Summary
Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.
Abstract
Zellmigration ist obligatorisch für die Wundheilung. Erstellen von künstlichen Wunden an Tiermodellen Forschung führt oft zu teure und komplizierte experimentelle Verfahren, während möglicherweise fehlt in der Präzision. In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine geeignete Plattform für die Erforschung der Zelle Wanderungsverhalten der Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlungen auf diese Zellen. Die Physiologie der Epithelzellen ist oft in nicht-Zusammenfluss Bedingungen untersucht; jedoch kann dieser Ansatz nicht natürliche Wundheilung Bedingungen ähneln. Stören die Epithel-Integrität mit mechanischen Mitteln erzeugt ein realistisches Modell, aber die Anwendung molekularer Verfahren behindern kann. Infolgedessen Mikroskopiertechniken basierend sind optimal für das Studium Epithelzelle Migration in-vitro-. Hier zeigen wir zwei spezifische Methoden, die künstliche Wunde kratzen Assay und der künstlichen Migration vorderen Assay, die quantitative und qualitative Daten über die wandernden Leistung von Epithelzellen bzw. erhalten können.
Introduction
Zellmigration ist erforderlich für die Wundheilung, da es für die endgültige Schließung der epithelialen Lücke und Wiederherstellung der gestörten Oberfläche1verantwortlich ist. Durchführung von künstlichen Wunden in Tiermodellen ermöglicht für die Replikation von diesem komplexen Prozess in in der Nähe von physiologischen Bedingungen2. Dieser Ansatz führt jedoch oft kostspieligen und komplizierten experimentellen Verfahren, die Präzision für die Untersuchung von unterschiedliche Prozesse, aufgrund der komplizierten Natur der Wundheilung Prozess möglicherweise fehlt.
In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine hilfreiche Alternative zu Tiermodelle zur Erforschung der Rolle von diesen Zellen in Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlung auf Zelle Wanderungsverhalten. Die Physiologie der Epithelzellen wird oft von molekularen Techniken mit nicht-Zusammenfluss Kulturen3,4,5,6untersucht; die Störung der Epithel Integrität wird jedoch in der Regel durch feine mechanische Ritzlinien erreicht. In der Zellkultur impliziert dies, dass die Wunde Lücke zu vernachlässigende Zahl von Zellen ausgesetzt sein kann, und sie eine zu kleine Probe für molekularbiologische Techniken stellen. Jedoch können diese Läsionen auf der mikroskopischen Skala, unter Ausnutzung der angeborenen wandernden Eigenschaften einige epithelialen Zell-Linien wie die Mink Lunge Epithelzelle (Mv1Lu) oder die Zelle spontan verewigt menschlichen Keratinozyten (HaCaT) untersucht werden Linien.
Hier haben wir eine Methode für die Mikroskopie, die geeignet ist, quantitative Daten über die Migration von Epithelzellen im Rahmen der Wundheilung3,4,7,8. Darüber hinaus präsentieren wir weitere Methoden, die hilfreich sind, qualitativ molekulare und morphologische Veränderungen auf epithelialen Monolagen während der Migration zu studieren. Insgesamt bieten diese Methoden einen Rahmen um die Dynamik und die morphologischen Veränderungen Epithelzelle Verhalten und Reaktion auf Behandlungen mit einbezogen bei der Wundheilung zu untersuchen.
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Protocol
1. künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien
- Zelle Monolage Vorbereitung
- Arbeiten unter sterilen Bedingungen, Samen und Mv1Lu oder HaCaT Epithelzellen in Kulturflaschen mit Serum ergänzt Medium wachsen. Aktualisieren Sie Medium einmal alle 24-48 h. Nachdem Zellen Zusammenfluss von 80 % erreichen, lösen Sie Zellen unter Verwendung einer geeigneten Methode, d.h., Trypsinization9.
Hinweis: Mv1Lu und HaCaT epithelialen Zelllinien mit EMEM und DEMEM Nährmedium kultiviert werden, mit 2 mM L-Glutamin ergänzt bzw. bei 37 ° C mit 5 % CO2kontrollierter Atmosphäre inkubiert. Jede Zelllinie muss gründlich untersucht werden, um festzustellen, Zellkonzentration und Timing erforderlich, um volle Konfluenz zu erreichen. In der Regel für Mv1Lu oder HaCaT-Zellen, 2-4 x 104 oder 4-6 x 104 Zellen/Brunnen, bzw. sind entkernt in einem 175 cm2 Kultur Kolben und bei 80 % Zusammenfluss ergibt bis zu 35 x 106 Mv1Lu oder 1 x 107 HaCaT-Zellen. - Samen Sie in entweder einer Kultur 12-Well oder 24-Well-Platte in jede Vertiefung 2 mL der Zellen. Medium zu aktualisieren, sobald alle 24-48 h. sicher Zellzahlen sind hoch genug, um 100 % Zusammenfluss nach 2 oder 3 Tagen erreichen.
- Nachdem die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, entfernen Sie das Serum ergänzt Medium zu und waschen Sie zweimal mit frischem serumfreien Medium. Halten Sie Zellen in serumfreien Medium für 24 h vor dem Verkratzen.
Hinweis: Mv1Lu oder HaCaT-Zellen haben keine speziellen Substrat Anforderungen; jedoch sollte vor Beschichtung der Kultur Plattenoberfläche mit einer Poly-L-Lysin-Lösung für Zell-Linien trennen spontan in serumfreien Bedingungen anfällig,10gelten.
- Arbeiten unter sterilen Bedingungen, Samen und Mv1Lu oder HaCaT Epithelzellen in Kulturflaschen mit Serum ergänzt Medium wachsen. Aktualisieren Sie Medium einmal alle 24-48 h. Nachdem Zellen Zusammenfluss von 80 % erreichen, lösen Sie Zellen unter Verwendung einer geeigneten Methode, d.h., Trypsinization9.
- Monolage kratzen
- Arbeiten in einer sterilen Umgebung, kratzen Sie die Monolayer Kultur durch das schmale Ende 20 µL und 200 µL steriler Mikropipette Tipp, abhängig von der gewünschten Breite Kratzer fest ziehen. Halten Sie die Spitze senkrecht zur Oberfläche Kultur Lücke Homogenität zu maximieren.
- Platzieren Sie die Kultur-Platten über eine dunkle Oberfläche deutlich die Zelle Monolage überwachen. Bei Bedarf führen Sie zwei senkrecht Kratzer (kreuzförmige) auf jedem Bohrloch bis zu 4 Migration Bereiche zu studieren.
- Waschen Sie freistehende Zellen durch sanft entfernen, Kultur und sanft hinzufügen frischen serumfreien Medium. Zwei Mal wiederholen, oder bis die meisten ungebundene Zellen entfernt worden sind.
- Arbeiten in einer sterilen Umgebung, kratzen Sie die Monolayer Kultur durch das schmale Ende 20 µL und 200 µL steriler Mikropipette Tipp, abhängig von der gewünschten Breite Kratzer fest ziehen. Halten Sie die Spitze senkrecht zur Oberfläche Kultur Lücke Homogenität zu maximieren.
- Experimentelle Verfahren und Datenerhebung
- Nehmen Sie bis zu 4 Vorbehandlung Referenzbilder zentriert auf die Kratzer Lücke von jeder gut mit einem invertierten Phasenkontrast-Mikroskop mit einer CCD-Kamera. Wählen Sie Interesse Bereiche ausrichten Mikroskop Feldrand bis zur angrenzenden Kreuzung von Kratzern.
Hinweis: In der Regel sind Bilder aufgenommen mit einer 10-fach Vergrößerung und eine Bildgröße von 1.280 x 1.024 Pixel. Auswahl der Interessengebiete wie oben hilft für einfache Lokalisierung und Validierung von bis zu 4 Messungen pro Bohrloch beschrieben. - Sobald alle Bilder gesammelt sind, benennen Sie Behandlung Brunnen; tauschen Sie das Medium in den Brunnen mit frischem Medium, das ausgewählte Behandlungen enthält.
Hinweis: Alternativ können für Chemikalien oder Verbindungen, die nicht Kulturmedium Homogenität stören, Behandlungen direkt in das Kulturmedium geimpft werden. - Inkubieren Sie zerkratzte Platte (37 ° C mit kontrollierter Atmosphäre mit 5 % CO2), bis die Bedingungen, unter Beobachtung erreichen 90 % Scratch Lückenschluss. Vermeiden Sie Vollsperrung.
Hinweis: Insgesamt Lückenschluss hebt Nachbehandlung Bildersammlung Referenzflächen sind nicht nachweisbar und der Zeitbezug zum Schließen der Lücke kann nicht hergestellt werden. Im Falle von Mv1Lu oder HaCaT-Zellen sind 16-19 h verpflichtet, 90 % Zusammenfluss zu erreichen. - Stoppen Sie die Zellwanderung durch die Fixierung der Zellen; ersetzen Sie sanft die experimentelle Kulturmedium mit 1 mL 4 % Formalin in PBS. 15 min bei RT inkubieren
- Waschen der Zellen, um überschüssige Formalin zu entfernen; ersetzen Sie sanft die Lösung in den Vertiefungen mit frischen PBS. Wiederholen Sie mindestens zwei Mal.
Hinweis: In diesem Stadium können nach dem Abdichten, Platten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. - Die ursprüngliche Referenzflächen gefangen genommen, nachdem kratzen entnehmen Sie Nachbehandlung Referenzbilder von jedem Bohrloch. Verwenden Sie die gleiche Ausstattung (umgekehrte optische Phasenkontrast-Mikroskop mit einer CCD-Kamera) und passenden Bildeinstellungen (Vergrößerung und digitaler Auflösung/Dichte).
Hinweis: Zellen, die einzeln zu migrieren und die Lücke unabhängig von der Bildung einer einheitlichen Front (z.B. MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszellen), können die Zeitverlauf Bilder die Berechnung der einzelnen Zelle Migration Geschwindigkeiten ermöglichen.
- Nehmen Sie bis zu 4 Vorbehandlung Referenzbilder zentriert auf die Kratzer Lücke von jeder gut mit einem invertierten Phasenkontrast-Mikroskop mit einer CCD-Kamera. Wählen Sie Interesse Bereiche ausrichten Mikroskop Feldrand bis zur angrenzenden Kreuzung von Kratzern.
- Bildanalyse und Quantifizierung der migration
- Mittels Bildverarbeitungs-Software (z. B.ImageJ), definieren Sie Scratch Lücke Grenzen und bestimmen Sie die Lücke Oberfläche für bis zu vier Messungen in Vorbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Vorbehandlung Lücke Oberfläche" (PREGAP). Wiederholen Sie den Vorgang für die Nachbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Nachbehandlung Lücke Oberfläche" (POSTGAP).
- Öffnen Sie das aufgezeichnete Bild mit ImageJ. Legen Sie im Menü "Bild" Bildtyp auf 8 Bit. Im Menü "Vorgang" zum Untermenü "Filter" und "Varianz" Filter anwenden.
- Im Menü "Bild" geben Sie "anpassen", Untermenü und Schwelle in schwarz und weiß (B & W), stellen Sie sicher, "Dark Background" ist nicht aktiviert. Im Menü "Vorgang" zur "binär" Untermenü, und wählen Sie "Löcher füllen".
- Wählen Sie im Menü "analysieren" "Messungen" und aktivieren Sie "Raum" zu. Ziehen Sie den messbaren Bereich nach der Migration von Rand Kontur zur Abgrenzung somit der Lückenschluss.
- Wählen Sie im Menü "analysieren" "analysieren Partikel" und zeichnen Sie "Fläche" Werte für die gezeichnete Fläche Oberfläche.
- PREGAP und POSTGAP Gesamtfläche Werte in einem Arbeitsblatt zu quantifizieren, absolute Migration für jeden Satz von Einzelproben als Differenz der Lücke Oberflächenmessungen vorstellen: PREGAP − POSTGAP [beliebige Einheiten]. Darüber hinaus absolute Migrationsdaten jeder Bedingung zu Kontrollproben zu normalisieren: (Probe / Kontrolle) * 100 [%].
Hinweis: Für Zellen, die einzeln zu migrieren und die Lücke unabhängig von der Bildung einer einheitlichen Front, (z.B., MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszellen), die absolute Migration kann berechnet werden durch zählen von Zellen in einer zentralen Streifen entweder in das Steuerelement oder die behandelten Proben. - Plot-Quantifizierung Ausgänge (siehe Abbildung 1). Durchführen Sie statistische Analyse, wenn nötig.
- Mittels Bildverarbeitungs-Software (z. B.ImageJ), definieren Sie Scratch Lücke Grenzen und bestimmen Sie die Lücke Oberfläche für bis zu vier Messungen in Vorbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Vorbehandlung Lücke Oberfläche" (PREGAP). Wiederholen Sie den Vorgang für die Nachbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Nachbehandlung Lücke Oberfläche" (POSTGAP).
2. künstliche Migration vorderen Assay für topographische Studien
- Zelle Monolage Vorbereitung
- Legen Sie unter sterilen Bedingungen arbeiten, eine Schicht aus sterilisierten Runde Deckgläsern in leere Kultur Platten bis die Plattenoberfläche vollständig bedeckt ist.
Hinweis: Passen bis zu 12 und 33 Deckgläsern auf 5 cm und 10 cm Durchmesser Teller, beziehungsweise. - Samen Sie auf dem Kultur-Teller sanft eine angemessene Lautstärke von Zellen in einer Konzentration, die 100 % Zusammenfluss nach 2 oder 3 Tagen erlaubt. Sicherstellen Sie, dass keine Deckglas benachbarten Deckgläsern überlappt und verhindern Sie, dass Deckgläsern schweben durch sanften Druck mit einer sterilen Mikropipette Spitze. Aktualisieren Sie dem Medium alle 24-48 h.
Hinweis: Jede Zelllinie muss gründlich untersucht werden, ermitteln Zellkonzentration und Timing erforderlich, um volle Konfluenz zu erreichen. In der Regel sind für Mv1Lu oder HaCaT-Zellen, 2-3 x 106 oder 2,5-4 x 106 Zellen/10 cm-Durchmesser Teller, bzw. ausgesät. Für kleinere Platten müssen Zellzahlen verkleinert werden. - Nachdem die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, das Serum ergänzt Medium zu entfernen und ersetzen mit frischen serumfreien Medium. Halten Sie die Zellen in serumfreien Medium für 24 h, bevor die künstliche Wunde durchgeführt wird.
Hinweis: Mv1Lu oder HaCaT-Zellen haben keine speziellen Substrat Anforderungen; jedoch sollte vor Beschichtung der Kultur Oberfläche mit einer Poly-L-Lysin-Lösung für Zell-Linien des Abnehmens spontan in serumfreien Bedingungen anfällig,10gelten.
- Legen Sie unter sterilen Bedingungen arbeiten, eine Schicht aus sterilisierten Runde Deckgläsern in leere Kultur Platten bis die Plattenoberfläche vollständig bedeckt ist.
- Monolage Verwundung
- Bewegen Sie mit sterilen Pinzette sanft ein Deckglas auf einen sauberen 10 cm Teller mit frischen serumfreien Medium. Beschädigung der Monolage halten das Deckglas an der Peripherie mit einer Pinzette zu vermeiden. Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf der Deckglas Bruch führen könnten.
- Erstellen Sie künstliche Wunden durch Ziehen einer sterilisierten Rasierklinge in einer Querlinie mittig auf den Deckgläsern. Ziehen Sie ca. 3-4 mm hin und her, um den zentralen Monolage Streifen vollständig zu entfernen. Sicherstellen Sie, dass keine Zellenrückstand der Verwundeten Kanten verbunden bleibt.
Hinweis: bei einem Durchmesser von 12 mm Runde Deckglas, erfolgt der Schnitt in der Mitte von dem Deckglas. Stellen Sie sicher, einen Streifen von Zellen gegenüber der Hauptfront groß genug (mindestens 2 mm breit) um zu vermeiden, Kippen des Deckglases in den folgenden Schritten zu verlassen. - Verwundete Deckgläsern mit Zellen nach oben, um eine saubere 6-Well-Platte mit mindestens 2 mL frisches serumfreien Medium zu übertragen. Passen Sie bis zu 4 verwundete Deckgläsern/gut.
- Vorsichtig waschen, zwei Mal mit frischen serumfreien Medium, freistehende Zellen zu entfernen.
- Versuchsdurchführung und Probenahme
- Tauschen Sie sanft das Medium in den Brunnen mit frischem Medium, das ausgewählte Behandlungen enthält.
Hinweis: Alternativ können für Chemikalien oder Verbindungen, die nicht Kulturmedium Homogenität stören, Behandlungen direkt in das Kulturmedium geimpft werden. Gehen Sie mit Vorsicht, jede mögliche Zelle Loslösung zu vermeiden. - Halten Sie die Platte in eine Zelle Brutmaschine (37 ° C, 5 % CO2) für das gewünschte experimentelle Timing.
- Stoppen Sie die Zellwanderung durch die Fixierung der Zellen; ersetzen Sie sanft die experimentelle Kulturmedium mit 1 mL 4 % Formalin in PBS. 15 min bei RT inkubieren
Hinweis: Mal Kurs Experimente, entfernen Sie die Proben aus der Kultur-Platte und befestigen Sie sie in einer separaten Platte, Formalin-Dämpfe, die Auswirkungen auf die anderen, laufenden experimentellen Bedingungen zu vermeiden. - Waschen der Zellen, um überschüssige Formalin zu entfernen; ersetzen Sie sanft die Lösung in den Vertiefungen mit frischen PBS. Wiederholen Sie mindestens zwei Mal.
Hinweis: In diesem Stadium können nach dem Abdichten, Platten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
- Tauschen Sie sanft das Medium in den Brunnen mit frischem Medium, das ausgewählte Behandlungen enthält.
- Immunfluoreszenz (IF) und topologische Analyse
- Führen Sie IF Färbung und Bildgebung auf einzelnen Deckgläsern als an anderer Stelle beschrieben,3,4,11.
- Permeabilize für 10 min durch Eintauchen Deckgläsern in einer 0,3 % Triton x-100 Lösung mit PBS-Puffer.
- Block für 30 min mit der folgenden blockierende Lösung: 0,3 % Rinderserumalbumin; 10 % fötalen Rinderserum; 5 % Magermilch; 0,3 % Triton x-100 Lösung mit PBS-Puffer.
Hinweis: Blockiert Lösung ohne Milch im Voraus vorbereitet und gespeichert werden kann bei-20 ° C. - Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit Primärantikörper in milchfreie blockierende Lösung verdünnt. Legen Sie die Deckgläsern kopfüber in die 15 µL Antikörper-Lösung für korrekte Verteilung zu gewährleisten.
Hinweis: Die Antikörper arbeiten Verdünnung ist variabel und hängt von der Antikörper im Einsatz. Beispielsweise erfordert der Kaninchen-Anti-c-Jun-Antikörper eine Verdünnung von 1/100. - Waschen Sie dreimal durch Eintauchen der Deckgläsern in einer in 0,1 % Triton x-100 Lösung in PBS.
- Inkubieren Sie die Deckgläsern in Sekundärantikörper verdünnt in milchfreie blockierende Puffer für 30 min.
Hinweis: Die Antikörper arbeiten Verdünnung ist variabel und hängt von der Antikörper im Einsatz. Die Ziege-Anti-Kaninchen (488) benötigt beispielsweise eine Verdünnung von 1/400 für optimale Auflösung. Andere Kennzeichnung Reagenzien wie Phalloidin und Hoechst 33258 können in dieser Phase der Inkubation Puffer hinzugefügt. - Waschen Sie dreimal durch Eintauchen der Deckgläsern in 0,1 % Triton x-100 Lösung in PBS.
- Montieren Sie die Deckgläsern kopfüber in ein 10 µL Montage Medien Tropfen (z.B.Vectashield) auf einen Objektträger gelegt. Verlassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht für die Montage mittlerer Verhärtung. Danach, bei 4 ° C im Dunkeln auf unbestimmte Zeit zu speichern.
- Erhalten Sie entweder Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie Bilder von strukturellen Veränderungen bei der Migration von Vorderkante.
Hinweis: Topologische Studien können durch Fliesen Bilder von Migration von vorne auf die innere Monolage durchgeführt werden. Semi-quantitativen Studien sind möglich durch Software-basierte Analyse auf lokalen Fluoreszenz-Intensitäten.
- Führen Sie IF Färbung und Bildgebung auf einzelnen Deckgläsern als an anderer Stelle beschrieben,3,4,11.
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Representative Results
Künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien: Bewertung der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Förderung der Migration:
EGF ist ein bekannter Induktor von epithelialen Zellen Proliferation und Migration und damit eine Positivkontrolle zur Quantifizierung der Migration Förderung. Mv1Lu und HaCaT Zelle Monolagen dienten in der Wunde kratzen Assays und Vorbehandlung Bilder stammen. Nach der Inokulation mit 10 ng/mL EGF wurden Zellen vor der Fixierung und Nachbehandlung Bilder für 19 h inkubiert. Verbreitung wurde durch Pflege Serum verhungern Bedingungen auf ein Minimum gehalten. Vor- und Nachbehandlung Bildergalerien wurden mit ImageJ analysiert und die zentrale Lücke Gebiete bestimmt waren. Das Experiment wurde in zweifacher Ausfertigung, Registrierung von vier Messungen für jedes gut laufen. Quantifizierung der absolute Migration wurde als Differenz der Flächen berechnet: (PREGAP − POSTGAP). In den stimulierten Mv1Lu Zellen (Abbildung 1A) im Vergleich zu den stimulierten HaCaT-Zellen (Abbildung 1 b) gab es ein größeres wandernden Potenzial. Die Unterschiede erklären sich durch die Zelle Quellen wird Schleimhaut Epithelzellen und Haut Keratinozyten, beziehungsweise.
Künstliche Migration vorderen Assay für topographische Studien: Variationen im Zellskelett Konformation und räumlichen Ausdruck von C-Jun:
Zellwanderung beinhaltet kontinuierliche und tiefe Veränderungen des Zytoskeletts Struktur um Verschiebung der Zelle aufrecht zu erhalten. HaCaT Zelle Monolagen dienten in der Migration vorderen Assays unter Kontrolle und Stimulation. Behandlung mit EGF potenziert das Zellskelett Dynamik, die werden von IF beobachtet und laser-scanning Mikroskopie (LSM; Abbildung 2A). EGF-Behandlung führt auch robuste Mitogen-Activated Protein (MAP)-Kinasen Signalisierung und c-JUN Überexpression. Fliesen LSM Bilder ermöglicht die Konfiguration des räumlichen Mustern. Erhöhte Expression von c-JUN an Zellen neben der Migration von vorne kann leicht durch die Bildanalyse Software offenbart werden; Hier haben wir eine Regenbogen-Skala für den grünen Kanal c-JUN Kennzeichnung (Abbildung 2 b) entsprechen.
Abbildung 1: Förderung der Migration von EGF in Mv1Lu und HaCaT-Zellen. Phasenkontrast-Mikroskopie Bilder des verletzten Bereichs des Mv1Lu (A) und (B) HaCaT-Zellen wurden unter Kontrolle Bedingungen aufgenommen und im Vergleich zu Bildern der Zellen mit 10 ng/mL EGF für 19 h in serumfreien Bedingungen behandelt. Repräsentative Mikrographen zeigen das Ausmaß der Kratzer Lücke und Schließung nach Verwundung mit 20 µL Mikropipette Spitze erhalten. Vergrößerung = 10 X; Maßstabsleiste = 100 µm. Zelle Migration wurde quantifiziert und vertrat als Variation der Bereich Unterschiede zwischen Behandlungen und Kontrollproben für jedes Assay (willkürliche Einheiten; (AU). Das Grundstück ist Vertreter der acht unabhängige Messungen für jede Bedingung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Actinfilamente und c-JUN Ausdruck Änderungen von EGF bei der Migration von HaCaT-Zellen gefördert. (A) über Nacht 10 ng/mL EGF Behandlung fördert die tiefgreifende Veränderungen in der Konformation der Actinfilamente in Migration von HaCaT-Zellen. Zellen an der Vorderseite der Migration der Kontrolle Bedingungen darzustellen einen fest strukturierten Aktin Filamente Zytoskelett, während Zellen mit EGF behandelt zeigen schlechte Aktin Filamente Organisation Migration vorne. Vergrößerung = 63 X; Maßstabsleiste = 20 µm. F-Aktin ist farblich rot und Hoechst wird durch eine blaue Farbe dargestellt. (B) wenn Immuno-Fluoreszenz in Kombination mit imaging-LSM verwendet wird, um c-JUN Ausdruck nach 10 ng/mL EGF-Behandlung auf Migration von HaCaT-Zellen zu studieren, Fliesen Kompositionen offenbaren räumliche Expressionsmuster. Bilder der c-Jun Fluoreszenz (grün) wurden in Pseudo-Farbe, zeigen die Intensität der Färbung von c-Jun umgewandelt. Die Regenbogen-Farbskala stellt Fluoreszenzintensität für c-Jun, entspricht Colormaps auf die richtigen Platten für EGF und Kontrolle. Co Färbung mit Phalloidin (rot) und Hoechst-33258 (blau) wurde verwendet, um die Zellstruktur und Kerne, bzw. zu zeigen. Bilder wurden von einem confocal Mikroskop genommen. Beachten Sie Ausdruck zunehmender nukleare c-Jun in Bereichen, die kurz vor dem Migrieren von vorne. Maßstabsleiste = 40 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Auf Haut oder Schleimhaut-Störungen wird die Barrierefunktion durch die Aktionen der zahlreichen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten oder epithelialen und immune Zellen wiederhergestellt. Gemeinsam, diese Zellen durchlaufen einen komplexen Prozess mit Apoptose, Proliferation, Differenzierung und allem, Fibroblasten und epithelialen Zell-Migration, die die ultimative Mechanismus für die Wiederherstellung des gestörten Gewebes verantwortlich ist und die Schließung der oberflächlichen Epithelzellen Lücke1,12 so studieren Zellwanderung hilft das physiologische Verhalten der Epithelzellen, genau zu beschreiben, während auch Bestimmung der modulierende potentiellen Behandlungen für Wunde Heilung.
Durchführung von künstlichen Wunden an verschiedenen Tiermodellen ermöglicht die Replikation dieses komplexen Prozesses in in der Nähe von physiologischen Bedingungen2und damit die Beurteilung von bestimmten pathologischen Bedingungen und die Auswirkungen der pharmazeutischen Behandlungen-13. Dieser Ansatz führt jedoch oft kostspielige und komplizierte Logistik sowie aufwändige experimentellen Verfahren, die Daten in eine verzögerte Mode13generieren können. Im Gegenteil, bietet in Vitro Zellkultur einen bequemeren Rahmen für die Erforschung des Verhaltens der beteiligten Zellen in der Wundheilung. Während primäre Zellkultur von Epithelzellen eine sinnvolle Option darstellt, kann es schwierig sein, zu erhalten und die Zellen, die Erhebung von Daten zu erschweren, können zu behandeln. Beispielsweise benötigen neben der typischen Low-Passage Einschränkung von Primärkulturen primären menschlichen Keratinozyten eine Fibroblasten Fütterung Schicht für Wachstum in-vitro-3. Im Gegenteil, darstellen etablierten Epithelzelle Kultur Linien, wie Mv1Lu oder HaCaT, ein hindernisfreies Forschungsmodell, dass Funktionen Verhalten und Eigenschaften wie die Primärkultur Zellen3,4, 14,15. Genau, behalten diese beiden Zelllinien für die Studie der Wundheilung, kritische Merkmale in ihrer Fähigkeit zu migrieren und Verbreitung durch Zell-Zell-Kontakt-Hemmung beim Zusammenfluss16,17zu stoppen.
Scratch-Assays sind eine zuverlässige und vielseitige Methode zur Quantifizierung der wandernden Fähigkeiten der verschiedenen Zelltypen, vor allem epitheliale und Krebszellen. Für den Fall von Krebszellen ist die Scratch-Methode zur Beurteilung der invasiven Potenzial vorgeschlagen worden. Jedoch greift dieser Ansatz zu kurz als Indikator für die Invasivität gegenüber spezifischere Methoden unter Berufung auf die Expression von Metalloproteasen benötigt für die Durchdringung der extrazellulären Matrix18,19. Im Gegenteil, sind Kratzer Assays zuverlässig für die Beurteilung der wandernden Leistung der Epithelzellen und die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf dieses Merkmal. Im Gegensatz zu Krebs Zelllinien zeigen, die häufig schlechte Zusammenhalt und die Fähigkeit zu wachsen auf mehrere Schichten, Mv1Lu, HaCaT und andere Epithelzelle Linien Form eng verbundenen "Wachstum Inseln", die ihre Margen in einem Prozess je nach beide erweitern Verbreitung, aber mehr vor allem auf Zellmigration. Infolgedessen sind spärlich oder Sub konfluierende Zelle Dichte Bedingungen konventionell verwendet, für die Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf die wandernden Physiologie; vor allem, wenn spätere molekularbiologische Techniken angewendet werden, minimiert als diese Zelle Umwelt Kontakt Hemmung während das Verhältnis von aktiv Migration zu maximieren Zellen. Jedoch stellen nicht Zusammenfluss Bedingungen für Epithelzellen, das Risiko des Ausschlusses wichtig bereits bestehenden Kontakt Hemmung Einflüsse, zum Beispiel in Form von epigenetischen Regulation. So verleihen konfluierende Bedingungen studieren, Wundheilung, erhöhte Treue des Modells.
Um genaue Schätzungen zu erhalten, sollten begleitende Faktoren beeinflussen die Konformation der Epithelzelle Schicht oder einen Beitrag zur Migration angesprochen werden. Während Zusammenfluss gewünscht wird, ist es wichtig zu vermeiden übermäßige Zelldichte oder vielschichtigen Kulturen, da diese Bedingungen negativ beeinflussen können. Daher Verbreitung erfolgt häufig durch Verhungern in serumfreien Medien oder durch die Zugabe von Chemikalien wie Mitomycin C, die irreversibel Zellproliferation durch DNA-Vernetzung3,20, verhaften 21. die Verwendung des einen oder der anderen stützt sich auf das Verhalten von bestimmten Zellformen; Mitomycin C ist vor allem dann indiziert, wenn reduziert, dass Serum-Supplementierung erforderlich ist, um massive Zelle Loslösung zu vermeiden. Das ist der Fall für HEK-293T Zellen, wo die Kultur-Oberfläche mit Poly-L-Lysin Pre-Beschichtung ist eine gute Option um Mytomycin C Behandlung zu vermeiden. Auch muss die Freisetzung von Entzündungsfaktoren, die Migration zu verändern angegangen werden. Verschiedene Strategien sind benutzt worden, hauptsächlich basierend auf Silikon-Einsätze, die Störung der epithelialen Oberfläche erreicht mit dem Scratch-Assay-22zu imitieren. Während Einsätzen bereits vorhandene Lücken zu, die Zellwanderung nach dem Entfernen der Silikon-Stück zu ermöglichen generieren, setzt die Scratch-Methode direkt auf Entfernen Sie einige der epithelialen Monoschicht um die Lücke zu generieren. Präferenz auf wie die Lücke zu erzeugen beruht auf der Fähigkeit von Einsätzen Kultur Oberflächenbeschichtung (d.h., Kultur-Platte oder Poly-L-Lysin) zu schützen vor Beschädigungen beim Kratzen, bei gleichzeitiger Minimierung auch die Freisetzung von Faktoren aus beschädigten Zellen, die möglicherweise beeinträchtigen Sie die Zelle Kultur Verhalten23. Obwohl diese Eigenschaften möglicherweise nützlich für einige experimentelle Einstellungen, z. B. Beurteilung der Fähigkeit von Krebszellen zu migrieren, nach unserer Erfahrung fanden wir erhebliche Nachteile für die Verwendung von Einsätzen in Studien der Wundheilung. Mv1Lu Zellen sind in der Lage sind, Anhängen an die Silikon einfügen äußere Oberfläche, wodurch unbeabsichtigt von der Zelle Monolage auf Entfernung von Silikon-Stücke zu reißen. Obwohl HaCaT-Zellen Silikon nicht zuordnen, fanden wir auch, eine verminderte Fähigkeit für diese Zellen, in Insert erzeugt Lücken zu migrieren. Umfang, Entzündungen und Migration sind eng damit verbundenen Reaktionen und scheinen diese gemeinsam im Rahmen der Wundheilung in HaCaT-Zellen entscheidend sein. Außerdem seit Anwendung eine Kunststoffspitze für die Spitze des Eisbergs Kultur keine offensichtliche Auswirkung auf die Fähigkeit der Zellen, die Lücke im Falle von HaCaT-Zellen wieder zu bevölkern schlägt ein solches Verhalten, dass extrazelluläre Matrix Reste in den Spalt zu Migration in führen ähnlicher Weise als Lederhaut in einer natürlichen Wunde.Die Hauptquelle der Variation bleibt jedoch das Kratzen Verfahren selbst, wie die Verwendung von eine Kunststoffspitze, die Wunde zu machen nicht immer die gleiche Größe Lücke dargestellt wird. Wir haben beobachtet Variationen bis zu 20 % unter den verschiedenen Proben aufgrund der Widersprüchlichkeit der Druck und die Position der Spitze zum Zeitpunkt von Grund auf neu. Diese Variationen können durch Verwundung der Monolage mit einem steiferen Gegenstand behandelt werden; jedoch würde Kratzer auf der Kunststoffoberfläche gefährden die Freizügigkeit der Zellen. Also, müssen Abweichungen in den ersten Kratzer berücksichtigt werden, um Migration zu berechnen; in der Regel durch Erhöhung der Anzahl der Messungen pro Zustand.
Neben der Quantifizierung kann verletzte Verfahren zusammen mit klassischen IF Techniken anwenden die molekularen Prozesse der Zellwanderung qualitativ bewerten. Die Fähigkeit der Epithelzellen auf Deckgläsern wachsen ist bekannt; in der Vergangenheit Variationen des Kratzers assays beteiligten Zellen migrieren auf Deckgläsern verschiedene Bedingungen, gefolgt von Fixierung und Färbung für den Vergleich innerhalb der Wunde-Scratch Versuchsaufbau24ausgesetzt. Hier fanden wir, dass große Lücken im Monolagen auf Deckgläsern wachsen zu schaffen für die Verlängerung der experimentellen Zeit Kurse3,4,7ermöglicht. Darüber hinaus in diesen Experimenten, wenn erhöht die Erkennung Fähigkeiten des Verfahrens möglicherweise genauen Mechanismen zellulären und subzellulären studieren beteiligt, und es nur durch die Verfügbarkeit von Antikörpern für diese Technik geeignet begrenzt ist und die Zellen von Interesse. Proben auf den Deckgläsern für IF verwendet werden auf Objektträger, montiert, für erweiterten Schutz zu ermöglichen. Dies hilft die Anwendung von Versuchsaufbauten, die langen Studienzeiten erfordern, wie die "Kacheln" Ansätze hier und anderswo,3,4,7präsentiert. Während die "Kacheln" Strategie räumliche Muster in zeitliche Daten zur Rekonstruktion der Mechanismen, die bei der Migration integriert ist, kann die Implementierung Software-Analyse-Tools semi-quantitative Bewertungen basierend auf lokalen Fluoreszenz bereitstellen. Intensität, und die Qualität der erhaltenen Informationen weiter zu bereichern. Nach unserer Erfahrung bietet Fliesen auch die Möglichkeit des Studiums Zelle Positionsinformationen für die Expression von Proteinen in dieser Art von Test. Diese Positionsdaten hat sich gezeigt, zu verstehen und besser übersetzen die Auswirkungen der verschiedenen Agenten auf Zellwanderung, vor allem in Installationen, wo die Position der Epithelzellen sehr wichtig ist, seine Wanderungsverhalten3 bestimmen, entscheidend sein ,4,14,15.
Beide Vorgehensweisen zeigen große Bequemlichkeit durch unkomplizierte Umsetzung, sowie die Herstellung von Qualitätsdaten. Damit diese Ansätze, die auf Mikroskopie Studien bieten einen einzigartigen und leistungsstarken Rahmen, die Dynamik und die morphologischen Veränderungen beteiligt Epithelzelle Verhalten zu studieren und als Reaktion auf die Behandlungen während der Wundheilung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Wir wollen durch ältere Mitglieder des Labors geben, die helfen, verbessern und verfeinern Sie diese Techniken in den tatsächlichen Zustand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada und Dr. Antonia Alcaraz-García. Wir sind verpflichtet, das Hospital Clínico Universitario Virgen De La Arrixaca für unterstützt nachdrücklich die Entwicklung dieser Techniken. Auch das Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planen Sie Estatal ich + D + I und Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento De La Investigación (Grant-Nr.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una Manera de Hacer Europa". Wir danken auch Universidad de Murcia, IMIB Arrixaca und FFI für administrative Unterstützung und Hilfe. Schließlich wollen wir einen besonderen Dank an Dr. Isabel Martínez-Argudo und die Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico De La Fábrica de Armas, Universidad Castilla La Mancha Toledo für ihre freundliche Unterstützung in bereitwillig Abtretung geben die Biomedizin und Biotechnologie-Labor den gefilmten Teil dieses Papiers zu ermöglichen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
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