Summary

Целом гора Confocal микроскопии для уха взрослого кожи: модель системы для изучения нейро сосудистые ветвления морфогенеза и иммунных клеток распределения

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Здесь мы описываем высокого разрешения всего гора изображений метод в коже уха всей взрослой мыши, что позволяет нам визуализировать ветвления морфогенеза и кучность периферических нервов и кровеносных сосудов, а также распределение иммунных клеток.

Abstract

Здесь мы представляем протокол кожи уха взрослого целом гора изображений техника для изучения всеобъемлющей трехмерной нейро сосудистые ветвления морфогенеза и структурирования, а также распределение иммунных клеток на клеточном уровне. Анализ периферических нервов и кровеносных сосудов анатомических структур во взрослых тканях предоставляет некоторые идеи в понимание функциональных нейро сосудистые проводки и нейро сосудистые дегенерации в патологических условиях заживление ран. Как весьма информативный модель системы мы сосредоточили наши исследования на кожу уха взрослого, который легко доступны для рассечения. Наш простой и воспроизводимые протокол обеспечивает точное описание клетчатых компонентов на всей коже, например периферических нервов (сенсорные аксонов, симпатичная(ый) аксонов и Шванновские клетки), кровеносные сосуды (эндотелиальные клетки и клетки сосудистой гладкой мышцы ) и воспалительных клеток. Мы считаем, что этот протокол будет проложить путь к расследованию морфологические аномалии в периферических нервов и кровеносных сосудов, а также воспаление в коже уха взрослого при различных патологических условиях.

Introduction

Кожа состоит из трех слоев: эпидермиса, дермы и гиподермы. Он использовался как модель системы для изучения стволовых клеток обслуживания, дифференциация и морфогенез в развитие, а также регенерации, tumorigenesis и воспаления в взрослых. Кожа является Богато васкуляризированной и иннервируются таким образом, что хорошо скоординированного развития периферической нервной системы и сосудистой системы.

Ранее мы продемонстрировали изображений техника целом гора эмбриональных кожи с несколькими маркировки для изучения нетронутыми периферических нервов и кровеносных сосудов, включая их клеточных компонентов1,2,3, 4: сенсорные аксоны, симпатичная(ый) аксоны, Шванновские клетки в нервы, эндотелиальные клетки, pericytes и сосудистой гладких мышечных клеток (VSMCs) в кровеносных сосудах. Во время ангиогенеза первичной капиллярной сети проходит интенсивный сосудистого ремоделирования и превращается в иерархической сосудистой разветвленную сеть. В развивающихся дермы/гиподермы артерий филиал наряду с периферической сенсорные нервы и Вены, а затем образуют прилегающих к артерии. После того, как иерархическое сосудистой сети тщательно покрыта VSMCs, симпатические нервы протянулись вдоль и иннервируют большого диаметра сосудов1,5,6. Несмотря на значимость в тесную связь между развивающихся нервной и сосудистой систем главный вопрос был решать, что произойдет с нейро сосудистые сетей в различных патологических ситуаций в взрослых. Трехмерных изображений высокого разрешения необходимо оценить патогенеза, наряду с анатомически узнаваемые ветвления морфогенеза и кучность.

Нейронов и сосудистой морфогенеза в кожи взрослых мыши обычно анализируемой окрашивание ткани секции. Другие исследования использовали всего гора изображения кожи для визуализации периферических нервов и кровеносных сосудов, в дополнение к волосяных фолликулов, сальных желез и мышца пили мышцы7,8,9. Однако толщина кожи взрослых затрудняет анализ кожи на всю глубину.

В настоящем исследовании мы разработали роман с высоким разрешением изображений целом гора уха взрослого кожи для преодоления этих проблем. Ухо кожа легко доступны для диссекции и последующей целом гора изображения кожи над ее всю глубину. Таким образом это простой и очень воспроизводимый метод, который может применяться для сравнения трехмерную архитектуру периферической нервной и сосудистой систем в коже, с всеобъемлющей количественной измерения. Мы продемонстрировали, что выравнивание периферической сенсорной и симпатических нервов с большого диаметра сосудов сохраняется в взрослых кожи. Цель настоящего Протокола заключается в визуализации ветвления морфогенеза и кучность периферических нервов и кровеносных сосудов, а также распределение иммунных клеток на клеточном уровне в модели взрослых мыши в различных условиях, таких как воспаление и Регенерация.

Protocol

Под номером официального утверждения от национального сердца, легких и крови института (NHLBI) животное уход и использование Комитета были все эксперименты в этом разделе. 1. Взрослый мыши ухо кожа коллекция Усыпить взрослых мышей воздействием двуокиси углерода (CO2<…

Representative Results

Взрослый мыши задний уха (рис. 1A) переднего ухо кожи и (рис. 1B) были immunostained с антителами к αSMA (красный), Tuj1 (зеленый) и PECAM-1 (синий). Задняя кожа была immunostained для изучения распределения нейро иммунных антител к CD11b (красный) и MBP (зеленый), вместе…

Discussion

Этот протокол описывает immunonohistochemical целом гора изображений уха взрослого кожи для анализа нервно сосудистых структур и распределение иммунных клеток. Мы считаем, что этот метод имеет многочисленные экспериментальные преимущества для исследователей для изучения ветвления морфогенез…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим K. Gill Лаборатория управления и технической поддержки, J. Hawkins и сотрудников национальных институтов здравоохранения (НИЗ) 50 животных фонда для помощи с мыши уход и р. Рид и F. Baldrey для административной помощи. Спасибо также S. Motegi и м. Udey для обмена их уха кожи рассечение протокол, N. ожоги редакционной помощи, и члены лаборатории стволовых клеток и нейро-сосудистая биология для технической помощи и вдумчивого обсуждения. Т. Ямадзаки был поддержан японского общества для поощрения науки (JSP) низ-KAITOKU. Эта работа была поддержана интрамуральных исследовательской программы национального сердца, легких и крови института (HL005702-11-ю.м.)

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).

Play Video

Cite This Article
Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

View Video