Summary
ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated 脳脊髄スライス培養を生成する低コストかつ信頼性の高い方法を提供します。
Abstract
Gaba 作動性介在ニューロン (INs) は、ドライブの認知・行動神経ネットワークの重要なコンポーネントです。大脳皮質を設定する運命を移行で腹側に組み込みと外因性の終脳 ((MGE、CGE) 内側と尾節大物を含む) さまざまなレスポンスで背側骨皮質骨板に起源の場所から接線方向手がかり。異なる方法論は遺伝子特定の経路を操作し、適切に必要な細胞骨格の動的な変化を調整する方法を調査に長年にわたって開発されている移行。子宮内エレクトロポレーションは遺伝子発現抑制の効果を研究に広く使用されています。 または形態および最終的な位置への影響を評価しながら過剰発現の特定のサブタイプします。ただし、このアプローチは容易に放射状に移行する錐体細胞を変更するのには使用されますが、それはより技術的に困難な子犬の減少生存率を与えられる低降伏点が生成される子宮内保険エレクトロポレーションをターゲットとエレクトロポレーションは、e14.5、MGE 派生アドインの勉強は、慣習として前に行われています。別のアプローチで MGE 植、MGE へ簡単なアクセスを提供、遺伝子組み換えの INs のイメージングを容易にします。ただし、これらの植で INs は内因性指導手掛かりおよび視床入力を欠いている、人工マトリックスに移行します。これは、アドインが子宮内アプローチの技術的な課題を回避しながらより自然主義的な環境で移行できますメソッドを最適化するために私たちを促した。本稿で述べるマウス萌芽期の脳脊髄スライス培養を容易に追跡、イメージおよびに応えて自然のパスに沿って移行する遺伝子組み換えのプラグインを再構築後のex 子宮穿孔の組み合わせ内因性の手がかり。このアプローチは定量化カルビンディン抗体に固定組織の神経再建を使用して様々 な形態学的パラメーターの詳細な分析と同様、コマ撮りの共焦点レーザー顕微鏡を使用して移行での動的な側面のことができます。
Introduction
皮質 gaba 作動性介在ニューロン (INs) はその生化学的性質、生理学的性質と接続性に関して多様であり、彼らは成熟したネットワーク1,2,3 でさまざまな機能を仲介します。、4,5。皮質の INs のさまざまなサブタイプの仕様が広く調査1,2されている遺伝子のカスケードを堅く調整されます。大脳皮質 gaba 作動性 INs の大部分 (70%) 内側神経節隆起 (MGE)、腹側に位置する萌芽期の構造の前駆細胞に属し、皮質板1、に到達する比較的長い距離の間で移行する必要があります。2,6皮質錐体細胞に移行放射状グリア細胞足場に沿って皮質板 (VZ) の心室の地帯から放射状、さまざまな組み込みが必要ですこのような足場に接続されていない、あるプラグインの接線方向の移動と。非皮質構造2,7,8から彼らを指導しながら皮質板へ移行するニューロンを誘致する外因性の手がかり。細胞周期を終了すると、アドインは、MGE から皮質板9,10に向かって接線方向の移動をトリガーする MGE の VZ 内で表現される化学療法反発手掛かりによって撃退されます。アドインの移行異なる反発手掛かり11の援助と線条体を避けるため、皮質板に達すると後、彼らは、接線方向から放射状移動モードに切り替えるし、錐体からキューに応答の一部の彼らの最終的な層流位置に到達セル12と他の細胞集団13。他の神経細胞の集団として、アドインの移行は、ニューロンの実際の動きを許可する様々 な動的形態変化を伴います。このいわゆる神経運動は 3 つの連続する手順の反復的なサイクルによって特徴付けられる: 主要なプロセス、核 (nucleokinesis) のアクティブな前向性モーション、後続プロセス14の撤回の伸長。移行ではドライブの分岐と向きと移行14,15 の速度を決定する、適切な方向に INs を導く主要なプロセスのアクティブな改造多数の組み込みと外因性手掛かりによって規制されて ,16。
移行した皮質を規制する要因は、近年1,2,7,17,18,19、20、広く研究されています。つながる神経発達障害、小児難治性てんかんや自閉症スペクトル障害1,2,21,などいくつかのこれらの分子の俳優の中断が仮定されています。22,23,24します。 したがって、生体外でそして生体内の様々 なアプローチの開発は以前に再検討された25として、動的な過程を研究する当社の能力が大幅に躍進する追求されてきた。体外メソッド、ボイデン室アッセイとストライプの選択法などを含む神経移行中に要件と特定の遺伝子または蛋白質の細胞の自律的影響を評価するための最速かつ最も再現性のある手段を提供します。他の影響を受けずに25 をを要因します。これらのアッセイは、ライブ イメージング8,26,27と組み合わせると特に役立ちます。これらの技術を簡単に e13.5 MGE から取得および8,28 を以前示すようにその後様々 なシグナル伝達経路と指導の手がかりを調べることができます、酵素と機械的解離によって分離.ただし、これらの試金は細胞遊走や生存25に影響を与える可能性がある神経細胞の挙動と細胞プロパティを変更するかもしれない三次元組織アーキテクチャの不在で人工細胞外マトリックスの場所を取る。これらの制限を回避するためにex vivo MGE 植は、速度と方向で14などのパラメーターと共に移行中に発生する動的形態学的変化を定量化するための代替ツールとして開発されています。 29。MGE 植を生成するは比較的簡単です、広くされている30を他の場所で説明されています。それは後者がオプション31マトリゲルと魅力的または冷淡なキュー25の存在下でコラーゲンの混合物、混合の大脳皮質細胞の膜上に MGE の小さな抽出物のめっきを伴います。MGE 植まばら標識細胞のイメージング、32,33 を示したように分岐、主要なプロセス中に骨格改造など、細胞内のプロセスの研究を簡素化する高解像度を可能にします。、34本研究で。MGE 植は、(例えば、Tielensら201633を見なさい) 特定の薬理学的または遊走操作後例えば 2D 環境での移行時に骨格変化を評価するために正常に使用されています。.ただし、この方法で、人工マトリックス内にアドインを移行、これは動作と再現性実験結果の有意性を変更可能性があります。
対照的に、子宮内でエレクトロポレーションのネイティブ環境でプラグインの遺伝子操作を有効にし、迅速かつ効率的の制限を回避しながらゲインの影響と遺伝子機能の損失を評価するために広く使用されている方法です。高価な時間のかかるノックアウトとノックで戦略25,35。セル型特定プロモーターを使用し、MGE36を含む腹内側核の構造への電極を配置することで、子宮内でエレクトロポレーションを前駆細胞で偏ってすることができます。さらに、子宮内エレクトロポレーションにより実験的構造を 1-2 日内のタイムリーな表現のため構造式を用いたウイルスに必要な 7-10 日に比べてベクトル25。しかし、子宮内でエレクトロポレーションの前駆細胞の低降伏点傾向があります。確かに、背側心室ゾーンにある錐体細胞の前駆細胞を効率的に導入することができますが子宮内を使用して、MGE より腹側に位置する構造をターゲット エレクトロポレーションより技術的に難しいは特に小さな e13.5 に胚と胚性致死性さらに率が高い実験的利回り25が減少します。
体外に関連する技術的な制限のいくつかを回避するために MGE は実験と体内の子宮内でエレクトロポレーションを外植体、脊髄スライス培養前のヴィヴォが開発した8,37をされています。 38,39。脳切片スライス文化提供は安価で生成する動物モデル25よりも時間がかかるしながら体内を模倣の利点が条件します。確かに、これらの準備はプラグインの具体的な可視化と共に、MGE へ簡単にアクセスを許可するより生理的環境8に移行するアドインの特定の分子経路を調査する焦点エレクトロポレーションと組み合わせることができます。,39,40,41我々 はしたがって切片文化38、 ex 子宮穿孔と時間経過の共焦点レーザー顕微鏡と組み合わせて我々 のアプローチを最適化して、さらに形態学的および動的処理の発生評価。中に MGE アドインの接線方向の移動。この議定書は適応し、錐体細胞42,43の移行を検討するex 子宮または子宮内脳エレクトロポレーションと脊髄スライス培養を使用している人から最適化されたと皮質 INs36,,3944。具体的には、首をはねられマウス胚と、MGE は electroporated ex vivo実験プラスミドの脳室内注入後より効率的かつ正確に達成できるものよりも MGE 前駆細胞のターゲット子宮内エレクトロポレーション。脳が抽出されると全脳辺縁系を数日間培養することができますに分割、ので、連続追跡 transfected INs のイメージングします。このアプローチは、通常脳スライスあたりの 5-20 接線方向に移行する INs を容易に分離できるように十分にまばらなニューロン集団をラベリングしながら統計的有意性に到達するために必要な実験の繰り返しの数を最小限に抑えることをラベルします。復興と微細形態学的評価のため個々 のニューロン。さらに、切片文化確実に移行する MGE 植に比べて INs はローカル分泌ケモカインと求心系の視床からの入力などを含むより自然な環境に公開されます。この方法は方向性と主要なプロセスの分岐など細かい動的プロセスの評価を許可する十分な解剖学的な詳細を提供している間 transfected INs によって採択された渡り鳥のパスを定量化するに適してnucleokinesis と後続のプロセス撤回。
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Protocol
すべての実験動物を含む Comité Institutionnel デもの Pratiques avec les チュー サント-ジュスティーヌ研究所 Animaux」(CIBPAR) で承認された、動物ケアの入門のカナダの評議会に従って実施されました。ケアと実験動物 (第 2 版) の使用。
ここで説明されているプロトコルは、日 (e) 13.5、同時にピークの CGE 派生 INs 生産45,46前に、とき MGE 派生アドインが積極的に生成される胚のエレクトロポレーション用に最適化されました。さらに、gaba 作動性インに向かってエレクトロポレーションをバイアス、アドイン (たとえば、最小限のエンハンサーとDlx5/6プロモーター)47で選択的に発現プロモーターを使用します。
1. 電気穿孔法と脊髄スライス培養用溶液の調製
- 無菌培養の培地の 125 mL を準備します。
- 正規ニューロン固有文化媒体の 125 mL を測定 (定式化の材料表を参照してください) 以前 UV 殺菌バイオ キャビネットの滅菌瓶 70% エタノールを散布します。無血清細胞固有のサプリメントは、1.75 mL 200 mM グルタミン (最終濃度 0.5 mM) の熱不活化馬血清無菌条件下で以前検体の 6.25 mL × 50 の 2.25 mL を追加します。ミックス徹底的に、生殖不能の円錐管に 15 mL の因数と 4 ° C で保存
注意: 培地準備が 4 ° C で最大 3 週間保存することができます。 - 無菌条件下で 150 μ 因数に X の Botteinstein の N-2 定式化48の原液 100 を分割し、使用するまで-20 ° C で凍結します。
- 正規ニューロン固有文化媒体の 125 mL を測定 (定式化の材料表を参照してください) 以前 UV 殺菌バイオ キャビネットの滅菌瓶 70% エタノールを散布します。無血清細胞固有のサプリメントは、1.75 mL 200 mM グルタミン (最終濃度 0.5 mM) の熱不活化馬血清無菌条件下で以前検体の 6.25 mL × 50 の 2.25 mL を追加します。ミックス徹底的に、生殖不能の円錐管に 15 mL の因数と 4 ° C で保存
- 無菌人工髄液 (アプライド) の 1 リットルを準備します。
- 800 mL の 1 L ビーカーに蒸留水を測定します。ショ糖の 25.67 g、塩化ナトリウム (NaCl) の 5.08 g、炭酸水素ナトリウム (NaHCO3) の 2.18 g ブドウ糖、塩化カリウム (KCl) 0.19 g の 1.80 g 0.15 のグラムを追加一塩基無水リン酸ナトリウム (NaH2PO4)、1 M 在庫 CaCl 21 mL.2H2O と 1 M の 2 mL 在庫 MgSO4.7H2O. 攪拌室温で溶解します。蒸留水 1 L の総ボリュームに到達するを追加します。
- 0.22 μ m のフィルターを使用して、滅菌バイオ セーフティ キャビネットにおける滅菌ボトルにソリューションをフィルターし、4 ° C で 1 ヶ月保存します。
- 各実験の前にアプライドで 4% の agarose の新鮮なソリューションを準備します。
- 50 mL の生殖不能の円錐管の事前に準備されたアプライドの 25 mL を測定し、ポイントの低融点アガロースの 1 グラムを追加します。
- 45 熱電子レンジで s。こぼれる、沸騰を開始するときにすべての 3-4 秒を加熱を中断、圧力をそれを再び閉じて、agarose をミックスする手動で攪拌させるチューブを開きます。アガロース溶液が均一になるまでを繰り返します。42 ° C で凝固を避けるために実験の残りの中にアガロース溶液を維持します。
注: より高い温度が脳組織を損傷します。
2. 注入のプラスミッドの準備
- ガラス製のインジェクション ピペットをプルします。
- マイクロ ピペット引き手適切なパラメーターを設定、設けられたスペースにはガラス毛細血管を保護し、フィラメントと中央に表示かどうかを確認します。
- プルダウン ボタンを押します。
- 先端の損傷を避けるためにさらに使用するまで熱の引き手およびボックスまたはきれいなペトリ皿の場所から新しく作ったマイクロインジェクション ピペットを慎重に取り外します。
- すべての計測器とキャビネットのバイオ セーフティのセットアップ必要この実験 (図 1A参照)、寛大 70% エタノールでバイオ セーフティ キャビネットにすべての楽器を散布し、楽器と 15 〜 20 分のための紫外光を用いた環境消毒します。
- 殺菌のステップ中に氷 (4 ° C) の上のプラスミドを解凍します。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに原液 (4 μ g/μ L) からのプラスミッドの 10 μ L を測定します。ファストグリーン FCF の 0.01% を追加します。穏やかに混合、簡単にスピンし、氷に使用されるまで続けます。
注: マキシ prep DNA は、エンドトキシン フリー マキシ準備キットを使用して製造元のプロトコルに従って準備されるべき。TE バッファーまたはヌクレアーゼ フリー DNA を可溶化することができます H2O および生殖不能の条件の下で実行する必要はありませんが、色素のソリューションが付いているプラスミッドの準備。マキシ prep からプラスミドを複数凍結融解サイクルを避けるために検体にする必要があります。検体プラスミド染付ないよりその 2 h 使用の前に混合されるべきそれ以上の使用のない凍結する必要があります. - 滅菌後、ナノ インジェクターをとおり準備します。
- クリーン ボックスまたはペトリ皿と約 15 μ m の外径を達成する斜めの方法でピペットの先端をカットする小さなピンセットに格納されている事前に準備されたガラス製のインジェクション ピペットのいずれかを選択します。
注: ここに与えられた外径ユーザーの我々 は、我々 の実験のアイデアを与えるに概数で、流体を許可しながら、脳を損傷することがなくプラスミド注射用スカルのピアスを容易にするために最適化されていますローディングおよび DNA のリリース。外径は、明視野顕微鏡下のミクロ スケール バーにあてるガラス マイクロインジェクション ピペットのカットを見ることによって測定できます。 - 注射器を使用して、その unpulled の終点 (すべての空気を吐き出す) から鉱物油で、ピペットを塗りつぶします。
- 製造元の指示に従い、ナノ インジェクターに充填ガラス マイクロ ピペットを挿入します。
- 空 2/3 rds ガラス マイクロ ピペット (空気のエントリを防ぐために十分な油を維持する)。
- クリーン ボックスまたはペトリ皿と約 15 μ m の外径を達成する斜めの方法でピペットの先端をカットする小さなピンセットに格納されている事前に準備されたガラス製のインジェクション ピペットのいずれかを選択します。
- 慎重に管内プラスミド/染料の解決の準備のマイクロ ピペットを挿入、プラスミド/色素溶液をガラス マイクロ ピペットを埋めます。
3 妊娠中の女性からマウス胚のコレクション
- 膣をプラグインするため、できれば毎日同じ時間 (午後の早い時間) に評価するために毎日の繁殖の女性を監視します。日 e0.5 は膣にプラグが観察される最初の日に対応します。
注: ここで説明した実験は、野生型マウスで実施できます。ただし、MGE の識別を容易とすべての gaba 作動性を (または特定のサブ セット MGE 派生アドインなど) のラベルには、トランスジェニック動物使用できます (例: GAD67EGFP;Dlx5/6Cre Cre レポーター遺伝子など47,49と)。このような状況で注入実験プラスミドは transfected INs の可視化を (黄色) 非 transfected INs (緑) とを比較できるように、別の蛍光体 (例えばmCherryまたはTdTomato) を表現しなければなりません。 - 首脱臼によって胚日 e13.5 に女性を犠牲に。
注: 犠牲の時に指定された麻酔薬の移行と生存の50,51で影響を与える可能性があり、避けるべきであります。 - とおり、帝王切開によって胚を収集します。
- 70% エタノール スプレー女性の腹部の寛大。滅菌ピンセットのペアで腹部の皮膚を引き上げて、もう一方の手で、腹部から皮膚をカットする滅菌手術用ハサミを使用してください。
- 滅菌ピンセットとはさみの 2 番目のペアで腹部の筋膜を引き上げ、子宮を慎重に回避しながらカットします。
- 滅菌ピンセットとはさみの 3 番目のペアを使用して、子宮の角を引き、骨盤腔内のそれらをカットします。60 mm の滅菌シャーレで、アミノ酸、ビタミン、無機塩類 (市販製品の材料の表を参照) を添加した神経系培養培地でいっぱいに切り裂かれた子宮角を配置します。
- 滅菌バイオ セーフティ キャビネット、胎盤から胎児を解剖し、斬首でヘッドを分離する高級ピンセット (それぞれの手に 1 つ) の 2 つのペアを使用します。
- 面取りカット 3 mL の滅菌プラスチック転送ピペットの先端を吸引ヘッドと転送凝固黒ワックス層し、同じ神経ベースでいっぱい新しい滅菌 60 mm のペトリ皿に補足として上記培。
注: この手順は、(マウス毛、血液) は汚染物質の移動を最小限に抑えます。黒のワックスは、解剖時に頭を安定させるために使用されます。培地は、これらの手順の中に酸素を受け取る必要はありません。
4. 心室プラスミド注射と、MGE のEx Vivoエレクトロポレーション
注: 次の手順は、事前に準備されたバイオ セーフティ キャビネットの無菌条件下で実行する必要があります。
- 場所 60 mm のペトリ皿層黒ワックスであり、バイオ セーフティ キャビネットの双眼鏡の下で培を補足ニューラル ベースで首のない頭を含みます。
- 頭、右、左の手で高級ピンセットで直面している吻側部を安定させるし、右手で右側脳室にプラスミド/色素溶液の 1-2 μ L を注入するナノ インジェクターを使用します。
注: 共発現実験をすることができます co electroporating がモル濃度で両方のプラスミドの混合により救助プラスミッドおよび shRNA 発現プラスミドを行います。 - Electroporate 注入された脳。
- 背側に配置され、頭に並列負電極と電極と対象とする、MGE 頭の腹側に向かって正の電極の間に頭を配置します。
- 電極に位置付けている、一度 500 ms、50 ms の 40 V の 4 正方形パルス パルス間間隔を提供します。
- 既にキャビネット、バイオ セーフティにおける配置ピンセットを使用して電極から任意の残留組織を削除します。
注: これらのパラメーターは、実験に用いた遺伝子導入装置のために特別に最適化されています。遺伝子導入装置の異なる種類を使用している場合ユーザー最適化テストを前もって実行することをお勧めします。 - すべての残りの脳の 4.1 から 4.3 の手順を繰り返します。
注: このプロトコルでは、1 つの脳のために必要な操作について説明しますが、収量が増えてそれぞれの脳 electroporating の前に順番に最大 4 脳を差し込むことが可能です。この戦略は、2 つまたは複数の異なるプラスミド注入される順番に (コントロールまたは実験プラスミドなど) (同腹子と比較できるように) 同じ実験中に特に有利であります。さらに、それは注入することが可能と electroporate 同時に電極を脳の表面に完全に平行に配置することで、収量を増やすには、脳の両側。
5. 脳の解剖と脊髄スライス培養
- まだ、バイオ セーフティ キャビネットの無菌環境で操作しながら頭蓋骨から脳を解剖します。
- 脳を慎重に回避しながらそれぞれの目に針を挿入することによって黒いワックスの層に頭を安定させます。
- 首の左側にある 2 番目の最後部から、頭蓋骨から皮膚を引き裂く高級ピンセットのペアを保持するのに高級ピンセットのペアを使用します。
- 片方の手でピンセットで頭を横方向に押しながら、脳幹のレベルで頭蓋骨を慎重にカットし、頭蓋骨を軽く引いて別のペアのもう一方の手でピンセットを使用します。各ピンセット, フロントに向かって、矢状面 (正中線) の頭蓋骨をカットし、頭骨の断片を解放するために横方向に切開します。
- 脳幹を持ち上げ、髄膜と脳神経を脳が頭蓋骨から完全になるまで慎重にカットします。
注: 5.1 で説明したすべてのステップは、バイオ セーフティ キャビネットにおける厳格な無菌条件の下で行わなければなりません。
- 4% ポイント agarose の区分のための低融点で脳を埋め込みます。
- (42 ° C で液体を保持) 上記準備アガロース溶液で 35 mm のペトリ皿を埋めます。
- 以前カット転送ピペットを使用して agarose いっぱい料理に electroporated 脳をすばやく転送します。室温で料理をしてください。
- (沈没を防ぐため) によく途中で脳を保つために金属棒でアガロースをかき混ぜると吻尾側平面に脳を料理に並列に位置します。固める、脳損傷を避けるために agarose の起動時を攪拌を停止します。
- かみそりの刃を使用すると、脳の周り 1-2 ミリの余白を残して、長方形のブロックを形成するために、脳を取り巻くアガロースをカットします。脳の吻側部が手順については、後続の断面の向きを容易にブロックの前方限界に垂直になるようにします。
- それぞれの脳に繰り返します。
注: それぞれの脳をさまざまな高さで設定中独立したアガロース ブロックを形成して時 (最大 3) 2 つ以上の脳を切断が可能です。
- Vibratome コロナ セクションとスライス培養。
- 100 X N-2 の雪解け 1 つの因数は、氷の上 (150 μ L) を補完し、検体無菌条件下で培地 15 mL を加えます。
- 6 ウェル培養プレートの各ウェルに培地 (の 1 つ X N2 の補足) 750 μ L を転送します。
- ツル首ピンセットで培地充填も各細胞文化挿入 (直径 30 mm、0.4 μ m の細孔径、PTFE) を配置します。
- 連続的に酸素のアプライドで vibratome お風呂を埋めます。お風呂の周囲の氷と 4 ° C に冷却または冷蔵 vibratome を使用します。
- ≫0.150 mm/s と 80 ヘルツに周波数 vibratome 速度を設定します。
- アガロース ブロック vibratome プラットフォーム、吻側端を下向きに、腹側を接着端のユーザーが直面しています。
- (4 ° C) で 250 μ m 厚のセクションを取得するコロナ セクションで脳をカットします。
- 滅菌へら MGE と慎重にセクション間の重複を回避しながら、単一の 30 mm 膜 1 つの動物からすべての脳のセクションを挿入する場所を含む 2-3 セクションを収集します。(前述の通り補った培地、750 μ L を含む) 6 ウェル培養プレートのウェル 1 個に挿入を配置します。また、各セクションは、500 μ l 添加した培養液でいっぱい 12 ウェル培養プレートの別々 の 13 mm 径膜に配置できます。培養液を各ウェルに推奨量では、水没することがなくメディアを栄養する脳セクションことができます。
注: 5.3.6 5.3.7 で説明されている手順が実行されない完全な無菌条件の下で、vibratome の滅菌処理・ バイオ セーフティ キャビネットで使用しない限り。したがって、任意の汚染を避けるために注意深く手順を実施することが重要です。適切な保護具 (クリーン マスク、手術用手袋、白衣) に着用するべきすべての時間や身体の部分も覆われているような髪、顔、手、培養皿 (培養液の有無にかかわらず) に渡してください。また、手袋とへらの脳のセクションを収集するために使用頻繁に 70% エタノールをスプレーすることをお勧めします。 - 48 または 72 h の 60% 湿度と 5% CO2と 37 ° C で換気滅菌インキュベーターで培養プレートを配置します。
注: これらのインキュベーション時間が MGE 派生アドインのタイムラプス イメージングと固定のスライスの共焦点イメージングそれぞれ最適化されました。最適なインキュベーション時間は、各実験的なデザインの事前テスト必要があります。さらに、選択した培養が 72 時間の場合と下、培養培地を変更する必要はありません。インキュベーション時間が長く、培養培地は 2-3 日毎変更必要があります。 - 目的の培養時間後 8 腔症 coverslip に関心のセクションを転送し、培地の 3-5 μ L を追加します。(37 ° C、湿度 60%、5% CO2) 環境室 coverslip が逆に接続されている場所は回転ディスク共焦点タイムラプス イメージング セッション セットアップするコンピューター援用取得ソフトウェアを装備しました。
注: また、セクション 4% パラホルムアルデヒド (一晩で 4 ° C または室温で 2 時間)、その後 electroporated を共焦点の下の形態学的特徴の可視化のための異なった抗体と immunostained で修正されることができます。顕微鏡。EGFP と mCherry 任意のプロシージャを反汚すことがなく共焦点顕微鏡で目視できる、固定プロセスは、蛍光を減らすことができるので、信号を向上させる GFP および mCherry に対する免疫組織化学を行うお勧めの削減先頭または末尾のプロセスの小さい枝などの萌芽期ニューロンの細かい成分の検出。
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Representative Results
このセクションで我々 は制御プラスミドや脊髄スライス培養続いて e13.5 マウス胚の MGE の興味の遺伝子をターゲット実験プラスミドのex 子宮穿孔の後得られた代表的な結果を提供します。37 ° C (タイムラプス イメージング) の 48 時間または 72 h (固定および免疫組織化学的分類) で培養 (スケマティック プロトコルの図 1 bを参照)。MGE 植から移行する INs の代表例図解 (図 1を参照スケマティック プロトコル) としてここで説明法との比較があります。プラスミド MGE 前駆細胞のエレクトロポレーションは、MGE からアドインの終了を延期するよう、培養時間をそれに応じて調整する必要があります。
成功した実験で切片スライス表示共焦点顕微鏡の下で健康的なすなわち皮質層がわかりやすい明るいフィールド モードを使用して、(認識によって強烈なスライス表面に目に見える汚染がないです。自家蛍光特性と蛍光フィラメント落射蛍光の下に表示の存在)。健康的な慢性脊髄スライスで細胞の約 20% は慢性脊髄文化 (例えば生後文化)52で説明したとおり文化 (図 2) で 72 時間後アポトーシスを受けます。それにもかかわらず、総ウズラ脳構造はここで (図 2 a) を汚す DAPI を使用して示すように、よく定義されたままです。我々 のプロトコル、MGE のex vivoエレクトロポレーション用培養 72 時間後背側の移行 5 20 セルが見られるの (図 3 a, B)、スライスごとの 50-100 transfected セルの平均値が得られます。固定および免疫組織化学的染色後、皮質板へ接線方向の移行を簡単にで識別できる共焦点顕微鏡現在、細長い/楕円形の細胞体、時折後続プロセス、および主要なプロセス接線方向指向。主要なプロセスは通常、1 つまたは 2 つの枝を生じ、核 (nucleokinesis の前に中心体住宅)、各分岐の終わりに成長円錐の前で時折腫れの存在によって認識可能であります。(図 3-G)。
このプロトコルは、タイムラプス イメージングによる単一細胞レベルでの移行 MGE 派生アドインの観察のために設計されました。Dlx5/6Cre; から生成されたコロナ脊髄脳スライスのこの特定の実験 (図 4)、RCEEGFP (興味の遺伝子をターゲット) 実験 shRNA とTdTomatoカセットを発現プラスミドを e13.5 に胚 electroporated。スライスされた 48 時間の培養、8 ウェル チェンバード coverslip 皿 (補われた培地の薄層上にフローティング商工会議所あたり 1 スライス) に転送され、装備倒立顕微鏡で 20 倍の空気 (0.70 NA) 目的を使用して 6-8 時間ごとに 3 分をイメージ回転のディスク共焦点ヘッド、コンピューター援用集録ソフトウェアとステージ トップ環境室。画像の中にスライス 37 ° C で保管されたいた継続的に酸素し、環境商工会議所 (5% CO2と 60% H2O) の加湿します。Electroporated MGE 派生アドインによって識別されたなど、eGFP の発現TdTomato、実験プラスミド (図 4 a, B) を表する確認の表現および gaba 作動性の身元を確認します。図 4移行動的パラメーターの細かい分析を可能にするスピードと距離を旅のように見られるように Electroporated を簡単に識別できるとも分離。さらに、ラベルを見られている彼らの自然環境中の皮質板に向かって接線方向に移行する主要なプロセスと nucleokinesis (図 4の分岐などダイナミックな形態変化を識別するために私たちを有効にします。F)。
MGE 派生アドインのex vivoエレクトロポレーションが MGE と組み合わせることもできます外植片方向と渡り鳥のダイナミクスの研究を補完するものとして、移行中に発生する細胞骨格の動的過程の高分解能イメージングを有効にするには切片培養。脊髄スライス培養の INs の接線方向の移動中に発生したものを連想させる神経細胞移動のさまざまなフェーズが見られる例として、electroporated の INs、MGE からの移行はリードなど、エレクトロポレーション後 48 h を外植体。神経突起の伸展と nucleokinesis (図 5 bE)。種々 細胞骨格は、細胞染色切片スライスに最適な達成することはできません (図 6 a)、ファロイジンをアクチン構造、例えば、MGE 植から移行する高解像度で、学ぶことが高細胞密度が与えられた (そして骨格要素の) ネイティブ環境で。これらの細胞骨格のプロセス、特に F-アクチンを改造すると、さらに研究できる動的にタイムラプス イメージングによる Lifeact 式を組み合わせることにより。例えば、IN の高解像度のタイムラプス観察の例を紹介Nkx2.1Cre; から得られる MGE 植から派生しました。RCEEGFPマウス脳の INs の興味の遺伝子の目標とされた削除を運ぶします。このには CMV プロモーター (マイケルデビッドソンからギフト) の制御の下で mCherry-Lifeact-7 プラスミドをトランスフェクトした図式で図 1、リアルタイム (図で発生する改造したウサギ由来 F アクチンの追跡を可能にするメソッドを使用6 b). したがって、切片文化が遺伝子組み換えの INs の方向性または移行パスを適切に評価する必要が、MGE 植補完できるこのような研究の高分解能イメージングのため隔離されたセルへのアクセスを提供することにより細胞骨格の動的過程。
上記実験の失敗の技術的な落とし穴があります。例えば、42 ° C よりも暖かい、アガロース溶液の脳を埋め込み、組織破壊と脳のスライスは、不透明になるトランスルー セントの損失によって明らかに神経細胞の死につながります。ただし、温度保管してはいけません低すぎると凝固アガロース溶液は、埋め込み処理中に壊れやすい胚の脳を破壊することが。第二に、汚染は、ここで説明した実験的アプローチの収量を大幅に削減できます。したがって、すべての手順を注意して、可能な限り厳しい滅菌条件の下で実施。すべてのソリューションや機器は、使用前に滅菌する必要があり、バクテリアやカビによる汚染を避けるために 70% エタノールで機器、頻繁散布する必要があります。汚染は、培養培地は黄色または不透明になると文化井戸に直接表示することができます。はっきりと流体に培養液が残っている場合、汚染は気付かないことがあります。ただし、スライス表面にカビの層が通常見られるまたはスライスになる固定と染色の手順の間に過度に壊れやすい。このようなスライスは、顕微鏡下で可視化、汚染は標識細胞を蛍光の層としてマニフェスト可能性があります。 または長い蛍光灯のフィラメントの存在によって明らかにされます。汚染された井戸に切片スライス、投げ出されるべきであるが、同じ板の他の井戸の培養スライス手順についてはさらに保つことができます。細菌汚染は非常にまれですが共有インキュベータ、培養室など、すべての機器が手動で洗浄、滅菌したことの意味を真剣に、すべき。
図 1:子宮 exエレクトロポレーション用プロトコルの図式的な表示は続いて切片培養または MGE 外植片します。A.のここで説明されているプロトコルに必要なすべての滅菌器具とバイオ セーフティ キャビネットのセットアップ例。B. ex 子宮エレクトロポレーションと脊髄スライス培養に使用するプロトコルの概略図。簡単に言えば、胚首をはねられ、実験のプラスミドは側脳室 (1) と (2) の MGE で electroporated で注入されます。脳は頭蓋骨 (3) から microdissected を agarose (4) に埋め込まれています。脊髄のセクション、vibratome (5) で生成され、37 °C(6) 微速度顕微鏡観察 (7.1) の 48 時間または 72 h 細胞再構成 (7.2) で文化に配置。外植体C.マイヤーズら201353から適応し、MGE の生成に使用されるプロトコルの概略簡単に言えば、背側皮質最初 e12.5 から e14.5 野生型マウスの胚を解剖 (1)、補った培 (2) 機械的に分離しました。皮質細胞は 105皮質細胞/cm2 x 5.25 の密度でメッキ、コラーゲン/ポリ-L-リジン-コーティング 8 腔症観察 (3) 37 ° C で 2 時間培養します。その後、e13.5 Dlx5/6Cre;RCEEGFP胚が子宮 exエレクトロポレーション MGE (4, 5) の処理と、MGE が手動で脳から分離され、100 μ m2フラグメント (6) でカットします。これらの植は、事前に準備された皮質の送り装置の層の上に配置、培養液で覆われて、共同タイムラプス イメージング (7) 前に 48 時間の培養で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 健全な切片スライスの細胞構築を保持します。切片の世代Nkx2.1Cre; のex vivoエレクトロポレーション後の文化をスライスします。RCEEGFPマウス胚 (A) は、保存された細胞構築 (DAPI (青) と Cre-レポーター (GFP)) によって明らかにされた重要な組織の損傷は発生しませんNkx2.1Cre; から 18 μ m 厚 cryosection と比較した場合、RCEEGFP 4% と胚 transcardially PFA e15.5 で。D と M は、それぞれ背腹ととともに内側軸を示します。(B). 63 x 装備倒立共焦点顕微鏡で撮影した高倍率画像/アンチ切断カスパーゼ 3 抗体 (Cl cas3) 染色後 1.4 石油目的皮質板の細胞の約 20% を受けることを明らかにします。(白い矢印) の健康を GFP 陽性を維持しながら、文化の中で顕微鏡写真に代表されるように、72 時間後アポトーシス (白い矢印) C C ''。比較すると、細胞のアポトーシスはほぼ完全に灌流動物から薄い cryosection を欠席 (D D '')。スケール バー: 250 μ m (A ・ B) と 15 μ m (C D '')。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: マウスの脊髄スライス脳胚と electroporated 介在神経 (INs) の高倍率の顕微鏡写真。A. Dlx5/6Cre; から切片培養RCEEGFP (のすべてを緑である) マウス脳と electroporated、 Dlx5/6::shRNAスクランブル-IRES-TdTomatoプラスミド。スライスが 4% で固定した PFA 文化、GFP と mCherry immunostained の 72 時間後。Electroporated プラグインを 3 D (50-60 μ m 厚 z-スタックをすべて 0.5 μ m を撮影光学セクション) でイメージしました 63 x を搭載した共焦点の顕微鏡を使用して/1.3 NA 石油目的。接線方向背パリウムのサブ室ゾーンの移行容易に識別 (赤、開] 矢印) にあります。D と M は、それぞれ背腹ととともに内側軸を示します。B.コントロールと野生型 (WT) 胚 electoporated から代表的な切片スライス培養Dlx5/6::shRNAスクランブル-IRES-TdTomatoプラスミド、72 h と mCherry のみの immunostained で固定します。Electroporated イン (赤) は、背側骨皮質骨板への移行が見られています。Electroporated をDlx5/6Cre; の共同TdTomato 、 EGFPの発現が付きますRCEEGFPマウス (C D) WT マウス (E H) でのみTdTomatoの発現とその典型的な形態、すなわち楕円形細胞体、枝分かれした主要なプロセス ( D H白矢印) または、後続のプロセス (白い矢印、 C D) 時折や nucleokinesis の前に体を住宅先行プロセスの時折腫れ (白い星でC C'とG)。スケール バー: (A B) 250 μ m、25 μ m (C H)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 脊髄スライス培養 48 h. のための electroporated をコマ撮りライブ イメージングTdTomatoカセット、shRNA をターゲットに興味の遺伝子を表現する実験的プラスミド e13.5 に INs electroporated Dlx5/6Cre; から得られた切片脳スライスにおける接線方向の移動で見られています。RCEEGFPマウス胚文化 (A、白い正方形) の 48 時間後。B、(白い四角) で同じ electroporated 皮質、すなわち軟膜表面に平行に接線方向の移行中、nucleokinesis の過程で見られるおよび続いて、タイムラプス イメージング/0.85 x 20 を使用して 8 時間ごとに 3 分 NA 空気目的 (拡大ボックス、 C F)。ニューロン最初および後続プロセス (白い矢印)、分岐の主要なプロセス (白い矢印) nucleokinesis (C) 過程で細長い細胞体 (開矢印) が表示されます。ライブ イメージングの 3 時間後、nucleokinesis が完了すると、後続のプロセスが収納されて、主要なプロセスは 2 つの長い分岐 (D、白矢印) を拡張します。5 時間 30 分後先行プロセス ブランチの 1 つは (白い矢印) を撤回は、ニューロンの細胞体 (開矢印) 移動前方約 10 μ m (E)。最後に、イメージングの 8 h 後移行が一時停止、ニューロンがその主要なプロセスをもう一度拡張し後続のプロセスが (白い矢印) に登場しているが核 (開矢印) が移動していない (F) を転送します。スケール バー: 250 μ m (A)、70 μ m (B) および (C) 30 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 48 h. の培養、MGE 植から派生した INs のタイムラプス イメージングINs は、Nkx2.1Cre;、から得られる MGE 植から移行する見られています。RCEEGFPマウス (どの MGE から派生したすべてのプラグインのエクスプレス eGFP) のメソッドを使用して、e13.5 にCMV::mCherry LifeAct 7プラスミド electroporated マイヤーズら201353から適応し、図 1の図式(A) 48 時間培養。INs は、コマ撮りのライブ イメージングを用いた 5 h (B E), 可視化されました。この例では eGFP と LifeAct の共発現では nucleokinesis (開矢印) の過程で最初に見られているし、拡張 2 つ先行プロセス ブランチ (白い矢印;B). これで 1 h 後 nucleokinesis を完了する (開矢印を参照)、細胞体が前方に移動し、後続プロセスは細胞体 (白い矢印) の後部に登場し、まだ 2 つの分岐 (白い矢印; 1 つの主要なプロセスが表示されますC). 2 時間 30 分 (開いた矢印) 後 2 番目の nucleokinesis が進んでおりには細胞体となった後続プロセス (白い矢印から発信された 2 つの主要なプロセスに恵まれている今D) します最後に、5 時間後に 1 つの突起残り先行プロセス ブランチ (白い矢印) で体を透過しながらのリトラクト後続プロセス (白い矢印) の後方にまだ存在で、3 番目の nucleokinesis のための準備。細胞体 (E)。スケール バー: 70 μ m (A) と (B E) 20 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 48 h. A. 高解像度 MGE 植からプラグインで改造するアクチンのイメージング タイムラプス培養Nkx2.1Cre; から切片スライスRCEEGFPマウスの脳はアクチン フィラメントの可視化を可能にする e15.5、Alexa 594 ファロイジンで染色に固定されます。INs は、63 x を使ってイメージ化/1.3 共焦点顕微鏡の NA 石油目的。Nucleokinesis 竣工後後続処理の取り消しに続く細胞体の背面をカッピング アクチン フィラメントを見て、健康なアドインの (白い矢印A'-A '')。B.の MGE 植は、 Nkx2.1Cre; から上記のように得られるRCEEGFP mCherry-Lifeact-7 CMVプロモーターの制御下での発現プラスミドを関心と electroporated の遺伝子の目標とされた削除を運ぶマウス脳。コマ撮りのライブ イメージング文化の 48 時間後、INs electroporated x/0.85 40 を使用して 3 時間 3 分ごとに従っている航空目的。アクチン細胞骨格のアクティブな改造の後部で主要なプロセスと成長円錐 (白い矢印) 内蛍光ドット赤 (黒と白の画像では白) の運動に代表されるように LifeAct と transfected で発生します、nucleokinesis 中細胞体 (B B ''、白矢印)。スケール バー: 7 μ m (-'') と 10 μ m (B B '')。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この記事で私たちは子宮 ex e13.5 にマウス MGE のエレクトロポレーションを実行するため、胎生期脳スライスの切片文化の生成のための信頼性の高い方法を提供します。体外メソッドでは、ボイデン室アッセイなどは比較的簡単に実行および異なる遺伝子やその他の要因を干渉することがなくタンパク質の特定の役割を評価するために使用することができます、彼らを排除するでの調査方向性と移行パス25に関して移行動態。MGE 植の効果的な手段として紹介したが、最も内因性の手がかりに欠けているでは、移行中に発生する動的な細胞骨格の変化を研究し、多くの場合 (ただし、これは、神経細胞移動を促進するために指導手掛かりを追加する必要MGE 植が皮質フィーダー層培養した場合は大幅に向上)25,54。それにもかかわらず、MGE 植に基づくアッセイは INs29の特定方向または移行パスを導くなどのより微妙なメカニズムに関与する分子的な手掛かりの意味を検出する失敗します。この問題は、子宮内でエレクトロポレーション25MGE 派生プラグインの特定の分類のためそのネイティブ環境13,29,41に移行することができます最終的に取り囲まれました。しかし、そのテクニックはスキルに挑戦し、関与し、手術のため、その収率が低い生存率胚および頻繁に複数のくずを使用する必要、MGE は子宮内で、対象とすることは困難であるという事実によって制限されます。意義55に到達します。したがって、マウス脳の胚の培養に続いて MGE の子宮 exエレクトロポレーションは移行動態とその自然 MGE 派生アドインの形態を調査するための低コスト、時間効率的、かつ信頼性の高い方法を提供してください。環境、手術子宮内エレクトロポレーションと指導の必要性を回避しながら MGE 植の合図します。また、この技法は、首と頭、構成で子宮を採用するより困難の上に負の 1 つの下で肯定的な電極を直接 apposing で対象にすることができます MGE に簡単にアクセスできます。また、MGE は塊状に注入できるし、切片スライス13,25,29, しかし、そのテクニックを生成した後に直接 electroporated を私たちの手でより効果的なより困難証明しています。ここで説明したプロトコル。この資料に記載されている手順に従って、1 つは 50-100 electroporated 切片スライス、タイムラプス イメージングとライブ 72 h Transfected INs を視覚化できること後、MGE の接線方向に移行する 5-20 が見られるあたり MGE 派生アドインを得るまたはイメージと後再建された固定および免疫組織化学的分類します。
ここで説明したプロトコル移行前のヴィヴォで勉強する最適化され、MGE 派生アドイン MGE 注入前のヴィヴォ、エレクトロポレーション、子宮内でエレクトロポレーションを記述する様々 な公開されたプロトコルに触発されたか慢性脊髄脳スライス文化36,38,39,42,43,56,,5758の世代。我々 のアプローチ MGE 前駆細胞への潜在的な損傷を制限39,56 を他の場所で説明されているようパルス高電圧 (100 V)、内 MGE 注射ではなく、パルス強度を低く (40 V) と心室内のプラスミド注射を使用 ,,5758。さらに、他の人は細菌汚染39,56,57,58を防ぐためにペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンの組み合わせを使用して、我々 は抗生物質を避けるために選択しています。私たち文化媒体以来、理論的には移行に影響する可能性が。特に、ペニシリンが GABAの受容体59,60の拮抗薬と GABAAの受容体活性化をアクティブにし、細胞内塩化グラデーションと KCC2 によって移行後停止移行61でのさまざまな段階で表現します。しかし、現在のプロトコルに記載されている諸注意を使用して、汚染効果的に回避できます抗生物質の不在でも。
我々 の手でこのアプローチの効率、にもかかわらず子宮 exエレクトロポレーションもその欠点があります。移行する細胞に自然な三次元環境を提供しながら移行でのコンテキストで切片スライスの薬理学的アッセイを行いにくいことです。確かに、MGE 派生アドインの移行は、主に細胞外の手がかり2,13,19と薬理学的阻害剤の応用依存または正確な切片スライスにアクティベーターを許可しませんスライスの全体的な健康や活動にグローバルな影響から細胞自律的効果の解離。このような実験のため、混合の解離皮質細胞がたつ MGE 植は、INs の外植体からの移行をより容易に分離および特定化合物62を選択的に公開できるので脊髄スライス培養することが望ましいにあります。さらに、子宮 exエレクトロポレーション エレクトロポレーション子宮内より行い易いが、それすることができますまだ技術的に困難な与えられた小さなサイズと壊れやすい状態で胚の脳のここで示した萌芽期の年齢でe13.5。 捜査官脳表面を傷つけず e13.5 に electroporated 脳を効率的に抽出するいくつかの試験を必要があります。さらに、産後のスライスではなく胚脊髄スライス保持できなくなって文化時間の長い期間にわたって。3 日間生体外で信頼性の高い結果をまでの少なくとも 7 日間の in vitro63胚脊髄スライス培養を保つことができる、これはエレクトロポレーションと組み合わされていない、ここで説明した実験がテストされて我々 の手。したがってより長い培養時間が必要な場合、調査官で事前最適化テストする必要があります実行。さらに、後期胚や初期産後の段階での開発の調査はお勧めできませんこの手法で e13.5 胚25を使用する場合、正常に子宮内でエレクトロポレーションで実現できますが、electroporated 胚は子宮腔に戻すし、生まれ、後ステージ21,64で分析に残すことができます。最後に、脊髄スライス培養続いて子宮 exエレクトロポレーションは両方の形態の分析と開発アドインの移行動態のためことができます。しかし、それは以前から指摘されて子宮内エレクトロポレーション法36、子宮 ex electroporations 脳スライスごとの 50-100 electoporated セルをもたらす、こうして人口分析に適していません。このような調査より、完全または条件付き削除 (またはノックで) 興味の遺伝子の動物モデルで行われています。脊髄スライス培養を生成するこのようなモデルが効率的に使用しまたはここに示されているように、移行での実際のダイナミクスを可視化する MGE 外植片利用可能な場合 (図 5を参照してくださいと図 6)。
このプロトコルの多くのステップは、最適な結果を得るために慎重に実施する必要があります。例えば、汚染することができます非常に簡単に発生するとは、厳格な無菌条件の下ですべての手順を実行、原始です。手袋とバイオ セーフティ キャビネット外で使用の楽器は、全体の手順中に頻繁 70% エタノールを散布する必要があります。さらに、文化メディアなど人工髄液のソリューションべき滅菌冷 (4 ° C) と作られた新鮮なすべての 2-3 週間。MGE 派生アドインを具体的にはラベルを付けるそのような実験に使用されるプラスミドがクローン化の固有プロモーターの制御下 (ex: Dlx5/649、 Lhx665)、単に、解剖学的に依存するのではなくMGE のターゲット。脊髄スライスの生成には、生き続けるための脳が必要です。したがって、細胞の健康と生存を維持するためにこの実験の瞬間から 3 時間以内に、胚が培養切片スライスを置くまでに取得されることとして実施しなければなりません。時間効率のため培養皿を事前実験開始の直前に自家製培養液でいっぱいし、37 ° C の携帯文化のインキュベーターで延期される使用できます。さらに、脳アガロース溶液とその後 vibratome 断面への適切な埋め込みを達成するために、慎重に皮質表面を損傷せず頭蓋骨から解剖する必要があります。例えば、周囲の agarose のゲルから 250 μ m 厚いセクションの剥離または vibratome 断面中にセクションの劣化も最小限に抑え、皮質表面への損傷があります。ニューロンの生存も重要ですアガロース溶液の温度は 42 ° C の近くに残ることより高い温度が低温、脳の適切な埋め込みを妨げるに対し組織の損傷および細胞死につながる (破損する中に、埋め込むプロセス)。文化、その他の汚染源を避けるためにスライスする必要がありますいない操作するイメージングのための顕微鏡に転送されるまで。これらの手順は、滅菌環境で実施されなければならないし、特に以降再イメージングするためのカルチャに戻すことが必要な場合は、これらの操作の後、プレートを汚染しないため注意が必要があります。最後に、ローディングの染料将来使用するための以前の実験から見たようにそのような材料の electroporated ニューロンの収量の大幅削減と混合 DNA 因数を療養中はお勧めしません。
結論としては、子宮 exエレクトロポレーションと切片スライス文化プロトコル上記 MGE 派生を単一細胞レベルでの特殊にラベリングが可能し、遺伝的に特定の分子経路を操作する使用ことができます。形態学的変化との移行動態の調節に役割を研究接線方向に移行するプラグイン。このメソッドは、渡り鳥を66,67の RNA 塩基配列を解読単一のセル、または患者の次世代シーケンシングを通じて新たな候補遺伝子の迅速かつ低コスト初期機能調査神経発達障害68,69,70です。この手法は、皮質および海馬70,71,72,73の錐体細胞を含む他の細胞数の移行を研究に広く使用されています。一度マスター、それされる可能性があります可能性のある画像のリサイクルと受容体と GFP 付けられた蛋白質を使用してチャンネルなどの膜タンパク質の輸送バイオ センサー74; を使用して特定の細胞シグナル伝達カスケードの活性化あるいは監視とオプトジェネティクス、皮質のアドインの海馬、扁桃体も線条体などの他の脳領域と結合したカルシウム イメージングを用いた細胞の活動の操作。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。ここの見解厚生労働大臣またはカナダ政府の見解を必ずしも表さない。
Acknowledgments
この仕事は、サボイ財団と治療てんかん財団からの助成金により運営された、E.R (共焦点顕微鏡) と G.H (回転ディスク共焦点顕微鏡) 革新のためのカナダの財団から助成金装置によって。小胞体からのキャリア賞を受賞、フォン デ recherche du ケベック州健康(周波数-S;Clinician-scientist 賞) でなく、健康研究 (機構; カナダの機関から若手研究者賞を受賞)。周波数 S の上級学者はガーナL.E はチュー サント-ジュスティーヌ基礎ポスドク研修賞、周波数 S ポスドク研修賞、星の財団との提携で、サボイ財団から Steriade サボイ博士課程終了後の訓練賞の受信者です。このプロジェクトはカナダ脳研究基金、ル. に与えられる健康カナダの金融支援を通じて脳カナダによって実現されました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
References
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