Summary
والهدف من هذا البروتوكول لقياس تأثير التغييرات الجلوكوز بوساطة للتنفس المتقدرية حضور المركبات الطبيعية في خلايا بيتا سليمة 832/13 باستخدام ريسبيروميتري ذات الدقة العالية.
Abstract
يسمح ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا المعزولة، والخلايا والأنسجة. خلايا بيتا تلعب دوراً حاسما في الجسم عن طريق ضبط مستويات السكر في الدم عن طريق إفراز الأنسولين استجابة لتركيزات مرتفعة من الجلوكوز. يتم التحكم في إفراز الأنسولين الجلوكوز الأيض والتنفس المتقدرية. ولذلك، قياس التنفس سليمة من خلايا بيتا ضروري لتكون قادرة على تحسين وظيفة خلايا بيتا كعلاج لمرض السكري. استخدام وظائف سليمة 832/13-1 اشتقاق خلايا بيتا يمكن أن نقيس تأثير على زيادة تركيز الجلوكوز في التنفس الخلوي. هذا البروتوكول يسمح لنا بقياس التنفس خلية بيتا في وجود أو عدم وجود مركبات مختلفة، مما يسمح أحد تحديد الأثر نظراً للمركبات في التنفس خلية سليمة. هنا علينا أن نظهر تأثير المركبين طبيعيا وأحادي يبيكاتيشين الكركمين، على التنفس خلية بيتا تحت الوجود منخفض (2.5 مم) أو ظروف ارتفاع الجلوكوز (16.7 مم). يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد تأثير المركبات المختلفة على تنفس خلايا بيتا سليمة وجود تركيزات الجلوكوز متباينة.
Introduction
الغرض الأساسي لخلايا بيتا البنكرياس للحفاظ على نظام نورموجليسيميا عن طريق إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز. خلايا بيتا بمعنى التغييرات الفسيولوجية في تعميم الجلوكوز إلى حد كبير نظراً لتقارب منخفضة، عالية السعة الجلوكوز الناقل GLUT2 (الجلوكوز الناقل 2، كم 16.7 ملم)1. مع ارتفاع مستويات السكر الدورة الدموية، يسهل هذا الناقل تقارب منخفضة السعة العالية زيادة تناسبية في الجلوكوز داخل الخلية داخل الخلية بيتا. يتم استقلاب الجلوكوز عن طريق تحلل، ودورة TCA (دورة حمض تريكاربوكسيليك) والتنفس المتقدرية أسفر عن ارتفاع مستويات ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) الخلوية. أن تركيز ATP مرتفعة كتل قنوات ك+ الحساسة ATP، أسفر عن غشاء ديبولاريزيشن. Depolarization الغشاء يسبب فتح بوابات الجهد Ca2 + قنوات والإصدار التالي من حويصلة منضم الأنسولين حبيبات2. الخلل في خلايا بيتا هي السمة مميزة لمرض السكري من النوع 2 (T2D)، ويؤدي إلى إفراز الأنسولين انخفاض وضعف الرقابة، وفي نهاية المطاف موت الخلية بيتا3. يمكن استخدام آليات للمحافظة على أو تحسين وظيفة خلايا بيتا كعلاج ل T2D.
وقد أثبتت الدراسات الآثار المفيدة لتحدث بشكل طبيعي المركبات النباتية في البنكرياس من خلايا بيتا4. قد تكون هذه المركبات تأثيرها من خلال تزايد انتشار الخلايا بيتا، والبقاء على قيد الحياة، أو إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز. على سبيل مثال، أظهرت الدراسات الأخيرة أن يبيكاتيشين أحادي يعزز إفراز الجلوكوز-وحفز الأنسولين من خلال زيادة التنفس المتقدرية وزيادة ATP الخلوية المستويات5. ولذلك، فهم كيف يمكن زيادة هذه المركبات الوظيفية بيتا خلية الإعلام مهم للاستفادة من هذه المركبات كالمداواة المحتملة.
ويمكن قياس التنفس الخلوي من خلال عدد من الأدوات. يسمح استخدام ريسبيروميتير عالية الدقة لمعايرة المغيرون الكيميائية إلى سكان خلية سليمة أو بيرميبيليزيد6. تسمح هذه الأداة إضافة المركبات المختلفة، بتركيزات مختلفة، وبالتالي إعطاء مجموعة واسعة من المعلومات.
ونظرا للعلاقة الحميمة بين الجلوكوز الأيض ووظيفة خلايا بيتا، قياسات التنفس الخلوي الحاسمة. يمكن أن يتم قياس التنفس الخلوي باستخدام خلايا بيتا أما بيرميبيليزيد أو سليمة، مع كل منها مجموعتها الخاصة من مزايا وعيوب7،8. بينما بيرميبيليزيشن خلايا بيتا يسمح أحد لقياس الجوانب المختلفة من سلسلة نقل الإلكترون، يفعل ذلك دون ما يخص إليه لحفز التنفس في الخلية بيتا وامتصاص السكر والايض. ولذلك، استخدام التنفس خلايا بيتا أونبيرميبيليزيد تقنية مفيدة جداً لتحديد استجابة خلايا بيتا لمختلف مستويات السكر، استخدام استهلاك الأوكسجين قراءات.
والغرض من هذا الأسلوب لقياس استهلاك الأوكسجين في وظائف سليمة-1 اشتقاق خلايا بيتا 832/13. هذا الأسلوب يسمح لنا بتحديد استجابة خلايا بيتا لظروف الجلوكوز أونستيمولاتوري (2.5 ملم الجلوكوز) فضلا عن ظروف الجلوكوز تنشيطية (الجلوكوز 16.7 مم). بينما الخلايا أونبيرميبيليزيد لا تسمح لنا لاختبار فردي المجمع الأول أو الثاني أو الثالث من الإلكترون النقل سلسلة، التقنية تسمح مقاييس التعامل مع التنفس تثبيط (أوليجوميسين A)، فصل الرابع معقدة (فككب-الكربونيل السيانيد- 4-فينيلهيدرازوني (تريفلوروميثوكسي))، وتعوق التنفس (أنتيميسين A) تماما. وتوضح هذه الدراسة الكفاءة لقياس التنفس في خلايا بيتا البنكرياس أونبيرميبيليزيد سليمة، فضلا عن تأثير المركبين طبيعيا وأحادي يبيكاتيشين الكركمين، على التنفس خلايا بيتا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-خلية ثقافة
- تستمد الثقافة وظائف-1 832/13 خلايا بيتا في 1640 RPMI تستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 1% البنسلين-ستربتوميسين، 10 مم هيبيس، 2 مم الجلوتامين 1 مم "بيروفات صوديوم" و 0.05 ملم 2-mercaptoethanol9،10،11 ،،من1213.
- إزالة خلايا 832/13 من قارورة T75 استخدام 2 مل من 0.25% التربسين، تفرخ في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تحييد التربسين بإضافة 8 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 كاملة.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع 100 ميليلتر من حجم الخلية من الخطوة 1، 2 في 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- كذلك طبق خلايا لوحة 832/13 في كثافة 2 × 106 خلايا/مل في 6.
- ثقافة الخلايا ح 48 في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية و 5% CO2 قبل بدء تجارب التنفس.
2-إعداد الخلايا ريسبيروميتري عالية الدقة
-
علاج الخلايا 832/13 مع مونومر يبيكاتيشين المشتقة الكاكاو.
- ثقافة الخلايا 832/13 عن 24 ساعة بعد الطلاء في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
- تغيير الوسائط ح 24 بعد الطلاء، وعلاج الخلايا 832/13 مع التحكم بالسيارة (3 الآبار) أو 100 نانومتر الكاكاو مونومر (3 الآبار)، تليها الثقافة لإضافية ح 24 (المجموع 48 ح) في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
- يغسل خلايا 832/13 في 1 × منخفضة الجلوكوز إفراز الإنزيم المخزن المؤقت (SAB) للمخزن المؤقت أسبيراتي 5 كحد أدنى، واحتضان خلايا 832/13 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب ح 3، تغيير 1 × الجلوكوز منخفضة صاب كل ساعة.
- جعل 10 x SAB مع 33.32 ز من كلوريد الصوديوم، ز 1.73 من بوكل، 0.82 ز خ2ص4، ز 0.7 مجسو4 وإضافة وحدة تخزين نهائي من 500 مل ح2س. تصفية العقيمة بالحل النهائي.
- جعل 1 × الجلوكوز منخفضة صاب مع 10 مل 10 × صاب، 100 ميليلتر من السكر بنسبة 45%، 2 مل 1 م حبيس، 1 مل من 0.25 م كاكل2، مل 0.57 من 35% حل جيش صرب البوسنة، ز 0.21 ناكو3 وإضافة ح2س إلى وحدة تخزين نهائي من 100 مل. تصفية العقيمة بالحل النهائي.
-
علاج الخلايا 832/13 مع الكركمين.
- ثقافة الخلايا 832/13 عن 48 ساعة بعد الطلاء في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
- يغسل خلايا 832/13 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب المخزن المؤقت أسبيراتي 5 كحد أدنى، واحتضان خلايا 832/13 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب ح 3، تغيير 1 × الجلوكوز منخفضة صاب كل ساعة.
- بعد 2.5 ح الاحتضان ح 3 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب، نضح المخزن المؤقت واحتضان خلايا في 1 x "صاب الجلوكوز منخفضة" مع التحكم بالسيارة أو 40 ميكرومتر الكركمين لمدة 30 دقيقة. وبعد الحضانة، نضح المخزن المؤقت.
-
حصاد الخلايا مع التربسين ريسبيروميتري عالية الدقة
- وبعد تفريخ ح 3 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب، إزالة الخلايا من اللوحة مع 250 ميليلتر من التربسين 0.25% من كل بئر.
- دمج الخلايا في التربسين من 3 آبار تعامل مع التحكم بالسيارة أو مجمع للفائدة مع 4 مل الديوان في أنبوب مخروطي 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع 100 ميليلتر من حجم الخلية من الخطوة 2.3.2 في 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- إضعاف العدد المناسب من الخلايا في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب جعل 3 مل بتركيز مناسب لكل دائرة. البيانات يوضح أن بتركيز 1 × 106 خلايا/مل هو الأكثر فعالية.
-
حصاد الخلايا مع تفكك ميكانيكية ريسبيروميتري عالية الدقة
- بعد الاحتضان ح 3 في 1 x إضافة الجلوكوز منخفضة الديوان، 1 مل من 1 x "صاب الجلوكوز منخفضة" لكل جيدا لطف ضربة الخلايا خارج اللوحة مع تفكك الميكانيكية التي بيبيتينج مع تلميح ماصة 1000 ميليلتر.
- دمج الخلايا من 3 آبار تعامل مع التحكم بالسيارة أو المركبة من اهتمام بما مجموعة 3 مل صاب في أنبوب مخروطي 15 مل للتنفس.
3-عالية الدقة ريسبيروميتري
- إعداد ريسبيروميتير عالية الدقة.
- قم بتشغيل ريسبيروميتير عالية الدقة، والاتصال بسطح المكتب بإطلاق برنامج التحليل ريسبيروميتير.
- نضح الإيثانول 70% من كلا المجلسين. امتصاص هذه الدوائر في الإيثانول 70% على الأقل من 45 دقيقة.
- أغسل دوائر المحكمة مرتين مع الإيثانول 70 ٪، يسفط بعد كل خطوة.
- أغسل دوائر ثلاث مرات مع ddH2س، يسفط بعد كل خطوة.
- أشطف بلونجيرس الدائرة في ddH2o. وهذا ينظف قبالة الإيثانول المتبقي من بلونجيرس ومن ميناء التيتانيوم.
- معايرة أجهزة الاستشعار الأوكسجين بولاروجرافيك.
- إضافة 2.4 مل 1 × العازلة "صاب الجلوكوز منخفضة" لكل دائرة أوكسيجراف، إثارة المخزن المؤقت بشكل مستمر باستخدام أشرطة مغناطيسية ضجة في قاعة في 750 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية مع فاصل زمني لتسجيل البيانات في 2.0 s من خلال الضغط على الزر F7 وفتح علامة التبويب المسمى "نظم". دفع بلونجيرس في كل وسيلة، وثم سحب إلى الإعداد تهوية وجع. السماح للجهاز حجته للحد أدنى من 1 ساعة حتى يتم الحصول على تدفق الأكسجين مستقرة.
- تعيين الجهاز في 37 درجة مئوية لمدة التجربة. تعيين الجهد الاستقطاب إلى 800 mV، مع ربح 2 بالضغط على الزر F7 وفتح علامة التبويب المسمى "الأكسجين، O2". حجته أن تركيز الأكسجين صاب المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة على الأقل، بينما التغيير في تركيز الأكسجين مستقر (أقل من 2 pmol/(s*mL)).
- وبعد استقرار تركيز الأكسجين، حدد منطقة مستقرة إنشاء خلفية قياس التغيير في تركيز الأكسجين فيه تغيير تركيز الأكسجين.
- تحديد منطقة التي تضغط على المفتاح shift، وغادر النقر على الماوس وسحب الماوس عبر المنطقة المحددة. انقر فوق الرسالة المرتبطة بالمنطقة المحددة والتغيير إلى "R1" لتتبع كل، تقابل مع كل من المجلسين.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق مربع "س2 المعايرة" في أسفل اليسار واليمين زوايا الشاشة، انقر فوق الزر "تحديد علامة" "معايرة الهواء" ك R1 وثم حدد "نسخ إلى الحافظة ومعايرة" لكلا المجلسين.
- إعداد تقييم تنفس خلايا بيتا 832/13 في الخطوات 2.1.5 أو 2.2.5.
- تحميل 2.4 مل عينة في كل غرفة (غرفة واحدة مع مراقبة المركبات تعامل الخلايا، غرفة واحدة مع الخلايا المعالجة المركبة) في الديوان الجلوكوز منخفضة 1 x تحتفظ 0.5 مل عينة خلية للبروتين كوانتيتيشن بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي (حمض بيسينتشونينيك) في حالة استخدام نهج الانفصال الميكانيكية (التجميد في-20 درجة مئوية للقياس في وقت لاحق).
- دفع المكبس بكل وسيلة ونضح حجم المتبقية. تحريك الخلايا باستمرار خلال التجربة في 750 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لكل الخطوات اللاحقة. جعل علامة بالنقر فوق F4 ووصفت بأنها "خلايا" عندما يتم تحميل عينات.
- قياس عينات لمدة 30 دقيقة. بعد استقرار إشارة، حدد منطقة التغيير في تركيز الأكسجين المقابلة لظروف الجلوكوز منخفضة (الجلوكوز 2.5 ملم) كما هو موضح في 3.2.3.
- بعد التوصل إلى استقرار إشارة، إضافة ميليلتر 12.5 حل 45% جلوكوز معقمة (16.7 مم تركيز النهائية) في كل دائرة من خلال التيتانيوم تحميل المنفذ باستخدام المحاقن. جعل علامة قياس "الجلوكوز" كما وصفت في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. حدد هذه المنطقة من التغيير في تركيز الأكسجين، كما هو موضح في 3.2.3. هذا هو قراءة جلوكوز 16.7 ملم، ويتوافق مع شروط محفزة7.
- بعد أن يتم التوصل إلى استقرار إشارة إضافة 1 ميليلتر من أوليجوميسين 5 مم (2.5 ميكرون نهائي تركيز) في كل دائرة من خلال ميناء التحميل. جعل علامة قياس "أولجا" كما وصفت في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. تحديد مجال هذا المنحنى كما هو موضح في 3.2.3. A أوليجوميسين يمنع ATP synthase وبالتالي حدوث تدفق الأوكسجين فقط عبر تسرب الإلكترونات وليس الفسفرة7.
- بعد أن يتم التوصل إلى استقرار إشارة إضافة 1 مم فككب بزيادات 1 ميليلتر حتى يثبت بمعدل تنفس كحد أقصى. ويمثل هذا التنفس أونكوبليد القصوى. بين 3-4 ميليلتر فككب كافية (1.5-2.0 ميكرون النهائي تركيز) للحث على التنفس أونكوبليد القصوى للخلايا الإضافية-1 832/13. جعل علامة المسمى "فككب" كما هو موضح في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. تحديد مجال هذا المنحنى كما هو موضح في 3.2.3. فككب عامل يفصل. وهذا يسمح لنا لقياس التنفس أونكوبليد7.
- بعد أن يتم التوصل إلى استقرار إشارة إضافة 1 ميليلتر من 5 مم أنتيميسين A (تركيز النهائي 2.5 ميكرومتر) في كل دائرة من خلال ميناء التحميل. جعل علامة المسمى "AntiA" كما هو موضح في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. تحديد مجال هذا المنحنى كما هو موضح في 3.2.3.
ملاحظة: A أنتيميسين يربط ريدكتيز السيتوكروم ج، ويحول دون أكسدة ubiquinone وكتل تنفس جميع. وهذا يسمح لنا التوقف تماما عن التنفس7.
- تحميل 2.4 مل عينة في كل غرفة (غرفة واحدة مع مراقبة المركبات تعامل الخلايا، غرفة واحدة مع الخلايا المعالجة المركبة) في الديوان الجلوكوز منخفضة 1 x تحتفظ 0.5 مل عينة خلية للبروتين كوانتيتيشن بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي (حمض بيسينتشونينيك) في حالة استخدام نهج الانفصال الميكانيكية (التجميد في-20 درجة مئوية للقياس في وقت لاحق).
- قياس خلايا بيتا 832/13 لتطبيع البروتين التركيز والتنفس.
- استخدام 0.5 مل من الإبقاء على تحميل، قياس البروتين العينة باستخدام أسلوب اتفاق التعاون الأساسي13عينة.
- قم بتشغيل كل عينة في ثلاث نسخ، دون تمييع، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- 832/13 حسابات تنفس خلايا بيتا من الخلايا تريبسينيزيد.
- أدخل عدد الخلايا كل استخدام مل في الفحص بالضغط على زر F3 لبرنامج التحليل ريسبيروميتير. تغيير الوحدات لخلايا/مل وأدخل تركيز الخلوية، وتغيير المتوسطة للديوان
- حدد خلفية قراءات تطبيع البيانات عن طريق تحديد وإدخال في س2 معايرة النموذج كما هو موضح في 3.2.3.
- إجراء تحديدات قراءات من 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، أوليجوميسين، فككب وأنتيميسين كما هو موضح في 3.3.1.
- ضمن برنامج التحليل ريسبيروميتير، تصدير قراءات لكل دائرة بعد إدخال تركيز البروتين وتحديد متوسط القيم المناسبة لكل معاملة أثناء قياس التنفس. يتم ذلك عن طريق النقر فوق F2 ومن ثم دفع "نسخ إلى الحافظة وظيفة". يعمل هذا على تصدير البيانات لاستخدامها في برامج التحليل الأخرى. استخدام قيم "س2 المنحدر neg." لإجراء العمليات الحسابية.
- تجميع البيانات لتشغيل مستقلة 3-5 من المركبات معاملة الضوابط والمركبات الطبيعية الخلايا المعالجة لتحديد أثر على التنفس الخلوي سليمة من خلايا بيتا 1 وظائف 832/13.
- 832/13 حسابات تنفس خلايا بيتا من ميكانيكيا تنفصل الخلايا.
- أدخل حسابات البروتين من مقايسة اتفاق التعاون الأساسي بالضغط على زر F3 لبرنامج التحليل ريسبيروميتير. تغيير الوحدات بملغ وأدخل تركيز اتفاق التعاون الأساسي وتغيير المتوسطة للديوان
- حدد خلفية قراءات تطبيع البيانات عن طريق تحديد وإدخال في س2 معايرة النموذج كما هو موضح في 3.2.3.
- إجراء تحديدات قراءات من 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، أوليجوميسين، فككب وأنتيميسين كما هو موضح في 3.3.1.
- ضمن برنامج التحليل ريسبيروميتير، تصدير قراءات لكل دائرة بعد إدخال تركيز البروتين وتحديد متوسط القيم المناسبة لكل معاملة أثناء قياس التنفس. يتم ذلك عن طريق النقر فوق F2 ومن ثم دفع "نسخ إلى الحافظة وظيفة". يعمل هذا على تصدير البيانات لاستخدامها في برامج التحليل الأخرى. استخدام قيم "س2 المنحدر neg." لإجراء العمليات الحسابية.
- تجميع البيانات لتشغيل مستقلة 3-5 من المركبات معاملة الضوابط والمركبات الطبيعية الخلايا المعالجة لتحديد أثر على التنفس الخلوي سليمة من خلايا بيتا 1 وظائف 832/13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلايا بيتا 1 وظائف 832/13 التي أعدت وتحصد كما هو موضح في البروتوكول سوف تثبت التحوير في استهلاك الأكسجين استناداً إلى مختلف التدخلات الكيميائية (الشكل 1A). سوف يلاحظ زيادة في التنفس عندما يتم زيادة تركيز الجلوكوز إلى 16.7 مم الجلوكوز (الشكل 1B). تنفس ستنخفض عندما تعامل الخلايا سليمة مع أ. أوليجوميسين ويعرف هذا التنفس تسرب، الذي يعرف بأنه حالة الجهاز التنفسي القاعدية، نونفوسفوريلاتينج. سوف يتحقق التنفس القصوى عندما تعامل الخلايا بيتا مع عامل يفصل فككب، الذي يعرف بأنه ETS التنفس أو التنفس نظام نقل الإلكترون. وأخيراً، التنفس ينخفض إلى الصفر عندما تعامل مع A أنتيميسين، وصفت روكس (استهلاك الأكسجين المتبقي) التي تشير إلى أن استهلاك الأوكسجين الخلوية غير الجهاز التنفسي.
سيتم تغيير الاختلافات في عدد الخلايا إلى حد كبير نوعية البيانات التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب. وتم قياس التنفس حمل الجلوكوز في 0.5 و 1 و 2 × 106 خلايا/مل (الشكل 2 ألف-2 ج). باستخدام عدد خلايا واتفاق التعاون الأساسي البروتين فحوصات، تركيزات البروتين المقابل للخلية اختبار ثلاثة تركيزات حسبت (الشكل 2D). القياسات باستخدام 0.5 × 10 كان سيظهر6 خلايا/مل لم تثبت التنفس التي حفزت الجلوكوز (الشكل 2A)، وإلا ETS المرتبطة التنفس زيادة كبيرة. وهذا يوحي بأن عدد الخلايا منخفض ينتج إشارة منخفضة إلى نسبة الضوضاء الذي يربك النتائج. وبالمثل، القياسات في 2 × 106 خلايا/مل أدت أيضا إلى تغير كبير، كما هو مبين بدلالة إحصائية فقط ويجري التوصل إلى قياسات ETS (الشكل 2). وهذا يفترض أنه نظراً للحاجة إلى إعادة الأوكسجين الدوائر عدة مرات أثناء الفحص، مما أدى إلى تباين أكبر من عينة بعينه. تبين هذه البيانات أن تؤدي تركيزات من 1 × 106 خلايا/مل كبيرة تحفز الجلوكوز التنفس، تسرب و ETS القياسات، التي تعد ضرورية لتحليل التنفس (الشكل 2B و 2E).
وترد في هذا البروتوكول طريقتين لإزالة الخلايا للتنفس. استخدام التربسين لإزالة الخلايا فعالة عندما يتم إكمال القياسات عند 37 درجة مئوية. يوضح قياسات التنفس القيام به في غياب أو وجود من الكركمين (الشكل 3A) صيانة لحفز الجلوكوز التنفس، تنفس التسرب والاختبارات. مقارنة بين الخلايا الكركمين العلاج إلى الخلايا غير المعالجة يوضح أي تغيير في أي من هذه المعلمات الجهاز التنفسي (الشكل 3B-ج). كما يوضح قياسات التنفس القيام به في غياب أو وجود مركب يبيكاتيشين الكاكاو (الشكل 3D) صيانة لحفز الجلوكوز التنفس، تنفس التسرب والاختبارات. مقارنة بين يبيكاتيشين الكاكاو مونومر تعامل الخلايا إلى خلايا غير المعالجة يوضح زيادة التنفس في 2.5 و 16.7 ملم الجلوكوز، وكذلك في التنفس تسرب و ETS (الرقم 3E-F). وتبين هذه البيانات أن بينما لا يعزز الكركمين تنفس الخلية بيتا 832/13، لا مونومر يبيكاتيشين الكاكاو (الشكل 3). قد تبين الكركمين لتعزيز إفراز الأنسولين عن طريق تثبيط النشاط فوسفوديستريس14. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن الكركمين لا يعزز إفراز الأنسولين عن طريق تحوير الوظيفة المتقدرية. ونحن قد أظهر أن الثقافة حضور مونومرات يبيكاتيشين الكاكاو الحث على التعبير عن مختلف عناصر سلسلة نقل الإلكترون المتقدرية5. كما لاحظنا زيادة التنفس في حالة تسرب (الناجمة عن المعاملة مع أوليجوميسين) ومع ETS (نظام نقل الإلكترون، الناجمة عن فككب). استخدام هذه الأداة تقترح عددا من الأهداف المحتملة لدراسات مستقبلية.
كبديل لإزالة التربسين من الخلايا، تفارق الميكانيكية أيضا يمكن أداؤها باستخدام تقنية الغسيل قدم عند الانتهاء عند 37 درجة مئوية. وأجريت قياسات التنفس في غياب أو وجود من الكركمين أو مونومر يبيكاتيشين الكاكاو (الشكل 4 أ-ج). وتبين هذه البيانات استمرار الاتجاهات التي لوحظت مع التربسين إعداد الخلايا، لكن يظهر الحساسية الانتقاص. بينما مونومر يبيكاتيشين التحكم والكاكاو تعامل الخلايا الحفاظ حفز الجلوكوز، التنفس تسرب و ETS، والخلايا تعامل مع الكركمين فقط الاحتفاظ التنفس حفزت الجلوكوز بسبب تقلب عينة إلى عينة زيادة. في حين تم الإبقاء على الاتجاهات التي لوحظت مع التربسين خلية التحضيرات (الشكل 4-F)، الأهمية قد انخفض في جميع المعلمات، يفترض أن تقلب عينة إلى عينة أكبر عرضته التفكك الميكانيكية و تطبيع رقم البروتين تركيز بدلاً من الخلية.
وتبين هذه البيانات أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لقياس التنفس سليمة خلايا بيتا 1 وظائف 832/13. وعلاوة على ذلك، توحي لدينا بروتوكول عدد خلايا أمثل لقياسات دقيقة وطريقة مفضلة لإعداد الخلايا إلى أقصى حد ممكن في إشارة إلى نسبة الضوضاء.
الشكل 1 : المنحنى الممثل التنفس من خلايا بيتا سليمة 832/13- يتم قياس خلايا سليمة 832/13 بيتا للتنفس في أوليجوميسين (الشكل 1A) 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، 2.5 ميكرون، 2 ميكرومتر فككب (-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) الكربونيل السيانيد-4و 2.5 ميكرون أنتيميسين أ ويرد توسيع مم 16.7 قسم الجلوكوز (الشكل 1B) لإثبات الزيادة في حفز الجلوكوز التنفس. وقيست الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا/مل. تسرب يشير إلى حالة الجهاز التنفسي القاعدية، نونفوسفوريلاتينج، ETS يشير إلى قدرة الجهاز التنفسي أونكوبليد نظام نقل الإلكترون، وروكس يشير إلى استهلاك الأوكسجين المتبقية بعد تحول دون التنفس المتقدرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحديد عدد 832/13 بيتا الخلايا اللازمة لقياس التنفس التي يسببها السكر. يتم قياس خلايا سليمة 832/13 بيتا للتنفس في تركيزات من (أ) 0.5 × 106 خلايا/مل (ب) 1 × 106 خلايا/مل، أو (ج) 2 x 106 خلايا/مل. (د) تركيزات البروتين التي تتوافق مع 0.5 x 106 خلايا/مل، 1 × 106 خلايا/مل و 2 × 106 خلايا/مل. (ﻫ) مقارنة بين التنفس في 0.5 x 106 خلايا/مل، 1 × 106 خلايا/مل و 2 × 106 خلايا/مل. وتم قياس التنفس تحت 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، 2.5 ميكرون أوليجوميسين، 2 ميكرومتر فككب و 2.5 ميكرون أنتيميسين بشروط. التنفس مع 2.5 و 16.7 مم الجلوكوز تثبت استجابة حفز الجلوكوز تنفس خلايا بيتا. يوضح التنفس بعد أوليجوميسين التنفس تسرب (حالة الجهاز التنفسي القاعدية، نونفوسفوريلاتينج). التنفس بعد فككب (الكربونيل السيانيد-علاج-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)4يوضح (قدرة الجهاز التنفسي أونكوبليد نظام نقل الإلكترون، ETS). n = 6 يدير مستقلة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± sem. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : قياسات التنفس من خلايا بيتا 832/13 بعد الإفراج عن استخدام التربسين. خلايا بيتا 832/13 تم مثقف في وجود أو عدم وجود يبيكاتيشين الكاكاو أحادي أو الكركمين والتنفس وتم قياس بعد الإفراج عن الخلايا باستخدام التربسين. وتم قياس التنفس تحت 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، 2.5 ميكرون أوليجوميسين، 2 ميكرومتر فككب و 2.5 ميكرون أنتيميسين بشروط. التنفس مع 2.5 و 16.7 مم الجلوكوز تثبت حفزت الجلوكوز التنفس. يوضح التنفس بعد أوليجوميسين التنفس تسرب (حالة الجهاز التنفسي القاعدية، نونفوسفوريلاتينج). التنفس بعد فككب (الكربونيل السيانيد-علاج-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)4يوضح (قدرة الجهاز التنفسي أونكوبليد نظام نقل الإلكترون، ETS). التنفس بعد أنتيميسين لعلاج يوضح استهلاك الأوكسجين المتبقية (روكس). (أ) علاج الخلايا 832/13 مع الكركمين تحتفظ بإجراء التغييرات المناسبة في التنفس بسبب العلاجات. تتبع الممثل (ب) و (ج) في المتوسط من البيانات للخلايا تعامل مع الكركمين يوضح أي تغيير تنفس الخلية بيتا 832/13. (د) العلاج الخلايا 832/13 مع مونومر يبيكاتيشين الكاكاو تحتفظ بإجراء التغييرات المناسبة في التنفس بسبب العلاجات. تتبع الممثل (ه) و (و) متوسط البيانات للكاكاو يبيكاتيشين مونومر تعامل الخلايا يوضح زيادة التنفس في جميع المعلمات بعد العلاج مونومر يبيكاتيشين الكاكاو. (ز) يتم عرض كافة المعلمات الثلاث معا للمقارنة. n = 6 يدير مستقلة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± sem. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : قياسات التنفس من خلايا بيتا 832/13 بعد الإفراج عن استخدام التفكك الميكانيكية- خلايا بيتا 832/13 تم مثقف في وجود أو عدم وجود يبيكاتيشين الكاكاو أحادي أو الكركمين والتنفس وتم قياس بعد الإفراج عن الخلايا باستخدام التفكك الميكانيكية. وتم قياس التنفس تحت 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، 2.5 ميكرون أوليجوميسين، 2 ميكرومتر فككب و 2.5 ميكرون أنتيميسين بشروط. التنفس مع 2.5 و 16.7 مم الجلوكوز تثبت استجابة الجلوكوز خلايا بيتا. يوضح التنفس بعد أوليجوميسين التنفس تسرب (حالة الجهاز التنفسي القاعدية، نونفوسفوريلاتينج). التنفس بعد فككب (الكربونيل السيانيد-علاج-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)4يوضح (قدرة الجهاز التنفسي أونكوبليد نظام نقل الإلكترون، ETS). المتوسط للبيانات لخلايا (A) دون علاج الخلايا أو الخلايا تعامل مع الكركمين (ب) أو مونومر يبيكاتيشين الكاكاو (ج) إثبات أن التفكك الميكانيكية يحافظ على التنفس حفزت الجلوكوز في جميع العلاجات، حين تسرب و يتم فقدان ETS أهمية فقط في الخلايا الكركمين العلاج. مقارنة بين الخلايا غير المعالجة الكركمين (د) أو (ه) يبيكاتيشين الكاكاو مونومر يوضح زيادة التنفس في كافة المعلمات مع مونومر يبيكاتيشين الكاكاو مع أي تغيير ملموس على التنفس مع الكركمين. (و) يتم عرض كافة المعلمات الثلاث معا للمقارنة. n = 6 يدير مستقلة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± sem. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والهدف من هذا البروتوكول استخدام ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس معدلات الالتهاب الرئوي في خلايا بيتا البنكرياس سليمة. هذا الأسلوب يسمح بقياس استجابة خلايا بيتا لمستويات السكر زيادة. كما يسمح البروتوكول للمعالجة بالمركبات المختلفة، كما هو موضح في هذا البروتوكول بتحدث بشكل طبيعي أحادي يبيكاتيشين أو الكركمين4،5. ويمكن استخدام العلاج مع مختلف المركبات الأخرى في هذا البروتوكول، مع المعالجة (كما هو موضح هنا) أو عن طريق علاج داخل الدوائر الجهاز التنفسي مع الحد الأدنى من تعديلات على البروتوكول الأساسي.
هناك عدة طرق يمكن من خلالها تعديل هذا الأسلوب. يمكن استخدام خطوط الخلايا بيتا الأخرى؛ ومع ذلك، سوف تحتاج عدد الخلايا وصاب أغسل مرات يتحدد تجريبيا. ويمكن أيضا استخدام القوارض الأولية والجزيرات البشرية؛ ومع ذلك، ستحتاج أيضا عدد الخلايا أو شبه جزيرة يحدد تجريبيا. دراسة واحدة على الأقل قد قياس استهلاك الأوكسجين جزيرة ليلى باستخدام الاستبانة ريسبيروميتري15. هذه الدراسة المطلوبة الجزيرات 400 كل رد فعل، ولكن لا يقيس السكر الناجم عن التنفس تغييرات. نظراً لأن النسيج الأساسي يستخدم بشكل متكرر مع ريسبيروميتيرس عالية الدقة16،17، يمكن أن تستخدم الجزيرات سليمة بعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها التجريبية. بيد نظراً لعدد كبير من الجزر الصغيرة اللازمة لهذا التحليل، أساليب أخرى لقياس استهلاك الأوكسجين قد يكون أكثر ملاءمة لقياسات التنفس الجزيرة الرئيسية.
وهناك بعض الخطوات الحاسمة مع البروتوكول المقدم. أولاً، من المهم وجود عدد كاف من الخلايا. لدينا دراسات تبين أن خلايا بيتا 832/13 بتركيز 1 × 106 خلايا/مل كافية لقياس التنفس حفزت الجلوكوز. القياسات باستخدام 0.5 × 106 خلايا/مل يدل التنفس حفزت الجلوكوز منخفضة ومنخفضة إشارة إلى نسبة الضوضاء. وعلاوة على ذلك، القياسات باستخدام 2 × 106 خلايا/مل أدت إلى تقلب عينة إلى عينة عالية، واستخدام الهاتف الخلوي السريع الأوكسجين فيها الدائرة المطلوب إعادة الأوكسجين وكثيراً ما أدت إلى موت الخلايا السريع. وينبغي تحديد العدد المناسب من الخلايا تجريبيا لخط خلية معينة من أجل استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه الخطوة الحاسمة.
وتعد خطوة حاسمة ثانية خلايا بيتا للاستجابة لمستويات مرتفعة من السكر. وقد وسائل الإعلام ثقافة RPMI 1640 مستويات عالية من السكر. يجب أن يتم نقل الخلايا من الجلوكوز عالية إلى ثقافة جلوكوز منخفضة. حضانة ح 3 في س 1 "صاب الجلوكوز منخفضة" غير كافية لخلايا بيتا لاستجابة كبيرة بإضافة الجلوكوز مم ~16.7. أغسل فترات أقل من 3 ح يسفر عن استجابات المتغير إلى إضافة السكر. استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشاكل استجابة الجلوكوز يمكن أن تعالج عن طريق زيادة طول الوقت أغسل صاب.
خطوة حاسمة ثالث هو طريقة لإعداد الخلايا للقياسات. لدينا البيانات يوضح أن بينما التربسين والتفكك الميكانيكية سواء استخدامها، التربسين صدر نتيجة الخلايا في قراءات أكثر اتساقا وأقل تقلب عينة بعينه. واستمر الاتجاه الملاحظ مع كلا الأسلوبين، مهما كانت قوة البيانات أكبر مع خلايا المعدة باستخدام التربسين. في حين يمكن استخدام أساليب أخرى، مثل إلغاء الخلية، لدينا البيانات تشير إلى أن استخدام التربسين سوف يسفر عن النتائج الأكثر استنساخه بأقل18،تقلب عينة إلى عينة19.
القيود المفروضة على هذا النهج ما يلي: أولاً، مع دائرتي العلاج فقط، هذا ليس إنتاجية عالية فحص الأسلوب. تشغيل كل من العينتين يأخذ بين ح 3-4، بما في ذلك الوقت لإعداد الجهاز. ثانيا، مطلوب تركيز كبير نسبيا من الخلايا للمقايسة، نظراً لمل ~2.2 من عينة (أو ~2.2 x 106 خلايا) يلزم كل دائرة. نظراً للمبلغ المطلوب للفحص العينة، يقتصر استخدام هذه الأداة وبروتوكول للجزر الرئيسية ما لم تتوفر إمدادات كبيرة. الدراسات السابقة التي استخدمت الجزر الصغيرة للتنفس في هذه التقنية المستخدمة ~ 400 الجزيرات/الدائرة15. تقريبا، وهذا سيتطلب الجزر الصغيرة من اثنين من الفئران لكل غرفة20. الثالث لأنه لا تستخدم الخلايا بيرميبيليزيد، القدرة على تحديد مدى تأثير العلاج على مكونات سلسلة الإلكترون الفردية باستخدام المركبات غير نفاذية الخلية غير متوفر.
وهناك عدد من المزايا الهامة لهذا البروتوكول فيما يتعلق بالأساليب القائمة. أولاً، هذا البروتوكول يسمح للمعايرة التدرجي للمركبات نفاذية الأغشية المختلفة. هذا يسمح بتحديد دقيق للتركيزات اللازمة. ثانيا، استخدام خلايا بيتا سليما يسمح لنا للاستعلام عن التأثير على استقلاب الجلوكوز سيتوسوليك والمتقدريه7. وهذا يسمح لنا بمراقبة تعمل يدل على تغييرات مسار glycolytic، ملاحظة التي يتم فقدها عند استخدام الخلايا بيرميبيليزيد. ثالثا، الخلايا سليمة تسمح لنا باستخدام الاستجابة الجلوكوز مرتفعة كمقياس لوظيفة خلايا بيتا، الذي خسر في المتغيرات بيرميبيليزيد لهذا التحليل. أخيرا، يسمح هذا البروتوكول لإضافة مركبات متعددة ومختلفة الاستعلام عن تأثير مركبات على التنفس خلية بيتا، ترفاً غير موجودة مع غيرها من أدوات قياس التنفس.
وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب القدرة على قياس بارامترات مثل ATP، والكالسيوم، وحاء2يا2 مستويات المتزامنة مع قياسات التنفس. كما يسمح هذا الأسلوب لقياس التنفس حضور مصادر الوقود الأخرى، مثل الأحماض الدهنية أو كيتونات. وأخيراً، مع بعض التعديلات، قياس مستويات الأنسولين يفرز المتزامن مع قياسات التنفس قد يكون أيضا ممكن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر أعضاء مختبرات تسم وهانكوك لمساعد والمناقشة العلمية. يشكر المؤلفون أندرو نيلسون، دكتوراه (جامعة فرجينيا للتكنولوجيا) لتوفير جزء مركب يبيكاتيشين المشتقة الكاكاو. وأيد هذه الدراسة منحة من مؤسسة التعليم والسكري إجراء البحوث إلى JST.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
References
- Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
- Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
- Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
- Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
- Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
- Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
- Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
- Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
- Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
- Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
- Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
- Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
- Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
- Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
- Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).
