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Biology

Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

El objetivo de este protocolo es medir el efecto de la glucosa mediada por cambios en la respiración mitocondrial en presencia de compuestos naturales en las células beta de la intacta 832/13 mediante respirometría de alta resolución.

Abstract

Respirometría de alta resolución permite la medición de consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas, células y tejidos. Las células beta juega un papel fundamental en el cuerpo por controlar niveles de glucosa en sangre a través de la secreción de insulina en respuesta a las concentraciones de glucosa elevada. La secreción de insulina es controlada por la respiración mitocondrial y el metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, medir respiración intacta de la célula beta es esencial para poder mejorar la función de célula beta como tratamiento para la diabetes. Con intacto 832/13 INS-1 derivados de las células beta podemos medir el efecto de aumentar la concentración de glucosa en la respiración celular. Este protocolo nos permite medir la respiración de la célula beta en la presencia o ausencia de diferentes compuestos, que le permitirán determinar el efecto de dar compuestos sobre la respiración de la célula intacta. Aquí se demuestra el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta bajo la presencia de condiciones de alta glucosa (16,7 mM) o baja (2,5 mM). Esta técnica puede utilizarse para determinar el efecto de diversos compuestos sobre la respiración de la célula beta intacta en presencia de diferentes concentraciones de glucosa.

Introduction

El propósito principal de la célula beta pancreática es mantener sistema normoglycemia a través de la secreción de insulina estimulada por glucosa. Las células beta detecta cambios fisiológicos en la circulación de la glucosa en gran parte debido a la baja afinidad, transportador de glucosa de alta capacidad GLUT2 (glucosa transportador 2, Km 16,7 mM)1. Al aumentar los niveles de glucosa circulatoria, este transportador de baja afinidad alta capacidad facilita un aumento proporcional de la glucosa intracelular dentro de la célula beta. La glucosa se metaboliza a través de la glucólisis, el ciclo TCA (ciclo del ácido tricarboxílico) y respiración mitocondrial que resulta en elevados niveles celulares de ATP (trifosfato de adenosina). La concentración elevada de ATP bloquea los canales de ATP sensibles K+ , dando por resultado la despolarización de la membrana. Despolarización de la membrana provoca la apertura de canales de Ca2 + voltaje cerrada y posterior liberación de la vesícula obligado de gránulos de insulina2. Disfunción de célula beta es un sello de la Diabetes tipo 2 (T2D) y resulta en la secreción de insulina disminuida y mal controlada y en última instancia de la muerte de la célula beta3. Mecanismos que mantengan o mejoran la función de célula beta podrían ser utilizados como un tratamiento para T2D.

Los estudios han demostrado los efectos beneficiosos de origen natural compuestos a base de plantas en la célula beta pancreática4. Estos compuestos pueden tener su efecto a través de la creciente proliferación de la célula beta, la supervivencia o la secreción de insulina estimulada por glucosa. Por ejemplo, estudios recientes han demostrado que la antocianina monomérica aumenta la secreción de insulina estimulada por glucosa mediante el aumento de la respiración mitocondrial y aumento de ATP celular niveles5. Por lo tanto, entender cómo estos compuestos pueden aumentar la célula beta funcional masa es importante aprovechar estos compuestos como terapéutica potencial.

Respiración celular puede medirse a través de una serie de herramientas. Uso de un respirómetro alta resolución permite la titulación de moduladores químicos a una población celular permeabilized o intacto del6. Esta herramienta permite la adición de compuestos diversos, a diferentes concentraciones, dando así una amplia gama de información.

Dada la íntima conexión entre metabolismo de la glucosa y la función de células beta, las mediciones de la respiración celular son críticas. Las mediciones de la respiración celular se pueden hacer con que las células beta permeabilized o intactas, cada uno con su propio conjunto de ventajas y desventajas de7,8. Mientras que la permeabilización de las células beta permite medir diferentes aspectos de la cadena de transporte de electrones, lo hace sin respeto al mecanismo para inducir la respiración en la célula beta, la absorción de la glucosa y el metabolismo. Por lo tanto, el uso de la respiración de la célula beta unpermeabilized es una técnica muy útil para determinar la respuesta de las células beta a diversos niveles de la glucosa, utilizando el consumo de oxígeno como la lectura.

El propósito de esta técnica es medir consumo de oxígeno intactas INS-1 derivados de las células beta 832/13. Esta técnica nos permite determinar la respuesta de las células beta a las condiciones unstimulatory de la glucosa (glucosa 2,5 mM) así como de las condiciones estimulantes glucosa (16,7 mM de glucosa). Mientras que las células unpermeabilized no nos permiten probar individualmente complejo I, II o III del electrón transporte de cadena, la técnica de permitir mediciones con respiración de inhibición (Oligomycin A), desacoplada IV complejo (FCCP-carbonilo cianuro- 4- phenylhydrazone (de trifluoromethoxy)) y totalmente inhibida (Antimycin A) la respiración. Este estudio demuestra la eficacia de la medición de la respiración en intactas unpermeabilized las células beta pancreáticas, así como el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta.

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Protocol

1. cultivo celular

  1. Derivado de la cultura INS-1 832/13 beta células en RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina de 1%, 10 mM HEPES, 2 mM glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0.05 mM de 2-Mercaptoetanol9,10,11 ,12,13.
  2. Eliminar las células 832/13 un frasco T75 utilizando 2 mL de tripsina 0.25%, incubar a 37 ° C por 10 minutos neutralizar tripsina mediante la adición de 8 mL de Medio RPMI 1640 completo.
  3. Contar las células usando un hemocitómetro y diluir 100 μl del volumen celular de paso 1.2 en 900 μl de PBS.
  4. Las células de la placa 832/13 con una densidad de 2 x 106 células/mL en 6 plato bien.
  5. Células en cultivo durante 48 h en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% de CO2 antes de comenzar los experimentos de respiración.

2. preparación de células de alta resolución respirometría

  1. Tratamiento de las células de 832/13 con monómero epicatequina derivados cacao.
    1. La cultura 832/13 células durante 24 h después de la siembra en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Cambiar medios de 24 h después de la galjanoplastia y tratar células 832/13 con control del vehículo (3 pozos) o monómero de nM cacao 100 (3 pozos), seguido por la cultura para un adicional 24 h (48 h en total) en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.
    3. Lavar las células 832/13 en 1 x baja glucosa secreción tampón de ensayo (SAB) para 5 minutos aspirado buffer e incubar células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB 3 h, cambio 1 x glucosa baja SAB cada hora.
      1. Hacer 10 x SAB con 33,32 g de NaCl, 1,73 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, 0.7 g de MgSO4 y H2O a un volumen final de 500 mL. Filtro estéril la solución final.
      2. Hacer 1 x glucosa baja SAB con 10 mL de 10 x SAB, 100 μl de glucosa 45%, 2 mL de HEPES, 1 mL de 1 M de 0.25M CaCl2, 0,57 mL de solución de BSA de 35%, 0,21 g de NaHCO3 y H2O a un volumen final de 100 mL. Filtro estéril la solución final.
  2. Tratamiento de células 832/13 con curcumina.
    1. La cultura 832/13 células durante 48 h después de la siembra en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Lavar las células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB para el tampón de aspirado de 5 minutos e incubar células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB 3 h, cambio 1 x glucosa baja SAB cada hora.
    3. Después de 2,5 h de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, Aspire buffer e incubar las células en 1 x baja glucosa SAB con control del vehículo o 40 μm curcumina durante 30 minutos. Tras la incubación, aspirar el búfer.
  3. Recolección de células con tripsina de respirometría de alta resolución
    1. Después de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, extraer las células de la placa con 250 μl de tripsina 0.25% por pozo.
    2. Combinar las celdas de tripsina de 3 pozos tratados con control del vehículo o el compuesto de interés con 4 mL de SAB en un tubo cónico de 15 mL.
    3. Contar las células usando un hemocitómetro y diluir 100 μl del volumen celular de paso 2.3.2 en 900 μl de PBS.
    4. Diluir el número apropiado de células en 1 x glucosa baja SAB hacer 3 mL en la concentración adecuada para cada cámara. Los datos demuestran que una concentración de 1 x 106 células/mL es el más eficaz.
  4. Recolección de células con disociación mecánica de respirometría de alta resolución
    1. Después de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, añadir 1 mL de 1 x baja glucosa SAB a cada bien y suavemente soplar las células de la placa con la disociación mecánica mediante pipeteo con una pipeta de 1000 μl.
    2. Combinar las celdas de 3 pozos tratados con control del vehículo o el compuesto de interés en un total de 3 mL SAB en un tubo cónico de 15 mL para la respiración.

3. alta resolución respirometría

  1. Preparación de la alta resolución respirómetro.
    1. Encienda el respirómetro de alta resolución y conectar al escritorio con el lanzamiento del programa de análisis del respirómetro.
    2. Aspire el etanol al 70% de ambas cámaras. Disfrutar de estas cámaras en etanol al 70% durante un mínimo de 45 minutos.
    3. Lavar las cámaras dos veces con etanol al 70%, aspirar después de cada paso.
    4. Lavar las cámaras tres veces con ddH2O, aspirando después de cada paso.
    5. Enjuague los émbolos de cámara en el ddH2O. Esto limpia de etanol residual de los émbolos y desde el puerto de titanio.
  2. Calibración de sensores de oxígeno polarográfico.
    1. Añadir a cada cámara oxygraph, revolviendo el búfer continuamente por medio de barras de agitación magnética en la cámara a 750 rpm y 37 ° C con un intervalo de registro de datos en 2.0 2,4 mL de 1 x buffer de baja glucosa SAB s pulsando la tecla F7 y abriendo la pestaña con la etiqueta "Sistemas". Empujar los émbolos en y luego retraerse a la posición de aireación de la llave. Deje que la máquina equilibrar por un mínimo de 1 hora hasta que se obtiene el flujo de oxígeno estable.
    2. Coloque la máquina a 37 ° C durante la duración del experimento. Ajustar la tensión de polarización a 800 mV, con una ganancia de 2 pulsando la tecla F7 y abriendo la ficha marcada "Oxígeno, O2". Equilibrar la concentración de oxígeno del búfer SAB durante al menos 30 minutos, mientras que el cambio en la concentración de oxígeno es estable (menos de 2 pmol/(s*mL)).
    3. Tras la estabilización de la concentración de oxígeno, seleccionar una región donde el cambio de concentración de oxígeno es estable para establecer la medida de fondo de cambio en la concentración de oxígeno.
      1. Seleccione una región pulsando la tecla shift, click izquierdo del mouse y arrastrando el ratón a través de la región seleccionada. Haga clic en la letra asociada con la región seleccionada y el cambio a "R1" para cada rastro, correspondiente con cada una de las dos cámaras.
      2. Haga doble clic en el cuadro "O2 calibración" en la parte inferior izquierda y esquinas de la pantalla a la derecha, haga clic en el botón "select marca" para la "calibración de aire" como R1 y luego seleccione "calibrar y copiar al portapapeles" para ambas cámaras.
  3. Evaluación de la respiración de las células beta 832/13 había elaborado en pasos 2.1.5 o 2.2.5.
    1. 2,4 mL de muestra en cada cámara (una cámara con control vehículo tratado las células, una cámara con células tratadas compuestas) de la carga en 1 x baja glucosa Sab Conservar 0,5 mL de muestra de células para la cuantificación de proteínas por ensayo BCA (ácido Bicinchoninic) si se utiliza el enfoque de disociación mecánica (congelación a-20 ° C para la medición más adelante).
      1. Empuje el émbolo y aspirar el volumen residual. Remover las células continuamente durante todo el experimento en 750 rpm y 37 ° C durante todos los pasos posteriores. Haga una marca haciendo clic en F4 y etiquetado como "células" cuando se cargan las muestras.
      2. Medir las muestras durante 30 minutos. Después de la estabilización de la señal, seleccione una región del cambio en la concentración de oxígeno correspondiente a las condiciones de baja glucosa (glucosa de 2.5 mM) como se describe en 3.2.3.
    2. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 12,5 μl de una solución de glucosa estéril 45% (concentración final de 16,7 mM) en cada compartimiento a través de titanio puerto utilizando una jeringa de carga. Hacer que una marca de medida "Glucosa", como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione la región del cambio en la concentración de oxígeno, como se describe en 3.2.3. Esta es la lectura de glucosa de 16,7 mM y corresponde con las condiciones de estimulación7.
    3. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 μl de oligomycin 5mM (2,5 μm concentración final) en cada compartimiento a través del puerto de carga. Hacer que una marca de medida "OligoA" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3. A Oligomycin inhibe la ATP Sintetasa y por lo tanto el único oxígeno flujo que ocurre es por pérdida de electrones y no de la fosforilación oxidativa7.
    4. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 mM FCCP en incrementos de 1 μl hasta que se establezca una tasa de respiración máxima. Esto representa máxima respiración desacoplada. Entre 3-4 μL FCCP es suficiente (1.5-2.0 μm concentración final) para inducir la respiración desacoplada máxima de células de INS-1 832/13. Haga una marca con la etiqueta "FCCP" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3. FCCP es un agente Desacoplador. Esto nos permite medir respiración desacoplada7.
    5. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 μl de 5 mM antimicina A (concentración final de 2.5 μm) en cada compartimiento a través del puerto de carga. Haga una marca con la etiqueta "AntiA" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3.
      Nota: Antimycin A une citocromo C reductasa inhibe la oxidación de la ubiquinona y bloquea la respiración de todos. Esto nos permite parar completamente la respiración7.
  4. Medición de las células beta de 832/13 para la normalización de la proteína concentración y respiración.
    1. Usando 0.5ml de muestra retenida en el cargamento, muestra de proteína medida usando el método BCA13.
    2. Ejecute cada muestra por triplicado, sin dilución, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. 832/13 cálculos de respiración de la célula beta de células tripsinizaron.
    1. Introduzca el número de células por mL uso en el ensayo pulsando la tecla F3 del programa de análisis del respirómetro. Cambiar las unidades a células/mL, introducir la concentración celular y cambiar el medio Sab a
    2. Seleccionar lecturas de fondo para normalizar los datos seleccionando y entrar en el O2 forma de calibración como se describe en 3.2.3.
    3. Hacer selecciones de lecturas de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM de glucosa, A Oligomycin, FCCP y Antimycin A como se describe en 3.3.1.
    4. Dentro del programa de análisis del respirómetro, exportar las lecturas para cada cámara después de entrar en la concentración de proteína y seleccionando los valores medios apropiados para cada tratamiento durante la medición de la respiración. Esto se hace haciendo clic en F2 y luego empuja la "copia a la función de Portapapeles". Exporta los datos para su uso en otros programas de análisis. Utilice los valores "O2 cuesta neg." para los cálculos.
    5. Compilar datos para 3-5 funciona independiente del vehículo tratado controles y naturales compuestos de células tratadas para determinar el efecto sobre intacto respiración celular de las células beta INS-1 832/13.
  6. 832/13 cálculos de respiración de la célula beta de disociaron mecánicamente las células.
    1. Entrar en los cálculos de proteína desde el ensayo BCA pulsando la tecla F3 del programa de análisis del respirómetro. Cambiar las unidades a mg, entrar en la concentración de BCA y cambiar el medio Sab a
    2. Seleccionar lecturas de fondo para normalizar los datos seleccionando y entrar en el O2 forma de calibración como se describe en 3.2.3.
    3. Hacer selecciones de lecturas de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM de glucosa, A Oligomycin, FCCP y Antimycin A como se describe en 3.3.1.
    4. Dentro del programa de análisis del respirómetro, exportar las lecturas para cada cámara después de entrar en la concentración de proteína y seleccionando los valores medios apropiados para cada tratamiento durante la medición de la respiración. Esto se hace haciendo clic en F2 y luego empuja la "copia a la función de Portapapeles". Exporta los datos para su uso en otros programas de análisis. Utilice los valores "O2 cuesta neg." para los cálculos.
    5. Compilar datos para 3-5 funciona independiente del vehículo tratado controles y naturales compuestos de células tratadas para determinar el efecto sobre intacto respiración celular de las células beta INS-1 832/13.

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Representative Results

INS-1 832/13 beta células que son preparadas y cosecha como se describe en el protocolo de demostrará la modulación en el consumo de oxígeno, basado en las diversas intervenciones químicas (figura 1A). Se observó un aumento en la respiración cuando la concentración de glucosa se incrementa a 16,7 mM de glucosa (figura 1B). La respiración disminuye cuando se tratan de las células intactas Oligomycin A. Esta respiración se conoce como escape, que se define como el estado respiratorio basal, nonphosphorylating. Respiración máxima se conseguirá cuando las células beta son tratadas con el agente Desacoplador FCCP, que se define como respiración de ETS, o respiración del sistema de transporte de electrones. Por último, respiración bajará a cero cuando se tratan con antimicina A, etiquetado como ROX (consumo de oxígeno residual) que se refiere al consumo de oxígeno celular no respiratoria.

Diferencias en el número de la célula cambiará significativamente la calidad de los datos obtenidos por esta técnica. Respiración de inducir a la glucosa fue medida en 0.5, 1 y 2 x 106 células/mL (figura 2A-2 C). Con recuentos de células y BCA ensayos de proteína, concentraciones de la proteína correspondiente a la celda de prueba tres concentraciones se calcularon (Figura 2D). Mediciones utilizando 0.5 x 106 células/mL no pudieron demostrar la respiración estimulada por la glucosa (figura 2A) y sólo las ETS asociados respiración creciente fue demostrado para ser importante. Esto sugiere que el número de celular bajo resulta en una baja de la señal a ruido que confunde los resultados. Del mismo modo, medidas 2 x 106 células/ml también dio lugar a variabilidad significativa, como lo indica significancia estadística se alcanzó sólo para las mediciones de ETS (figura 2). Esto es probablemente debido a la necesidad de volver a oxigenar las cámaras varias veces durante el ensayo, que dio lugar a una mayor variabilidad de las muestras. Estos datos demuestran que las concentraciones de 1 x 106 células/mL como resultado importante respiración estimulada por glucosa, fugas y ETS mediciones que son necesarias para el análisis de la respiración (figura 2B y 2E).

En este protocolo, se presentan dos métodos para la eliminación de las células para la respiración. Utilizando tripsina para eliminar las células es efectiva cuando se hayan completado las mediciones a 37 ° C. Las mediciones de la respiración en la ausencia o presencia de curcumina (Figura 3A) demuestra mantenimiento de glucosa-estimula la respiración, respiración fugas y ETS. Comparación de curcumina tratada las células a las células no tratadas muestra ningún cambio en cualquiera de estos parámetros respiratorios (figura 3B-C). Las mediciones de la respiración en la ausencia o presencia de monómeros de epicatequina del cacao (figura 3D) también demuestra mantenimiento de glucosa-estimula la respiración, respiración fugas y ETS. Comparación de epicatequina del cacao monómero tratar células a células no tratadas demuestra mayor respiración en 2.5 mM y 16,7 mM de glucosa, así como en fugas y ETS la respiración (figura 3E-F). Estos datos demuestran que mientras que la curcumina no mejorar la respiración de la célula beta de 832/13, monómeros de epicatequina del cacao no (figura 3). La curcumina ha demostrado aumentar la secreción de insulina por inhibición de fosfodiesterasa actividad14. Nuestros datos sugieren que la curcumina no mejora la secreción de insulina a través de la modulación de la función mitocondrial. Ya hemos demostrado que la cultura en la presencia de monómeros de epicatequina del cacao induce la expresión de los diversos componentes de la cadena de transporte de electrones mitocondrial5. También observamos respiración creciente en el estado de fuga (inducida por el tratamiento con oligomycin) y ETS (sistema de transporte de electrones, inducida por el FCCP). El uso de esta herramienta sugiere una serie de objetivos potenciales para futuros estudios.

Como alternativa a la eliminación de la tripsina de las células, disociación mecánica también se puede realizar mediante la técnica de lavado presentado terminada a 37 ° C. Se realizaron mediciones de la respiración en la ausencia o presencia de curcumina o monómeros de epicatequina del cacao (Figura 4A-C). Estos datos demuestran que se mantienen las tendencias observadas con preparación de tripsina de las células, sin embargo la sensibilidad parece ser disminuido. Mientras monómero epicatequina cacao y control de las células que mantienen la glucosa estimulado, fugas y ETS la respiración, las células tratadas con curcumina sólo retuvo la respiración estimulada por la glucosa debido a la creciente variabilidad de muestra a muestra. Mientras que las tendencias observadas con preparaciones celulares de tripsina se mantuvieron (figura 4-F), la significación disminuida en todos los parámetros, probablemente a la mayor variabilidad de muestra a muestra, introducido por la disociación mecánica y la normalización para número de concentración en lugar de la célula de la proteína.

Estos datos demuestran que este protocolo puede utilizarse para medir la respiración de las células beta de intactas INS-1 832/13. Además, nuestro protocolo indica un numero de celular óptima para mediciones de precisión y un método para preparar las células para maximizar la relación señal a ruido.

Figure 1
Figura 1 : Curva representativa de la respiración de las células beta intacta 832/13. Las células beta intacta 832/13 se miden para la respiración en Oligomycin (figura 1A) 2,5 mM glucosa, 16,7 mM glucosa, 2.5 μm, μm 2 FCCP (carbonilo cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) y 2.5 μm antimicina Una expansión de lo 16,7 mM sección de glucosa (figura 1B) se presenta para demostrar el aumento en la respiración estimulada por glucosa. Las células fueron medidas en una concentración de 1 x 106 células/mL. FUGA se refiere al estado respiratorio basal, nonphosphorylating, ETS se refiere a la capacidad respiratoria desacoplada del sistema de transporte de electrones, y ROX se refiere al consumo de oxígeno residual después de que se inhibe la respiración mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Determinación del número de células beta de 832/13 necesarias para las mediciones de glucosa inducida por la respiración. Las células beta intacta 832/13 se miden para la respiración en las concentraciones de (A) 0,5 x 106 células/mL (B) 1 x 106 células/mL, o (C) 2 x 106 células/mL. (D) las concentraciones de proteína que se corresponden con 0,5 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL y 2 x 106 células/mL. (E) comparación de la respiración en 0.5 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL y 2 x 106 células/mL. Respiración se midió menos de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM glucosa, 2.5 μm Oligomycin, 2 μm FCCP y 2,5 μm Antimycin A condiciones. Respiración con 2.5 y 16,7 mM de glucosa demuestran la respuesta de glucosa-estimula la respiración de las células beta. Respiración después de oligomycin demuestra la respiración fugas (estado respiratorio basal, nonphosphorylating). Respiración después de FCCP (carbonilo cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tratamiento demuestra (capacidad respiratoria desacoplada del sistema de transporte de electrones, ETS). n = 6 pistas independientes. Datos se presentan como promedio ± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, *** p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Las mediciones de la respiración de las células beta 832/13 después de lanzamiento utilizando tripsina. 832/13 beta células fueron cultivadas en la presencia o ausencia de antocianina monomérica de cacao o la curcumina y la respiración se midió después de soltar las células utilizando tripsina. Respiración se midió menos de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM glucosa, 2.5 μm Oligomycin, 2 μm FCCP y 2,5 μm Antimycin A condiciones. Respiración con 2.5 y 16,7 mM de glucosa demuestran la respiración estimulada por glucosa. Respiración después de oligomycin demuestra la respiración fugas (estado respiratorio basal, nonphosphorylating). Respiración después de FCCP (carbonilo cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tratamiento demuestra (capacidad respiratoria desacoplada del sistema de transporte de electrones, ETS). Respiración después de antimicina un tratamiento muestra el consumo de oxígeno residual (ROX). (A) tratamiento de células de 832/13 con curcumina mantiene los cambios apropiados en la respiración debido a los tratamientos. Seguimiento representativo (B) y (C) promedio de datos para las células tratadas con curcumina no muestra ningún cambio en la respiración de la célula beta de 832/13. (D) tratamiento de 832/13 células con los monómeros de epicatequina del cacao mantiene los cambios apropiados en la respiración debido a los tratamientos. Rastro de representante (E) y (F) promedio de datos para epicatequina del cacao monómero tratar células demuestra mayor respiración en todos los parámetros después del tratamiento de monómeros de epicatequina del cacao. (G) los tres parámetros se presentan juntos para la comparación. n = 6 pistas independientes. Datos se presentan como promedio ± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, *** p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Las mediciones de la respiración de las células beta 832/13 después de lanzamiento mediante disociación mecánica. 832/13 beta células fueron cultivadas en la presencia o ausencia de antocianina monomérica de cacao o la curcumina y la respiración se midió después de soltar las células mediante disociación mecánica. Respiración se midió menos de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM glucosa, 2.5 μm Oligomycin, 2 μm FCCP y 2,5 μm Antimycin A condiciones. Respiración con 2.5 y 16,7 mM de glucosa demuestran la respuesta de la glucosa de las células beta. Respiración después de oligomycin demuestra la respiración fugas (estado respiratorio basal, nonphosphorylating). Respiración después de FCCP (carbonilo cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) tratamiento demuestra (capacidad respiratoria desacoplada del sistema de transporte de electrones, ETS). Promedio de datos para las células (A) no tratan de células o células tratadas con curcumina (B) o monómeros de epicatequina del cacao (C) demostrar que disociación mecánica mantiene respiración estimulada por glucosa en todos los tratamientos, mientras que la fuga y Significado ETS se pierde solamente en células tratada la curcumina. Comparación de las células no tratadas (D) la curcumina o monómeros de epicatequina del cacao (E) muestra mayor respiración en todos los parámetros con monómero epicatequina del cacao sin cambios significativos en la respiración con curcumina. (F) los tres parámetros se presentan juntos para la comparación. n = 6 pistas independientes. Datos se presentan como promedio ± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El objetivo de este protocolo es utilizar respirometria de alta resolución para medir tasas respiratorias en intacto las células beta pancreáticas. Este método permite la medición de la respuesta de la célula beta a niveles creciente de la glucosa. El protocolo también permite el tratamiento previo con varios compuestos, como se demuestra en el presente Protocolo con el natural monómero epicatequina o curcumina4,5. Tratamiento con varios otros compuestos podría utilizarse en el presente Protocolo, con tratamiento previo (como se muestra aquí) o por el tratamiento dentro de las cámaras respiratorias con mínimas modificaciones en el protocolo base.

Hay varias maneras por la que se puede modificar este método. Podrían utilizarse otras líneas de la célula beta; No obstante, el número de células y tiempos de lavado SAB debe determinarse experimentalmente. Roedor primaria e islotes humanos también podrían ser utilizados; sin embargo, el número de células o islote equivalentes también tendrá que determinarse experimentalmente. Al menos un estudio ha medido el consumo de oxígeno del islote mediante respirometría alta resolución15. Este estudio requiere 400 islotes por reacción, pero no mide la glucosa inducida por cambios de respiración. Dado que el primario del tejido se utiliza con frecuencia con alta resolución respirometers16,17, islotes intactos podrían utilizarse después de la resolución de problemas experimentales. Sin embargo, dado el gran número de islotes requerido para este ensayo, otros métodos de medición de consumo de oxígeno pueden ser más adecuados para la medición de la respiración primaria islote.

Hay algunos pasos críticos con el protocolo presentado. En primer lugar, es fundamental tener un número adecuado de células. Nuestros estudios demuestran que las células beta de 832/13 en una concentración de 1 x 106 células/mL es suficiente para las mediciones de glucosa-estimula la respiración. Mediciones utilizando 0.5 x 106 células/mL demostraron respiración estimulada por la glucosa baja y una baja relación señal a ruido. Además, mediciones con 2 x 106 células/mL dio lugar a la alta variabilidad de muestra a muestra y rápida utilización celular de oxígeno que requiere volver a oxigenar y frecuentemente resultó en la muerte celular rápida. El número de células adecuado debe determinarse experimentalmente para la línea celular dado para solucionar este paso crítico.

Un segundo paso fundamental es preparar las células beta para responder a los niveles de glucosa elevados. El medio de cultivo RPMI 1640 tiene niveles de glucosa alta. Deben mover las células de la glucosa alta a una cultura de glucosa baja. Una incubación de 3 h en 1 x SAB de glucosa baja es suficiente para las células beta tener una respuesta significativa a la adición de ~16.7 mM de glucosa. Períodos de lavado de menos de 3 h resultan en variable respuesta a la adición de glucosa. Problemas de respuesta de glucosa pueden ser abordado mediante el aumento de la longitud de tiempo de lavado SAB.

Un tercer paso crítico es el método para preparar las células para las mediciones. Nuestros datos demuestran que mientras que la tripsina y disociación mecánica se pueden ambos utilizar, tripsina liberados resultado células en lecturas más coherentes y menos variabilidad de muestra a muestra. Se mantuvo la tendencia observada con ambos métodos, sin embargo la fuerza de los datos fue mayor con las células con tripsina. Aunque pueden utilizarse otros métodos, como el raspado de células, nuestros datos sugieren que el uso de la tripsina resultará en los resultados más reproducibles con menos variabilidad que muestra18,19.

Limitaciones de este enfoque incluyen el siguiente. En primer lugar, con sólo dos cámaras de tratamiento, esto no es un alto rendimiento, método de detección. Cada serie de muestras de dos toma entre 3-4 h, incluyendo el tiempo para preparar la máquina. En segundo lugar, una concentración relativamente grande de células es necesaria para el análisis, dado los ~2.2 mL de muestra (o ~2.2 x 106 células) necesitan por cámara. Debido a la cantidad de muestra necesaria para el ensayo, el uso de esta herramienta y protocolo para primarias islotes está limitado a menos que una fuente grande está disponible. Los estudios previos que han utilizado islotes para la respiración en esta técnica utilizan ~ 400 islotes/cámara15. Esto requeriría, aproximadamente,20del compartimiento de islotes de dos ratones de cada uno. En tercer lugar porque no se utilizan células permeabilized, la capacidad para determinar el efecto del tratamiento sobre los componentes de la cadena de electrones individuales mediante el uso de compuestos que no son permeable la célula no está disponible.

Hay un número de ventajas significativas de este protocolo con respecto a los métodos existentes. En primer lugar, este protocolo permite la valoración gradual de varios compuestos de membrana permeable. Esto permite la exacta determinación de las concentraciones necesarias. En segundo lugar, uso de las células intactas de la beta nos permite consultar el efecto sobre el metabolismo de glucosa citosólica y mitocondrial7. Esto nos permite observar fenotipos indicativos de cambios en el camino glicolítico, una observación que se pierde al usar las células permeabilized. En tercer lugar, las células intactas nos permiten utilizar la respuesta a la glucosa elevada como una métrica de función de célula beta, que se pierde en variantes permeabilized de este ensayo. Por último, este protocolo permite la adición de compuestos diferentes y múltiples para consultar el efecto de los compuestos sobre la respiración de la célula beta, un lujo que no está presente con otras herramientas que miden la respiración.

Futuras aplicaciones de este método incluyen la capacidad de medir parámetros tales como ATP, calcio y H2O2 niveles concurrentes con las mediciones de la respiración. Este método también permite medición de la respiración en presencia de otras fuentes de combustible, tales como ácidos grasos o cuerpos cetónicos. Por último, con algunas modificaciones, mide los niveles de insulina secretada concomitante con las mediciones de la respiración también es posibles.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a miembros de los laboratorios Tessem y Hancock para asistente y discusión científica. Los autores agradecen a Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para proporcionar la fracción de monómero epicatequina derivados cacao. Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de educación y la investigación acción Diabetes al JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

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References

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Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales
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Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

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