고의 가능성을 제공 합니다. 이 위치 정보를 이해 하 고 더 나은 셀 마이그레이션, 특히 상피 세포의 위치는3의 철새 행동을 결정 하는 매우 중요 한 설정에 다른 대리인의 효과 번역 중요 한 표시 되었습니다. ,4,,1415.
설명 하는 두 절차 단순한 구현으로 품질 데이터를 생성 하 여 훌륭한 편의 보여 줍니다. 따라서, 역학과 상피 세포 행동에 관련 된 형태학 적 변화를 공부 하는 독특하고 강력한 프레임 워크를 제공 하는 현미경 연구를 기반으로 하는이 방법 및 응답 치료 중에 상처 치유.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심은 선언 합니다.
Acknowledgments
개선 하 고 이러한 기술을 실제의 상태를 수정 하는 데 도움이 실험실의 이전 회원 감사 하겠습니다: 모라-닥터 셀 리아 마 르 티 네즈; 박사 안 나 Mrowiec, 닥터 카 탈리 나 루이즈-카나다와 닥터 안토니 아 Alcaraz-가르시아. 우리는 강력 하 게 이러한 기술의 개발을 지원 하기 위한 병원 Clínico 대학교 일 드 라 Arrixaca에 게 빚을입니다. 또한 기관 드 건배 카를로스 III, Fondo 드 Investigaciones Sanitarias. Estatal 계획 나 + D + 어 Instituto de 건배 카를로스 III-Subdirección 일반 드 Evaluación y Fomento 드 라 Investigación (허가 번호: PI13/00794); www.isciii.es. 자금 페더 "Una 마네 드 대처해 유로 파". 우리 또한 감사 IMIB Arrixaca, 대학 드 무르시아, FFIS 행정 지원 및 지원. 마지막으로, 우리 특별 한 닥터 이사벨 마르티네스-Argudo 고은 Facultad 드 Ciencias Ambientales y Bioquímica, 캠퍼스 Tecnológico 드 라 디렉터리 드 무기, 대학 카스 티 야 라만 차, 톨레도 기꺼이 넘겨주는에 그들의 종류 지원에 대 한 감사를 주고 싶어 여 의학 및 생명 공학 연구소가이 종이의 촬영된 부분을 가능 하 게
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
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