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Medicine

इन विट्रो घाव हीलिंग के दौरान उपकला कोशिका प्रवास के आकलन के लिए सूक्ष्म आधारित तरीकों

Published: January 2, 2018 doi: 10.3791/56799
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Laboratorio de Oncología Molecular y TGF-β, IMIB-Arrixaca, 2Departamento de Enfermería, Facultad Enfermería, Universidad de Murcia
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि का वर्णन करता है कि कैसे चीरा-तरह के घावों पर बने संस्कृतिक उपकला कोशिका monolayers आसानी से मॉडल घाव हीलिंग इन विट्रो, फोकल या लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, और जो उच्च गुणवत्ता प्रदान कर सकते हैं कक्ष व्यवहार और माइग्रेशन में शामिल तंत्र दोनों का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक डेटा ।

Abstract

कोशिका प्रवास घाव भरने के लिए एक अनिवार्य पहलू है । अनुसंधान पशु मॉडल पर कृत्रिम घावों का निर्माण अक्सर महंगा और जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में परिणाम है, जबकि संभावित परिशुद्धता में कमी । इन विट्रो में उपकला कोशिका लाइनों की संस्कृति घाव भरने में सेल प्रवासी व्यवहार और इन कोशिकाओं पर उपचार के प्रभाव पर शोध के लिए एक उपयुक्त मंच प्रदान करता है । उपकला कोशिकाओं की फिजियोलॉजी अक्सर गैर-धाराप्रवाह स्थितियों में अध्ययन किया जाता है; हालांकि, इस दृष्टिकोण प्राकृतिक घाव भरने की स्थिति के समान नहीं हो सकता है । यांत्रिक अर्थ द्वारा उपकला अखंडता में खलल डालना एक यथार्थवादी मॉडल उत्पन्न करता है, लेकिन आणविक तकनीकों के आवेदन में बाधा हो सकती है. नतीजतन, सूक्ष्म आधारित तकनीक इन विट्रो में उपकला कोशिका प्रवास का अध्ययन करने के लिए इष्टतम हैं । यहां हम विस्तार से दो विशिष्ट तरीकों, कृत्रिम घाव खरोंच परख और कृत्रिम प्रवासन सामने परख, कि मात्रात्मक और गुणात्मक डेटा क्रमशः प्राप्त कर सकते हैं, उपकला कोशिकाओं के प्रवासी प्रदर्शन पर.

Introduction

कोशिका प्रवास घाव भरने के लिए आवश्यक है, के रूप में यह उपकला अंतर और बाधित सतह की बहाली के अंतिम बंद होने के लिए जिंमेदार है1। पशु मॉडलों में कृत्रिम घावों प्रदर्शन के पास शारीरिक परिस्थितियों में इस जटिल प्रक्रिया की प्रतिकृति के लिए अनुमति देता है2. हालांकि, इस दृष्टिकोण अक्सर महंगा और जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में परिणाम, कि संभावित रूप से अलग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए परिशुद्धता कमी, घाव भरने की प्रक्रिया की जटिल प्रकृति के कारण.

इन विट्रो में उपकला कोशिका लाइनों की संस्कृति भूमिका है कि इन कोशिकाओं को घाव भरने में खेलते हैं और सेल प्रवासी व्यवहार पर उपचार के प्रभाव पर शोध के लिए पशु मॉडल के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है । उपकला कोशिकाओं के फिजियोलॉजी अक्सर गैर-धाराप्रवाह संस्कृतियों का उपयोग कर आणविक तकनीक द्वारा अध्ययन किया जाता है3,4,5,6; हालांकि, उपकला अखंडता के विघटन आमतौर पर ठीक यांत्रिक चीरा द्वारा हासिल की है. कोशिका संस्कृति में, यह मतलब है कि कोशिकाओं की नगण्य संख्या घाव अंतर को उजागर किया जा सकता है, और वे आणविक जीवविज्ञान की तकनीक के लिए एक बहुत छोटा सा नमूना प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, इन घावों सूक्ष्म पैमाने पर अध्ययन किया जा सकता है, कुछ उपकला कोशिका लाइनों के सहज प्रवासी गुणों का लाभ उठाते हुए, जैसे मिंक फेफड़ों की उपकला कोशिका (Mv1Lu) या अनायास अमरता मानव keratinocyte (HaCaT) सेल लाइनों.

यहाँ हम माइक्रोस्कोपी के लिए एक विधि वर्णित है कि घाव भरने के संदर्भ में उपकला कोशिकाओं के प्रवास पर मात्रात्मक डेटा को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है3,4,7,8. इसके अलावा, हम अतिरिक्त विधियां प्रस्तुत करते है जो प्रवास के दौरान उपकला monolayers पर होने वाले गुणात्मक आणविक और रूपात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने में सहायक होती हैं । कुल मिलाकर, इन तरीकों दोनों गतिशीलता और रूपात्मक उपकला कोशिका व्यवहार और घाव भरने के दौरान उपचार के लिए प्रतिक्रिया के साथ शामिल परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं ।

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Protocol

1. मात्रात्मक अध्ययन के लिए कृत्रिम घाव खरोंच परख

  1. सेल monolayer तयारी
    1. बाँझ शर्तों के तहत कार्य करना, बीज और संस्कृति कुप्पी में Mv1Lu या HaCaT उपकला कोशिकाओं सीरम पूरक माध्यम का उपयोग कर विकसित. मध्यम ताजा एक बार हर 24-48 एच । कोशिकाओं ८०% संगम तक पहुंचने के बाद, एक उपयुक्त विधि का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग करें, यानी, trypsinization9.
      नोट: Mv1Lu और HaCaT उपकला कोशिका लाइनों EMEM और DEMEM संस्कृति माध्यम का उपयोग कर रहे हैं, क्रमशः, 2 मिमी L-Glutamine के साथ पूरक, और 5% CO2के एक नियंत्रित वातावरण के साथ ३७ ° c पर मशीनी. हर कोशिका लाइन अच्छी तरह से परख के लिए सेल एकाग्रता और पूरा प्रवाह तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय निर्धारित किया जाना चाहिए । सामांयतया Mv1Lu या HaCaT कक्षों के लिए, 2-4 x 104 या 4-6 x 104 कोशिकाओं/ठीक है, क्रमशः, एक १७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और ८०% संगम पैदावार पर ३५ x 106 Mv1Lu या 1 x 107 HaCaT कोशिकाओं ।
    2. या तो एक 12 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में, बीज कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर में । मध्यम ताजा एक बार हर 24-48 ज. सुनिश्चित करें कि कक्ष संख्या 2 या 3 दिनों के बाद १००% संगम तक पहुंचने के लिए पर्याप्त उच्च हैं ।
    3. के बाद कोशिकाओं संगम तक पहुँचने, सीरम पूरक मध्यम निकालें और ताजा सीरम मुक्त माध्यम से दो बार धो. स्क्रैचिंग से पहले 24 ज के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में कोशिकाओं रखें ।
      नोट: Mv1Lu या HaCaT कोशिकाओं विशेष सब्सट्रेट आवश्यकताओं नहीं है; हालांकि, सेल लाइनों के लिए अनायास सीरम मुक्त स्थितियों में अलग करने के लिए अतिसंवेदनशील, संस्कृति प्लेट सतह के एक पाली-एल-lysine समाधान का उपयोग कर पूर्व कोटिंग10माना जाना चाहिए ।
  2. Monolayer scratching
    1. एक बाँझ वातावरण में कार्य करना, दृढ़ता से एक 20 µ एल या २०० µ l बाँझ micropipette टिप के संकीर्ण अंत खींचकर संस्कृति monolayer खरोंच, वांछित खरोंच चौड़ाई पर निर्भर करता है. अंतर सजातीयता को अधिकतम करने के लिए संस्कृति की सतह को सीधा टिप रखें ।
      1. स्पष्ट रूप से सेल monolayer की निगरानी के लिए एक अंधेरे सतह पर संस्कृति प्लेट्स रखें । यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक अच्छी तरह से 4 प्रवास क्षेत्रों तक अध्ययन करने पर दो सीधा खरोंच (पार के आकार) प्रदर्शन करते हैं ।
    2. धीरे संस्कृति माध्यम को हटाने और धीरे से ताजा सीरम मुक्त माध्यम जोड़ने से अलग कोशिकाओं धो. दोहराएं दो बार, या जब तक कि अधिकांश अनुलग्न की गई कक्ष निकाल दिए गए हैं ।
  3. प्रयोगात्मक प्रक्रिया और डेटा संग्रह
    1. एक अच्छी तरह से एक औंधा चरण-कंट्रास्ट एक सीसीडी कैमरा शामिल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से खरोंच अंतराल पर केंद्रित 4 पूर्व उपचार संदर्भ छवियों को ले लो । खरोंच के आसंन चौराहे के लिए माइक्रोस्कोप क्षेत्र के किनारे संरेखित करके ब्याज क्षेत्रों का चयन करें ।
      नोट: आमतौर पर, छवियां एक 10x आवर्धन और एक १,२८० x १,०२४ पिक्सेल छवि आकार का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं । ऊपर वर्णित के रूप में ब्याज क्षेत्रों का चयन अच्छी तरह से प्रति 4 माप के लिए आसान स्थानीयकरण और सत्यापन के लिए मदद करता है.
    2. एक बार सभी छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं, उपचार कुओं नामित; ताजा माध्यम है कि चयनित उपचार शामिल कुओं में मध्यम विनिमय ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, रसायनों या यौगिकों कि संस्कृति मध्यम सजातीयता परेशान नहीं करते के लिए, उपचार संस्कृति माध्यम में सीधे inoculated जा सकता है ।
    3. एक नियंत्रित वातावरण के साथ खरोंच प्लेट (३७ ° c 5% सह2) जब तक निगरानी के तहत शर्तों तक पहुंच ९०% खरोंच अंतर बंद । पूर्ण बंद होने से बचें ।
      नोट: कुल गैप बंद करने nullifies के बाद उपचार चित्र संग्रह संदर्भ क्षेत्रों के रूप में detectable नहीं है और गैप बंद करने के लिए समय संदर्भ स्थापित नहीं किया जा सकता है । Mv1Lu या HaCaT कोशिकाओं के मामले में ९०% संगम तक पहुंचने के लिए 16-19 ज की आवश्यकता होती है ।
    4. कक्षों को ठीक करके कक्ष माइग्रेशन रोकें; धीरे पंजाबियों में 4% formalin के 1 मिलीलीटर के साथ प्रयोगात्मक संस्कृति के माध्यम की जगह । आरटी पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    5. अतिरिक्त formalin को निकालने के लिए कक्षों को धोएं; धीरे ताजा पंजाबियों के साथ कुओं में समाधान की जगह । दो बार दोहराएं ।
      नोट: इस स्तर पर, सील करने के बाद, प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
    6. खरोंच के बाद कब्जा कर लिया मूल संदर्भ क्षेत्रों से प्रत्येक कुआं के बाद उपचार संदर्भ छवियों को ले लो । एक ही उपकरण का प्रयोग करें (उल्टे ऑप्टिकल चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप एक सीसीडी कैमरा शामिल) और चित्र सेटिंग्स मिलान (आवर्धन और डिजिटल संकल्प/
      नोट: कक्षों के लिए जो व्यक्तिगत रूप से माइग्रेट करें और अंतर को एक सुसंगत मोर्चे के गठन की स्वतंत्र रूप से भरें (उदा., एमडीए-एमबी-२३१ स्तन कैंसर मानव कोशिकाएं), समय-पाठ्यक्रम छवियां व्यक्तिगत सेल माइग्रेशन गति की गणना की अनुमति दे सकती हैं ।
  4. माइग्रेशन की छवि विश्लेषण और ठहराव
    1. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग (उदा, ImageJ), खरोंच अंतर सीमा को परिभाषित करने और पूर्व उपचार चित्रों में चार माप के लिए अंतर की सतह का निर्धारण । "पूर्व उपचार गैप सतह" (PREGAP) के रूप में डेटा रिकॉर्ड । बाद के उपचार चित्रों के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ । "के बाद उपचार गैप सतह" (POSTGAP) के रूप में डेटा रिकॉर्ड ।
      1. दर्ज छवि ImageJ का उपयोग कर खोलें । "छवि" मेनू में, छवि प्रकार सेट करने के लिए 8 बिट. "प्रक्रिया" मेनू में, "फ़िल्टर" सबमेनू पर जाएं और "प्रसरण" फ़िल्टरिंग लागू करें ।
      2. "छवि" मेनू में, "समायोजित" सबमेनू दर्ज करें और काले और सफेद (B & #38; W) के लिए थ्रेशोल्ड सेट, सुनिश्चित करें कि "डार्क पृष्ठभूमि" चयनित नहीं है । "प्रक्रिया" मेनू में, "बाइनरी" सबमेनू पर जाएं, और "भरण छिद्र" का चयन करें ।
      3. "विश्लेषण" मेनू में, "सेट माप" का चयन करें और सक्रिय "क्षेत्र". तो पलायन बढ़त समोच्च इस प्रकार का सीमांकन के बाद औसत दर्जे का क्षेत्र आकर्षित ।
      4. "विश्लेषण" मेनू में, "विश्लेषण कणों" का चयन करें और खींचा क्षेत्र सतह के लिए "कुल क्षेत्र" मूल्यों रिकॉर्ड ।
    2. एक स्प्रेडशीट में PREGAP और POSTGAP कुल क्षेत्र मूल्यों का परिचय अंतर सतह माप के अंतर के रूप में व्यक्तिगत नमूनों के प्रत्येक सेट के लिए निरपेक्ष प्रवास यों तो: PREGAP − POSTGAP [मनमानी इकाइयों] । साथ ही, नमूने को नियंत्रित करने के लिए प्रत्येक शर्त के निरपेक्ष माइग्रेशन डेटा को सामान्य करें: (नमूना/नियंत्रण) * १०० [%] ।
      नोट: कोशिकाओं है कि व्यक्तिगत रूप से माइग्रेट और अंतर को भरने के लिए एक सुसंगत मोर्चे के गठन के स्वतंत्र रूप से, (जैसे, एमडीए-एमबी-२३१ स्तन कैंसर मानव कोशिकाओं), निरपेक्ष प्रवास की गणना कर सकते है एक केंद्रीय पट्टी पर हमला कोशिकाओं गिनती द्वारा या तो नियंत्रण या इलाज के नमूने ।
    3. प्लॉट ठहराव आउटपुट ( चित्र 1देखें) । यदि आवश्यक हो तो सांख्यिकीय विश्लेषण करें ।
शर्तों की अधिक से अधिक संख्या के लिए दो शर्तों या प्रसरण परीक्षण के विश्लेषण की तुलना करते समय विद्यार्थी के t-परीक्षण पर विचार करें ।

2. कृत्रिम प्रवासन स्थलाकृतिक अध्ययन के लिए सामने परख

  1. सेल monolayer तयारी
    1. बाँझ स्थितियों में काम करने, खाली संस्कृति प्लेट में निष्फल दौर coverslips की एक परत जगह जब तक प्लेट की सतह पूरी तरह से कवर किया जाता है ।
      नोट: अप करने के लिए 12 और ३३ coverslips 5 सेमी और 10 सेमी व्यास प्लेटों पर फिट, क्रमशः ।
    2. संस्कृति की थाली पर, धीरे से एक एकाग्रता है कि 2 या 3 दिनों के बाद १००% संगम की अनुमति देता है पर कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा बीज । सुनिश्चित करें कि कोई coverslip coverslips पड़ोसी ओवरलैप और एक बाँझ micropipette टिप के साथ कोमल दबाव लागू करने से अस्थायी coverslips को रोकने के. मीडियम को रिफ्रेश करें हर 24-48 एच.
      नोट: हर कोशिका लाइन पूरी तरह से परख की जानी चाहिए कोशिका एकाग्रता और समय पूरा प्रवाह तक पहुंचने के लिए आवश्यक निर्धारित करने के लिए । आमतौर पर Mv1Lu या HaCaT कोशिकाओं के लिए, 2-3 x 106 या 2.5-4 x 106 कोशिकाओं/10 सेमी-व्यास प्लेट, क्रमशः, वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । छोटी पट्टियों के लिए, कक्ष संख्याओं को स्केल किया जाना चाहिए ।
    3. के बाद कोशिकाओं संगम तक पहुँचने, सीरम पूरक मध्यम निकालें और ताजा सीरम मुक्त माध्यम से प्रतिस्थापित. कोशिकाओं को सीरम मुक्त माध्यम में 24 ज के लिए रखें कृत्रिम घाव से पहले किया जाता है ।
      नोट: Mv1Lu या HaCaT कोशिकाओं विशेष सब्सट्रेट आवश्यकताओं नहीं है; हालांकि, कोशिका लाइनों के लिए सहज सीरम मुक्त स्थितियों में अलग करने की संभावना है, एक पाली-एल-lysine समाधान का उपयोग कर संस्कृति की सतह के पूर्व कोटिंग10माना जाना चाहिए ।
  2. Monolayer जख्मी
    1. बाँझ चिमटी का प्रयोग, धीरे ताजा सीरम मुक्त माध्यम से युक्त एक साफ 10 सेमी प्लेट के लिए एक coverslip ले जाएँ. coverslip को चिमटी के साथ परिधि में धारण करने से monolayer को नुकसान होने से बचें । अत्यधिक दबाव है कि coverslip टूटना में परिणाम सकता से बचें ।
    2. coverslips के केंद्र पर एक अनुप्रस्थ लाइन में एक निष्फल उस्तरा ब्लेड खींचकर कृत्रिम घाव बनाएं । खींचें 3-4 mm वापस और आगे, ताकि पूरी तरह से केंद्रीय monolayer पट्टी को दूर करने के लिए । सुनिश्चित करें कि कोई सेल मलबे घायल किनारों से जुड़ा रहता है ।
      नोट: एक 12 मिमी व्यास दौर coverslip पर, चीरा coverslip के मध्य में किया जाता है. करने के लिए मुख्य सामने काफी बड़े विपरीत कोशिकाओं की एक लकीर छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि निंनलिखित चरणों में coverslip के झुकाव से बचने के लिए (कम से 2 मिमी चौड़ा) ।
    3. स्थानांतरण coverslips अप का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ, एक साफ 6 अच्छी तरह से युक्त थाली के लिए कम से 2 मिलीलीटर ताजा सीरम मुक्त मध्यम । 4 जख्मी coverslips को फिट/
    4. धीरे दो बार ताजा सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग कर अलग कोशिकाओं को हटाने धो लो ।
  3. प्रयोगात्मक प्रक्रिया और नमूना
    1. धीरे से ताजा माध्यम है कि चयनित उपचार शामिल कुओं में मध्यम विनिमय ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, रसायनों या यौगिकों कि संस्कृति मध्यम सजातीयता परेशान नहीं करते के लिए, उपचार संस्कृति माध्यम में सीधे inoculated जा सकता है । किसी भी संभावित कोशिका टुकड़ी से बचने के लिए सावधानी के साथ आगे बढ़ें ।
    2. वांछित प्रयोगात्मक समय के लिए एक सेल मशीन (३७ ° c, 5% CO2) के अंदर थाली रखें ।
    3. कक्षों को ठीक करके कक्ष माइग्रेशन रोकें; धीरे पंजाबियों में 4% formalin के 1 मिलीलीटर के साथ प्रयोगात्मक संस्कृति के माध्यम की जगह । आरटी पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के लिए, संस्कृति प्लेट से नमूनों को हटाने और अन्य, चल रही प्रयोगात्मक स्थितियों को प्रभावित formalin धुएं से बचने के लिए एक अलग थाली में उन्हें ठीक.
    4. अतिरिक्त formalin को निकालने के लिए कक्षों को धोएं; धीरे ताजा पंजाबियों के साथ कुओं में समाधान की जगह । दो बार दोहराएं ।
      नोट: इस स्तर पर, सील करने के बाद, प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) और टोपोलॉजिकल विश्लेषण
    1. प्रदर्शन यदि धुंधला और व्यक्तिगत coverslips पर इमेजिंग के रूप में कहीं और3,4,11वर्णित है ।
      1. Permeabilize में coverslips विसर्जित करके 10 मिनट के लिए ०.३% ट्राइटन X-१०० के समाधान में पंजाब ।
      2. 30 मिनट के लिए ब्लॉक निंन अवरुद्ध समाधान का उपयोग: ०.३% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन; 10% भ्रूण गोजातीय सीरम; ५% स्किम मिल्क; ०.३% ट्राइटन X-१०० पंजाब में समाधान ।
        नोट: दूध के बिना समाधान अवरुद्ध अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
      3. दूध मुक्त अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ, एक नम कक्ष के अंदर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन । उचित वितरण सुनिश्चित करने के लिए 15 µ l एंटीबॉडी समाधान में coverslips उल्टा-नीचे रखें ।
        नोट: एंटीबॉडी काम कमजोर पड़ने चर रहा है और उपयोग में एंटीबॉडी पर निर्भर करेगा । उदाहरण के लिए, खरगोश विरोधी सी-जून एंटीबॉडी एक 1/100 कमजोर पड़ने की आवश्यकता है ।
      4. coverslips में एक ०.१% ट्राइटन एक्स में डूबा द्वारा तीन बार धो-१०० पंजाब में समाधान ।
      5. 30 मिनट के लिए दूध मुक्त अवरुद्ध बफर में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी में coverslips की मशीन ।
        नोट: एंटीबॉडी काम कमजोर पड़ने चर रहा है और उपयोग में एंटीबॉडी पर निर्भर करेगा । उदाहरण के लिए, बकरी-विरोधी खरगोश (४८८) इष्टतम संकल्प के लिए एक 1/400 कमजोर पड़ने की आवश्यकता है । ऐसे phalloidin और Hoechst-३३२५८ के रूप में अंय लेबलिंग एजेंट इस स्तर पर मशीन बफर को जोड़ा जा सकता है ।
      6. पंजाब में ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० समाधान में coverslips की सूई से तीन बार धो लें ।
      7. माउंट coverslips उल्टा एक 10 µ एल बढ़ते मीडिया ड्रॉप (जैसे, Vectashield) एक खुर्दबीन स्लाइड पर रखा में नीचे । बढ़ते मध्यम सख्त के लिए रात भर कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्लाइड छोड़ दें । बाद में, अंधेरे में अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    2. या तो epifluorescence या केंद्र संरचनात्मक परिवर्तन के सामने बढ़त पर होने वाली सूक्ष्म छवियों को प्राप्त करें ।
      नोट: टोपोलॉजिकल अध्ययनों से छत चित्रों द्वारा भीतरी monolayer के सामने माइग्रेट किया जा सकता है । अर्द्ध मात्रात्मक अध्ययन स्थानीय प्रतिदीप्ति तीव्रता पर सॉफ्टवेयर आधारित विश्लेषण द्वारा संभव हो रहे हैं ।

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Representative Results

मात्रात्मक अध्ययन के लिए कृत्रिम घाव खरोंच परख: एपिडर्मल वृद्धि फैक्टर का आकलन (EGF) माइग्रेशन का प्रचार:

EGF उपकला कोशिकाओं प्रसार और प्रवास के एक प्रसिद्ध उत्प्रेरण है, और इस प्रकार प्रवास पदोंनति को बढ़ाता है के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण । Mv1Lu और HaCaT कोशिका monolayers घाव खरोंच परख और पूर्व उपचार चित्रों में इस्तेमाल किया गया प्राप्त थे । 10 एनजी/एमएल EGF के साथ टीका के बाद, कोशिकाओं निर्धारण और बाद उपचार चित्रों से पहले 19 ज के लिए मशीन थे । प्रसार सीरम भुखमरी की स्थिति को बनाए रखने के द्वारा एक ंयूनतम करने के लिए रखा गया था । दोनों पूर्व और चित्रों के बाद उपचार सेट ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और केंद्रीय अंतर क्षेत्रों का निर्धारण किया गया । प्रयोग नकल में चला गया था, एक अच्छी तरह के लिए चार माप दर्ज की गई । निरपेक्ष प्रवास के ठहराव की गणना सतहों के अंतर के रूप में की गई थी: (PREGAP − POSTGAP) । उत्तेजित Mv1Lu कोशिकाओं (चित्र 1a) की तुलना में उत्तेजित HaCaT कोशिकाओं (आंकड़ा 1b) में अधिक प्रवासी क्षमता थी । मतभेद कोशिका स्रोतों द्वारा समझाया, म्यूकोसा उपकला कोशिकाओं और त्वचा keratinocytes, क्रमशः किया जा रहा है ।

कृत्रिम प्रवासन स्थलाकृतिक अध्ययन के लिए सामने परख: Cytoskeletal अनुरूपता और सी के स्थानिक अभिव्यक्ति में बदलाव-जून:

सेल प्रवास cytoskeleton संरचना के निरंतर और गहरे परिवर्तन शामिल है ताकि सेल विस्थापन को बनाए रखने के लिए । HaCaT सेल monolayers नियंत्रण और उत्तेजना शर्तों के तहत प्रवास के सामने परख में इस्तेमाल किया गया । EGF के साथ उपचार potentiates cytoskeletal गतिशीलता, जो अगर और लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है (LSM; चित्र 2a) । EGF ट्रीटमेंट में भी दमदार Mitogen-एक्टिवेट प्रोटीन (MAP) kinases सिगनलिंग और सी-जून का एक् सप्रेस का परिणाम है । छत LSM छवियों स्थानिक पैटर्न के विंयास के लिए अनुमति देता है । सी की वृद्धि की अभिव्यक्ति-जून पलायन सामने से सटे कोशिकाओं पर आसानी से सॉफ्टवेयर छवि विश्लेषण से पता चला जा सकता है; यहां, हम ग्रीन चैनल के लिए एक इंद्रधनुष पैमाने पर लागू किया है, जो सी के अनुरूप-जून लेबलिंग (चित्र b) ।

Figure 1
चित्र 1. Mv1Lu और HaCaT कक्षों में EGF द्वारा प्रवास का संवर्धन. Mv1Lu (ए) और HaCaT (बी) कोशिकाओं के घायल क्षेत्र के विपरीत सूक्ष्म चित्र चरण नियंत्रण शर्तों के तहत लिया गया था और 10 एनजी/एमएल EGF के साथ 19 एच के लिए सीरम मुक्त परिस्थितियों में इलाज किया कोशिकाओं की छवियों की तुलना में । प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ एक 20 µ एल micropipette टिप के साथ घाव के बाद प्राप्त खरोंच गैप और बंद करने की हद तक दिखा । आवर्धन = 10x; स्केल बार = १०० µm. सेल प्रवासन मात्रा और प्रत्येक परख (मनमाना इकाइयों के लिए उपचार और नियंत्रण के नमूनों के बीच क्षेत्र मतभेदों के रूपांतर के रूप में प्रतिनिधित्व किया गया; AU) । भूखंड प्रत्येक शर्त के लिए आठ स्वतंत्र माप के प्रतिनिधि है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. Actin रेशा और सी-जून अभिव्यक्ति परिवर्तन HaCaT कक्षों में माइग्रेट करने में EGF द्वारा संवर्धित । (A) रातोंरात 10 एनजी/एमएल EGF उपचार HaCaT कोशिकाओं पलायन में actin रेशा के अनुरूप में गहरा परिवर्तन को बढ़ावा देता है । माइग्रेशन के सामने नियंत्रण शर्तों के कक्ष एक कसकर संरचित actin रेशा cytoskeleton चित्रित करते हैं, जबकि कक्ष EGF के साथ व्यवहार किया जाता है जो माइग्रेशन के सामने गरीब actin रेशा संगठन दिखाते हैं । आवर्धन = 63x; स्केल बार = 20 µm. F-Actin रंग कोडित लाल है, और Hoechst एक नीला रंग द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । (ख) जब bliss-प्रतिदीप्ति LSM इमेजिंग के साथ संयोजन में प्रयोग किया जाता है सी-जून अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए 10 एनजी/एमएल EGF उपचार के बाद HaCaT कोशिकाओं पर पलायन, छत रचनाओं स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न प्रकट करते हैं । सी की छवियां-जून प्रतिदीप्ति (ग्रीन) छद्म रंग में परिवर्तित करने के लिए सी की तीव्रता-जून धुंधला दिखा रहे थे । रंग इंद्रधनुष स्केल सी के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता जून का प्रतिनिधित्व करता है, EGF और नियंत्रण के लिए सही पैनलों पर colormaps के लिए इसी । phalloidin (लाल) और Hoechst-३३२५८ (नीला) के साथ सह-दाग क्रमशः कोशिका संरचना और नाभिक दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्र एक फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा उठाए गए थे । पलायन सामने के निकट क्षेत्रों में परमाणु सी-जून के बढ़ते अभिव्यक्ति स्तर पर ध्यान दें । स्केल बार = ४० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

त्वचा या श्लेष्मा झिल्ली व्यवधान पर, बैरियर समारोह fibroblasts या उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित कई कोशिका प्रकार, की क्रियाओं द्वारा बहाल किया जाता है. संयुक्त रूप से, इन कोशिकाओं को एक जटिल apoptosis शामिल प्रक्रिया से गुजरना, प्रसार, भेदभाव, और महत्वपूर्ण बात, fibroblast और उपकला कोशिका प्रवास, जो अंतिम तंत्र बाधित ऊतक की बहाली के लिए जिम्मेदार है और सतही उपकला अंतर को बंद करने1,12 इस प्रकार, सेल माइग्रेशन का अध्ययन ठीक उपकला कोशिकाओं के शारीरिक व्यवहार का वर्णन करने में मदद करता है, जबकि भी घाव के लिए उपचार की modulatory क्षमता का निर्धारण चिकित्सा.

विभिन्न अनुसंधान पशु मॉडल पर कृत्रिम घावों प्रदर्शन के पास शारीरिक स्थितियों में इस जटिल प्रक्रिया की प्रतिकृति के लिए अनुमति देता है2, और इस प्रकार कुछ रोग की स्थिति या दवा के प्रभाव का आकलन 13उपचार । हालांकि, इस दृष्टिकोण अक्सर महंगा और जटिल रसद में परिणाम, साथ ही साथ भारी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं है कि एक देरी फैशन में डेटा उत्पन्न कर सकते हैं13. इसके विपरीत, इन विट्रो में कोशिका संस्कृति घाव भरने की प्रक्रिया में शामिल कोशिकाओं के व्यवहार पर शोध करने के लिए एक अधिक सुविधाजनक ढांचा प्रदान करता है । जबकि उपकला कोशिकाओं के प्राथमिक सेल संस्कृति एक व्यवहार्य विकल्प का गठन, यह प्राप्त करने के लिए और कोशिकाओं को संभालना मुश्किल हो सकता है, जो डेटा संग्रह जटिल कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, प्राथमिक संस्कृतियों के ठेठ कम बीतने के प्रतिबंध के अलावा, प्राथमिक मानव keratinocytes इन विट्रो3में वृद्धि के लिए एक fibroblast खिला परत की जरूरत है । इसके विपरीत, अच्छी तरह से Mv1Lu या HaCaT की तरह उपकला कोशिका संस्कृति लाइनों, की स्थापना की, एक बाधा मुक्त अनुसंधान मॉडल है कि सुविधाओं व्यवहार और प्राथमिक संस्कृति कोशिकाओं में उन लोगों की तरह विशेषताओं का गठन3,4, 14,15. संक्षेप में, घाव भरने के अध्ययन के लिए, इन दो सेल लाइनों की अपनी क्षमता में महत्वपूर्ण लक्षण बनाए रखने के लिए विस्थापित और सेल के कारण प्रसार बंद16,17पर सेल संपर्क निषेध ।

स्क्रैच परख विभिंन प्रकार के कोशिकाएं, विशेष रूप से उपकला और कैंसर कोशिकाओं की प्रवासी क्षमताओं को बढ़ाता है के लिए एक विश्वसनीय और बहुमुखी विधि हैं । कैंसर कोशिकाओं के मामले के लिए, खरोंच विधि इनवेसिव क्षमता के आकलन के लिए प्रस्तावित किया गया है । हालांकि, इस दृष्टिकोण इनवेसिव के लिए एक संकेतक के रूप में कम हो जाता है जब अधिक विशिष्ट extracellular मैट्रिक्स18,19मर्मज्ञ के लिए आवश्यक metalloproteases की अभिव्यक्ति पर निर्भर तरीकों की तुलना में । इसके विपरीत, खरोंच परख उपकला कोशिकाओं के प्रवासी प्रदर्शन और इस विशेषता पर विभिन्न उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए विश्वसनीय हैं । कैंसर कोशिकाओं लाइनों, जो अक्सर गरीब सामंजस्य और कई परतों, Mv1Lu, HaCaT, और अंय उपकला कोशिका लाइनों पर बढ़ने की क्षमता दिखाने के विपरीत में कसकर जुड़े "विकास द्वीप", जो दोनों के आधार पर एक प्रक्रिया में उनके मार्जिन का विस्तार के रूप में प्रसार, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात सेल प्रवास पर । फलस्वरूप, विरल या उप-धाराप्रवाह कोशिका घनत्व की स्थितियां पारंपरिक रूप से प्रवासी फिजियोलॉजी पर विभिन्न उपचार के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है; खासकर जब बाद आणविक जीव विज्ञान तकनीक लागू कर रहे हैं, इस सेल वातावरण के रूप में सक्रिय रूप से पलायन कोशिकाओं के अनुपात को अधिकतम करते हुए संपर्क संकोच को कम करता है । हालांकि, उपकला कोशिकाओं के लिए, गैर-धाराप्रवाह शर्तों epigenetic विनियमन के रूप में उदाहरण के लिए, महत्वपूर्ण पूर्व मौजूदा संपर्क अवरोध प्रभाव को छोड़कर के जोखिम मुद्रा. इस प्रकार, घाव भरने का अध्ययन करने के लिए, धाराप्रवाह शर्तों मॉडल की वृद्धि की निष्ठा प्रदान ।

सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए, उपकला कोशिका परत की रचना को प्रभावित करने वाले सहवर्ती कारकों या माइग्रेशन में योगदान करने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए । जबकि संगम वांछित है, यह अत्यधिक कोशिका घनत्व या multilayered संस्कृतियों से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि इन शर्तों नकारात्मक प्रभावित हो सकता है । इसलिए, आमतौर पर प्रसार सीरम मुक्त मीडिया में भुखमरी द्वारा या मीतोमयसीं सी है, जो डीएनए crosslinking3,20द्वारा सेल प्रसार की गिरफ्तारी अचल की तरह रसायनों के अलावा द्वारा नियंत्रित किया जाता है, 21. एक या दूसरे का उपयोग विशिष्ट कोशिका रेखाओं के व्यवहार पर निर्भर करता है; मीतोमयसीं सी विशेष रूप से संकेत दिया है जब कम सीरम पूरकता भारी सेल टुकड़ी से बचने के लिए आवश्यक है । यही कारण है कि HEK-293T कोशिकाओं के लिए मामला है, जहां प्री-कोटिंग संस्कृति सतह का उपयोग कर पाली-L-lysine Mytomycin C उपचार से बचने के लिए एक अच्छा विकल्प है । भड़काऊ कारकों है कि प्रवास को बदल सकता है की रिहाई भी संबोधित किया जाना चाहिए । विभिंन रणनीतियों का इस्तेमाल किया गया है, मुख्य रूप से सिलिकॉन आवेषण पर आधारित के लिए उपकला खरोंच परख22के साथ प्राप्त की सतह के विघटन की नकल । जबकि आवेषण पहले उत्पंन मौजूदा अंतराल है कि सिलिकॉन टुकड़ा हटाने के बाद सेल प्रवास की अनुमति, खरोंच विधि उपकला monolayer में से कुछ को हटाने के लिए अंतर उत्पंन पर सीधे निर्भर करता है । कैसे अंतर उत्पन्न करने के लिए पर वरीयता संस्कृति सतह कोटिंग की रक्षा के लिए आवेषण की क्षमता पर निर्भर करता है (यानी, संस्कृति प्लेट या पाली-एल-lysine) scratching के दौरान नुकसान से, जबकि भी क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से कारकों की रिहाई को कम करने कि मई कक्ष संस्कृति व्यवहार23समझौता । हालांकि इन विशेषताओं कुछ प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए उपयोगी हो सकता है, यानी, कैंसर की कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए विस्थापित, हमारे अनुभव में हम घाव भरने के अध्ययन में आवेषण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण कमियां पाया । Mv1Lu कोशिकाओं सिलिकॉन डालने बाहरी सतह, जो अनजाने में सिलिकॉन टुकड़ों को हटाने पर कोशिका monolayer के फाड़ में परिणाम करने के लिए संलग्न करने में सक्षम हैं । इसके अलावा, हालांकि HaCaT कोशिकाओं सिलिकॉन के लिए संलग्न नहीं है, हम इन कोशिकाओं को सम्मिलित-उत्पन्न अंतराल में स्थानांतरित करने के लिए एक कम करने की क्षमता पाया. उस हद तक, सूजन और प्रवास कसकर संबद्ध प्रतिक्रियाएं हैं, और इन HaCaT कोशिकाओं में घाव भरने के संदर्भ में एक साथ महत्वपूर्ण दिखाई देते हैं । इसके अलावा, के बाद से संस्कृति की सतह scratching के लिए एक प्लास्टिक टिप लागू करने की कोशिकाओं की क्षमता पर कोई स्पष्ट परिणाम अंतर को फिर से भरना है, HaCaT कोशिकाओं के मामले में, इस तरह के व्यवहार से पता चलता है कि extracellular मैट्रिक्स अवशेष में अंतर गाइड मई प्रवास में एक प्राकृतिक घाव में dermis के रूप में एक समान फैशन ।हालांकि, भिन्नता का मुख्य स्रोत खरोंच प्रक्रिया ही रहता है, एक प्लास्टिक टिप के उपयोग के रूप में घाव बनाने के लिए हमेशा एक ही आकार अंतराल प्रदान नहीं करता है. हम विभिंन नमूनों के बीच 20% तक रूपांतरों को देखा है, दबाव और खरोंच के समय टिप की स्थिति की विसंगति के कारण । इन परिवर्तनों को एक अधिक कठोर वस्तु के साथ monolayer घायल द्वारा संबोधित किया जा सकता है; हालांकि, प्लास्टिक की सतह पर किसी भी खरोंच कोशिकाओं के मुक्त आंदोलन ख़तरे में डालना होगा । तो, प्रारंभिक खरोंच में बदलाव खाते में प्रवास की गणना करने के लिए लिया जाना चाहिए; आमतौर पर, प्रति शर्त माप की संख्या में वृद्धि करके ।

ठहराव के अलावा, यदि तकनीक गुणात्मक सेल प्रवास की आणविक प्रक्रियाओं का आकलन कर सकते है क्लासिक के साथ एक साथ घाव भरने प्रक्रियाओं लागू । coverslips पर विकसित करने के लिए उपकला कोशिकाओं की क्षमता अच्छी तरह से पता है; अतीत में, खरोंच परख के रूपांतरों अलग coverslips पर पलायन फिक्सिंग और घाव के भीतर तुलना के लिए धुंधला-खरोंच प्रयोगात्मक सेटअप24के बाद शर्तों को उजागर कोशिकाओं को शामिल किया गया । यहां, हमने पाया है कि coverslips पर बढ़ रही monolayers में व्यापक अंतराल बनाने प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम3,4,7का विस्तार करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इन प्रयोगों में, यदि प्रक्रिया का पता लगाने क्षमताओं को संभावित रूप से किसी भी सटीक सेलुलर और सेलुलर शामिल तंत्र का अध्ययन बढ़ जाती है, और यह केवल एंटीबॉडी की उपलब्धता इस तकनीक के लिए उपयुक्त द्वारा सीमित है और रुचि के कक्ष । के लिए इस्तेमाल coverslips पर नमूने यदि माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखा जाता है, जो विस्तारित संरक्षण के लिए अनुमति देते हैं । इस एड्स प्रयोगात्मक setups के आवेदन है कि लंबे समय अध्ययन की आवश्यकता होती है, "छत" दृष्टिकोण की तरह यहां और3,4,7कहीं और प्रदर्शन । जबकि "छत" रणनीति प्रवास में शामिल तंत्र के पुनर्निर्माण के लिए लौकिक डेटा के साथ स्थानिक पैटर्न को एकीकृत, सॉफ्टवेयर विश्लेषण उपकरण के कार्यांवयन अर्द्ध मात्रात्मक आकलन स्थानीय प्रतिदीप्ति के आधार पर प्रदान कर सकते है तीव्रता, और आगे की जानकारी की गुणवत्ता को समृद्ध प्राप्त की । हमारे अनुभव में, छत भी इस प्रकार की परख में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सेल की स्थिति की जानकारी का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है । यह स्थिति जानकारी को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो दिखाया गया है और बेहतर सेल प्रवास पर विभिन्न एजेंटों के प्रभाव का अनुवाद, विशेष रूप से setups में जहां उपकला कोशिकाओं की स्थिति बहुत अपने प्रवासी व्यवहार निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है3 ,4,14,15.

दोनों प्रक्रियाओं जटिल कार्यांवयन द्वारा महान सुविधा का प्रदर्शन, साथ ही साथ गुणवत्ता डेटा उत्पादन वर्णित है । इस प्रकार, इन दृष्टिकोण है कि सूक्ष्म अध्ययन पर आधारित हैं, दोनों गतिशीलता और रूपात्मक उपकला कोशिका व्यवहार और घाव भरने के दौरान उपचार के लिए प्रतिक्रिया में शामिल परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा और शक्तिशाली ढांचा प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का एलान है कि हितों का टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला के पुराने सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं जो इन तकनीकों को अपने वास्तविक राज्य में सुधार और परिष्कृत करने में मदद करते हैं: Dr. सेलिया मार्टिनेज-मोरा; डॉ. अण्णा Mrowiec, डॉ. Catalina Ruiz-Cañada आणि डॉ. Antonia Alcaraz-García. हम दृढ़ता से इन तकनीकों के विकास का समर्थन करने के लिए अस्पताल Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca के लिए ऋणी हैं । इसके अलावा Instituto डी सैलड कार्लोस III, Fondo डी Investigaciones Sanitarias । योजना Estatal i + मृ + i और Instituto de सैलड कार्लोस III-Subdirección जनरल डे Evaluación y फोमेंटो de la Investigación (अनुदान सं.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos फेडर "ऊना मनेरा डे hacer यूरोपा". हम भी Universidad de मर्सिया, IMIB-Arrixaca और प्रशासनिक सहायता और सहायता के लिए FFIS धंयवाद । अंत में, हम Dr. इसाबेल मार्टिनेज-Argudo और Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, कैंपस Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla ला माँचा, Toledo में अपनी तरह के समर्थन के लिए के लिए एक विशेष धंयवाद देना चाहता हूं जैव चिकित्सा और बायोटेक्नोलॉजी प्रयोगशाला संभव बनाने के लिए इस अखबार का हिस्सा फिल्माया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Biowest, Nuaillé, France L0102-500 Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) Lonza BE12 -662F Optional 10 % FBS supplement
L-Glutamine Lonza BE17-605E Use at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA DE17603A
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA T4049 Dilute as appropriate
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) Gibco by Life Technologies 14200-067 Dilute to 1x
24-well culture plates BD FALCON//SARSTED 734-0020
6-well culture plates SARSTEDT 83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA E9644 Used 10 ng/mL
Round cover glass MENZEL-GLÄSER MENZCB00120RA020 SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743 Martor (through VWR) MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tips VWR 732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tips VWR 732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscope Motic Spain Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscope ZEISS Microimaging, Germany LSM 510 META
10 cm Culture dish BD FALCON 353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody Santa Cruz Biotechnology sc-1694 Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 Invitrogen A11008 Used 1:400
Hoechst-33258 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA 14530 Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) Invitrogen A12381 Used 1:100
Bovine Serum Albumin Santa Cruz Biotechnology SC-2323
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA T9284
Skim milk BD DIFCO 232100
ImageJ National Institutes of Health, USA Release 1.50i
Zen LSM 510 image processing software ZEISS Microimaging, Germany Release 5.0 SP 1.1

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References

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चिकित्सा समस्या १३१ कृत्रिम घाव घाव बंद उपकला कोशिका monolayer सेल प्रवासन आकृति विज्ञान keratinocytes
इन <em>विट्रो</em> घाव हीलिंग के दौरान उपकला कोशिका प्रवास के आकलन के लिए सूक्ष्म आधारित तरीकों
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Liarte, S.,… More

Liarte, S., Bernabé-García, Á., Armero-Barranco, D., Nicolás, F. J. Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing. J. Vis. Exp. (131), e56799, doi:10.3791/56799 (2018).

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