Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høj opløsning respirometri at måle mitokondrie funktion af intakt Beta celler i overværelse af naturlige forbindelser

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

Målet med denne protokol er at måle effekten af glukose-medieret ændringer til mitokondrie respiration i overværelse af naturlige forbindelser på intakt 832/13 beta celler ved hjælp af høj opløsning respirometri.

Abstract

Høj opløsning respirometri giver mulighed for måling af iltforbrug af isolerede mitochondrier, celler og væv. Beta celler spiller en afgørende rolle i kroppen ved at kontrollere blodsukkerniveauet gennem insulinsekretion som reaktion på forhøjet glucose koncentrationer. Insulinsekretion er kontrolleret af glukose metabolisme og mitokondriel respiration. Derfor, måling af intakt beta celle respiration er afgørende for at kunne forbedre beta cellefunktion som en behandling for diabetes. Ved hjælp af intakt 832/13 INS-1 afledt betaceller vi kan måle effekten af øget glukose koncentration på cellulær respiration. Denne protokol tillader os at måle beta celle respiration i tilstedeværelsen eller fraværet af forskellige forbindelser, tillader en at bestemme virkningen af givet forbindelser på intakt celle respiration. Her viser vi to naturligt forekommende forbindelser, monomere epicatechin og curcumin, indvirkning på beta celle respiration under tilstedeværelse af lav (2,5 mM) eller høje glukose (16,7 mM) betingelser. Denne teknik kan bruges til at bestemme virkningen af forskellige forbindelser på intakt beta celle respiration i overværelse af forskellige glucose koncentrationer.

Introduction

Det primære formål med cellen i bugspytkirtlen beta er at vedligeholde systemet normoglycemia gennem glucose-stimuleret insulinsekretion. Beta-celler fornemme fysiologiske forandringer i cirkulerende glukose i vid udstrækning på grund af lav affinitet, høj kapacitet glukose transporter GLUT2 (Glucose transportør 2, Km 16,7 mM)1. Som kredsløbssygdomme blodsukkerniveauet stiger, letter denne høj kapacitet lav-affinitet transporter en proportionel stigning i intracellulære glukose i beta-celle. Glukose metaboliseres via glykolysen, TCA cyklus (tricarboxylic syre cyklus) og mitokondriel respiration resulterer i forhøjede cellulære ATP (adenosin trifosfat) niveauer. Forhøjede ATP koncentrationen blokerer ATP følsomme K+ kanaler, hvilket resulterer i membran depolarisering. Membran depolarisering medfører åbning af spænding gated Ca2 + kanaler og efterfølgende frigivelse af vesikel bundet insulin granulat2. Beta cell dysfunktion er kendetegnende for Type 2 Diabetes (T2D) og resulterer i nedsat og dårligt kontrolleret insulinsekretion og i sidste ende beta celle død3. Mekanismer, der opretholde eller forbedre beta cellefunktion kunne bruges som en behandling for T2D.

Undersøgelser har vist de gavnlige virkninger af naturligt forekommende plante-baserede forbindelser på pancreas beta celle4. Disse forbindelser kan have deres virkning gennem voksende beta celleproliferation, overlevelse eller glucose-stimuleret insulinsekretion. Som et eksempel, har de seneste undersøgelser vist at monomere epicatechin forbedrer glucose-stimuleret insulinsekretion gennem øget mitokondriel respiration og øge cellulære ATP niveauer5. Derfor forstå hvordan disse forbindelser kan øge funktionelle beta-celle masse er vigtigt at udnytte disse forbindelser som potentiel terapi.

Cellulær respiration kan måles gennem en række værktøjer. Brug af en høj opløsning respirometer giver mulighed for titrering af kemiske modulatorer til en permeabilized eller intakt celle befolkning6. Dette værktøj tillader tilsætning af forskellige forbindelser, ved forskellige koncentrationer, hvilket giver en bred vifte af oplysninger.

Betragtning af den intime forbindelse mellem glukose metabolisme og beta cellefunktion, er målinger af cellulære respiration kritisk. Målinger af cellulære respiration kan gøres ved hjælp af enten permeabilized eller intakt beta celler, med hver har sit eget sæt af fordele og ulemper7,8. Mens permeabilization af beta-celler gør det muligt at måle forskellige aspekter af elektron transport-kæden, gør det så uden hensyn til mekanismen for inducerende respiration i beta cell, glukoseoptagelse og stofskifte. Brug af unpermeabilized beta celle respiration er derfor en meget nyttig teknik til at bestemme beta celler reaktionen på forskellige glucose niveauer, ved hjælp af iltforbrug som udlæsningen.

Formålet med denne teknik er at måle iltforbruget i intakt INS-1 afledt 832/13 beta celler. Denne teknik gør det muligt at bestemme svar af beta-celler til at unstimulatory glukose betingelser (2,5 mM glukose) og stimulerende glukose betingelser (16,7 mM glukose). Mens de unpermeabilized celler ikke tillader os at individuelt teste kompleks I, II eller III i elektronen transport kæde, teknikken tillader målinger beskæftiger sig med komplekse IV hæmning (oligomycinets A), sammenkædet respiration (FCCP-Carbonyl cyanid- 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone), og helt hæmmet respiration (Antimycin A). Denne undersøgelse viser effekten af måling respiration i intakt unpermeabilized i bugspytkirtlen beta celler, samt to naturligt forekommende forbindelser, monomere epicatechin og curcumin, indvirkning på beta celle respiration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellekultur

  1. Kultur INS-1 afledt 832/13 beta celler i RPMI 1640 suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat og 0,05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.
  2. Fjerne 832/13 celler fra en T75 kolben med 2 mL 0,25% trypsin, inkubation ved 37 ° C i 10 min. Neutraliser trypsin ved at tilføje 8 mL af komplet RPMI 1640 medier.
  3. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og fortyndes 100 µL af cellevolumen fra trin 1.2 i 900 µL af PBS.
  4. Plade 832/13 celler med en tæthed på 2 x 106 celler/mL i en 6 parabol godt.
  5. Kultur celler i 48 timer i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 før du begynder respiration eksperimenter.

2. forberedelse af celler for høj opløsning respirometri

  1. Behandling af 832/13 celler med kakao afledte epicatechin monomer.
    1. Kultur 832/13 celler i 24 timer efter plating i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Ændre media 24 h efter plating, og behandle 832/13 celler med køretøjet kontrol (3 boringer) eller 100 nM kakao monomer (3 boringer), efterfulgt af kultur i en yderligere 24 timer (48 h samlede) i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    3. Vaske 832/13 celler i 1 x lav Glucose sekretion analysebuffer (SAB) for 5 min. aspirat buffer, og der inkuberes 832/13 celler i 1 x lav Glucose tillægs-og ændringsbudget for 3 h, ændre 1 x lav Glucose SAB hver time.
      1. Gøre 10 x SAB med 33.32 g NaCl, 1,73 g af KCl, 0,82 g KH2PO4, 0,7 g af MgSO4 og tilføje H2O til en endelige mængden af 500 mL. Sterile filter den endelige løsning.
      2. Gør 1 x lav Glucose SAB med 10 mL 10 x SAB, 100 µL af 45% glucose, 2 mL 1 M HEPES, 1 mL 0,25 M CaCl2, 0.57 mL 35% BSA løsning, 0.21 g NaHCO3 og tilføje H2O til en endelige rumfang på 100 mL. Sterile filter den endelige løsning.
  2. Behandling af 832/13 celler med curcumin.
    1. Kultur 832/13 celler i 48 timer efter plating i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Vaske 832/13 celler i 1 x lav Glucose tillægs-og ændringsbudget for 5 min. aspirat buffer, og der inkuberes 832/13 celler i 1 x lav Glucose tillægs-og ændringsbudget for 3 h, ændre 1 x lav Glucose SAB hver time.
    3. Efter 2,5 h 3 h inkubation i 1 x lav Glucose SAB, Aspirér buffer, og der inkuberes celler i 1 x lav Glucose SAB med køretøjet kontrol eller 40 µM curcumin i 30 min. Efter inkubationen Opsug bufferen.
  3. Høst celler med trypsin for høj opløsning respirometri
    1. Efter 3 h inkubation i 1 x lav Glucose SAB, fjerne celler fra pladen med 250 µL af 0,25% trypsin pr. brønd.
    2. Kombiner celler i trypsin fra 3 boringer behandlet med køretøjet kontrol eller sammensatte af interesse med 4 mL af SAB i en 15 mL konisk slange.
    3. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og fortyndes 100 µL af cellevolumen fra trin 2.3.2 i 900 µL af PBS.
    4. Fortynd det passende antal celler i 1 x lav Glucose SAB at gøre 3 mL i den passende koncentration for hver afdeling. Dataene viser, at en koncentration på 1 x 106 celler/mL er den mest effektive.
  4. Høst celler med mekanisk dissociation for høj opløsning respirometri
    1. Efter 3 h inkubation i 1 x lav Glucose SAB, tilsættes 1 mL af 1 x lav Glucose SAB til hver godt og forsigtigt blæse celler fra pladen med mekanisk dissociation af pipettering med 1000 µL pipette spids.
    2. Kombiner celler fra 3 boringer behandlet med køretøjet kontrol eller sammensatte af interesse i alt 3 mL SAB i en 15 mL konisk slange respiration.

3. høj opløsning respirometri

  1. Forberedelse af den høj opløsning respirometer.
    1. Tænde den med høj opløsning respirometer og oprette forbindelse til skrivebordet ved at lancere programmet respirometer analyse.
    2. Opsug 70% ethanol fra begge kamre. Nyd disse kamre i 70% ethanol i mindst 45 min.
    3. Vask kamre to gange med 70% ethanol, sugning efter hvert trin.
    4. Vask kamre tre gange med ddH2O, sugning efter hvert trin.
    5. Skyl kammer udstikkere i ddH2O. Denne renser ud resterende ethanol fra stemplerne og titanium port.
  2. Kalibrering af polarographic ilt sensorer.
    1. Tilføje 2,4 mL 1 x lav Glucose SAB buffer til hvert oxygraph kammer, omrøring den buffer, der løbende bruger magnetiske rør barer i salen på 750 rpm og 37 ° C med en dataregistrering interval på 2,0 s ved at trykke F7-knappen og åbne fanen mærket "Systemer". Skubbe udstikkere hele vejen i, og derefter trække til indstillingen skruenøgle beluftning. Lad maskinen Blandingen henstår i mindst 1 time før stabile ilt flux er opnået.
    2. Sæt maskinen ved 37 ° C for varigheden af forsøget. Indstille polarisering spænding til 800 mV, med en gevinst på 2 ved at trykke F7-knappen og åbne fanen mærket "Ilt, O2". Reagensglasset iltkoncentration SAB buffer i mindst 30 min, mens ændringerne i iltkoncentrationen er stabil (mindre end 2 pmol/(s*mL)).
    3. Efter oxygen koncentrationen stabilisering, Vælg en region, hvor ændringen af iltkoncentrationen er stabilt at etablere baggrunden måling af ændringer i koncentration af ilt.
      1. Vælg et område ved at trykke shift-tasten, venstre klikke på musen og trække musen hen over den valgte region. Klik på det bogstav, der er tilknyttet den valgte region og ændre til "R1" for hvert spor, svarer med hver af de to kamre.
      2. Dobbeltklik på boksen "O2 kalibrering" i nederste venstre og højre hjørner af skærmen, skal du klikke på knappen "Vælg" for "luft kalibrering" som R1 og derefter vælge "kalibrere og kopiere til Udklipsholder" for begge kamre.
  3. Evaluering af åndedræt af 832/13 betaceller fremstillet i trin 2.1.5 eller 2.2.5.
    1. Indlæse 2,4 mL af prøven i hver afdeling (en afdeling med kontrol køretøj behandlede celler, et kammer med sammensatte behandlede celler) i 1 x lav Glucose SAB. Bevare 0,5 mL af celle prøve for protein kvantitering af BCA (Bicinchoninic syre) assay, hvis ved hjælp af mekaniske dissociation tilgang (fryse ved-20 ° C for måling senere).
      1. Skubbe stemplet hele vejen og Opsug residualvolumen. Rør celler konstant gennem hele eksperimentet på 750 rpm og 37 ° C i alle efterfølgende trin. Gøre en mark ved at klikke på F4 og mærkning som "celler" når prøverne er indlæst.
      2. Måle prøver i 30 min. Efter signal stabilisering, skal du vælge en region af ændringen i iltkoncentrationen svarende til lav glucose forhold (2,5 mM glukose) som beskrevet i 3.2.3.
    2. Når signalet stabilisering er nået, tilføje 12,5 µL af 45% sterilt glucose opløsning (16,7 mM slutkoncentration) i hver afdeling gennem titanium lastning port ved hjælp af en sprøjte. Gøre en mark målt "Glucose" som beskrevet i punkt 3.3.1, når behandling er tilføjet. Lad signal stabilisere og optage cellulær respiration, indtil en stabil ilt flux er opnået. Vælg denne region af ændringen i koncentrationen af ilt, som beskrevet i 3.2.3. Dette er 16,7 mM glukose læsning, og svarer med stimulerende forhold7.
    3. Efter signal stabilisering er nået tilføje 1 µL af 5mM oligomycinets en (2,5 µM slutkoncentration) i hver afdeling gennem loading port. Gøre en mark målt "OligoA" som beskrevet i punkt 3.3.1, når behandling er tilføjet. Lad signal stabilisere og optage cellulær respiration, indtil en stabil ilt flux er opnået. Vælg dette område af kurven, som beskrevet i 3.2.3. Oligomycinets A hæmmer ATPsyntase og dermed den eneste ilt flux forekommende er via lækage af elektroner og ikke oxidativ fosforylering7.
    4. Når signalet stabilisering er nået føje 1 mM FCCP 1 µL intervaller indtil en maksimal åndedræt sats er etableret. Dette repræsenterer maksimal afkoblede respiration. Mellem 3-4 µL er FCCP tilstrækkelig (1,5-2,0 µM endelige koncentration) til at fremkalde maksimal afkoblede respiration INS-1 832/13 celler. Gør et mærke, mærket "FCCP", som beskrevet i punkt 3.3.1, når behandling er tilføjet. Lad signal stabilisere og optage cellulær respiration, indtil en stabil ilt flux er opnået. Vælg dette område af kurven, som beskrevet i 3.2.3. FCCP er en frakobling agent. Dette gør det muligt for os at måle afkoblede respiration7.
    5. Efter signal stabilisering er nået tilføje 1 µL af 5 mM Antimycin A (2,5 µM slutkoncentration) i hver afdeling gennem loading port. Gør et mærke, mærket "AntiA" som beskrevet i punkt 3.3.1, når behandling er tilføjet. Lad signal stabilisere og optage cellulær respiration, indtil en stabil ilt flux er opnået. Vælg dette område af kurven, som beskrevet i 3.2.3.
      Bemærk: Antimycin A binder cytokrom C reduktase, hæmmer ubikinon oxidation, og blokerer alle respiration. Dette tillader os at helt stoppe respiration7.
  4. Måling af 832/13 beta celler for protein koncentration og respiration normalisering.
    1. Ved hjælp af 0,5 mL af prøven opbevares på lastning, foranstaltning protein prøve ved hjælp af BCA metode13.
    2. Kør hver prøve i tre eksemplarer, uden fortynding, efter fabrikantens anvisninger.
  5. 832/13 beta celle respiration beregninger fra trypsinized celler.
    1. Angiv antallet af celler pr. mL anvendelse i analysen ved at skubbe knappen F3 af programmet respirometer analyse. Ændre enhederne til celler/mL, Angiv den cellulære koncentration og ændre medium til SAB.
    2. Vælg baggrund aflæsninger til at normalisere dataene ved at vælge og ind i O2 kalibrering form som beskrevet i 3.2.3.
    3. Foretag valg af aflæsninger fra 2,5 mM glukose, 16,7 mM glukose, oligomycinets A, FCCP og Antimycin A efter anvisningerne i 3.3.1.
    4. Inden for respirometer analyse program, skal du eksportere aflæsninger for hvert kammer efter at angive proteinkoncentration og vælge de relevante gennemsnitlige værdier for hver behandling under respiration målingen. Dette gøres ved at klikke på F2 og derefter skubbe "Kopier til Udklipsholder funktion". Denne eksport data til brug i andre programmer, analyse. Bruge "O2 skråning neg." værdier for beregninger.
    5. Kompilere data for 3-5 uafhængige kørsler af køretøjet behandlet kontrol og naturlige forbindelser behandlede celler for at bestemme virkningen på intakt cellulær respiration INS-1 832/13 beta celler.
  6. 832/13 beta celle respiration beregninger fra adskilles mekanisk celler.
    1. Angiv protein beregninger fra BCA assay ved at skubbe knappen F3 af programmet respirometer analyse. Ændre enhederne til mg, Angiv BCA koncentration og ændre medium til SAB.
    2. Vælg baggrund aflæsninger til at normalisere dataene ved at vælge og ind i O2 kalibrering form som beskrevet i 3.2.3.
    3. Foretag valg af aflæsninger fra 2,5 mM glukose, 16,7 mM glukose, oligomycinets A, FCCP og Antimycin A efter anvisningerne i 3.3.1.
    4. Inden for respirometer analyse program, skal du eksportere aflæsninger for hvert kammer efter at angive proteinkoncentration og vælge de relevante gennemsnitlige værdier for hver behandling under respiration målingen. Dette gøres ved at klikke på F2 og derefter skubbe "Kopier til Udklipsholder funktion". Denne eksport data til brug i andre programmer, analyse. Bruge "O2 skråning neg." værdier for beregninger.
    5. Kompilere data for 3-5 uafhængige kørsler af køretøjet behandlet kontrol og naturlige forbindelser behandlede celler for at bestemme virkningen på intakt cellulær respiration INS-1 832/13 beta celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

INS-1 832/13 beta-celler, der er udarbejdet og høstet som beskrevet i protokollen vil demonstrere graduering i forbrug af ilt baseret på de forskellige kemiske interventioner (figur 1A). En stigning i respiration vil observeres, når glukose koncentration er steget til 16,7 mM glukose (figur 1B). Respiration vil falde når de intakte celler behandles med oligomycinets A. Denne respiration er kendt som lækage, der defineres som den basale, nonphosphorylating respiratorisk tilstand. Maksimal respiration vil blive opnået, når beta-celler behandles med den frakobling agent FCCP, der defineres som ETS respiration eller elektron transport system respiration. Endelig, respiration vil falde til nul når behandlet med Antimycin A, mærket som ROX (resterende iltforbrug), som refererer til ikke-respiratorisk cellulær iltforbrug.

Forskelle i celle nummer vil væsentligt ændre kvaliteten af resultaterne af denne teknik. Glukose-fremkalde respiration blev målt i 0,5, 1 og 2 x 106 celler/mL (figur 2A-2 C). Ved hjælp af celletal og BCA undersøgelser protein, protein koncentrationer svarende til de tre testede celle koncentrationer blev beregnet (figur 2D). Måling ved hjælp af 0,5 x 10 var6 celler/mL til at påvise glucose-stimuleret respiration (figur 2A), og kun ETS forbundet øget åndedræt vist sig at være betydelig. Dette tyder på, at lav celle nummer resulterer i et lavt signal til støj-forhold, der tilintetgør resultaterne. Tilsvarende resulteret målinger på 2 x 106 celler/mL også i betydelige variation, som angivet af Statistisk signifikans kun at være nået til ETS målinger (figur 2 c). Dette er formentlig på grund af behovet for at re oxygenat afdelingerne flere gange under analysen, hvilket resulterede i større variation fra prøve til prøve. Disse data viser, at koncentrationer af 1 x 106 celler/mL resultere i betydelige glucose-stimuleret respiration, lækage og ETS målinger, der er nødvendige for respiration analyser (figur 2B og 2E).

To metoder til at fjerne cellerne respiration er præsenteret i denne protokol. Ved hjælp af trypsin for at fjerne celler er effektiv, når målingerne er gennemført ved 37 ° C. Respiration målinger udført i fravær eller tilstedeværelse af curcumin (figur 3A) viser vedligeholdelse af glucose-stimuleret respiration, lækage og ETS respiration. Sammenligning af curcumin behandlede celler til ubehandlede celler viser ingen ændring til en af disse respiratorisk parametre (figur 3B-C). Respiration målinger udført i fravær eller tilstedeværelse af kakao epicatechin monomer (figur 3D) viser også vedligeholdelse af glucose-stimuleret respiration, lækage og ETS respiration. Sammenligning af kakao epicatechin monomer behandlede celler til ubehandlede celler viser øget respiration på 2,5 mM og 16,7 mM Glucose, samt i LÆK og ETS respiration (figur 3E-F). Disse data viser, at mens curcumin ikke forbedre 832/13 beta celle respiration, kakao epicatechin monomer gør (figur 3 g). Curcumin har vist sig at forbedre insulinsekretion via hæmmer phosphodiesterase aktivitet14. Vores data tyder på, at curcumin ikke forbedrer insulinsekretion via modulerende mitokondrie funktion. Vi har allerede vist, at kultur i overværelse af kakao epicatechin monomerer inducerer udtryk af forskellige komponenter af mitokondrie elektron transport kæde5. Vi bemærkede også øget respiration i LÆK tilstand (induceret ved behandling med oligomycinets) og med ETS (elektronen transportsystem, induceret af FCCP). Brug af dette værktøj foreslår en række potentielle mål for fremtidige undersøgelser.

Som et alternativ til trypsin fjernelse af celler, kan mekanisk dissociation også udføres ved hjælp af præsenteres vask teknik når afsluttet ved 37 ° C. Respiration målinger blev udført i fravær eller tilstedeværelse af curcumin eller kakao epicatechin monomer (figur 4A-C). Disse data viser, at de tendenser, der observeres med trypsin forberedelse af celler opretholdes, men følsomhed synes at være aftaget. Mens kontrol og kakao epicatechin monomer behandlede celler vedligeholdes glucose-stimuleret, beholdt lækage og ETS respiration, celler behandles med curcumin kun den glucose-stimulerede respiration på grund af den øgede prøve til prøve variation. Mens de tendenser, der observeres med trypsin celle præparater blev opretholdt (figur 4D-F), betydningen faldt i alle parametre, formentlig den større prøve til prøve variation blev indført ved den mekaniske dissociation og normalisering til protein koncentration i stedet for celle nummer.

Disse data viser, at denne protokol kan bruges til at måle åndedræt af intakt INS-1 832/13 beta celler. Desuden antyder vores protokol en optimal celle nummer for nøjagtige målinger og en foretrukne metode til forberedelse af celler for at maksimere signal til støjforhold.

Figure 1
Figur 1 : Repræsentant respiration kurve af intakt 832/13 beta celler. Intakt 832/13 beta celler er målt til respiration i (figur 1A) 2,5 mM glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM oligomycinets, 2 µM FCCP (Carbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) og 2,5 µM Antimycin A. En udvidelse af 16,7 mM glukose afsnit (figur 1B) præsenteres for at vise stigning i glucose-stimuleret respiration. Celler blev målt i en koncentration på 1 x 106 celler/mL. RENDE refererer til den basale nonphosphorylating respiratorisk tilstand, ETS refererer til den afkoblede respiratorisk kapacitet af elektronen transportsystem og ROX refererer til det resterende iltforbrug efter mitokondrie respiration er hæmmet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Bestemmelse af antallet af 832/13 beta celler nødvendige for glucose-induceret respiration målinger. Intakt 832/13 beta celler er målt til respiration i koncentrationer på (A) 0,5 x 106 celler/mL (B) 1 x 106 celler/mL, eller (C) 2 x 106 celler/mL. (D) Protein koncentrationer, der svarer til 0,5 x 106 celler/mL, 1 x 106 celler/mL og 2 x 106 celler/mL. (E) sammenligning af åndedræt på 0,5 x 106 celler/mL, 1 x 106 celler/mL og 2 x 106 celler/mL. Åndedræt blev målt under 2,5 mM glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM oligomycinets, 2 µM FCCP og 2,5 µM Antimycin A betingelser. Respiration med 2,5 og 16,7 mM glukose demonstrere glucose-stimuleret respiration svar af beta-celler. Respiration efter oligomycinets viser LEAK respiration (basal, nonphosphorylating respiratorisk tilstand). Respiration efter FCCP (Carbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling viser (afkoblede respiratorisk kapacitet af elektronen transportsystem, ETS). n = 6 uafhængige kører. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Åndedræt målinger af 832/13 beta celler efter frigivelsen ved hjælp af trypsin. 832/13 beta celler blev kulturperler i tilstedeværelse eller fravær af monomere kakao epicatechin eller curcumin og respiration blev målt efter at slippe celler ved hjælp af trypsin. Åndedræt blev målt under 2,5 mM glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM oligomycinets, 2 µM FCCP og 2,5 µM Antimycin A betingelser. Respiration med 2,5 og 16,7 mM glukose demonstrere glucose-stimuleret respiration. Respiration efter oligomycinets viser LEAK respiration (basal, nonphosphorylating respiratorisk tilstand). Respiration efter FCCP (Carbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling viser (afkoblede respiratorisk kapacitet af elektronen transportsystem, ETS). Respiration efter antimycin en behandling viser resterende iltforbrug (ROX). (A) behandlingen af 832/13 celler med curcumin fastholder de relevante ændringer i respiration som følge af behandlingerne. (B) repræsentative spor og (C) gennemsnit af data for celler behandles med curcumin viser ingen ændring af 832/13 beta celle respiration. (D) behandling af 832/13 celler med kakao epicatechin monomer fastholder de relevante ændringer i respiration som følge af behandlingerne. (E) repræsentative spor og (F) den gennemsnitlige data for kakao epicatechin monomer behandlede celler viser øget respiration i alle parametre efter kakao epicatechin monomer behandling. (G) alle tre parametre præsenteres sammen til sammenligning. n = 6 uafhængige kører. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Åndedræt målinger af 832/13 beta celler efter frigivelsen ved hjælp af mekaniske dissociation. 832/13 beta celler blev kulturperler i tilstedeværelse eller fravær af monomere kakao epicatechin eller curcumin og respiration blev målt efter at slippe celler ved hjælp af mekaniske dissociation. Åndedræt blev målt under 2,5 mM glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM oligomycinets, 2 µM FCCP og 2,5 µM Antimycin A betingelser. Respiration med 2,5 og 16,7 mM glukose demonstrere glukose svar af beta-celler. Respiration efter oligomycinets viser LEAK respiration (basal, nonphosphorylating respiratorisk tilstand). Respiration efter FCCP (Carbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling viser (afkoblede respiratorisk kapacitet af elektronen transportsystem, ETS). Gennemsnit af data for celler (A) ubehandlet celler eller celler behandles med (B) curcumin eller (C) kakao epicatechin monomer demonstrere den mekaniske dissociation bevarer glucose-stimuleret respiration i alle behandlinger, mens lækage og ETS betydning er tabt kun i curcumin behandlede celler. Sammenligning af ubehandlede celler (D) curcumin eller (E) kakao epicatechin monomer viser øget respiration i alle parametre med kakao epicatechin monomer med ingen væsentlig ændring af respiration med curcumin. (F) alle tre parametre præsenteres sammen til sammenligning. n = 6 uafhængige kører. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formålet med denne protokol er at bruge høj opløsning respirometri for at måle respiratorisk satser i intakt i bugspytkirtlen beta celler. Denne metode giver mulighed for måling af beta celle respons til øget glucose niveauer. Protokollen giver også mulighed for forbehandling med forskellige forbindelser, som vist i denne protokol med naturligt forekommende monomere epicatechin eller curcumin4,5. Behandling med forskellige andre stoffer kan anvendes i denne protokol, med forbehandling (som vist her) eller ved at behandle inden for de respiratoriske kamre med minimale ændringer til base-protokollen.

Der er forskellige måder, som denne metode kunne ændres. Andre beta cellelinjer kunne bruges; dog skal celle nummer og SAB vask gange bestemmes eksperimentelt. Primære gnaver og menneskelige Holme kunne også bruges; antallet af celler eller Holmen ækvivalenter skal dog også bestemmes eksperimentelt. Mindst én undersøgelse har målt islet iltforbrug ved hjælp af høj opløsning respirometri15. Denne undersøgelse kræves 400 Holme pr. reaktion, men måle ikke glukose induceret respiration ændringer. Eftersom primære væv bruges ofte med høj opløsning respirometers16,17, kunne intakt Holme bruges efter eksperimentel fejlfinding. Men i betragtning af det store antal småøer kræves for denne analyse, andre metoder til måling af iltforbrug kan være bedre egnet til målinger af primære islet respiration.

Der er et par kritiske trin med præsenteres protokollen. Først, at have et passende antal celler er kritisk. Vores undersøgelser viser, at 832/13 beta celler i en koncentration på 1 x 106 celler/mL er tilstrækkelig for glucose-stimuleret respiration målinger. Måling ved hjælp af 0,5 x 10 demonstreret6 celler/mL lav glucose-stimuleret respiration og et lavt signal / støjforhold. Endvidere resulterede målinger ved hjælp af 2 x 106 celler/mL i høj prøve til prøve variation og hurtig cellulære brugen af ilt som kræves kammer re oxygenat og ofte resulterede i hurtig celledød. Det passende antal celler skal bestemmes eksperimentelt for linjen given celle for at fejlfinde dette kritiske trin.

Et andet kritisk trin forbereder beta-celler til at reagere på forhøjet blodsukker. RPMI 1640 Kulturmedier har høje blodsukkerniveauer. Cellerne skal flyttes fra den høje glukose til en lav glucose kultur. 3 h inkubation i 1 x lav Glucose SAB er tilstrækkelig for beta-celler til at have en betydelig reaktion på tilsætningen af ~16.7 mM glukose. Vask perioder på mindre end 3 h resultere i variable svar til tilsætning af glukose. Fejlfinding af glukose svar problemer kan løses ved at øge varigheden af SAB vask.

En tredje kritiske trin er metoden til at forberede cellerne til målinger. Vores data viser, at mens trypsin og mekaniske dissociation kan begge bruges, trypsin udgivet celler resultat i mere konsekvent aflæsninger og mindre prøve til prøve variation. Tendensen observeret med begge metoder blev opretholdt, men styrken af dataene, der var større med de celler, der er udarbejdet ved hjælp af trypsin. Mens kan anvendes andre metoder, såsom celle skrabning, tyder vores data på, at brugen af trypsin vil resultere i de mest reproducerbare resultater med mindre prøve til prøve variation18,19.

Begrænsninger af denne tilgang omfatter følgende. Først, med kun to behandling kamre, dette er ikke en high throughput screening metode. Hver køre to prøver tager mellem 3-4 h, herunder tid til at forberede maskinen. Andet er en forholdsvis stor koncentration af celler påkrævet til analysen, givet ~2.2 mL af prøven (eller ~2.2 x 106 celler) nødvendige pr. kammer. På grund af mængden af prøven kræves for analysen, er brug af dette værktøj og protokol for primære Holme begrænset, medmindre der foreligger et stort udbud. De tidligere undersøgelser, der har brugt Holme respiration i denne teknik bruges ~ 400 Holme/afdeling15. Dette kræver groft, Holme fra to mus for hver afdeling20. For det tredje fordi permeabilized celler ikke bliver brugt, er evnen til at fastslå effekten af behandling på enkelte elektron kæde komponenter ved hjælp af forbindelser, ikke der er celle gennemtrængelig ikke tilgængelig.

Der er en række betydelige fordele af denne protokol med hensyn til eksisterende metoder. Første, denne protokol giver mulighed for trinvis titrering af forskellige membran gennemtrængelig forbindelser. Dette giver mulighed for præcis bestemmelse af nødvendige koncentrationer. For det andet tillader brugen af intakt beta celler os at forespørge effekt på cytosole og mitokondriel glukose metabolisme7. Dette gør det muligt for os at observere fænotyper vejledende af ændringer i de glykolytiske pathway, en observation, der går tabt, når du bruger permeabilized celler. For det tredje tillade de intakte celler os at bruge reaktion på forhøjet glukose som en metrikværdi for beta cellefunktion, som er mistet i permeabilized varianter af denne analyse. Endelig, denne protokol giver mulighed for tilsætning af forskellige og flere forbindelser til at forespørge effekten af forbindelser på beta celle respiration, en luksus, der ikke er til stede med andre værktøjer, der måler respiration.

Fremtidige anvendelser af denne metode omfatter evnen til at måle parametre som ATP, calcium og H2O2 niveauer samtidige med respiration målinger. Denne metode giver også mulighed for måling af respiration i overværelse af andre brændstof kilder, såsom fedtsyrer eller ketoner. Endelig, med nogle ændringer, måling udskilles insulin niveauer samtidig med respiration målinger kan også være muligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Tessem og Hancock labs for assistent og videnskabelige diskussion. Forfatterne takke Andrew Neilson, ph.d. (Virginia Tech) for at give kakao afledte epicatechin monomer brøkdel. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Diabetes aktionsforskning og Education Foundation til JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
  4. Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
  5. Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
  6. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
  7. Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
  8. Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
  9. Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
  10. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  11. Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
  12. Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
  13. Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
  14. Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
  15. Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
  16. Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
  17. Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
  18. Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
  19. Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
  20. Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).

Tags

Cellebiologi sag 131 Beta cell mitokondrier respiration glukose høj opløsning respirometri kakao epicatechin monomer curcumin
Høj opløsning respirometri at måle mitokondrie funktion af intakt Beta celler i overværelse af naturlige forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock,… More

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter