Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Högupplösta respiration att mäta mitokondriefunktion av intakt betacellerna i närvaro av naturliga föreningar

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

Målet med detta protokoll är att mäta effekten av glukos-medierad ändringar av mitokondriell andning i närvaro av naturliga föreningar på intakt 832/13 beta-celler använder högupplösta respiration.

Abstract

Högupplösta respiration möjliggör mätning av syreförbrukning isolerade mitokondrier, celler och vävnader. Beta-celler har en kritisk roll i kroppen genom att kontrollera blodsockernivåerna genom insulinutsöndringen som svar på förhöjda glukos koncentrationer. Insulinutsöndringen styrs av glukosmetabolism och mitokondrie respiration. Därför är mäta intakt beta cellandningen viktigt för att kunna förbättra betacellernas funktion som en behandling för diabetes. Genom att använda intakt 832/13 INS-1 fås betacellerna kan vi mäta effekten av ökande glukos koncentration på cellandningen. Detta protokoll tillåter oss att mäta beta cellandning i närvaro eller frånvaro av olika föreningar, tillåter en att avgöra effekten av ges föreningar på intakt cellandningen. Här visar vi effekten av två naturligt förekommande föreningar, monomer epicatechin och curcumin, på beta cellandningen under närvaro av låg (2,5 mM) eller hög glukos (16,7 mM) villkor. Denna teknik kan användas för att avgöra effekten av olika föreningar på intakt beta cellandning i närvaro av olika glukos koncentrationer.

Introduction

Det primära syftet med betacellen är att upprätthålla systemet normoglycemia genom glukos-stimulerad insulinsekretion. Beta-cellerna känner av fysiologiska förändringar i cirkulerande glukos till stor del på grund av den låga affiniteten, hög kapacitet glukostransportör GLUT2 (glukos Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Som cirkulatoriska blodsockernivån stiger, underlättar denna hög kapacitet låg affinitet transportör en proportionell ökning av intracellulära glukos inom beta cellen. Glukos metaboliseras genom glykolys, TCA cykeln (tricarboxylic syra cykel) och mitokondrie respiration vilket resulterar i förhöjda cellulär ATP (adenosintrifosfat). Den förhöjda ATP koncentrationen blockerar de ATP känsliga K+ kanaler, vilket resulterar i membran depolarisation. Membranet depolarisation orsakar öppnandet av spänning gated-Ca2 + -kanaler och påföljande frisättning av vesikler bunden insulin granulat2. Betacellen dysfunktion är ett kännetecken för typ 2-Diabetes (T2D) och resulterar i minskad och dåligt kontrollerad insulinutsöndringen och slutligen beta cell death3. Mekanismer för att upprätthålla eller förbättra betacellernas funktion kunde användas som en behandling för T2D.

Studier har visat positiva effekter av naturligt växt-baserade föreningar på betacellen4. Dessa föreningar har sin verkan genom ökande beta cellproliferation, överlevnad eller glukos-stimulerad insulinsekretion. Som ett exempel, har senaste studier visat att monomer epicatechin förbättrar glukos-stimulerad insulinsekretion genom ökad mitokondriell respiration och öka cellulär ATP nivåer5. Därför förstå hur dessa föreningar kan öka funktionella beta cell massan är viktigt att utnyttja dessa föreningar som potentiella therapeutics.

Cellandning kan mätas genom ett antal verktyg. Användning av en högupplöst respirometer möjliggör titrering av kemiska modulatorer till en permeabilized eller intakt cell befolkningen6. Detta verktyg tillåter tillägg av olika föreningar, vid olika koncentrationer, vilket ger ett brett spektrum av information.

Hänsyn till intima sambandet mellan glukosmetabolism och betacellernas funktion, är mätningar av cellandningen kritiska. Mätningar av cellandningen kan göras med antingen permeabilized eller intakt beta-celler, med var och en har sin egen uppsättning av fördelar och nackdelar7,8. Medan permeabilisering av beta-cellerna gör att man kan mäta olika aspekter av elektron transportkedjan, gör det det utan när det gäller mekanismen för att inducera andning i betacellen, glukosupptag och metabolism. Användning av unpermeabilized beta cellandningen är därför en mycket användbar teknik för att fastställa att betacellerna bemöta olika glukosnivåer, använda syreförbrukning som utslaget.

Syftet med denna teknik är att mäta syreförbrukning i intakt INS-1 härrör 832/13 beta-celler. Denna teknik tillåter oss att bestämma svaret av beta-cellerna till unstimulatory glukos villkor (2,5 mM glukos) samt stimulerande glukos villkor (16,7 mM glukos). Medan de unpermeabilized cellerna inte tillåter oss att testa individuellt komplex I, II eller III av elektron transport kedja, tekniken tillåter mätningar behandlar komplexa IV hämning (Oligomycin A), uncoupled respiration (FCCP-karbonyl cyanid- 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), och helt hämmad andning (Antimycin A). Denna studie visar effekten av mäta andning i intakt unpermeabilized betaceller, liksom effekten av två naturligt förekommande föreningar, monomer epicatechin och curcumin, på beta cellandningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell kultur

  1. Kultur INS-1 härrör 832/13 betacellerna i RPMI 1640 kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat och 0,05 mM 2-merkaptoetanol9,10,11 ,12,13.
  2. Ta bort 832/13 celler från en T75 flask med 2 mL av 0,25% trypsin, inkubation vid 37 ° C i 10 min. neutralisera trypsin genom att tillsätta 8 mL komplett RPMI 1640 media.
  3. Räkna celler som använder en hemocytometer och späd 100 µL av cell volymen från steg 1.2 i 900 µL av PBS.
  4. Plattan 832/13 celler på en densitet på 2 x 106 celler/mL i en 6 maträtt väl.
  5. Kultur celler för 48 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 innan du börjar respiration experiment.

2. förberedelse av celler för högupplösta respiration

  1. Behandling av 832/13 celler med kakao härledda epicatechin monomer.
    1. Kultur 832/13 celler för 24 h efter plätering i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
    2. Ändra media 24 h efter plätering och behandla 832/13 celler med fordonskontroll (3 brunnar) eller 100 nM kakao monomer (3 brunnar), följt av kultur för en ytterligare 24 h (48 h totalt) i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
    3. Tvätta 832/13 celler i 1 x låg glukos sekretion analysbuffert (SAB) för 5 min. Aspirera buffert och inkubera 832/13 celler i 1 x låg glukos SAB för 3 h, ändra 1 x låg glukos SAB varje timme.
      1. Gör 10 x SAB med 33.32 g NaCl, 1.73 g kaliumklorid, 0,82 g KH2PO4, 0,7 g MgSO4 och Lägg till H2O till en slutlig volym av 500 mL. Sterila filter den slutliga lösningen.
      2. Gör 1 x låg glukos SAB med 10 mL 10 x SAB, 100 µL av 45% glukos, 2 mL 1 m HEPES, 1 mL av 0,25 M CaCl2, 0,57 mL 35% BSA lösning, 0.21 g NaHCO3 och lägga till H2O till en slutlig volym av 100 mL. Sterila filter den slutliga lösningen.
  2. Behandling av 832/13 celler med curcumin.
    1. Kultur 832/13 celler för 48 h efter plätering i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
    2. Tvätta 832/13 celler i 1 x låg glukos SAB för 5 min. Aspirera buffert och inkubera 832/13 celler i 1 x låg glukos SAB för 3 h, ändra 1 x låg glukos SAB varje timme.
    3. Efter 2,5 h i 3 h inkubering i 1 x låg glukos SAB, aspirera buffert och inkubera cellerna i 1 x låg glukos SAB med fordonskontroll eller 40 µM curcumin i 30 min. Efter inkubation, aspirera bufferten.
  3. Skörda celler med trypsin för högupplösta respiration
    1. Efter 3 h inkubering i 1 x låg glukos SAB, ta bort celler från plattan med 250 µL per brunn trypsin på 0,25%.
    2. Kombinera celler i trypsin från 3 brunnar behandlas med fordonskontroll eller förening av intresse med 4 mL SAB i en 15 mL koniska rör.
    3. Räkna celler som använder en hemocytometer och späd 100 µL av cell volymen från steg 2.3.2 i 900 µL av PBS.
    4. Späd lämpligt antal celler i 1 x låg glukos SAB att göra 3 mL i lämplig koncentration för varje kammare. Data visar att en koncentration av 1 x 106 celler/mL är den mest effektiva.
  4. Skörda celler med mekaniska dissociation för högupplösta respiration
    1. Efter 3 h inkubering i 1 x låg glukos SAB, tillsätt 1 mL 1 x låg glukos SAB till varje väl och försiktigt blåsa celler utanför plattan med mekaniska dissociation av pipettering med en 1000 µL pipettspetsen.
    2. Kombinera cellerna från 3 brunnar behandlas med fordonskontroll eller sammansatta av intresse i sammanlagt 3 mL SAB i en 15 mL konisk slang för respiration.

3. högupplöst respiration

  1. Beredning av den högupplösta respirometer.
    1. Slå på den högupplösta respirometer och ansluta till skrivbordet genom att lansera programmet respirometer analys.
    2. Aspirera 70% etanol från båda kamrarna. Blötlägg dessa kamrar i 70% etanol i minst 45 min.
    3. Tvätta kamrarna två gånger med 70% etanol, aspirera efter varje steg.
    4. Tvätta kamrarna tre gånger med ddH2O, aspirera efter varje steg.
    5. Skölj kammare kolvarna i ddH2O. Detta rensar bort kvarvarande etanol från kolvarna och från Titan hamnen.
  2. Kalibrering av polarographic syresensorer.
    1. Tillsätt 2,4 mL 1 x låg glukos SAB buffert till varje oxygraph kammare, omrörning den buffert som kontinuerligt använder magnetiska rör barer i kammaren vid 750 rpm och 37 ° C med en data-registreringsintervall på 2.0 s genom att trycka på F7-knappen och öppna fliken märkt ”system”. Driva kolvar hela vägen in, och sedan dra in till inställningen skiftnyckel luftning. Låt maskinen låt jämvikta i minst 1 timme tills stabil syre flux erhålls.
    2. Ställ in maskinen vid 37 ° C under hela försöket. Ange polarisering spänning till 800 mV, med en vinst på 2 genom att trycka på F7-knappen och öppna fliken märkt ”syre, O2”. Temperera syrekoncentrationen i SAB bufferten för minst 30 min, medan förändringen i syrehalten är stabil (mindre än 2 pmol/(s*mL)).
    3. Syre koncentration stabilisering, Välj en region där ändringen av syrekoncentrationen är stabil att etablera bakgrund mätning av förändring i koncentrationen syrgas.
      1. Välj en region genom att trycka på SKIFT-tangenten, vänster klicka på musen och dra musen över den valda regionen. Klicka på det brev som är associerad med den valda regionen och ändra till ”R1” för varje trace, motsvarande med var och en av de två kammarna.
      2. Dubbelklicka på rutan ”O2 kalibrering” längst ned till vänster och höger hörn på skärmen, klicka på knappen ”Välj märke” för ”air kalibrering” som R1 och välj sedan ”kalibrera och kopiera till Urklipp” för båda kamrarna.
  3. Utvärdering av respiration av 832/13 betacellerna beredd i steg 2.1.5 eller 2.2.5.
    1. Ladda 2,4 mL av provet i varje kammare (en kammare med kontroll fordonet behandlas celler, en kammare med sammansatta behandlade cellerna) i 1 x låg glukos SAB. Behålla 0,5 mL av cell prov för protein kvantifiering av BCA (Bicinchoninic acid) analys om använder metoden mekaniska dissociation (frys vid-20 ° C för mätning senare).
      1. Tryck kolven i hela vägen och aspirera kvarvarande volymen. Rör cellerna kontinuerligt under experimentet vid 750 rpm och 37 ° C för alla efterföljande steg. Gör en markering genom att klicka på F4 och märkning som ”celler” när prover är laddade.
      2. Mäta prover för 30 min. Efter signal stabilisering, Välj en region i förändring i koncentrationen av syrgas motsvarar villkor som låg glukos (2,5 mM glukos) som beskrivs i 3.2.3.
    2. Efter signal stabilisering uppnås, tillsätt 12,5 µL av en 45% glukoslösning för steril (16,7 mM slutlig koncentration) i varje kammare via Titan laddar port med hjälp av en spruta. Gör ett märke mätt ”glukos” som beskrivs i 3.3.1 när behandling läggs. Låt signalen stabilisera och registrera cellandningen tills en stabil syre flux uppnås. Välj denna region i förändring i koncentrationen av syrgas, som beskrivs i 3.2.3. Detta är 16,7 mM glukos läsningen, och motsvarar med stimulerande villkor7.
    3. Efter signal stabilisering uppnås tillsätt 1 µL av 5mM oligomycin (2,5 µM koncentration) i varje kammare genom lastningshamnen. Gör ett märke mätt ”OligoA” som beskrivs i 3.3.1 när behandling läggs. Låt signalen stabilisera och registrera cellandningen tills en stabil syre flux uppnås. Välj detta område av kurvan som beskrivs i 3.2.3. Oligomycin A hämmar ATP synthase och därmed den enda syre flux uppstår är via läckage av elektroner och inte oxidativ fosforylering7.
    4. Efter signal stabilisering uppnås lägga till 1 mM FCCP 1 µL ökningar tills en maximal respiration klassar är etablerad. Detta motsvarar maximal uncoupled respiration. Mellan 3-4 µL är FCCP tillräcklig (1,5-2,0 µM slutliga koncentration) framkalla maximal uncoupled respiration av INS-1 832/13 celler. Gör ett märke som heter ”FCCP” som beskrivs i 3.3.1 när behandling läggs. Låt signalen stabilisera och registrera cellandningen tills en stabil syre flux uppnås. Välj detta område av kurvan som beskrivs i 3.2.3. FCCP är en uncoupling agent. Detta tillåter oss att mäta uncoupled respiration7.
    5. Efter signal stabilisering uppnås tillsätt 1 µL av 5 mM Antimycin A (2,5 µM slutlig koncentration) i varje kammare genom lastningshamnen. Gör ett märke som heter ”AntiA” som beskrivs i 3.3.1 när behandling läggs. Låt signalen stabilisera och registrera cellandningen tills en stabil syre flux uppnås. Välj detta område av kurvan som beskrivs i 3.2.3.
      Obs: Antimycin A binder cytokrom C reduktas, hämmar ubikinon oxidation och blockerar alla respiration. Detta tillåter oss att fullständigt stoppa respiration7.
  4. Mäta 832/13 beta-celler för protein koncentration och andning normalisering.
    1. Använda den 0,5 mL av provet kvar vid lastning, åtgärd protein prov med BCA metod13.
    2. Kör varje prov i tre exemplar, utan utspädning, följa tillverkarens instruktioner.
  5. 832/13 betacellen andning beräkningar från trypsinized celler.
    1. Ange antalet celler per mL användning i analysen genom att trycka på F3 knappen i programmet respirometer analys. Ändra måttenheterna celler/ml, ange den cellulära koncentrationen och ändra medium till SAB.
    2. Välj bakgrund avläsningar att normalisera data genom att markera och in i den O2 kalibrering formulär som beskrivs i 3.2.3.
    3. Gör val av avläsningar från 2,5 mM glukos, 16,7 mM glukos, Oligomycin A, FCCP och Antimycin A som beskrivs i 3.3.1.
    4. Inom programmet respirometer analys, exportera avläsningarna för varje kammare efter att ange proteinkoncentration och välja lämpliga genomsnittliga värden för varje behandling under respiration mätningen. Detta görs genom att klicka på F2 och sedan trycka ”kopiera till Urklipp funktion”. Detta exporterar data för användning i andra analysprogram. Använd ”O2 lutning neg.” värden för beräkningar.
    5. Sammanställa data för 3-5 oberoende körningar av fordonet behandlas kontroller och naturliga föreningar behandlade cellerna för att avgöra effekten på intakt cellandningen av INS-1 832/13 beta-celler.
  6. 832/13 betacellen andning beräkningar från mekaniskt separerade celler.
    1. Ange protein beräkningarna från BCA analysen genom att trycka på F3-knappen i programmet respirometer analys. Ändra måttenheterna mg, ange BCA koncentrationen och ändra medium till SAB.
    2. Välj bakgrund avläsningar att normalisera data genom att markera och in i den O2 kalibrering formulär som beskrivs i 3.2.3.
    3. Gör val av avläsningar från 2,5 mM glukos, 16,7 mM glukos, Oligomycin A, FCCP och Antimycin A som beskrivs i 3.3.1.
    4. Inom programmet respirometer analys, exportera avläsningarna för varje kammare efter att ange proteinkoncentration och välja lämpliga genomsnittliga värden för varje behandling under respiration mätningen. Detta görs genom att klicka på F2 och sedan trycka ”kopiera till Urklipp funktion”. Detta exporterar data för användning i andra analysprogram. Använd ”O2 lutning neg.” värden för beräkningar.
    5. Sammanställa data för 3-5 oberoende körningar av fordonet behandlas kontroller och naturliga föreningar behandlade cellerna för att avgöra effekten på intakt cellandningen av INS-1 832/13 beta-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

INS-1 832/13 beta-celler som är beredd och skördas som beskrivs i protokollet visar modulering syreförbrukning baserat på de olika kemiska insatserna (figur 1A). En ökning av respiration observeras när glukos koncentrationen ökas till 16,7 mM glukos (figur 1B). Respiration kommer att minska när de intakta cellerna behandlas med Oligomycin A. Denna andning kallas läcka, vilket definieras som det basala, nonphosphorylating respiratoriska tillståndet. Maximal andning kommer att uppnås när beta-cellerna behandlas med uncoupling agenten FCCP, som definieras som ETS respiration eller elektrontransport system respiration. Slutligen, andning kommer att sjunka till noll när de behandlas med Antimycin A, märkt som ROX (kvarvarande syreförbrukning) som avser icke-respiratoriska cellulära syreförbrukningen.

Skillnader i antalet celler kommer att avsevärt ändra kvaliteten på de uppgifter som erhållits från denna teknik. Glukos-inducera respiration mättes på 0,5, 1 och 2 x 106 celler/mL (figur 2A-2 C). Med hjälp av blodkroppar och BCA analyser protein, protein koncentrationer motsvarande tre testade cellen koncentrationer beräknades (figur 2D). Mätningar med 0,5 x 10 visade6 celler/mL inte styrkt att glukos-stimulerad respiration (figur 2A), och endast ETS tillhörande ökad respiration sig vara betydande. Detta tyder på att antalet lågt resulterar det i lågt signal-brus-förhållande som förvirrar resultaten. Likaså resulterat mätningar på 2 x 106 celler/mL också i betydande variationer, som indikeras av statistisk signifikans endast nåtts för ETS mätningar (figur 2 c). Detta beror förmodligen på att behöva åter syresätta kamrarna flera gånger under analysen, vilket resulterade i större variation från prov till prov. Dessa data visar att koncentrationerna av 1 x 106 celler/mL resultera i betydande glukos-stimulerad respiration, läcka och ETS mätningar, som är nödvändiga för respiration analyser (figur 2B och 2E).

Två metoder för att avlägsna celler för respiration presenteras i detta protokoll. Använda trypsin för att avlägsna celler är effektiv när mätningar genomförs vid 37 ° C. Respiration mätningar görs i frånvaron eller närvaron av curcumin (figur 3A) visar underhåll av glukos-stimulerad respiration, läcka och ETS respiration. Jämförelse av curcumin behandlade celler till obehandlade celler visar ingen förändring av någon av dessa respiratoriska parametrar (figur 3B-C). Respiration mätningar görs i frånvaron eller närvaron av kakao epicatechin monomer (figur 3D) visar också underhåll av glukos-stimulerad respiration, läcka och ETS respiration. Jämförelse av kakao epicatechin monomer behandlade celler till obehandlade celler visar ökad andning vid 2,5 mM och 16,7 mM glukos, liksom i läcka och ETS respiration (figur 3E-F). Dessa data visar att medan curcumin inte förbättra 832/13 beta cellandningen, kakao epicatechin monomer gör (figur 3 g). Curcumin har visat sig öka insulinutsöndringen genom att hämma fosfodiesteras aktivitet14. Våra data tyder på att curcumin inte ökar insulinutsöndringen genom modulerande mitokondriefunktion. Vi har redan visat att kulturen i närvaro av kakao epicatechin monomerer inducerar uttryck av olika komponenter av mitokondriell elektrontransport kedja5. Vi har också observerat ökad andning i tillståndet läcka (inducerad av behandling med oligomycin) och med ETS (elektronen transportsystemet, inducerad av FCCP). Användning av detta verktyg föreslår ett antal potentiella mål för framtida studier.

Som ett alternativ till trypsin borttagning av celler, kan mekaniska dissociation också utföras med hjälp av presenterade tvätt tekniken när klar vid 37 ° C. Respiration mätningar gjorda i frånvaron eller närvaron av curcumin eller kakao epicatechin monomer (figur 4A-C). Dessa data visar att de trender som observerats med trypsin beredning av cellerna bibehålls, men känsligheten verkar minskas. Medan kontrollen och kakao epicatechin monomer behandlade celler upprätthålls den glukos-stimulerad, behöll läcka och ETS respiration, celler behandlas med curcumin endast glukos-stimuleras andningen på grund av den ökade prov till prov variationen. Medan de trender som observerats med trypsin cell preparat bibehölls (figur 4 d-F), betydelse minskade i alla parametrar, förmodligen till den större prov till prov variation infördes genom mekanisk dissociation och normaliseringen till protein koncentration i stället för cell nummer.

Dessa data visar att detta protokoll kan användas att mäta respiration av intakt INS-1 832/13 beta-celler. Våra protokoll föreslår dessutom en optimal cell nummer för noggranna mätningar och en rekommenderad metod för att förbereda cellerna för att maximera signal-brusförhållande.

Figure 1
Figur 1 : Representativa respiration kurvan av intakt 832/13 betacellerna. Intakt 832/13 betacellerna mäts för respiration i (figur 1A), 2,5 mM glukos, 16,7 mM glukos, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP (Karbonylklorid cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) och 2,5 µM Antimycin A. En expansion av 16,7 mM glukos avsnitt (figur 1B) presenteras för att Visa ökningen av glukos-stimulerad respiration. Celler mättes med en koncentration på 1 x 106 celler/mL. LÄCKA refererar till det basala nonphosphorylating respiratoriska tillståndet, ETS refererar till elektronen transportsystemet uncoupled respiratoriska kapacitet och ROX refererar till kvarstående syreförbrukningen efter mitokondriell andningen hämmas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Bestämning av antalet 832/13 beta celler nödvändiga för glukos-inducerad respiration mätningar. Intakt 832/13 betacellerna mäts för respiration vid koncentrationer av (A) 0,5 x 106 celler/mL (B) 1 x 106 celler/mL, eller (C) 2 x 106 celler/mL. (D) Protein koncentrationer som motsvarar 0,5 x 106 celler/mL, 1 x 106 celler/mL och 2 x 106 celler/mL. (E) jämförelse av andning på 0,5 x 106 celler/mL, 1 x 106 celler/mL och 2 x 106 celler/mL. Respiration mättes under 2,5 mM glukos, 16,7 mM glukos, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP och 2,5 µM Antimycin A villkor. Andning med 2,5 och 16,7 mM glukos visar glukos-stimulerad respiration svaret av betacellerna. Respiration efter oligomycin visar den läcka respirationen (basal, nonphosphorylating respiratoriska tillstånd). Respiration efter FCCP (Karbonylklorid cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling visar (okopplade respiratoriska kapacitet elektronen transportsystemet, ETS). n = 6 oberoende körningar. Data presenteras som Genomsnittligt ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Respiration mätningar av 832/13 beta-celler efter release använder trypsin. 832/13 beta-cellerna odlades i närvaro eller frånvaro av monomer kakao epicatechin eller curcumin och respiration mättes efter släppa celler med hjälp av trypsin. Respiration mättes under 2,5 mM glukos, 16,7 mM glukos, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP och 2,5 µM Antimycin A villkor. Andning med 2,5 och 16,7 mM glukos visar glukos-stimulerad respiration. Respiration efter oligomycin visar den läcka respirationen (basal, nonphosphorylating respiratoriska tillstånd). Respiration efter FCCP (Karbonylklorid cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling visar (okopplade respiratoriska kapacitet elektronen transportsystemet, ETS). Respiration efter antimycin en behandling visar återstående syreförbrukning (ROX). (A) behandling av 832/13 celler med curcumin upprätthåller lämpliga ändringar i andning på grund av behandlingarna. (B) representativa trace och (C) medelvärde av data för celler behandlas med curcumin visar ingen förändring av 832/13 beta cellandningen. (D) behandling av 832/13 celler med kakao epicatechin monomer upprätthåller lämpliga ändringar i andning på grund av behandlingarna. (E) representativa trace och (F) genomsnittliga data för kakao epicatechin monomer behandlade celler visar ökad andning i alla parametrar efter kakao epicatechin monomer behandling. (G) alla tre parametrar presenteras tillsammans för jämförelse. n = 6 oberoende körningar. Data presenteras som Genomsnittligt ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Respiration mätningar av 832/13 beta-celler efter release använder mekaniska dissociation. 832/13 beta-cellerna odlades i närvaro eller frånvaro av monomer kakao epicatechin eller curcumin och respiration mättes efter släppa celler med hjälp av mekaniska dissociation. Respiration mättes under 2,5 mM glukos, 16,7 mM glukos, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP och 2,5 µM Antimycin A villkor. Andning med 2,5 och 16,7 mM glukos visar glukos svaret av betacellerna. Respiration efter oligomycin visar den läcka respirationen (basal, nonphosphorylating respiratoriska tillstånd). Respiration efter FCCP (Karbonylklorid cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling visar (okopplade respiratoriska kapacitet elektronen transportsystemet, ETS). Medelvärde av data för celler (A) obehandlade celler eller celler behandlas med curcumin (B) eller (C) kakao epicatechin monomer demonstrera den mekaniska dissociationen upprätthåller glukos-stimulerad andning i alla behandlingar, medan läcka och ETS betydelse är förlorat endast i curcumin behandlade celler. Jämförelse av obehandlade celler att curcumin (D) eller (E) kakao epicatechin monomer visar ökad andning i alla parametrar med kakao epicatechin monomer utan betydande ändring andning med curcumin. (F) alla tre parametrar presenteras tillsammans för jämförelse. n = 6 oberoende körningar. Data presenteras som Genomsnittligt ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syftet med detta protokoll är att använda högupplösta respiration för att mäta andningsfrekvens i intakt betaceller. Denna metod tillåter mätning av beta-cellssvar ökade blodsockernivåer. Protokollet tillåter också för förbehandling med olika föreningar, som visat i detta protokoll med naturligt förekommande monomer epicatechin eller curcumin4,5. Behandling med olika andra föreningar kan användas i detta protokoll med förbehandling (som visas här) eller genom att behandla inom respiratorisk kamrarna med minimala ändringar i bas protokollet.

Det finns olika sätt som denna metod kunde ändras. Andra beta cellinjer kan användas; dock kommer att de mobilnummer och SAB tvätt tider behöva bestämmas experimentellt. Primära gnagare och mänskliga holmar skulle också kunna användas; dock måste antalet celler eller holme medel också bestämmas experimentellt. Minst en studie har mätt holme syreförbrukning använder högupplösta respiration15. Denna studie krävs 400 holmar per reaktion, men mäta inte glukos inducerad respiration förändringar. Med tanke på att primära vävnad används ofta med högupplösta respirometers16,17, kunde intakt holmar användas efter experimentell felsökning. Men kan med tanke på det stora antalet holmar som krävs för denna analys, andra metoder för att mäta syreförbrukning vara bättre lämpade för mätningar av primära holme respiration.

Det finns några kritiska steg med protokollet presenteras. Först, att ha ett tillräckligt antal celler är kritiskt. Våra studier visar att 832/13 beta-celler vid en koncentration på 1 x 106 celler/mL räcker för glukos-stimulerad respiration mätningar. Mätningar med 0,5 x 10 visat6 celler/mL låg glukos-stimulerad andning och en låg signal-brus-förhållande. Dessutom resulterade mätningar med 2 x 106 celler/mL i hög prov till prov variation och snabb cellulära användning av syre som krävs kammare åter syresätta och ofta resulterade i snabb celldöd. Lämpligt antal celler bör fastställas experimentellt för viss cell linje för att felsöka detta kritiska steg.

En andra kritiska steget förbereder betacellerna att bemöta förhöjda blodsockernivåer. RPMI 1640 kulturmassmedia har högt blodsocker. Cellerna måste flyttas från den höga glukosen till en låg glukos kultur. En 3 h inkubation i 1 x låg glukos SAB räcker för beta-cellerna ha en betydande svar på tillägg av ~16.7 mM glukos. Tvätta perioder på mindre än 3 h resultatet i variabel Svaren till tillsats av glukos. Felsökning av glukos svar problem kan åtgärdas genom att öka längden på SAB tvätt tid.

En tredje kritiska steget är metoden för att förbereda cellerna mätningar. Våra data visar att medan trypsin och mekaniska dissociation kan både användas, trypsin släppt celler resultat mer konsekventa mätvärden och färre prov till prov variation. Den trenden som observerats med båda metoderna bibehölls, men styrkan i data var större med celler tillagade av trypsin. Medan andra metoder, såsom cell skrapning, kan användas för tyder våra data på att användning av trypsin kommer att resultera i de mest reproducerbara resultat med mindre prov till prov variation18,19.

Begränsningarna med denna metod inkluderar följande. Först, med endast två behandling kammare, detta är inte en hög genomströmning screening metod. Varje körning av två prover tar mellan 3-4 h, inklusive den tid att förbereda maskinen. För det andra krävs en relativt stor koncentration av celler för analysen, med tanke på de ~2.2 mL av provet (eller ~2.2 x 106 celler) behövs per kammare. På grund av de prov som behövs för analysen, är användningen av detta verktyg och protokoll för primära holmar begränsad om inte en stor leverans är tillgänglig. De tidigare studier som har använt holmar för respiration i denna teknik används ~ 400 holmar/chamber15. Detta skulle kräva, ungefär, holmar från två möss för varje kammare20. Tredje eftersom permeabilized celler inte används, är förmågan att avgöra effekten av behandlingen på enskilda elektronen kedja komponenter med hjälp av föreningar som inte är cell genomsläppliga inte tillgängligt.

I området i närheten finns det ett antal betydande fördelar av detta protokoll med avseende på befintliga metoder. Första tillåter detta protokoll för stegvis titrering av olika membran genomsläpplig föreningar. Detta möjliggör exakt bestämning av nödvändiga koncentrationer. Andra, användningen av intakt betacellerna tillåter oss att fråga effekten på cytosoliska och mitokondrie glukos metabolism7. Detta tillåter oss att iaktta fenotyper vägledande av ändringar glycolytic vägen, en observation som försvinner när du använder permeabilized celler. För det tredje, intakt cellerna tillåter oss att använda svaret till förhöjda glukos som ett mått på betacellernas funktion, som är förlorade i permeabilized varianter av denna analys. Slutligen tillåter detta protokoll tillägg av olika och flera föreningar att fråga effekten av föreningar på beta cellandning, en lyx som inte är närvarande med andra verktyg som mäter respiration.

Framtida tillämpningar av denna metod inkluderar möjligheten att mäta parametrar såsom ATP, kalcium och H2O2 nivåer samtidiga med respiration mätningar. Denna metod kan också för mätning av andning i närvaro av andra bränslekällor, såsom fettsyror eller ketoner. Slutligen, med vissa modifieringar, mäta utsöndras insulinnivåer samtidig med respiration mätningar kan också vara möjligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka medlemmarna av de Tessem och Hancock laboratorier för assistent och vetenskapliga diskussionen. Författarna vill tacka Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) för att tillhandahålla den kakao härledda epicatechin monomer fraktionen. Denna studie stöddes av ett bidrag från Diabetes aktionsforskning och Education Foundation till JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
  4. Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
  5. Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
  6. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
  7. Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
  8. Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
  9. Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
  10. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  11. Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
  12. Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
  13. Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
  14. Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
  15. Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
  16. Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
  17. Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
  18. Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
  19. Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
  20. Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).

Tags

Cellbiologi fråga 131 Beta cellen mitokondrier respiration glukos högupplösta respiration kakao epicatechin monomer curcumin
Högupplösta respiration att mäta mitokondriefunktion av intakt betacellerna i närvaro av naturliga föreningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock,… More

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter