Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

Het doel van dit protocol is voor het meten van het effect van glucose-gemedieerde wijzigingen in mitochondriale ademhaling in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen op intact 832/13 beta cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie.

Abstract

Hoge resolutie respirometrie zorgt voor het meten van zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën, cellen en weefsels. Beta-cellen spelen een cruciale rol in het lichaam door de controlerende bloedglucosespiegels door insuline secretie in reactie op verhoogde glucose concentraties. Insuline secretie wordt gecontroleerd door het glucose metabolisme en mitochondriale ademhaling. Daarom is het essentieel om de verbetering van de bèta-cel functie als een behandeling voor diabetes te kunnen meten intact bèta cel ademhaling. Met behulp van intact 832/13 INS-1 afgeleid beta cellen kunnen we het meten van het effect van de toenemende concentratie van glucose op cellulaire ademhaling. Dit protocol laat ons toe om bèta cel ademhaling meten in de aanwezigheid of afwezigheid van verschillende stoffen, zodat naar het vaststellen van het effect van de gegeven verbindingen op intact cel ademhaling. We laten hier zien het effect van twee natuurlijk voorkomende verbindingen, monomere epicatechine en curcumine, op bèta cel ademhaling onder de aanwezigheid van laag (2,5 mM) of hoge glucose (16.7 mM) voorwaarden. Deze techniek kan worden gebruikt om te bepalen van het effect van de verschillende verbindingen op intact bèta cel ademhaling in de aanwezigheid van verschillende concentraties van de glucose.

Introduction

Het primaire doel van de alvleesklier beta cel is om systeem normoglycemia door glucose-gestimuleerd insuline secretie. De beta-cellen zin fysiologische veranderingen in het circulerende glucose grotendeels te wijten aan de lage affiniteit, hoge capaciteit glucose transporter GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16.7 mM)1. Als bloedsomloop glucoseniveaus stijgen, vergemakkelijkt deze hoge capaciteit laag-affiniteit vervoerder een evenredige toename van de intracellulaire glucose binnen de beta-cel. Glucose wordt gemetaboliseerd door glycolyse, de TCA cyclus (tricarboxylic acid cyclus) en de mitochondriale ademhaling, wat resulteert in verhoogde cellulaire concentraties van de ATP (adenosinetrifosfaat). De verhoogde concentratie van ATP blokkeert de ATP gevoelige K+ kanalen, leidt tot membraan depolarisatie. Membraan depolarisatie zorgt ervoor dat de opening van de spanning gated Ca2 + kanalen en latere release van vesikel gebonden insuline korrels2. Beta cel dysfunctie is een kenmerk van Type 2 Diabetes (T2D), en resulteert in verminderde en slecht gecontroleerde insuline secretie en uiteindelijk bèta cel dood3. Mechanismen die handhaven of te verbeteren van beta cel functie kunnen worden gebruikt als een behandeling voor T2D.

Studies hebben aangetoond dat de gunstige effecten van natuurlijk voorkomende stoffen op basis van planten op de alvleesklier bèta cel4. Deze verbindingen hebben hun effect door toenemende beta celproliferatie, overleving, of de glucose-gestimuleerd insuline secretie. Als voorbeeld, hebben recente studies aangetoond dat monomeer Epicatechine glucose-gestimuleerd insuline secretie verbetert door verhoging van de mitochondriale ademhaling en verhoging van cellulaire ATP5niveaus. Daarom begrijpen hoe deze samenstellingen kunnen het verhogen van functionele bèta cel massa is belangrijk om de invloed van deze stoffen als potentiële therapeutics.

Cellular respiration kan worden gemeten door middel van een aantal tools. Gebruik van een hoge-resolutie respirometer zorgt voor de titratie van chemische modulatoren naar een permeabel of intact cel bevolking6. Dit hulpprogramma staat de toevoeging van verschillende stoffen, bij verschillende concentraties, waardoor een breed scala van informatie.

Gezien de intieme verbinding tussen glucose metabolisme en bèta-cel functie, staan metingen van cellulaire ademhaling kritisch tegenover. Metingen van cellulaire ademhaling kunnen worden gedaan met dat permeabel ofwel intact beta-cellen, elk met een eigen set van voordelen en nadelen van de7,8. Terwijl permeabilization van beta cellen kan men meet verschillende aspecten van de keten elektronentransport, doet zij dit zonder betrekking tot het mechanisme voor de ademhaling in het beta-cel, de glucose-opname en het metabolisme induceren. Dus, gebruik van unpermeabilized bèta cel ademhaling is een zeer handige techniek om te bepalen van de reactie van de beta-cellen op verschillende niveaus van de bloedglucose, met behulp van zuurstofverbruik als de uitlezing.

Het doel van deze techniek is voor het meten van zuurstofverbruik in intact INS-1 afgeleide 832/13 beta cellen. Deze techniek laat toe te bepalen van de reactie van de beta-cellen op voorwaarden van de unstimulatory glucose (2.5 mM glucose) en stimulerend glucose voorwaarden (16.7 mM glucose). Terwijl de unpermeabilized cellen niet toestaan ons te testen afzonderlijk complex I, II of III van het elektron vervoeren keten, de techniek staat u toe om metingen te maken met complexe IV remming (Oligomycin A), rekken ademhaling (FCCP-Carbonyl cyanide- 4- phenylhydrazone (trifluormethoxy)), en volledig geremd ademhaling (Antimycin A). Deze studie toont aan dat de werkzaamheid van het meten van de ademhaling in intact unpermeabilized alvleesklier beta cellen, alsmede het effect van twee natuurlijk voorkomende verbindingen, monomere epicatechine en curcumine, op bèta cel ademhaling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de celkweek

  1. Cultuur INS-1 afgeleide 832/13 beta cellen in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamine, 1 mM natrium pyruvaat en 0.05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.
  2. 832/13 cellen verwijderen uit een T75 kolf met behulp van 2 mL van 0,25% trypsine, incuberen bij 37 ° C gedurende 10 min. neutraliseren trypsine door 8 mL van volledige RPMI 1640-media toe te voegen.
  3. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en Verdun 100 µL van het volume van de cel uit stap 1.2 in 900 µL van PBS.
  4. Plaat 832/13 cellen bij een dichtheid van 2 x 106 cellen/mL in een 6 schotel goed.
  5. Cultuur cellen gedurende 48 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voordat u begint met ademhaling experimenten.

2. voorbereiding van cellen met een hoge resolutie respirometrie

  1. Het behandelen van 832/13 cellen met cacao afgeleide Epicatechine monomeer.
    1. Cultuur 832/13 cellen gedurende 24 uur na de beplating in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
    2. Wijzig media 24u na plating en 832/13 cellen met controle van het voertuig (3 wells) of 100 nM cacao monomeer (3 wells), gevolgd door de cultuur voor een aanvullende 24 h (totaal 48 h) in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2behandelen.
    3. 832/13 cellen in 1 x lage Glucose secretie Assay Buffer (GAB) voor 5 min. Aspirate buffer wassen en incubeer 832/13 cellen in 1 x lage Glucose SAB gedurende 3 uur, 1 x lage Glucose SAB wijzigen elk uur.
      1. Maak 10 x SAB met 33.32 g NaCl, 1,73 g van KCl, KH2PO4, 0.7 g van MgSO4 0.82 g en H2O toevoegen aan een eindvolume van 500 mL. Steriel filter de uiteindelijke oplossing.
      2. Maak 1 x lage Glucose SAB met 10 mL 10 x SAB, 100 µL van 45% glucose, 1 M HEPES, 1 mL 2 mL van 0,25 M CaCl2, 0,57 mL van 35% BSA-oplossing, 0.21 NaHCO3 g en H2O tot een eindvolume van 100 mL toe te voegen. Steriel filter de uiteindelijke oplossing.
  2. Het behandelen van 832/13 cellen met curcumine.
    1. Cultuur 832/13 cellen voor 48 h na beplating in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
    2. 832/13 cellen in 1 x lage Glucose SAB voor 5 min. Aspirate buffer wassen en incubeer 832/13 cellen in 1 x lage Glucose SAB gedurende 3 uur, 1 x lage Glucose SAB wijzigen elk uur.
    3. Na 2,5 uur de incubatietijd van 3 h in 1 x lage Glucose SAB gecombineerd buffer en incubeer cellen in 1 x lage Glucose SAB met controle van het voertuig of 40 µM curcumine voor 30 min. Na incubatie, gecombineerd de buffer.
  3. Oogsten van cellen met trypsine voor hoge resolutie respirometrie
    1. Na de incubatie 3U in 1 x lage Glucose SAB, de cellen van de plaat met 250 µL van 0,25% trypsine per putje te verwijderen.
    2. De cellen in trypsine van 3 putten behandeld met controle van het voertuig of samengestelde van belang met 4 mL SAB in een conische tube van 15 mL combineren.
    3. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en Verdun 100 µL van het volume van de cel uit stap 2.3.2 in 900 µL van PBS.
    4. Verdun het juiste aantal cellen in 1 x lage Glucose GAB 3 mL maken met de geschikte concentratie voor elke kamer. De gegevens blijkt dat een concentratie van 1 x 106 cellen/mL het meest effectief.
  4. Oogsten van cellen met mechanische dissociatie voor hoge resolutie respirometrie
    1. Na de incubatie 3U in 1 x Voeg lage Glucose GAB, 1 mL 1 x lage Glucose SAB aan elk goed en zachtjes blazen cellen uit de plaat met mechanische dissociatie door pipetteren met een 1000 µL pipette uiteinde.
    2. De cellen van 3 putten behandeld met controle van het voertuig of samengestelde van belang in een totaal van 3 mL SAB in een conische tube van 15 mL voor ademhaling te combineren.

3. hoge resolutie respirometrie

  1. Voorbereiding van de hoge-resolutie respirometer.
    1. De hoge resolutie respirometer inschakelen en verbinding maken met het bureaublad door de lancering van de respirometer analyseprogramma.
    2. Gecombineerd 70% ethanol uit beide kamers. Geniet van deze kamers in 70% ethanol voor minimaal 45 min.
    3. De kamers met 70% ethanol, zuigen na elke stap twee keer wassen.
    4. Wassen van de kamers driemaal met ddH2O, zuigen na elke stap.
    5. Spoel de kamer plunjers in ddH2O. Dit reinigt uit residuele ethanol uit de plunjers en de titanium-poort.
  2. Kalibratie van polarographic zuurstofsensoren.
    1. 2.4 mL 1 x lage Glucose SAB buffer toevoegen aan elke oxygraph kamer, roeren de buffer voortdurend met behulp van magnetische roer bars in de kamer op 750 rpm en 37 ° C met een gegevens-opname-interval op 2.0 s door op de F7 te drukken en het tabblad te openen met het label "Systemen". Duw plunjers helemaal in, en klik vervolgens met de instelling van de beluchting moersleutel intrekken. Laat de machine equilibreer gedurende een minimum van 1 uur tot stabiele zuurstof flux is verkregen.
    2. Stel de machine bij 37 ° C voor de duur van het experiment. Polarisatie spanning ingesteld op 800 mV, met een winst van 2 door op de F7 te drukken en het tabblad met het label "Zuurstof, O2"te openen. Equilibreer de zuurstofconcentratie van de GAB buffer gedurende ten minste 30 minuten, terwijl de verandering in zuurstofconcentratie stabiel is (minder dan 2 pmol/(s*mL)).
    3. Selecteer een regio waar de verandering van de zuurstofconcentratie stabiel is om achtergrond meting van de verandering in zuurstofconcentratie na de stabilisatie van de concentratie van zuurstof.
      1. Selecteer een gebied door indrukken van de shift-toets, linker muisknop te klikken op de muis en slepen met de muis in de geselecteerde regio. Klik op de letter die is gekoppeld aan de geselecteerde regio en verandering "R1" voor elke trace, overeenkomt met elk van de twee kamers.
      2. Tweevoudig tikken voort naar de vak "O2 van kalibratie" op de bodem verlaten en rechts van de hoeken van het scherm, klik op de knop "Selecteer mark" voor de "lucht kalibratie" als R1 en selecteer vervolgens "kalibreren en naar Klembord kopiëren" voor beide kamers.
  3. Evaluatie van de ademhaling van 832/13 beta cellen voorbereid in stappen 2.1.5 of 2.2.5.
    1. Laden van 2,4 mL van het monster in elke kamer (één kamer met controle voertuig behandeld cellen, één kamer met samengestelde behandelde cellen) in 1 x lage Glucose SAB. 0,5 mL van cel monster voor eiwit kwantificatie door BCA (Bicinchoninic zuur) assay behouden, indien met behulp van de mechanische dissociatie aanpak (bevriezing bij-20 ° C voor later meting).
      1. Duw van de plunjer helemaal en het restvolume gecombineerd. Roer de cellen continu tijdens het experiment op 750 rpm en 37 ° C voor alle volgende stappen. Een merk maken door te klikken op F4 en labelen als "cellen" Wanneer monsters worden geladen.
      2. De monsters van de maatregel voor 30 min. Na stabilisatie van het signaal, selecteert u een regio van de verandering in zuurstofgehalte overeenkomt met de voorwaarden van de lage glucose (2.5 mM glucose) zoals beschreven in 3.2.3.
    2. Na stabilisatie van het signaal is bereikt, toevoegen 12,5 µL van een 45% steriele glucose-oplossing (16.7 mM eindconcentratie) in elke kamer via de titanium poort met behulp van een injectiespuit te laden. Maak die een mark "Glucose" als beschreven in 3.3.1 gemeten wanneer behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer deze regio van de verandering in zuurstofconcentratie, zoals beschreven in 3.2.3. Dit is de 16.7 mM Glucose lezing, en komt overeen met stimulerend voorwaarden7.
    3. Na stabilisatie van het signaal is bereikt Voeg 1 µL van 5mM oligomycin een (2,5 µM eindconcentratie) in elke kamer via de poort van het laden. Maak die een mark "OligoA" als beschreven in 3.3.1 gemeten wanneer behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer dit gebied van de curve zoals beschreven in 3.2.3. Oligomycin A remt ATP-synthase en is dus de enige zuurstof flux die zich voordoen via lekken van elektronen en niet oxidatieve fosforylatie7.
    4. Na stabilisatie van het signaal is bereikt toevoegen 1 mM FCCP in 1 µL stappen tot een maximale ademhalingsfrequentie is gevestigd. Dit betekent maximale afgekoppeld ademhaling. Tussen de 3-4 µL is FCCP voldoende (1,5-2,0 µM eindconcentratie) voor het opwekken van maximale afgekoppeld ademhaling van INS-1 832/13 cellen. Maak een markering met het label "FCCP" zoals beschreven in 3.3.1 wanneer de behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer dit gebied van de curve zoals beschreven in 3.2.3. FCCP is een ontkoppelingseiwit agent. Dit kan we meten afgekoppeld ademhaling7.
    5. Na stabilisatie van het signaal is bereikt toevoegen 1 µL van 5 mM Antimycin A (2,5 µM eindconcentratie) in elke kamer via de poort laden. Maak een markering met het label "AntiA" zoals beschreven in 3.3.1 wanneer de behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer dit gebied van de curve zoals beschreven in 3.2.3.
      Opmerking: Antimycin A bindt cytochroom C reductase, remt ubiquinone oxidatie en blokkeert alle ademhaling. Dit laat ons ademhaling7volledig te stoppen.
  4. Het meten van 832/13 beta cellen voor eiwit concentratie en ademhaling normalisatie.
    1. Met behulp van de 0,5 mL van het monster bewaard laden, maatregel eiwitSteekproef met behulp van de methode BCA13.
    2. Elk monster in drievoud, zonder verdunning, na instructies van de fabrikant worden uitgevoerd.
  5. 832/13 bèta cel ademhaling berekeningen van trypsinized cellen.
    1. Voer het aantal cellen per mL gebruik in de analyse door het indrukken van de knop van de F3 van de respirometer analyseprogramma. De maateenheid wijzigen in cellen/mL, voer de cellulaire concentratie en middellange omzetten in SAB.
    2. Selecteer achtergrond lezingen te normaliseren van de gegevens door te selecteren en het aangaan van de O-2 kalibratie vorm zoals beschreven in 3.2.3.
    3. Maak selecties van lezingen van 2,5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, Oligomycin A, FCCP en Antimycin A zoals beschreven in 3.3.1.
    4. Binnen de respirometer analyseprogramma, exporteert u de lezingen voor elke kamer na invoeren van eiwitconcentratie en selecteren van de juiste gemiddelde waarden voor elke behandeling tijdens de meting van de ademhaling. Dit wordt gedaan door te klikken op F2 en vervolgens duwen het "kopiëren naar Klembord-functie". Zo exporteert u de gegevens voor gebruik in andere programma's van analyse. De "O2 helling neg."-waarden gebruiken voor berekeningen.
    5. Gegevens verzamelen voor 3-5 onafhankelijke loopt van voertuig behandeld besturingselementen en natuurlijke verbindingen behandelde cellen om te bepalen van het effect op intact cellulaire ademhaling van INS-1 832/13 beta cellen.
  6. 832/13 bèta cel ademhaling berekeningen van mechanisch losgekoppeld cellen.
    1. Voer de eiwit-berekeningen van de BCA-bepaling door het indrukken van de knop van de F3 van de respirometer analyseprogramma. De maateenheid wijzigen in mg, voer de BCA-concentratie en middellange omzetten in SAB.
    2. Selecteer achtergrond lezingen te normaliseren van de gegevens door te selecteren en het aangaan van de O-2 kalibratie vorm zoals beschreven in 3.2.3.
    3. Maak selecties van lezingen van 2,5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, Oligomycin A, FCCP en Antimycin A zoals beschreven in 3.3.1.
    4. Binnen de respirometer analyseprogramma, exporteert u de lezingen voor elke kamer na invoeren van eiwitconcentratie en selecteren van de juiste gemiddelde waarden voor elke behandeling tijdens de meting van de ademhaling. Dit wordt gedaan door te klikken op F2 en vervolgens duwen het "kopiëren naar Klembord-functie". Zo exporteert u de gegevens voor gebruik in andere programma's van analyse. De "O2 helling neg."-waarden gebruiken voor berekeningen.
    5. Gegevens verzamelen voor 3-5 onafhankelijke loopt van voertuig behandeld besturingselementen en natuurlijke verbindingen behandelde cellen om te bepalen van het effect op intact cellulaire ademhaling van INS-1 832/13 beta cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

INS-1 832/13 beta cellen die worden voorbereid en geoogst zoals beschreven in het protocol demonstreer modulatie in zuurstofverbruik op basis van de verschillende chemische interventies (figuur 1A). Wanneer de concentratie glucose wordt verhoogd tot 16.7 mM Glucose (figuur 1B) zal een toename van de ademhaling in acht worden genomen. Ademhaling zal dalen wanneer de onbeschadigde cellen worden behandeld met Oligomycin A. Deze ademhaling staat bekend als het lek, dat wordt gedefinieerd als de basale nonphosphorylating respiratoire staat. Maximale ademhaling zal worden bereikt wanneer de beta-cellen worden behandeld met de ontkoppelingseiwit agent FCCP, die is gedefinieerd als de ETS ademhaling of elektronentransport systeem ademhaling. Ten slotte, ademhaling zal dalen tot nul wanneer behandeld met Antimycin A, aangeduid als ROX (residuele zuurstofverbruik) waarin wordt verwezen naar het niet-respiratoire cellulaire zuurstofverbruik.

Verschillen in celaantal verandert aanzienlijk de kwaliteit van de gegevens die zijn verkregen van deze techniek. Glucose-induceren ademhaling werd gemeten op 0,5, 1 en 2 x 106 cellen/mL (figuur 2A-2 C). Met behulp van cellen en BCA testen eiwit, eiwit concentratie overeenstemt met de drie geteste cel concentraties werden berekend (figuur 2D). Metingen met behulp van 0,5 x 106 cellen/mL niet kan bewijzen glucose-gestimuleerd ademhaling (figuur 2A), en alleen de ETS verbonden verhoogde ademhaling bleek te groot. Dit suggereert dat de lage celaantal resulteert in een lage signaal / ruisverhouding dat kunstdiscours van de resultaten. Ook metingen op 2 x 106 cellen/mL ook geleid tot aanzienlijke variabiliteit, zoals aangegeven door de statistische significantie alleen wordt bereikt voor de ETS-metingen (figuur 2C). Dit is vermoedelijk te wijten aan de noodzaak om opnieuw het zuurstof van de kamers meerdere keren tijdens de test, wat in een grotere variabiliteit van steekproef om steekproef resulteerde. Deze gegevens laten zien dat concentraties van 1 x 106 cellen/mL leiden tot significante glucose-gestimuleerd ademhaling, lek en ETS metingen, die nodig voor de ademhaling analyses zijn (figuur 2B en 2E).

Twee methoden voor het verwijderen van de cellen voor ademhaling worden gepresenteerd in dit protocol. Met trypsine te verwijderen van de cellen is effectief wanneer metingen zijn voltooid bij 37 ° C. Ademhaling metingen gedaan in de afwezigheid of de aanwezigheid van curcumine (figuur 3A) toont onderhoud van glucose-gestimuleerd ademhaling, lek en ETS ademhaling. Vergelijking van curcumine behandeld cellen naar onbehandeld cellen toont geen verandering aan van deze luchtwegen parameters (figuur 3B-C). Ademhaling metingen gedaan in de afwezigheid of de aanwezigheid van cacao Epicatechine monomeer (figuur 3D) toont ook aan onderhoud van glucose-gestimuleerd ademhaling, lek en ETS ademhaling. Vergelijking van cacao Epicatechine monomeer behandeld cellen naar onbehandeld cellen toont verhoogde ademhaling bij 2.5 mM en 16.7 mM Glucose, evenals in de lek en ETS ademhaling (3E figuur-F). Deze gegevens tonen aan dat, terwijl curcumine 832/13 bèta cel ademhaling niet verbeteren doet, cacao Epicatechine monomeer (Figuur 3 g doet). Curcumine is aangetoond dat het verbeteren van de insuline secretie door remming van fosfodiësterase activiteit14. Onze gegevens suggereren dat curcumine doet niet insuline secretie door modulerende mitochondriale functie verbeteren. We hebben reeds aangetoond dat cultuur in aanwezigheid van cacao Epicatechine monomeren expressie van verschillende onderdelen van het mitochondriaal elektronentransport keten5 induceert. Wij ook waargenomen verhoogde ademhaling in de staat van de lek (geïnduceerd door behandeling met oligomycin) en met ETS (elektronentransport systeem, geïnduceerd door FCCP). Het gebruik van deze tool stelt een aantal potentiële doelen voor toekomstige studies.

Als alternatief voor de verwijdering van de Trypsine van cellen, kan mechanische dissociatie ook worden uitgevoerd met behulp van de techniek van de gepresenteerde wassen wanneer voltooid bij 37 ° C. Ademhaling metingen werden gedaan in de afwezigheid of de aanwezigheid van curcumine of cacao Epicatechine monomeer (figuur 4A-C). Deze gegevens laten zien dat de trends waargenomen met trypsine voorbereiding van de cellen worden gehandhaafd, maar de gevoeligheid lijkt te worden verminderd. Hoewel controle en cacao Epicatechine monomeer behandeld cellen behouden de glucose-gestimuleerd, bewaard lek en ETS ademhaling, behandeld met curcumine cellen alleen de glucose-gestimuleerd ademhaling als gevolg van de toegenomen variabiliteit van de monster-naar-sample. Terwijl de waargenomen met trypsine cel preparaten trends werden onderhouden (Figuur 4 d-F), de betekenis daalden in alle parameters, vermoedelijk naar de grotere variabiliteit van de monster-naar-sample geïntroduceerd door de mechanische dissociatie en de normalisatie naar eiwit concentratie in plaats van cel nummer.

Deze gegevens tonen aan dat dit protocol kan worden gebruikt voor het meten van de ademhaling van intact INS-1 832/13 beta cellen. Ons protocol stelt bovendien een optimale celaantal voor nauwkeurige metingen en een voorkeur voor het voorbereiden van de cellen om te maximaliseren van de signaal / ruisverhouding.

Figure 1
Figuur 1 : Representatief ademhaling curve van de beta-cellen intact 832/13. Intact 832/13 beta cellen worden gemeten voor ademhaling in (figuur 1A) 2.5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP (Carbonyl cyanide -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) en 2,5 µM Antimycin A. Een uitbreiding van de 16.7 mM Glucose sectie (figuur 1B) wordt voorgesteld om aan te tonen van de stijging van de glucose-gestimuleerd ademhaling. Cellen werden gemeten bij een concentratie van 1 x 106 cellen/mL. Lek verwijst naar de luchtwegen basale, nonphosphorylating, ETS verwijst naar de afgekoppeld respiratoire capaciteit van het systeem van het elektronentransport en ROX verwijst naar het residuele zuurstofverbruik nadat mitochondriale ademhaling wordt geremd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Bepaling van het aantal 832/13 beta cellen nodig voor glucose-geïnduceerde ademhaling metingen. Intact 832/13 beta cellen worden gemeten voor ademhaling bij concentraties van (A) 0,5 x 106 cellen/mL (B) 1 x 106 cellen/mL, of (C) 2 x 106 cellen/mL. (D) eiwit concentraties die met 0,5 x 106 cellen/mL, 1 x 106 cellen/mL en 2 x 106 cellen/mL corresponderen. (E) de vergelijking van de ademhaling bij 0,5 x 106 cellen/mL, 1 x 106 cellen/mL en 2 x 106 cellen/mL. Ademhaling is gemeten onder 2.5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP en 2,5 µM Antimycin A voorwaarden. Ademhaling met 2.5 en 16.7 mM glucose aantonen dat de reactie van de glucose-gestimuleerd ademhaling van de beta-cellen. Ademhaling na oligomycin toont de lek ademhaling (basale nonphosphorylating respiratoire staat). Ademhaling na FCCP (Carbonyl cyanide -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandeling toont (afgekoppeld respiratoire capaciteit van het elektronentransport systeem, ETS). n = 6 onafhankelijke loopt. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001, *** p < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Ademhaling metingen van 832/13 beta cellen na release met behulp van trypsine. 832/13 beta cellen werden gekweekt in de aan- of afwezigheid van monomeer cacao epicatechin of curcumine en ademhaling is gemeten na het loslaten van cellen met behulp van trypsine. Ademhaling is gemeten onder 2.5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP en 2,5 µM Antimycin A voorwaarden. Ademhaling met 2.5 en 16.7 mM glucose aantonen glucose-gestimuleerd ademhaling. Ademhaling na oligomycin toont de lek ademhaling (basale nonphosphorylating respiratoire staat). Ademhaling na FCCP (Carbonyl cyanide -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandeling toont (afgekoppeld respiratoire capaciteit van het elektronentransport systeem, ETS). Ademhaling na antimycin een behandeling toont residuele zuurstofverbruik (ROX). (A) behandeling van 832/13 cellen met curcumine onderhoudt de gewenste wijzigingen in de ademhaling als gevolg van de behandelingen. Representatieve trace (B) en (C) gemiddelde van gegevens voor cellen behandeld met curcumine blijkt ongewijzigd 832/13 bèta cel ademhaling. (D) behandeling van 832/13 cellen met cacao Epicatechine monomeer onderhoudt de gewenste wijzigingen in de ademhaling als gevolg van de behandelingen. Representatieve trace (E) en (F) gemiddelde van de gegevens voor cacao Epicatechine monomeer behandeld cellen toont verhoogde ademhaling in alle parameters na de cacao Epicatechine monomeer behandeling. (G) alle drie parameters zijn bij elkaar voor de vergelijking. n = 6 onafhankelijke loopt. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001, *** p < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Ademhaling metingen van 832/13 beta cellen na release met behulp van mechanische dissociatie. 832/13 beta cellen werden gekweekt in de aan- of afwezigheid van monomeer cacao epicatechin of curcumine en ademhaling na het loslaten van cellen met behulp van mechanische dissociatie werd gemeten. Ademhaling is gemeten onder 2.5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP en 2,5 µM Antimycin A voorwaarden. Ademhaling met 2.5 en 16.7 mM glucose aantonen dat de reactie van de glucose van de beta-cellen. Ademhaling na oligomycin toont de lek ademhaling (basale nonphosphorylating respiratoire staat). Ademhaling na FCCP (Carbonyl cyanide -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandeling toont (afgekoppeld respiratoire capaciteit van het elektronentransport systeem, ETS). Gemiddelde van gegevens voor cellen (A) onbehandeld cellen of cellen die zijn behandeld met curcumine (B) of (C) cacao Epicatechine monomeer aantonen dat mechanische dissociatie onderhoudt glucose-gestimuleerd ademhaling in alle behandelingen, terwijl het lek en ETS betekenis zijn verloren alleen in cellen van curcumine behandeld. Vergelijking van onbehandelde cellen curcumine (D) of (E) cacao Epicatechine monomeer toont verhoogde ademhaling in alle parameters met cacao Epicatechine monomeer met geen significante verandering aan ademhaling met curcumine. (F) alle drie parameters zijn bij elkaar voor de vergelijking. n = 6 onafhankelijke loopt. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De doelstelling van dit protocol is te gebruiken met een hoge resolutie respirometrie voor het meten van respiratoire tarieven in intact alvleesklier beta-cellen. Met deze methode kan de meting van de bèta cel-reactie op meer glucoseniveaus. Het protocol voorziet ook de voorbehandeling met verschillende verbindingen, zoals blijkt uit dit protocol met de natuurlijk voorkomende monomeer Epicatechine of curcumine4,5. Behandeling met verschillende andere verbindingen kan worden gebruikt in dit protocol, met voorbehandeling (zoals hier) of door de behandeling van in de luchtwegen kamers met minimale aanpassingen aan het basis protocol.

Er zijn verschillende manieren waarop deze methode kan worden gewijzigd. Andere cellijnen van beta kunnen worden gebruikt; echter moet het celaantal en SAB wassen tijden experimenteel worden bepaald. Primaire knaagdier en menselijke eilandjes kunnen ook worden gebruikt; echter, het aantal cellen of islet equivalenten ook moet experimenteel worden bepaald. Ten minste één studie heeft islet zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie15gemeten. Deze studie 400 eilandjes per reactie vereist, maar deed niet meten van glucose geïnduceerde ademhaling wijzigingen. Gezien het feit dat primaire weefsel vaak met een hoge resolutie respirometers16,17 gebruikt wordt, kunnen intact eilandjes gebruikt worden na de experimentele oplossen. Echter, gezien het grote aantal eilandjes die nodig is voor deze test, andere methoden voor het meten van zuurstofverbruik kunnen beter geschikt voor metingen van primaire islet ademhaling.

Er zijn een paar essentiële stappen met het gepresenteerde protocol. Ten eerste, met een voldoende aantal cellen is cruciaal. Onze studies tonen aan dat 832/13 beta cellen bij een concentratie van 1 x 106 cellen/mL is voldoende voor glucose-gestimuleerd ademhaling metingen. Metingen met behulp van 0,5 x 106 cellen/mL aangetoond lage glucose-gestimuleerd ademhaling en een lage signaal / ruisverhouding. Bovendien resulteerde metingen met behulp van 2 x 106 cellen/mL in hoge variabiliteit van de steekproef om steekproef, en snelle cellulaire gebruik van zuurstof welke vereiste kamer opnieuw zuurstof en vaak resulteerde in snelle celdood. Het juiste aantal cellen moet experimenteel worden bepaald voor de regel van bepaalde cel voor het oplossen van deze kritieke stap.

Een tweede cruciale stap bereidt de beta-cellen om te reageren op verhoogde glucoseniveaus. De voedingsbodems RPMI 1640 heeft hoge glucoseniveaus. De cellen moeten worden verplaatst van de hoge glucose aan de cultuur van een lage glucose. Een 3 uur incubatie in 1 x lage Glucose SAB is voldoende voor de beta-cellen hebben een belangrijke reactie op de toevoeging van ~16.7 mM glucose. Wassen perioden van minder dan 3 h resultaat in variabele reacties op de toevoeging van glucose. Problemen met de reactie van glucose kan worden aangepakt door het verhogen van de tijdsduur SAB wassen.

Een derde belangrijke stap is de methode ter voorbereiding van de cellen van de metingen. Onze data toont aan dat terwijl trypsine en mechanische dissociatie kunnen zowel worden gebruikt, trypsine cellen resultaat in meer consistente lezingen en minder monster-naar-sample variabiliteit vrijgegeven. De trend met beide methoden werd gehandhaafd, maar de sterkte van de gegevens met de cellen die zijn opgesteld op basis van trypsine groter was. Terwijl andere methoden, zoals de cel schrapen, testlucht worden blijkt onze gegevens dat het gebruik van tripsine in de meest reproduceerbare resultaten met minder monster-naar-sample variabiliteit18,19 resulteren zal.

Beperkingen van deze aanpak zijn de volgende beschikbaar. Ten eerste, met slechts twee kamers van de behandeling, dit is niet een hoge throughput screening methode. Elke uitvoering van twee monsters duurt tussen de 3-4 h, met inbegrip van de tijd voor te bereiden van de machine. Ten tweede, een relatief hoge concentratie van cellen is vereist voor de assay, gegeven de ~2.2 mL monster (of ~2.2 x 106 cellen) per kamer nodig. Vanwege de hoeveelheid monster nodig zijn voor de bepaling, is het gebruik van deze tool en protocol voor primaire eilandjes beperkt, tenzij een grote voorraad beschikbaar is. De vorige studies die eilandjes voor ademhaling in deze techniek gebruikt ~ 400 eilandjes/kamer15. Dit zou vereisen, ongeveer, eilandjes van twee muizen voor elke kamer20. Ten derde omdat niet permeabel cellen worden gebruikt, is de mogelijkheid om het vaststellen van het effect van de behandeling op onderdelen van de keten van de individuele elektron met behulp van verbindingen die geen cel permeabele niet beschikbaar.

Er zijn een aantal belangrijke voordelen van dit protocol met betrekking tot bestaande methoden. Ten eerste, dit protocol voorziet de stapsgewijze titratie van verschillende membraan doorlaatbaar verbindingen. Hierdoor voor nauwkeurige bepaling van de noodzakelijke concentratie. Tweede, gebruik van intact beta cellen stelt ons in staat het effect op cytosolische en mitochondriale glucose metabolisme7worden opgevraagd. Hierdoor kunnen observeren fenotypen indicatieve van wijzigingen in het glycolytic traject, een waarneming die gaat verloren wanneer cuvetten permeabel. Derde, de cellen intact laten te gebruiken van de reactie op verhoogde glucose als een metriek van beta cel functie, die is verloren in permeabel varianten van deze test. Ten slotte voorziet dit protocol de toevoeging van verschillende en meerdere verbindingen op query het effect van verbindingen op bèta cel ademhaling, een luxe die niet aanwezig met andere hulpprogramma's die het meten van de ademhaling.

Toekomstige toepassingen van deze methode omvatten de capaciteit voor het meten van parameters zoals ATP, calcium en H2O2 niveaus tegelijk met metingen van de ademhaling. Deze methode staat ook voor het meten van de ademhaling in het bijzijn van andere brandstoffen, zoals vetzuren of ketonen. Tot slot, met enkele wijzigingen, meten secreted insulineniveaus gelijktijdig met ademhaling metingen ook mogelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank leden van de Tessem en Hancock labs voor assistent en wetenschappelijke discussie. De auteurs bedanken Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) voor het verstrekken van de cacao afgeleide Epicatechine monomeer breuk. Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Diabetes Action Research en Education Foundation naar JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
  4. Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
  5. Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
  6. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
  7. Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
  8. Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
  9. Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
  10. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  11. Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
  12. Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
  13. Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
  14. Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
  15. Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
  16. Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
  17. Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
  18. Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
  19. Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
  20. Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).

Tags

Celbiologie kwestie 131 bèta cel mitochondriën ademhaling glucose high-resolution respirometrie cacao Epicatechine monomeer curcumine
Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock,… More

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter