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Biology

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Abstract

Respirometria de alta resolução permite a medição do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas, células e tecidos. As células beta desempenham um papel fundamental no corpo por controlar níveis de glicose no sangue através da secreção de insulina em resposta a concentrações elevadas de glicose. A secreção de insulina é controlada pelo metabolismo da glicose e respiração mitocondrial. Portanto, medir a respiração celular intacta de beta é essencial para ser capaz de melhorar a função da célula beta como um tratamento para o diabetes. Usar intacta 832/13 INS-1 derivado de células beta, podemos medir o efeito do aumento da concentração de glicose na respiração celular. Este protocolo permite-nos medir a respiração celular beta na presença ou ausência de vários compostos, permitindo que se determine o efeito de dado compostos na respiração celular intacta. Aqui vamos demonstrar o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na célula beta respiração sob a presença de condições de glicose elevada (16,7 mM) ou baixo (2,5 mM). Esta técnica pode ser usada para determinar o efeito de vários compostos na respiração celular intacta de beta na presença de diferentes concentrações de glicose.

Introduction

O objetivo principal da célula beta pancreática é manter o sistema normoglycemia, através da secreção de insulina glicose-estimulado. As células beta sentir mudanças fisiológicas em circulação glicose em grande parte devido a baixa afinidade, transportador de glicose alta capacidade GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Como aumento dos níveis de glicose circulatório, este transporte de baixa afinidade de alta capacidade facilita um aumento proporcional de glicose intracelular dentro da célula beta. Glicose é metabolizada através da glicólise, o ciclo de TCA (ciclo do ácido cítrico) e respiração mitocondrial, resultando em elevados níveis celulares de ATP (adenosina trifosfato). A elevada concentração de ATP bloqueia os canais de K+ sensíveis ATP, resultando em despolarização da membrana. Despolarização da membrana provoca a abertura de canais de tensão Ca2 + e subsequente liberação de vesículas limite de grânulos de insulina2. Disfunção da célula beta é uma marca registrada de Diabetes tipo 2 (T2D) e resulta na secreção de insulina diminuída e mal controlado e, finalmente, a morte de células beta3. Mecanismos que mantêm ou melhorar a função da célula beta podem ser usados como um tratamento para T2D.

Estudos têm demonstrado os efeitos benéficos de ocorrência natural compostos à base de plantas em células pancreáticas do beta4. Estes compostos podem ter seu efeito através da crescente proliferação de células beta, sobrevivência ou a secreção de insulina glicose-estimulada. Por exemplo, estudos recentes têm demonstrado que epicatequina monomérica aumenta a secreção de insulina glicose-estimulada, aumentando a respiração mitocondrial e ATP celular a aumentar os níveis de5. Portanto, compreender como esses compostos podem aumentar funcional de células beta em massa é importante para alavancar estes compostos como terapêutica potencial.

Respiração celular pode ser medida através de um número de ferramentas. Uso de um respirometer de alta resolução permite a titulação de moduladores químicos para uma população de célula intacta ou permeabilized6. Esta ferramenta permite a adição de vários compostos, em diferentes concentrações, dando assim uma grande variedade de informações.

Dada a conexão íntima entre o metabolismo da glicose e função da célula beta, medições de respiração celular são críticas. Medições da respiração celular podem ser feitas usando permeabilized ou intactas as células beta, com cada um que tem seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens de7,8. Enquanto permeabilização de células beta permite medir diferentes aspectos da cadeia de transporte de elétrons, fá-lo sem cumprimentos para o mecanismo de indução de respiração na célula beta, absorção de glicose e metabolismo. Portanto, o uso da respiração celular de beta unpermeabilized é uma técnica muito útil para determinar a resposta de células beta para vários níveis de glicose, usando o consumo de oxigênio como a leitura.

O objetivo desta técnica é medir o consumo de oxigênio em intacta INS-1 derivado de células beta de 832/13. Esta técnica nos permite determinar a resposta das células beta às condições unstimulatory glicose (glicose 2,5 mM) bem como condições estimulatórios glicose (glicose 16,7 mM). Enquanto as células unpermeabilized não nos permitem testar individualmente complexo I, II ou III do elétron da cadeia de transporte, a técnica que permite medições lidando com respiração de inibição (A oligomicina), desacoplada complexa IV (FCCP-carbonila cianeto- 4- phenylhydrazone (trifluorometoxi)) e completamente inibida a respiração (A Antimycin). Este estudo demonstra a eficácia da respiração em intactas unpermeabilized células-beta do pâncreas, bem como o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na respiração celular beta de medição.

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Protocol

1. cultura de pilha

  1. Cultura INS-1 derivado 832/13 células beta em RPMI 1640 suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 10 mM HEPES, glutamina de 2 mM, 1 mM piruvato de sódio e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol9,10,11 ,12,13.
  2. Remova células 832/13 de um frasco de T75 usando 2 mL de tripsina 0,25%, incubar a 37 ° C por 10 min. neutralizar tripsina adicionando 8 mL de mídia completa de RPMI 1640.
  3. Contar as células usando um hemocytometer e diluir 100 µ l do volume de célula de etapa 1.2 em 900 µ l de PBS.
  4. Células de placa 832/13 em uma densidade de 2 x 106 células/mL em um 6 bem o prato.
  5. Cultura de células para 48 h numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% CO2 antes de iniciar os experimentos de respiração.

2. preparação de células para respirometria de alta resolução

  1. Tratamento de 832/13 células com monômero de cacau epicatequina derivada.
    1. Cultura de células 832/13 para 24 h após chapeamento numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2.
    2. Mudar de mídia 24 h após o chapeamento e tratar as células 832/13 com o controle do veículo (3 poços) ou 100 monômero de cacau nM (3 poços), seguido de cultura para um adicional 24h (total de 48 h) em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2.
    3. Lavam-se células de 832/13 em 1 x baixa glicose secreção ensaio Buffer (SAB) para o buffer de aspirado de 5 min. e incube 832/13 células em 1x baixa glicose SAB para 3h, mudando 1 x baixa glicose SAB cada hora.
      1. Fazer 10 x SAB com 33,32 g de NaCl, 1,73 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, 0,7 g de MgSO4 e adicione H2O, até um volume final de 500 mL. Filtro estéril a solução final.
      2. Faça 1 x baixa glicose SAB com 10 mL de 10 x SAB, 100 µ l de 45% de glicose, 2 mL de 1m HEPES, 1ml de 0,25 M CaCl2, 0,57 mL de solução de BSA de 35%, 0,21 g de NaHCO3 e adicione H2O para um volume final de 100 mL. Filtro estéril a solução final.
  2. Tratamento de 832/13 células com curcumina.
    1. Cultura 832/13 células para 48 h após chapeamento numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2.
    2. Lavar as células 832/13 1 x baixa glicose SAB para o buffer de aspirado de 5 min. e incube 832/13 células em 1x baixa glicose SAB para 3h, mudando 1 x baixa glicose SAB a cada hora.
    3. Após 2,5 h de incubação h 3 em 1 x baixa glicose SAB, Aspire o tampão e incubar as células em 1 x baixa glicose SAB com o controle do veículo ou 40 µM curcumina por 30 min. Após incubação, Aspire o buffer.
  3. Colheita de células com tripsina para respirometria de alta resolução
    1. Após a incubação de 3h em 1 x baixa glicose SAB, remova as células da placa com 250 µ l de tripsina 0,25% por poço.
    2. Combine as células em tripsina de 3 poços tratados com o controle do veículo ou compostos de interesse com 4 mL de SAB em um tubo cônico de 15 mL.
    3. Contar as células usando um hemocytometer e diluir 100 µ l do volume de célula de etapa 2.3.2 em 900 µ l de PBS.
    4. Dilua o número adequado de células em 1 x baixa glicose SAB fazer 3 mL na concentração adequada para cada câmara. Os dados demonstram que uma concentração de 1 x 106 células/mL é o mais eficaz.
  4. Colheita de células com dissociação mecânica para respirometria de alta resolução
    1. Após a incubação de 3h em 1 x baixa glicose SAB, adicione 1 mL de 1x baixa glicose SAB a cada bem e delicadamente explodir células no prato com dissociação mecânica pipetando com uma ponta de pipeta 1000 µ l.
    2. Combine as células de 3 poços tratados com o controle do veículo ou compostos de interesse em um total de 3 mL SAB em um tubo cônico de 15 mL para a respiração.

3. High-Resolution respirometria

  1. Preparação da respirometer de alta resolução.
    1. Ligue o respirometer de alta resolução e conectar para a área de trabalho com o lançamento do programa de análise de respirometer.
    2. Aspire o etanol a 70% de ambas as câmaras. Aproveite estas câmaras em etanol a 70% por um período mínimo de 45 min.
    3. Lave as câmaras duas vezes com etanol 70%, por aspiração após cada etapa.
    4. Lave as câmaras três vezes com o ddH2O, por aspiração após cada etapa.
    5. Lave os êmbolos de câmara no ddH2O. Isto limpa fora etanol residual dos êmbolos e para o porto de titânio.
  2. Calibração de sensores de oxigênio polarographic.
    1. Adicionar a 2,4 mL de tampão de baixa glicose SAB 1x a cada câmara oxygraph, agitando o buffer continuamente usando barras magnéticas celeuma na câmara a 750 rpm e 37 ° C, com um intervalo de gravação de dados no 2.0 s apertando a tecla F7 e abrindo a guia rotulada "Sistemas". Empurre os pistões em todo o caminho e então retorne à configuração da chave de aeração. Deixe a máquina equilibrar durante um período mínimo de 1 hora até à obtenção de fluxo de oxigênio estável.
    2. Defina a máquina a 37 ° C para a duração do experimento. Definir a tensão de polarização de 800 mV, com um ganho de 2 apertando a tecla F7 e abrindo na guia rotulada "Oxigênio, O2". Equilibrar a concentração de oxigênio do buffer SAB pelo menos 30 min, enquanto a mudança na concentração de oxigênio é estável (menos de 2 pmol/(s*mL)).
    3. Após a estabilização da concentração de oxigênio, selecione uma região onde a alteração da concentração de oxigênio é estável para estabelecer a medida do fundo da mudança na concentração de oxigênio.
      1. Selecione uma região por pressionando a tecla shift, o botão esquerdo do mouse e arrastar o mouse na região selecionada. Clique sobre a letra associada a região selecionada e mude para "R1" para cada traço, correspondente com cada uma das duas câmaras.
      2. Clique duas vezes na caixa "O2 calibração" no canto inferior esquerdo e direito cantos da tela, clique no botão "selecionar marca" para a "calibração de ar" como R1 e selecione "calibrar e copiar para o clipboard" para ambas as câmaras.
  3. Avaliação da respiração das células beta de 832/13 preparado em etapas 2.1.5 ou 2.2.5.
    1. Carga de 2,4 mL da amostra em cada câmara (uma câmara com controle veículo Tratado células, uma câmara com células tratadas compostas) em 1 x baixa glicose sab Mantêm a 0,5 mL de amostra de células para quantificação da proteína, ensaio BCA (ácido Bicinchoninic) se usando a abordagem de dissociação mecânica (congelar a-20 ° C para medição mais tarde).
      1. Empurre o êmbolo todo o caminho e aspire o volume residual. Misture as células continuamente ao longo do experimento a 750 rpm e 37 ° C, durante todas as etapas subsequentes. Faça uma marca clicando em F4 e rotular como "células", quando as amostras são carregadas.
      2. Medir as amostras por 30 min. Após a estabilização do sinal, selecione uma região da mudança na concentração de oxigênio correspondente às condições de baixos de glicose (glicose 2,5 mM), conforme descrito em 3.2.3.
    2. Após estabilização do sinal é atingida, adicione 12,5 µ l de uma solução de glicose estéril de 45% (concentração final de 16,7 mM) em cada câmara através do titânio Porto utilizando uma seringa de carregamento. Faça que uma marca medido "Glicose", como descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta região da mudança na concentração de oxigênio, conforme descrito em 3.2.3. Esta é a leitura de glicose 16,7 mM e corresponde com condições estimulatórios7.
    3. Após estabilização do sinal é atingida, adicione 1 µ l de oligomicina 5mM (2,5 µM concentracao final) em cada câmara através do porto de carregamento. Faça que uma marca medido "OligoA", como descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3. Oligomycin A inibe a ATP sintase e, portanto, a única ocorrendo fluxo do oxigênio é através de vazamento de elétrons e não a fosforilação oxidativa7.
    4. Após estabilização do sinal é atingida mais 1 mM Compararia em incrementos de 1 µ l até uma taxa de respiração máxima é estabelecida. Isso representa a respiração desacoplada máxima. Entre 3-4 µ l Compararia é suficiente (1,5-2,0 µM concentração final) para induzir a respiração desacoplada máxima das células INS-1 832/13. Faça uma marca rotulada "FCCP", conforme descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3. Compararia é um agente de desacoplamento. Isso nos permite medir a respiração desacopladas7.
    5. Após estabilização do sinal é atingida adicione 1 µ l de 5mm Antimycin A (concentração final de 2,5 µM) em cada câmara através do porto de carregamento. Faça uma marca rotulada "AntiA" conforme descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3.
      Nota: Antimycin A vincula citocromo C redutase, inibe a oxidação de ubiquinona e bloqueia a respiração de todos. Isso nos permite parar completamente a respiração7.
  4. 832/13 células beta para normalização de concentração e respiração de proteína de medição.
    1. Usando a 0,5 mL da amostra retida no carregamento, amostra de proteína de medida usando o BCA método13.
    2. Execute cada amostra em triplicata, sem diluição, seguindo as instruções do fabricante.
  5. 832/13 célula beta cálculos de respiração das células trypsinized.
    1. Digite o número de células por mL uso no ensaio empurrando a tecla F3 do programa de análise de respirometer. Alterar as unidades de células/mL, insira a concentração celular e alterar médio para sab.
    2. Selecione leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e entrando O2 forma de calibração conforme descrito em 3.2.3.
    3. Faça seleções de leituras de 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, Oligomycin A, FCCP e A Antimycin conforme descrito em 3.3.1.
    4. Dentro do programa de análise de respirometer, exporte as leituras para cada câmara após entrar a concentração de proteína e selecionando valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Isto é feito clicando em F2 e, em seguida, empurrando o "copiar para a função de transferência". Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores de "Declive negativo2" para cálculos.
    5. Compilação de dados para 3-5 é executado independente do veículo tratados controles e naturais compostos de células tratadas para determinar o efeito na intacta respiração celular de células beta de INS-1 832/13.
  6. cálculos de respiração de célula beta de 832/13 de dissociado mecanicamente as células.
    1. Inserir os cálculos de proteína de ensaio BCA empurrando a tecla F3 do programa de análise de respirometer. Alterar as unidades de mg, inserir a concentração do BCA e alterar médio para sab.
    2. Selecione leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e entrando O2 forma de calibração conforme descrito em 3.2.3.
    3. Faça seleções de leituras de 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, Oligomycin A, FCCP e A Antimycin conforme descrito em 3.3.1.
    4. Dentro do programa de análise de respirometer, exporte as leituras para cada câmara após entrar a concentração de proteína e selecionando valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Isto é feito clicando em F2 e, em seguida, empurrando o "copiar para a função de transferência". Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores de "Declive negativo2" para cálculos.
    5. Compilação de dados para 3-5 é executado independente do veículo tratados controles e naturais compostos de células tratadas para determinar o efeito na intacta respiração celular de células beta de INS-1 832/13.

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Representative Results

As células beta INS-1 832/13 que são preparadas e colhidas conforme descrito no protocolo irá demonstrar a modulação no consumo de oxigênio baseado em várias intervenções químicas (figura 1A). Será observado um aumento na respiração quando a concentração de glicose é aumentada para 16,7 mM de glicose (figura 1B). Respiração diminuirá quando as células intactas são tratadas com o Oligomycin A. Esta respiração é conhecida como vazamento, que é definido como o estado respiratório basal, nonphosphorylating. Respiração máxima será alcançada quando as células beta são tratadas com o agente de desacoplamento Compararia, que é definido como respiração de ETS, ou respiração do sistema de transporte de elétrons. Finalmente, a respiração irá cair para zero quando tratados com A Antimycin, rotulado como ROX (consumo de oxigênio residual), que se refere ao consumo de oxigênio celular não respiratória.

Diferenças no número de célula mudará significativamente a qualidade dos dados obtidos a partir desta técnica. Glicose-induzir respiração foi medida em 0,5, 1 e 2 x 106 células/mL (Figura 2A-2 C). Usando a contagem de células e BCA ensaios de proteína, as concentrações de proteína correspondente à célula testado três concentrações foram calculadas (Figura 2D). As medições utilizando 0,5 x 106 células/mL não conseguiram demonstrar a respiração estimulada de glicose (Figura 2A) e só os ETS associado a respiração aumentada foi mostrada para ser significativo. Isto sugere que o número de células baixo resulta em um baixo sinal à relação de ruído que confunde os resultados. Da mesma forma, as medições em 2 x 106 células/mL também resultaram em significativa variabilidade, conforme indicado pela significância estatística, só sendo alcançada para as medições de ETS (Figura 2). Isto é provavelmente devido à necessidade de re-oxigenar as câmaras várias vezes durante o ensaio, o que resultou em maior variabilidade de amostra para amostra. Estes dados demonstram que as concentrações de 1 x 106 células/mL resultam em significativa respiração glicose-estimulada, vazamento e ETS medições, que são necessárias para análises de respiração (Figura 2B e 2E).

Dois métodos para a remoção das células para a respiração são apresentados no presente protocolo. Usando a tripsina para remover células é eficaz quando as medições são concluídas a 37 ° C. Medições de respiração feitas na ausência ou presença de curcumina (Figura 3A) demonstra a manutenção da respiração glicose-estimulada, respiração de vazamento e ETS. Comparação de curcumina tratada células às células não tratadas não demonstra nenhuma mudança de qualquer um desses parâmetros respiratórios (Figura 3B-C). Medições de respiração feitas na ausência ou presença de monômero de epicatequina do cacau (Figura 3D) também demonstra a manutenção da respiração glicose-estimulada, respiração de vazamento e ETS. Comparação de cacau epicatequina monômero Tratado células às células não tratadas demonstra respiração aumentou 2,5 mM e 16,7 mM de glicose, assim como na respiração de vazamento e ETS (Figura 3E-F). Estes dados demonstram que, enquanto a curcumina não melhorar a respiração de célula beta 832/13, epicatequina do cacau monômero faz (Figura 3). A curcumina foi mostrada para aumentar a secreção de insulina através da inibição da fosfodiesterase atividade14. Nossos dados sugerem que a curcumina não aumentar a secreção de insulina através da função mitocondrial de modulação. Já demonstrámos que cultura na presença de monômeros de epicatequina do cacau induz a expressão de vários componentes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial5. Observamos também a respiração aumentada no estado de fuga (induzida pelo tratamento com oligomicina) e com ETS (sistema de transporte de elétrons, induzido pela FCCP). O uso desta ferramenta sugere uma série de potenciais alvos para estudos futuros.

Como alternativa à remoção de tripsina de células, dissociação mecânica pode também ser realizada usando a técnica de lavagem apresentadas quando concluída a 37 ° C. Medições de respiração foram feitas na ausência ou presença de curcumina ou cacau epicatequina monômero (Figura 4A-C). Estes dados demonstram que as tendências observadas com preparação de tripsina, as células são mantidas, no entanto, a sensibilidade parece ser diminuída. Enquanto controle e cacau epicatequina monômero tratada células mantidas a glicose-estimulada, vazamento e ETS respiração, as células tratadas com curcumina apenas mantidos a respiração glicose-estimulado devido à maior variabilidade de amostra-de-amostra. Enquanto as tendências observadas com preparações da pilha de tripsina foram mantidas (Figura 4-F), o significado diminuiu em todos os parâmetros, presumivelmente para a maior variabilidade de amostra-de-amostra introduzido pela dissociação mecânica e a normalização de número de concentração, ao invés de células de proteína.

Estes dados demonstram que este protocolo pode ser usado para medir a respiração de intactas as células beta do INS-1 832/13. Além disso, nosso protocolo sugere um número de celular ideal para medições precisas e um método preferido para preparar as células para maximizar a relação sinal / ruído.

Figure 1
Figura 1 : Curva representativa de respiração das células beta de intacta 832/13. As células beta intacto 832/13 são medidas para a respiração na (figura 1A), 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, 2,5 µM oligomicina, 2 µM Compararia (carbonila cianeto -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) e A. de Antimycin 2,5 µM Uma expansão de 16,7 milímetros seção de glicose (figura 1B) é apresentada para demonstrar o aumento da respiração glicose-estimulado. As células foram medidas em uma concentração de 1 x 106 células/mL. VAZAMENTO refere-se ao estado respiratório basal, nonphosphorylating, ETS refere-se à capacidade respiratória desacoplada do sistema de transporte de elétrons e ROX refere-se ao consumo de oxigênio residual depois de respiração mitocondrial é inibida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Determinação do número de células beta de 832/13 necessários para medições de respiração induzida por glicose. As células beta intacto 832/13 são medidas para respiração em concentrações de (A) 0,5 x 106 células/mL (B) 1 x 106 células/mL, ou (C) 2 x 106 células/mL. (D) as concentrações de proteína que correspondem com 0,5 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL e 2 x 106 células/mL. (E) comparação da respiração em 0,5 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL e 2 x 106 células/mL. Respiração foi medida abaixo dos 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, 2,5 µM oligomicina, 2 µM Compararia e 2,5 µM A Antimycin de condições. Respiração com glicose de 2,5 e 16,7 mM demonstram a resposta de glicose-estimulada a respiração das células beta. Respiração após oligomicina demonstra a respiração de vazamento (estado respiratório basal, nonphosphorylating). Respiração após FCCP (carbonila cianeto -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tratamento demonstra (capacidade respiratória desacoplada do sistema de transporte de elétrons, ETS). n = 6 corridas independentes. Dados são apresentados como média ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, * * * p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Medições de respiração das células beta de 832/13 após lançamento usando tripsina. as células beta 832/13 foram cultivadas na presença ou ausência de epicatequina cacau monomérica ou curcumina e respiração foi medido após liberar células usando a tripsina. Respiração foi medida abaixo dos 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, 2,5 µM oligomicina, 2 µM Compararia e 2,5 µM A Antimycin de condições. Respiração com glicose de 2,5 e 16,7 mM demonstrar respiração glicose-estimulado. Respiração após oligomicina demonstra a respiração de vazamento (estado respiratório basal, nonphosphorylating). Respiração após FCCP (carbonila cianeto -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tratamento demonstra (capacidade respiratória desacoplada do sistema de transporte de elétrons, ETS). Respiração após antimycin um tratamento demonstra o consumo de oxigênio residual (ROX). (A) tratamento de 832/13 células com curcumina mantém as alterações apropriadas na respiração devido as tratamentos. Rastreamento representante (B) e (C) média de dados para as células tratadas com curcumina não demonstram nenhuma mudança de respiração celular beta de 832/13. (D) tratamento de 832/13 células com monômero de epicatequina do cacau mantém as alterações apropriadas na respiração devido as tratamentos. Rastreamento representativa (E) e (F) média de dados para células de monômero Tratado epicatequina do cacau demonstra aumento de respiração em todos os parâmetros após o tratamento de monômero de epicatequina do cacau. (G) todos os três parâmetros são apresentados juntos para comparação. n = 6 corridas independentes. Dados são apresentados como média ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, * * * p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Medições de respiração das células beta de 832/13 após lançamento usando dissociação mecânica. as células beta 832/13 foram cultivadas na presença ou ausência de epicatequina cacau monomérica ou curcumina e respiração foi medido após liberar células usando dissociação mecânica. Respiração foi medida abaixo dos 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, 2,5 µM oligomicina, 2 µM Compararia e 2,5 µM A Antimycin de condições. Respiração com glicose de 2,5 e 16,7 mM demonstram a resposta de glicose das células beta. Respiração após oligomicina demonstra a respiração de vazamento (estado respiratório basal, nonphosphorylating). Respiração após FCCP (carbonila cianeto -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tratamento demonstra (capacidade respiratória desacoplada do sistema de transporte de elétrons, ETS). Média de dados por células (A) não for tratada, as células ou células tratadas com curcumina (B) ou (C) epicatequina do cacau monômero demonstrar essa dissociação mecânica mantém respiração glicose-estimulada em todos os tratamentos, enquanto o vazamento e Significado ETS perdem-se apenas nas células de curcumina tratada. Comparação de células não tratadas a curcumina (D) ou (E) epicatequina do cacau monômero demonstra aumento de respiração em todos os parâmetros com monômero de epicatequina do cacau com nenhuma mudança significativa de respiração com curcumina. (F) todos os três parâmetros são apresentados juntos para comparação. n = 6 corridas independentes. Dados são apresentados como média ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O objectivo do presente protocolo é usar respirometria de alta resolução para medir as taxas respiratórias em células-beta do pâncreas intactas. Este método permite a medição da resposta célula beta à glicose aumento níveis. O protocolo também permite o tratamento prévio com vários compostos, como demonstrado no presente protocolo com o natural monomérico epicatequina ou curcumina4,5. Tratamento com vários outros compostos pode ser usado no presente protocolo, com pré-tratamento (como mostrado aqui) ou por tratar dentro das câmaras respiratórias com modificações mínimas para o protocolo de base.

Existem várias maneiras pelas quais este método poderia ser modificado. Outras linhas de células beta podem ser usadas; no entanto, o número do celular e SAB lavagem vezes precisará ser determinado experimentalmente. Roedor primário e ilhotas humanas também poderiam ser usadas; Entretanto, o número de células ou ilhéu equivalentes também deve ser determinado experimentalmente. Pelo menos um estudo tenha medido o consumo de oxigênio do Ilhéu usando alta resolução respirometria15. Este estudo exigido 400 ilhotas por reação, mas não medir glicose induzida por alterações de respiração. Dado que o tecido primário é usado frequentemente com respirometers de alta resolução16,17, ilhotas intactas poderiam ser usadas após a solução de experimental. No entanto, dado o grande número de ilhotas exigido para este ensaio, outros métodos de medição do consumo de oxigênio podem ser mais adequados para a medição da respiração primária ilhéu.

Existem alguns passos críticos com o protocolo apresentado. Em primeiro lugar, ter um número adequado de células é crítico. Os estudos mostram que as células beta 832/13 em uma concentração de 1 x 106 células/mL é suficiente para medições de glicose-estimulada a respiração. As medições utilizando 0,5 x 106 células/mL demonstrou baixa respiração glicose-estimulada e um baixo sinal à relação de ruído. Além disso, as medições utilizando 2 x 106 células/mL resultaram em alta variabilidade de amostra para amostra e a rápida utilização celular de oxigênio que câmara necessária re-oxigenar e frequentemente resultou em morte celular rápida. O número adequado de células deve ser determinado experimentalmente para a linha de determinada célula a fim de solucionar este passo crítico.

Um segundo passo crítico está preparando as células beta para responder a níveis elevados de glicose. O meio de cultura RPMI 1640 tem níveis elevados de glicose. As células devem ser feitas a glicose alta para uma cultura de baixos de glicose. Uma incubação de 3 h em 1x baixa glicose SAB é suficiente para as células beta para ter uma resposta significativa à adição de glicose de ~16.7 mM. Lavagem de períodos de menos de 3 h resultam em variáveis respostas à adição de glicose. Solucionando problemas de resposta de glicose pode ser resolvido aumentando o comprimento do tempo de lavagem SAB.

Um terceiro passo crítico é o método para preparar as células para medições. Nossos dados demonstram que, enquanto a tripsina e dissociação mecânica podem ser usados, tripsina lançado resultado células em leituras mais consistentes e menos variabilidade de amostra para amostra. A tendência observada com ambos os métodos foi mantida, no entanto, a força dos dados foi maior com as células preparadas com tripsina. Enquanto podem ser utilizados outros métodos, tais como célula raspagem, nossos dados sugerem que o uso de tripsina resultará em resultados mais reprodutíveis com menos de18,de variabilidade de amostra para amostra19.

As limitações desta abordagem incluem o seguinte. Em primeiro lugar, com apenas duas câmaras de tratamento, isto não é um método de triagem com rendimento elevado. Cada execução de duas amostras leva entre 3-4 h, incluindo o tempo para preparar a máquina. Em segundo lugar, uma concentração relativamente grande de células é necessária para o ensaio, dado a ~2.2 mL de amostra (ou ~2.2 x 106 células) necessários por câmara. Devido à quantidade de amostra necessária para o ensaio, o uso desta ferramenta e protocolo para Ilhéus primários é limitado, a menos que exista uma grande oferta. Os estudos anteriores que usaram ilhotas por respiração nesta técnica usou ~ 400 ilhotas/câmara15. Isso exigiria que, aproximadamente, ilhotas de dois ratos para cada câmara20. Em terceiro lugar porque as células permeabilized não estão sendo usadas, a capacidade de determinar o efeito do tratamento em componentes da cadeia de elétrons individuais usando compostos que não são permeável celular não está disponível.

Há uma série de vantagens significativas do presente protocolo em relação a métodos existentes. Em primeiro lugar, este protocolo permite a titulação gradual de vários compostos de membrana permeável. Isto permite a determinação precisa das concentrações necessárias. Em segundo lugar, uso de células-beta intactos nos permite consultar o efeito sobre o metabolismo de glicose citosólico e mitocondrial7. Isso nos permite observar fenótipos indicativos de alterações ao pathway glycolytic, uma observação que é perdida quando usando pilhas permeabilized. Em terceiro lugar, as células intactas nos permitem usar a resposta à glicose elevada como uma métrica da função de células beta, que é perdida em permeabilized variantes deste teste. Finalmente, este protocolo permite a adição de vários e vários compostos para consultar o efeito dos compostos na respiração celular de beta, um luxo que não está presente com outras ferramentas que medem a respiração.

Futuras aplicações deste método incluem a capacidade de medir parâmetros tais como H2O2 níveis simultâneos com medições de respiração, cálcio e ATP. Este método permite também a medição da respiração na presença de outras fontes de combustível, tais como ácidos graxos ou cetonas. Finalmente, com algumas modificações, os níveis de insulina secretada medição concomitante com medições de respiração podem também ser possíveis.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer os membros dos laboratórios Tessem e Hancock para assistente e discussão científica. Os autores agradecer Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para fornecer a fração de monômero de cacau epicatequina derivada. Este estudo foi suportado por uma concessão da Fundação de educação e pesquisa-ação Diabetes de JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

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References

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Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais
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