Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההשפעה של שינויים בתיווך גלוקוז נשימה מיטוכונדריאלי בנוכחות תרכובות טבעיות על תאי הבטא תקינה 832/13 באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה.
Abstract
Respirometry ברזולוציה גבוהה מאפשרת מדידת צריכת החמצן של המיטוכונדריה מבודד, תאים ורקמות. תאי הבטא תפקיד חיוני בגוף על ידי השליטה רמות הגלוקוז בדם באמצעות הפרשת האינסולין בתגובה ריכוזי גלוקוז גבוהות. הפרשת האינסולין נשלטת על ידי נשימה מיטוכונדריאלי מטבוליזם של גלוקוז. לכן, מדידת נשימה תאי בטא שלם הוא חיוני יוכל לשפר את תפקוד תאי בטא כטיפול בסוכרת. באמצעות תוספות ללא פגע 832/13-1 נגזר בתאי בטא אנו יכולים למדוד את ההשפעה של הגדלת ריכוז הגלוקוז על נשימה תאית. פרוטוקול זה מאפשר לנו למדוד את הנשימה תאי בטא, נוכחות או היעדרות של תרכובות שונות, המאפשרת לקבוע את ההשפעה של נתון תרכובות על נשימה תא שלם. כאן אנחנו מדגימים את ההשפעה של שתי תרכובות המתרחשים באופן טבעי, monomeric epicatechin, כורכומין, על הנשימה תאי בטא תחת הנוכחות של נמוך (2.5 מ מ) או תנאים גלוקוז גבוהות (16.7 מ מ). ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את ההשפעה של תרכובות שונות על תאי בטא ללא פגע הנשימה בנוכחות שונות ריכוזי גלוקוז.
Introduction
המטרה העיקרית של תאי בטא בלבלב היא לשמור על המערכת normoglycemia באמצעות הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז. תאי הבטא לחוש שינויים פיזיולוגיים במחזור גלוקוז בעיקר בשל בזיקה נמוכה, קיבולת גבוהה גלוקוז טרנספורטר GLUT2 (גלוקוז המשלח 2, Km 16.7 מ מ)1. לעלות רמות הגלוקוז במחזור הדם, טרנספורטר נמוך-זיקה זו בקיבולת גבוהה מקלה על גידול יחסי של גלוקוז תאיים בתוך התא בטא. גלוקוז עובר מטבוליזם דרך גליקוליזה, מחזור TCA (מחזור חומצה tricarboxylic) מיטוכונדריאלי הנשימה וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ATP (אדנוזין טריפוספט) הסלולר. ריכוז ATP מוגברות חוסם ATP רגיש K+ הערוצים, וכתוצאה מכך ממברנה דפולריזציה. דפולריזציה הממברנה גורם הפתיחה של מתח מגודרת Ca2 + ערוצי וכרוכים שחרור עוקבות של שלפוחית אינסולין בגרגרים2. תפקוד לקוי של תאי בטא מהווה סימן היכר של סוכרת מסוג 2 (T2D), ותוצאות הפרשת האינסולין ירדה ומבוקר לקוי ובסופו של דבר למוות תאי בטא3- מנגנונים לשמור או לשפר את תפקוד תאי בטא יכול לשמש כטיפול עבור T2D.
מחקרים הראו את ההשפעות המיטיבות של באופן טבעי המבוסס על צמח תרכובות תאי בטא בלבלב4. תרכובות אלו ייתכן השפעתם באמצעות הגדלת התפשטות תאי בטא, הישרדות או הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי monomeric epicatechin מגבירה את הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז ע י הגברת הנשימה מיטוכונדריאלי, הגדלת הסלולר ATP רמות5. לכן, להבין איך תרכובות אלו יכולים להגדיל את תאי בטא פונקציונלי מסה חשוב למנף תרכובות אלו כמו הרפוי פוטנציאליים.
נשימה תאית ניתן למדוד באמצעות מספר כלים. השימוש respirometer ברזולוציה גבוהה מאפשר טיטור של מאפננים כימי אוכלוסיית תאים permeabilized או שלם6. כלי זה מאפשר התוספת של תרכובות שונות, בריכוזים שונים, ובכך נותן מגוון רחב של מידע.
לאור הקשר האינטימי בין מטבוליזם הגלוקוז ותפקוד תאי בטא, מדידות של נשימה תאית הם קריטיים. מדידות של נשימה תאית יכול להיעשות באמצעות תאי הבטא או permeabilized או שלם, עם כל בעל קבוצה נפרדת של היתרונות והחסרונות7,8. בעוד permeabilization של תאי הבטא מאפשרת למדוד היבטים שונים של רשת התחבורה אלקטרון, היא עושה זאת מבלי בתועלת מנגנון להשראת הנשימה תאי בטא, ספיגת הגלוקוז ואת חילוף החומרים. לכן, השימוש של תאי בטא unpermeabilized נשימה היא טכניקה מאוד שימושי כדי לקבוע את תאי הבטא בתגובה רמות גלוקוז שונות, באמצעות צריכת חמצן כמו המדידה.
מטרת טכניקה זו היא למדוד את צריכת החמצן של תוספות ללא פגע-1 נגזר בתאי בטא 832/13. טכניקה זו מאפשרת לנו לקבוע את התגובה של תאי הבטא לתנאים גלוקוז unstimulatory (גלוקוז 2.5 מ מ) כמו גם תנאים מופחתים גלוקוז (מ מ 16.7 גלוקוז). בעוד unpermeabilized התאים אינם מאפשרים לנו לבחון באופן אינדיבידואלי את מתחם הראשון, השני או השלישי של האלקטרון הובלה שרשרת, הטכניקה מתירה מדידות התמודדות עם מורכבות הרביעי עיכוב (Oligomycin א), חשיפות נשימה (FCCP-קרבוניל ציאניד- 4- phenylhydrazone (trifluoromethoxy)), ואת לגמרי עכבות נשימה (Antimycin א). מחקר זה מדגים את היעילות של מדידת נשימה ללא פגע בתאי בטא בלבלב unpermeabilized, כמו גם ההשפעה של שתי תרכובות המתרחשים באופן טבעי, monomeric epicatechin, כורכומין, על הנשימה תאי בטא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים
- התרבות הארצי-1 נגזר תאי ביתא 832/13 RPMI 1640 בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10 מ מ HEPES, 2 מ מ גלוטמין 1 מ"מ נתרן פירובט, מ מ 0.05 מרקפטואתנול9,10,11 12, ,13.
- הסר 832/13 תאים מבקבוק T75 באמצעות 2 מ של 0.25% טריפסין, המקננת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות נטרול טריפסין על-ידי הוספת 8 מ של מדיה RPMI 1640 מלאה.
- לספור תאים באמצעות hemocytometer ו לדלל µL 100 של נפח התאים של שלב µL 1.2 ב- 900 ל- PBS.
- צלחת 832/13 תאים על צפיפות של 2 x 106 תאים/מ ל 6 טוב מגישים.
- התרבות התאים עבור 48 ש ח בחודש חממה humidified-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפני תחילת הניסויים נשימה.
2. הכנה של תאים Respirometry ברזולוציה גבוהה
-
טיפול 832/13 תאים עם קקאו epicatechin נגזר מונומר.
- תרבות 832/13 תאים עבור 24 שעות לאחר ציפוי ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2.
- לשנות את המדיה 24 שעות לאחר ציפוי, ולטיפול 832/13 תאים עם בקרת הרכב (3 בארות) או מונומר nM קקאו 100 (3 בארות), ואחריו תרבות עבור h 24 נוספים (סה כ 48 שעות) ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2.
- לשטוף 832/13 תאים 1 x נמוך הגלוקוז הפרשת Assay מאגר (SAB) עבור מאגר וביופסיה 5 דק, דגירה 832/13 תאים 1 x גלוקוז נמוך SAB עבור h 3, שינוי 1 x גלוקוז נמוך SAB בכל שעה.
- להפוך 10 x SAB עם g 33.32 של NaCl, 1.73 g של אשלגן כלורי, 0.82 גר'2פו ח'4, 0.7 גר' MgSO4 ולהוסיף H2O נפח סופי של 500 מ"ל. מסנן סטרילי הפתרון הסופי.
- דגם 1 x גלוקוז נמוך SAB עם 10 מ"ל של 10 x SAB, 100 µL של 45% גלוקוז, 2 מ של 1 מ' HEPES, 1 מ"ל של 0.25M CaCl2, מ 0.57 ל 35% BSA פתרון, 0.21 גר' NaHCO3 ולהוסיף H2O לאמצעי הסופי של 100 מ ל. מסנן סטרילי הפתרון הסופי.
-
טיפול 832/13 תאים עם כורכומין.
- תרבות 832/13 תאים עבור 48 שעות לאחר ציפוי ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2.
- לשטוף 832/13 תאים 1 x גלוקוז נמוך SAB עבור מאגר וביופסיה 5 דק, דגירה 832/13 תאים 1 x גלוקוז נמוך SAB עבור h 3, שינוי 1 x גלוקוז נמוך SAB בכל שעה.
- אחרי h 2.5 של הדגירה 3 h ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB, תשאף מאגר של דגירה תאים 1 x SAB גלוקוז נמוך עם בקרת הרכב או 40 µM כורכומין למשך 30 דקות. בעקבות דגירה, וארוקן את המאגר.
-
קציר תאים עם טריפסין עבור respirometry ברזולוציה גבוהה
- לאחר הדגירה 3 h ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB, להסיר התאים לצלחת עם 250 µL של 0.25% טריפסין לכל טוב.
- לשלב את התאים טריפסין מבארות 3 מטופלים עם בקרת הרכב או תרכובת של עניין עם 4 מיליליטר SAB צינור חרוטי 15 מ"ל.
- לספור תאים באמצעות hemocytometer ו לדלל µL 100 של נפח התאים של שלב µL 2.3.2 בשנת 900 ל- PBS.
- לדלל את מספר התאים ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB כדי 3 מ"ל-הריכוז המתאים עבור כל חדר המתאים. הנתונים מדגים כי ריכוז עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל הוא היעיל ביותר.
-
קציר תאים עם דיסוציאציה מכני עבור respirometry ברזולוציה גבוהה
- לאחר הדגירה 3 h ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB, להוסיף 1 מ"ל של x 1 SAB גלוקוז נמוך לכל היטב ובעדינות לפוצץ תאים מחוץ לצלחת עם דיסוציאציה מכני על-ידי pipetting עם טיפ פיפטה 1000 µL.
- לשלב את התאים מבארות 3 מטופלים עם בקרת הרכב או תרכובת עניין סך של 3 מ ל SAB צינור חרוטי 15 מ"ל על הנשימה.
3. Respirometry ברזולוציה גבוהה
- הכנת respirometer ברזולוציה גבוהה.
- הפעל את respirometer ברזולוציה גבוהה ולאחר להתחבר אל שולחן העבודה על-ידי השקת התוכנית ניתוח respirometer.
- האחות אתנול 70% מן התאים שניכם. משרים את התאים האלה אתנול 70% למשך תקופה מינימלית של 45 דקות.
- לשטוף את צ'יימברס פעמיים עם אתנול 70%, כ רפה בעברית לאחר כל שלב.
- לשטוף את צ'יימברס שלוש פעמים עם ddH2O, כ רפה בעברית לאחר כל שלב.
- לשטוף את בוכנות קאמרית ב- ddH2O. זה מנקה את אתנול שיורית של בוכנות ומן הנמל טיטניום.
- כיול של חיישני חמצן polarographic.
- להוסיף 2.4 מ ל 1 x SAB גלוקוז נמוך מאגר כל תא oxygraph, זע המאגר באופן רציף באמצעות מערבבים מגנטי ברים בבית הבליעה-750 סל ד ו- 37 ° C עם מרווח לצריבת נתונים ב 2.0 s על-ידי לחיצה על כפתור F7 ופתיחה הכרטיסיה שכותרתו "מערכות". לדחוף בוכנות כל הדרך פנימה, ומשכו אז אל ההגדרה לערבב ברגים. תן את מכונת equilibrate למשך תקופה מינימלית של שעה עד חמצן יציב השטף מתקבל.
- הגדר את המכונה ב 37 מעלות צלזיוס משך זמן הניסוי. הגדר קיטוב מתח 800 mV, עם רווח של 2 על ידי ללחוץ על הכפתור F7 ולאחר פתיחת הכרטיסיה בשם "חמצן, O2". Equilibrate את ריכוז החמצן המאגר SAB במשך לפחות 30 דקות, ואילו השינוי בריכוז חמצן הוא יציב (פחות מ-2 pmol/(s*mL)).
- לאחר ייצוב ריכוז חמצן, בחר אזור שבו השינוי של ריכוז חמצן יציב כדי ליצור רקע מדידות של שינוי בריכוז החמצן.
- בחר אזור על ידי לחיצה על מקש shift, לחיצה שמאלה על העכבר גרירת העכבר ברחבי האזור הנבחר. לחץ על האות המשויכים לשינוי "R1" והאזור שנבחר עבור כל עקבות, עם כל אחד שני תאים.
- לחץ פעמיים על תיבת "O2 כיול" בפינה השמאלית התחתונה, נכון הפינות של המסך, לחץ על הלחצן "בחר מארק" עבור "הכיול אוויר" כמו R1 ולאחר מכן בחר "לכייל, העתק ללוח" עבור שניהם צ'יימברס.
- הערכה של הנשימה של תאי הבטא 832/13 שהוכנו בשלבים 2.1.5 או 2.2.5.
- טען 2.4 מ של דגימה בכל אחד (אחד קאמרית עם בקרת רכב מטופל תאים, תא אחד עם מתחם תאים שטופלו) ב 1 x SAB. גלוקוז נמוך שומרים על 0.5 מ של דגימות התאים עבור כימות חלבונים על ידי assay BCA (חומצה Bicinchoninic) אם באמצעות גישה דיסוציאציה מכני (קיפאון ב-20 ° C למדידה מאוחר יותר).
- לדחוף את הבוכנה פנימה עד הסוף, תשאף האחסון שיורית. מערבבים את התאים באופן רציף לאורך כל הניסוי-750 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס במשך כל השלבים הבאים. להפוך סימן על-ידי לחיצה על F4, תיוג כמו "תאים" כאשר דגימות נטענים.
- למדוד דגימות למשך 30 דקות. לאחר ייצוב האות, בחר אזור של השינוי בריכוז חמצן המתאימים לתנאים גלוקוז נמוך (2.5 מ"מ גלוקוז) כפי שמתואר 3.2.3.
- לאחר ייצוב האות מתמלאת, להוסיף 12.5 µL של פתרון גלוקוז סטרילי 45% (הריכוז הסופי 16.7 מ מ) לתא בכל דרך טיטניום טעינת יציאה באמצעות מזרק. להפוך שסימן נמדד "גלוקוזה" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר אזור זה של השינוי בריכוז חמצן, כפי שמתואר 3.2.3. זוהי קריאת גלוקוז 16.7 מ מ, והיא מתכתבת עם תנאים מופחתים7.
- לאחר ייצוב האות מתמלאת להוסיף 1 µL של 5 מ מ oligomycin (2.5 מיקרומטר הסופי ריכוז) לתא בכל דרך יציאת הטעינה. להפוך שסימן נמדד "OligoA" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר את האזור הזה של העקומה כפי שמתואר 3.2.3. Oligomycin A מעכב ATP סינתאז, ובכך המתרחשים חמצן השטף היחידה היא באמצעות דליפה של אלקטרונים ולא זרחון חמצוני7.
- לאחר ייצוב האות מתמלאת מוסיפים 1 מ"מ FCCP במרווחים של 1 µL עד קצב הנשימה המרבי הוא הוקם. זה מייצג נשימה חשיפות מקסימלי. בין 3-4 µL FCCP הוא מספיק (1.5-2.0 מיקרומטר הסופי ריכוז) לזירוז נשימה חשיפות מקסימלי של תוספות-1 832/13 תאים. הפוך סימון עם התווית "FCCP" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר את האזור הזה של העקומה כפי שמתואר 3.2.3. FCCP הוא סוכן uncoupling. זה מאפשר לנו למדוד נשימה חשיפות7.
- לאחר ייצוב האות מתמלאת להוסיף 1 µL של 5 מ מ Antimycin A (ריכוז סופי 2.5 מיקרומטר) לתא בכל דרך יציאת הטעינה. להפוך סימן שכותרתו "אנטיה" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר את האזור הזה של העקומה כפי שמתואר 3.2.3.
הערה: Antimycin A נקשר ציטוכרום C reductase, מעכב חמצון ubiquinone ו חוסם כל נשימה. זה מאפשר לנו להפסיק לחלוטין את הנשימה7.
- טען 2.4 מ של דגימה בכל אחד (אחד קאמרית עם בקרת רכב מטופל תאים, תא אחד עם מתחם תאים שטופלו) ב 1 x SAB. גלוקוז נמוך שומרים על 0.5 מ של דגימות התאים עבור כימות חלבונים על ידי assay BCA (חומצה Bicinchoninic) אם באמצעות גישה דיסוציאציה מכני (קיפאון ב-20 ° C למדידה מאוחר יותר).
- מדידת 832/13 בתאי בטא עבור חלבונים ריכוז ונשימה נורמליזציה.
- באמצעות 0.5 mL מדגם נשמר-טעינה, למדוד חלבון לדוגמה באמצעות שיטת BCA13.
- הפעל כל מדגם שהפקידים, ללא דילול, ההוראות של היצרן.
- 832/13 תאי בטא נשימה חישובים מתאי trypsinized.
- הזן את מספר התאים לכל שימוש mL וזמינותו על-ידי לחיצה על לחצן F3 של התוכנית ניתוח respirometer. לשנות את היחידות תאים למ"ל, הזן את הריכוז הסלולר ולשנות בינוני עד SAB.
- בחר רקע קריאות כדי לנרמל את הנתונים על-ידי בחירת ולחתימה על O2 טופס כיול כפי שמתואר 3.2.3.
- לבצע בחירות של קריאות מכל 2.5 מ"מ גלוקוז, 16.7 מ מ גלוקוז, Oligomycin A, FCCP ו- Antimycin A כמתואר 3.3.1.
- בתוך התוכנית ניתוח respirometer, לייצא את קריאות אחד לאחר הזנת ריכוז חלבון ובחירה את הערך הממוצע עבור כל טיפול במהלך המדידה נשימה. פעולה זו מתבצעת על-ידי לחיצה על F2, ודחף את "העותק לפונקציה הלוח". זה מייצא את הנתונים לשימוש בתוכניות אחרות ניתוח. השתמש בערכים "O2 שיפוע שלילי" עבור חישובים.
- בצע הידור נתונים עבור 3-5 ריצות עצמאית של הרכב מטופלים פקדים טבעי תרכובות תאים שטופלו כדי לקבוע את ההשפעה על נשימה תאית תקין של תאי הבטא 832 הארצי-1/13.
- 832/13 תאי בטא נשימה חישובים מן מכנית הפומבית תאים.
- הזן את החישובים חלבון וזמינותו BCA על-ידי לחיצה על לחצן F3 של התוכנית ניתוח respirometer. לשנות את היחידות מ ג, הזן את הריכוז BCA ולשנות בינוני עד SAB.
- בחר רקע קריאות כדי לנרמל את הנתונים על-ידי בחירת ולחתימה על O2 טופס כיול כפי שמתואר 3.2.3.
- לבצע בחירות של קריאות מכל 2.5 מ"מ גלוקוז, 16.7 מ מ גלוקוז, Oligomycin A, FCCP ו- Antimycin A כמתואר 3.3.1.
- בתוך התוכנית ניתוח respirometer, לייצא את קריאות אחד לאחר הזנת ריכוז חלבון ובחירה את הערך הממוצע עבור כל טיפול במהלך המדידה נשימה. פעולה זו מתבצעת על-ידי לחיצה על F2, ודחף את "העותק לפונקציה הלוח". זה מייצא את הנתונים לשימוש בתוכניות אחרות ניתוח. השתמש בערכים "O2 שיפוע שלילי" עבור חישובים.
- בצע הידור נתונים עבור 3-5 ריצות עצמאית של הרכב מטופלים פקדים טבעי תרכובות תאים שטופלו כדי לקבוע את ההשפעה על נשימה תאית תקין של תאי הבטא 832 הארצי-1/13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי הבטא 832 הארצי-1/13, כי הם מוכנים שנקטפו כמפורט בפרוטוקול תדגים אפנון בצריכת החמצן בהתבסס על ההתערבות כימיים שונים (איור 1 א'). עלייה נשימה יתקיימו כאשר ריכוז הגלוקוז הוא גדל עד 16.7 מ"מ גלוקוז (איור 1B). נשימה יקטן כאשר התאים ללא פגע מטופלים עם Oligomycin א נשימה זו ידועה בשם דליפה, אשר מוגדרת בתור המדינה בדרכי הנשימה הבזליים, nonphosphorylating. נשימה מקסימלי תושג כאשר תאי הבטא מטופלים עם הסוכן uncoupling FCCP, אשר מוגדר ETS נשימה, או אלקטרון התחבורה מערכת הנשימה. לבסוף, נשימה תרד לאפס כאשר מטופלים עם Antimycin A, כאנטי ROX (צריכת חמצן שיורית) המתייחס צריכת חמצן סלולרי שאינו נשימתי.
הבדלים במספר התאים ישתנה באופן משמעותי את איכות הנתונים המתקבלים בטכניקה זו. זירוז-גלוקוז נשימה נמדדה ב 0.5, 1, ו 2 x 106 תאים למ"ל (איור 2 א-2 C). באמצעות ספירת BCA חלבון מבחני, החלבון בריכוזים המתאימים לתא נבדקו שלושה ריכוזים חושבו (איור דו-ממדי). מדידות באמצעות 0.5 x 106 תאים למ"ל נכשל להפגין נשימה מגורה-גלוקוז (איור 2 א), ולא רק את החוצנים הקשורים נשימה מוגברת הוצגה להיות משמעותי. הדבר מצביע על כי המספר נמוך תא התוצאה היא אות חלש יחס הרעש שמבלבלת את התוצאות. באופן דומה, מדידות-עונה 2 פרק 106 תאים למ"ל הביאה גם השתנות משמעותית, כפי שמציין מובהקות סטטיסטית רק להיות הושיט את המידות ETS (איור 2C). זאת כנראה בשל הצורך מחדש לחמצן התאים מספר פעמים במהלך וזמינותו, אשר הביא השתנות גדולה יותר מדגם מדגם. נתונים אלה מדגימים כי ריכוזי עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל לגרום בנשימה משמעותי מגורה-גלוקוז, דליפה של ETS מדידות, אשר נחוצים עבור ניתוחים נשימה (איור 2B , 2E).
שתי שיטות הסרת התאים עבור הנשימה מוצגים פרוטוקול זה. באמצעות טריפסין כדי להסיר תאים יעילה כאשר מדידות הושלמו ב 37 º C. מדידות נשימה נעשה העדר או נוכחות של כורכומין (איור 3 א) מדגים תחזוקה של גירוי-גלוקוז הנשימה, הנשימה דליפה של ETS. השוואה של כורכומין מטופלים תאים לתאים ללא טיפול מדגים ללא כל שינוי כלשהו פרמטרים אלה בדרכי הנשימה (איור 3B-C). מדידות נשימה נעשה העדר או נוכחות של epicatechin קקאו מונומר (איור 3D) גם מדגים תחזוקה של גירוי-גלוקוז הנשימה, הנשימה דליפה של ETS. השוואה של קקאו epicatechin תאים מונומר להתייחס לתאים ללא טיפול מדגים נשימה מוגבר ב- 2.5 מ מ ו מ מ 16.7 גלוקוז, כמו גם בנשימה דליפה של ETS (איור 3E-F). נתונים אלה מדגימים כי בעוד כורכומין אינו משפר נשימה תאי בטא 832/13, epicatechin קקאו מונומר עושה (איור 3G). הכורכומין הוכח להגברת הפרשת אינסולין דרך עיכוב פעילות phosphodiesterase14. הנתונים שלנו מראים כי כורכומין לא שפר את הפרשת האינסולין דרך להתכוונן מיטוכונדריאלי פונקציה. כבר הראו כי תרבות בנוכחות epicatechin קקאו מונומרים המניע ביטוי מרכיבים שונים של רשת התחבורה אלקטרון מיטוכונדריאלי5. הבחנו גם נשימה מוגברת במדינה דליפה (המושרה על ידי טיפול עם oligomycin) ועם ETS (מערכת התחבורה אלקטרון, המושרה על ידי FCCP). השימוש בכלי זה מצביע על מספר מטרות אפשריות עבור מחקרים עתידיים.
כחלופה טריפסין להסרה של תאים, דיסוציאציה מכני גם ניתן לבצע בטכניקה כביסה שהוצגו כאשר הושלמה ב 37 º C. נשימה מדידות נעשו בו העדר או נוכחות של כורכומין או epicatechin קקאו מונומר (איור 4A-C). נתונים אלה מדגימים כי המגמות נצפתה עם טריפסין הכנה של התאים נשמרים, אולם הרגישות מופיעה כדי לרדת. בעוד מונומר epicatechin שליטה וקקאו מטופלים תאי שמר את הגלוקוז-גירוי, דליפה של ETS נשימה, תאים שטופלו כורכומין נשמרות רק את הנשימה מגורה-גלוקוז לאור ההשתנות מדגם-כדי-sample מוגברת. בעוד המגמות הבחינו בהכנות תא טריפסין היו מתוחזקים (איור 4D-F), המשמעות ירד בחודש כל הפרמטרים, ככל הנראה כדי ההשתנות מדגם-כדי-sample רבתי שהציג את הדיסוציאציה מכני, נירמול למספר ריכוז ולא תא חלבון.
נתונים אלה מדגימים כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד את הנשימה של תאי הבטא הארצי-1 832/13 ללא פגע. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו מציע מספר התא האופטימלי עבור מדידות מדויקות וגם בשיטה המועדפת עבור הכנת התאים כדי למקסם את האות לרעש יחס.
איור 1 : נציג נשימה העקומה של תאי הבטא תקינה 832/13. תאי הבטא תקינה 832/13 נמדדים על הנשימה ב- Oligomycin (איור 1 א') 2.5 מ"מ גלוקוז, מ מ 16.7 גלוקוז, 2.5 מיקרומטר, 2 מיקרומטר FCCP (קרבוניל ציאניד -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) ו 2.5 מיקרומטר Antimycin א הרחבה של 16.7 מ מ סעיף גלוקוז (איור 1B) מוצגת כדי להדגים את הגידול בנשימה מגורה-גלוקוז. תאים נמדדו ב ריכוז עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל.... דליפת מתייחס המדינה הנשימה הבזליים, nonphosphorylating ETS מתייחס יכולת הנשימה חשיפות של מערכת התחבורה אלקטרון, לוקאס סולאס מתייחס צריכת חמצן שיורית לאחר נשימה מיטוכונדריאלי מעוכבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : קביעת מספר תאי הבטא 832/13 הכרחי למדידות נשימה גלוקוז-induced. תאי הבטא תקינה 832/13 נמדדים על נשימה בריכוזים של (A) 0.5 x 106 תאים/mL (B) עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל, או (ג) 2 x 106 תאים למ"ל. (ד) ריכוז חלבון זה מתכתב עם 0.5 x 106 תאים למ"ל, עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ו 2 x 106 תאים למ"ל. השוואה (E) של הנשימה-0.5 x 106 תאים למ"ל, עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ו 2 x 106 תאים למ"ל. נשימה נמדד גלוקוז, מ מ 16.7 גלוקוז, 2.5 מיקרומטר תחת-2.5 מ מ Oligomycin, 2 מיקרומטר FCCP ותנאים 2.5 מיקרומטר Antimycin A. נשימה עם הסוכר מ מ 2.5 ו- 16.7 מדגימים את התגובה מגורה-גלוקוז נשימה של תאי הבטא. נשימה לאחר oligomycin מדגים את הנשימה דליפה (הבזליים, nonphosphorylating הנשימה המדינה). נשימה לאחר FCCP (קרבוניל ציאניד -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) טיפול מדגים (חשיפות קיבולת הנשימה של מערכת התחבורה אלקטרון, ETS). n = 6 מסלולים עצמאיים. הנתונים כפי הממוצע ± ב- SEM שהוצגו * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מדידות נשימה של תאי הבטא 832/13 לאחר שחרורו באמצעות טריפסין. תאי הבטא 832/13 היו תרבותי ב נוכחות או היעדרות של monomeric epicatechin קקאו או כורכומין, נשימה נמדדה לאחר שחרור תאים באמצעות טריפסין. נשימה נמדד גלוקוז, מ מ 16.7 גלוקוז, 2.5 מיקרומטר תחת-2.5 מ מ Oligomycin, 2 מיקרומטר FCCP ותנאים 2.5 מיקרומטר Antimycin A. נשימה עם הסוכר מ מ 2.5 ו- 16.7 מדגימים נשימה מגורה-גלוקוז. נשימה לאחר oligomycin מדגים את הנשימה דליפה (הבזליים, nonphosphorylating הנשימה המדינה). נשימה לאחר FCCP (קרבוניל ציאניד -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) טיפול מדגים (חשיפות קיבולת הנשימה של מערכת התחבורה אלקטרון, ETS). נשימה לאחר antimycin טיפול מדגים צריכת החמצן שיורית (רוקס). טיפול (A) 832/13 תאים עם כורכומין שומר את השינויים המתאימים בנשימה בשל הטיפולים. מעקב נציג (B) ו- (ג) ממוצע של נתונים עבור תאים שטופלו כורכומין מדגים ללא כל שינוי הנשימה תאי בטא 832/13. טיפול (D) 832/13 תאים עם קקאו epicatechin מונומר שומר את השינויים המתאימים בנשימה בשל הטיפולים. מעקב נציג (E) ו- (F) ממוצע של נתונים עבור תאים מונומר שטופלו epicatechin קקאו מדגים נשימה מוגברת של כל הפרמטרים לאחר הטיפול מונומר epicatechin קקאו. (G) כל שלושה פרמטרים מוצגים יחד לשם השוואה. n = 6 מסלולים עצמאיים. הנתונים כפי הממוצע ± ב- SEM שהוצגו * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : מדידות נשימה של תאי הבטא 832/13 לאחר שחרורו באמצעות דיסוציאציה מכני. תאי הבטא 832/13 היו תרבותי ב נוכחות או היעדרות של monomeric epicatechin קקאו או כורכומין, נשימה נמדדה לאחר שחרור תאים באמצעות דיסוציאציה מכני. נשימה נמדד גלוקוז, מ מ 16.7 גלוקוז, 2.5 מיקרומטר תחת-2.5 מ מ Oligomycin, 2 מיקרומטר FCCP ותנאים 2.5 מיקרומטר Antimycin A. נשימה עם הסוכר מ מ 2.5 ו- 16.7 מדגימים את התגובה גלוקוז של תאי הבטא. נשימה לאחר oligomycin מדגים את הנשימה דליפה (הבזליים, nonphosphorylating הנשימה המדינה). נשימה לאחר FCCP (קרבוניל ציאניד -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) טיפול מדגים (חשיפות קיבולת הנשימה של מערכת התחבורה אלקטרון, ETS). הממוצע של נתונים עבור תאים (א) מטופל תאים או תאים שטופלו כורכומין (B) או (ג) epicatechin קקאו מונומר להדגים את הדיסוציאציה מכני שומרת על נשימה מגורה-גלוקוז לכל הטיפולים, בעת דליפת ו ETS מובהקות הן אבודות רק בתאים כורכומין מטופלים. השוואה של תאים שלא טופלו כורכומין (ד) או (E) epicatechin קקאו מונומר מדגים נשימה מוגברת של כל הפרמטרים עם קקאו epicatechin מונומר ללא שינוי משמעותי כדי נשימה עם כורכומין. (F) כל שלושה פרמטרים מוצגים יחד לשם השוואה. n = 6 מסלולים עצמאיים. הנתונים כפי הממוצע ± ב- SEM שהוצגו * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הנשימה בבתי שלם בתאי בטא בלבלב. שיטה זו מאפשרת מדידת תגובת תאי בטא רמות גלוקוז מוגברת. הפרוטוקול מאפשר גם רעלני עם תרכובות שונות, כפי שמתואר ב פרוטוקול זה עם המתרחשים באופן טבעי monomeric epicatechin או כורכומין4,5. פרוטוקול זה, עם רעלני (כפי שמוצג כאן), או על ידי טיפול בתוך התאים הנשימה עם שינויים מינימליים פרוטוקול בסיסי יכול לשמש טיפול עם תרכובות שונות אחרות.
ישנן דרכים שונות על ידי אשר יכול להיות שונה בשיטה זו. שורות תאי בטא אחרות יכול לשמש; עם זאת, מספר הטלפון והשעות שטיפת SAB יהיה צורך להיקבע השפעול. ראשי מכרסם ושל האדם יכול גם לשמש; עם זאת, מספר התאים או איון מקבילות גם צריך להיקבע השפעול. לפחות מחקר אחד יש למדוד צריכת החמצן איון שימוש ברזולוציה גבוהה respirometry15. מחקר זה נדרש איונים 400 לכל תגובה, אך לא למדוד שינויים נשימה גלוקוז המושרה. בהתחשב בכך רקמות הראשי משמש לעתים קרובות עם16,respirometers ברזולוציה גבוהה17, איים שלמים יוכל לשמש לאחר פתרון בעיות ניסיוני. עם זאת, לאור מספר רב של איים הנדרש עבור זה וזמינותו, שיטות אחרות למדידת צריכת חמצן עשוי להיות מתאימה יותר. מדידות של איון העיקרי נשימה.
ישנם כמה צעדים קריטיים עם פרוטוקול שהוצגו. ראשית, יש מספר תאים הוא קריטי. מחקרים שלנו מראים כי תאי הבטא 832/13-ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל מספיקה למדידות נשימה מגורה-גלוקוז. מדידות באמצעות 0.5 x 106 תאים למ"ל הפגין נשימה מגורה-גלוקוז נמוך ו אות לרעש יחס נמוך. יתר על כן, מדידות באמצעות 2 x 106 תאים למ"ל הביא השתנות הדגימה כדי מדגם גבוהה ושימוש מהירה התאית חמצן אשר קאמרית הדרושים מחדש חמצן וכתוצאה לעתים קרובות מוות תאים מהירה. מספר מתאים של תאים צריך להיקבע השפעול עבור שורת תאים נתון על מנת לפתור בעיות שלב קריטי זה.
שלב קריטי השני הוא מכין את תאי הבטא להגיב על רמות גלוקוז גבוהות. התקשורת התרבות RPMI 1640 יש רמות גלוקוז גבוהות. התאים חייבים להעביר את גלוקוז גבוהה תרבות גלוקוז נמוך. דגירה 3 h ב- 1 x SAB גלוקוז נמוך מספיקה עבור התאים בטא תגובה משמעותית התוספת של גלוקוז ~16.7 מ מ. שטיפת תקופות של פחות מ-3 שעות התוצאה משתנה התגובות התוספת של גלוקוז. פתרון בעיות תגובת הגלוקוז ניתן לטפל על ידי הגדלת משך הזמן לשטוף SAB.
שלב קריטי השלישית היא השיטה עבור הכנת התאים למדידות. הנתונים שלנו מדגים בזמן טריפסין, דיסוציאציה מכני שניתן להשתמש בשניהם, טריפסין שוחרר תוצאה תאים בקריאות עקבית יותר ופחות ולשונות דוגמת-כדי-sample. המגמה נצפתה עם שתי השיטות נשמר, אולם הכוח של הנתונים היה גדול עם תאי המוכנים טריפסין. בעוד בשיטות אחרות, כגון תא גירוד, עשוי לשמש הנתונים שלנו מראים כי השימוש של טריפסין יביא התוצאות ביותר לשחזור עם פחות מדגם-כדי-sample השתנות18,19.
מגבלות של גישה זו כוללים את הבאים. ראשית, עם רק שתי טיפול תאי, זו אינה תפוקה גבוהה הקרנת בשיטה. כל הפעלה של שני מדגמים לוקח בין 3-4 h, כולל הזמן להכין את המכונה. שנית, ריכוז יחסית גדול של תאים נדרש וזמינותו, בהתחשב mL ~2.2 מדגם (או ~2.2 x 106 תאים) זקוקים לכל תא. עקב כמות הדגימה הדרושה וזמינותו, השימוש של הכלי הזה, פרוטוקול עבור איונים העיקרית היא מוגבלת, אלא אם מאגר גדול הינו זמין. המחקרים הקודמים בהם השתמשו איים על נשימה בטכניקה זו משתמשים ~ 400 איונים/קאמרית15. זה דורש, בערך, איים מתוך שני עכברים עבור כל תא20. שלישית כי תאים permeabilized שאינם בשימוש, היכולת לקבוע את השפעת הטיפול על רכיבים אלקטרונים בודדים שרשרת באמצעות תרכובות שאינן תא חדיר אינה זמינה.
ישנם מספר יתרונות משמעותיים של פרוטוקול זה לגבי שיטות קיימות. ראשית, פרוטוקול זה מאפשר עבור טיטור stepwise של תרכובות שונות קרום חדיר. זה לאפשר הקביעה מדויקת של ריכוזים הכרחי. שנית, השימוש בתאי בטא שלם מאפשרת לנו לבצע שאילתה ההשפעה על חילוף החומרים של גלוקוז cytosolic ו מיטוכונדריאלי7. פעולה זו מאפשרת לנו להתבונן פנוטיפים מעיד על שינוי מסלול glycolytic, התבוננות זה אובד בעת שימוש בתאים permeabilized. שלישית, התאים ללא פגע מאפשרות לנו להשתמש תגובת גלוקוז גבוהות כמו מדד של תפקוד תאי בטא, אשר הולך לאיבוד גרסאות permeabilized של זה וזמינותו. בסופו של דבר, פרוטוקול זה מאפשר התוספת של חומרים שונים, מרובים בשאילתה את ההשפעה של תרכובות על תאי בטא נשימה, מותרות שאינה קיימת עם כלים נוספים המודדים את הנשימה.
יישומים עתידיים של שיטה זו כוללות את היכולת למדוד פרמטרים כגון ATP, סידן ו- H2O2 רמות בו זמנית עם נשימה מדידות. שיטה זו מאפשרת גם למדידה של הנשימה בנוכחות מקורות דלק אחרים, כגון חומצות שומן או קטונים. לבסוף, עם מספר שינויים, מדידת רמות האינסולין המופרש בו-זמני עם נשימה מדידות גם ייתכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות חברים של מעבדות Tessem, הנקוק העוזרת, דיון מדעי. המחברים מודים אנדרו Neilson, PhD (וירג'יניה טק) על מתן השבר מונומר קקאו epicatechin נגזרת. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר פעולה סוכרת, קרן חינוך JST.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
References
- Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
- Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
- Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
- Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
- Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
- Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
- Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
- Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
- Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
- Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
- Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
- Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
- Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
- Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
- Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).
