Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الرحم السابقين انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57526
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2,4
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology, Université de Montréal, 4Department of Pediatrics, Université de Montréal

Summary

هنا، نحن نقدم طريقة منخفضة التكلفة وموثوق بها لتوليد اليكتروبوراتيد الدماغ أورجانوتيبيك شريحة الثقافات من أجنة الفأر مناسبة للفحص المجهري [كنفوكل] وتقنيات التصوير العيش.

Abstract

جابايرجيك إينتيرنيورونس (INs) هي عناصر حاسمة للشبكات العصبية التي تدفع الإدراك والسلوك. الوظائف الموجهة لملء القشرة ترحيل عرضية من موطنهم الأصلي في تيلينسيفالون البطني (بما في ذلك من امينينسيس ganglionic الآنسي ووالذيليه (MGE، فريق الخبراء الاستشاري)) إلى لوحة القشرية الظهرية في الاستجابة لمجموعة متنوعة من الذاتية والخارجية العظة. وقد وضعت منهجيات مختلفة على مر السنين التلاعب بمسارات محددة وراثيا والتحقيق في كيفية تنظيم ديناميكية cytoskeletal التغييرات المطلوبة للسليم في الهجرة. في الرحم انهانسر قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة تأثير الجينات القمع أو الأنواع الفرعية overexpression في محددة في حين تقييم الأثر على مورفولوجيا والموقف النهائي. ومع ذلك، رغم سهولة استخدام هذا النهج لتعديل الخلايا الهرمية ترحيل إشعاعيا، أنه أكثر من الناحية الفنية يتحدى عند استهداف انهانسر INs. في الرحم يولد عائد منخفض نظراً لمعدلات البقاء على قيد الحياة انخفضت من الجراء عندما ويجري انهانسر قبل e14.5، كما هي العادة عند دراسة الإضافية المستمدة من MGE. في نهج بديل، توفير إمكانية وصول سهلة إلى MGE MGE explants وتسهيل تصوير وظائف معدلة وراثيا. بيد في هذه اكسبلانتس، ترحيل الوظائف داخل مصفوفة مصطنعة، تخلو من إشارات التوجيه الذاتية والمدخلات ثالاميك. هذا ما حدا بنا إلى تحسين أسلوب حيث يمكن ترحيل الإضافية في بيئة أكثر طبيعي، بينما التحايل على التحديات التقنية في الرحم النهج. في هذه الورقة، ويصف لنا مزيج انهانسر الرحم السابقين من أدمغة الفأر الجنينية متبوعاً أورجانوتيبيك شريحة الثقافات سهولة تعقب والصورة وإعادة بناء الوظائف المعدلة وراثيا ترحيل على طول مساراتها الطبيعية استجابة الرموز الذاتية. ويسمح هذا النهج لكل التقدير الكمي لجوانب حيوية في الهجرة مع الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، فضلا عن تحليل مفصل لمختلف المعايير المورفولوجية استخدام الخلايا العصبية عمليات إعادة البناء في الأنسجة إيمونولابيليد الثابتة.

Introduction

إينتيرنيورونس جابايرجيك القشرية (INs) متنوعة فيما يتعلق بخصائصها البيوكيميائية، الخصائص الفسيولوجية والربط، والتوسط في وظائف مختلفة في الشبكات ناضجة1،2،3 ،،من45. مواصفات أنواع فرعية مختلفة من وظائف القشرية محكم ينظم من خلال الشلالات الوراثية التي تم دراستها على نطاق واسع1،2. غالبية الوظائف جابايرجيك القشرية (70 في المائة) تنشأ من فروعه في نيافة ganglionic الآنسي (MGE)، بنية جنينية تقع بطنيا، ويجب ترحيل عبر مسافات طويلة نسبيا للوصول إلى لوحة القشرية1، 2 , 6-في حين تهاجر الخلايا الهرمية القشرية إشعاعيا من منطقة البطين (VZ) إلى لوحة القشرية على طول سقالة إطلاق شعاعي، هجرة عرضية من الوظائف، التي هي لم تعلق على هذه سقالة، يتطلب مجموعة متنوعة من الجوهرية و الرموز الخارجية لجذب الخلايا العصبية ترحيل نحو لوحة القشرية، بينما توجه لهم بعيداً عن هياكل غير القشرية2،،من78. بعد إنهاء دورة الخلية، وظائف هي صده من MGE الكيماوي الاشمئزاز العظة أعرب داخل VZ MGE، الذي يشغل الهجرة عرضية نحو9،القشرية اللوحة10. ترحيل الوظائف تجنب المخطط مع المعونة من منبهات مختلفة مثيرة للاشمئزاز11 ، وبعد أن وصلت إلى لوحة القشرية، أنهم التبديل من عرضية إلى وضع هجرة شعاعي وتصل إلى مركزها الصفحي النهائي، جزئيا في استجابة لمنبهات من الهرمية خلايا12 وسائر السكان الخلوية13. هجرة الوظائف، أما بالنسبة لسائر السكان الخلايا العصبية، يشمل مختلف التغييرات الشكلية الدينامية للسماح بالحركة الفعلية للخلايا العصبية. تتميز هذه الحركة العصبية ما يسمى بدورات متكررة من ثلاث خطوات متتالية: استطالة عملية رائدة، حركة نشطة أنتيروجرادي من النواة (نوكليوكينيسيس)، والتراجع عن عملية زائدة14. في الهجرة وينظم العديد من الإشارات الذاتية والخارجية التي محرك المتفرعة ويعيد البناء النشط لعملية رائدة لتوجيه الوظائف في الاتجاه السليم، تحديد اتجاه وسرعة الهجرة14،15 ،16.

وقد درست المحددات تنظم القشرية في الهجرة على نطاق واسع في السنوات الأخيرة1،2،7،17،18،،من1920، وقد تم افترض تعطل في بعض هذه الجهات الفاعلة الجزيئية يؤدي إلى الاضطرابات النمائية، مثل طب الأطفال صهر الصرع أو التوحد طيف اضطرابات1،2،21، 22 , 23 , 24-ولذلك سعى تطوير مختلف النهج في المختبر و في فيفو تقدم كبير في قدرتنا على دراسة هذه العملية الدينامية، ب استعراضها في السابق25. أساليب في المختبر ، بما في ذلك مقايسة الدائرة Boyden و "المقايسة خيار شريطية"، توفير الوسائل الأسرع والأكثر استنساخه من تقييم الشرط وخلية مستقلة من جينات معينة أو بروتينات أثناء الهجرة العصبية، دون تأثير العوامل الأخرى25. هذه الاختبارات مفيدة بشكل خاص عندما جنبا إلى جنب مع تصوير يعيش8،،من2627. مع هذه التقنيات، هي وظائف بسهولة استرجاعها من e13.5 MGE ومعزولة من جراء تفكك الانزيمية والميكانيكية، بعد الذي يمكن أن يحقق في مسارات إشارات مختلفة ورموز التوجيه، كما هو موضح سابقا8،28 . ومع ذلك، تجري هذه الاختبارات في مصفوفة خارج الخلية اصطناعية في غياب بنية الأنسجة الثلاثية الأبعاد، التي قد تغير من خصائص السلوك والخلايا العصبية، يحتمل أن تؤثر على خلية الهجرة و/أو بقاء25. وقد وضعت explants MGE السابقين فيفو للتحايل على هذه القيود، كأداة بديلة لقياس التغيرات المورفولوجية الدينامية التي تحدث أثناء الترحيل جنبا إلى جنب مع المعلمات مثل سرعة واتجاه14، 29. توليد MGE explants بسيط نسبيا، وقد تم على نطاق واسع الوارد وصفها في أماكن أخرى من30. ويترتب عليها الطلاء من خلاصة صغيرة من MGE في أحادي الطبقة الخلايا القشرية المختلطة أو في مزيج من ماتريجيل والكولاجين حضور25من منبهات جذابة أو مثيرة للاشمئزاز، على الرغم من أن هذه الأخيرة هي اختيارية31. MGE explants تسمح بدقة عالية التصوير للخلايا المسماة قليلة، وتبسيط دراسة العمليات داخل الخلايا، مثل إعادة عرض cytoskeletal أثناء العملية الرائدة التفريع، كما هو موضح سابقا33 32، ،34 وفي هذه الدراسة. MGE explants قد استخدمت بنجاح لتقييم التغيرات cytoskeletal ديناميكية خلال في الهجرة في بيئة ثنائية الأبعاد، على سبيل المثال بعد المعالجات الدوائية أو تشيموتاكتيك محددة (انظر، على سبيل المثال، تيلينس et al. عام 201633) . ومع ذلك، مع هذا النهج، ترحيل الوظائف داخل مصفوفة مصطنعة، وهذا قد تغير في السلوك، وإمكانية تكرار نتائج وأهمية النتائج التجريبية.

على النقيض من ذلك، يسمح التلاعب بالجينات للوظائف في بيئتها الأصلية في الرحم انهانسر وهو أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لسرعة وكفاءة تقييم أثر اكتساب وفقدان وظيفة الجينات بينما التحايل على القيود المفروضة على خروج المغلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً وتدق في استراتيجيات25،35. انهانسر في الرحم يمكن أن تكون منحازة في فروعه باستخدام نوع الخلية المروجين محددة ووضع أقطاب كهربائية نحو الهياكل فينتروميديال، بما في ذلك MGE36. وعلاوة على ذلك، في الرحم انهانسر يسمح للتعبير المناسب عن الثوابت التجريبية في غضون أيام 1-2، بالمقارنة مع 7-10 أيام المطلوبة لبناء التعبير استخدام الفيروسية متجهات25. ومع ذلك، في الرحم انهانسر من فروعه يميل إلى أن يكون المنخفضة الغلة. في الواقع، على الرغم من أن يمكن تكون transfected الخلايا الهرمية فروعه الموجودة في منطقة البطين الظهرية كفاءة استخدام في الرحم انهانسر، تستهدف الهياكل تقع أكثر بطنيا، مثل MGE، هو أكثر من الناحية الفنية تحديا، لا سيما في e13.5 الصغيرة يقلل الأجنة، وارتفاع معدل الفتك الجنينية زيادة الغلة التجريبية25.

للالتفاف حول بعض القيود الفنية المرتبطة في المختبر MGE explant التجارب و في فيفو في الرحم انهانسر، تم السابقين فيفو أورجانوتيبيك شريحة الثقافات المتقدمة8،37، ،من 3839. المخ أورجانوتيبيك عرض الثقافات شريحة شروط الاستفادة من محاكاة في فيفو ، رغم أنها أقل تكلفة واستهلاكا للوقت مما الحيوان توليد نماذج25. في الواقع، هذه التحضيرات تسمح سهولة وصول إلى MGE، جنبا إلى جنب مع التصور محددة من الوظائف، ويمكن دمجها مع انهانسر المحورية للتحقيق في مسارات جزيئية محددة في ترحيل في بيئة فيزيولوجية أكثر8 وظائف , 39 , 40 , 41-أننا قد الأمثل ولذلك نهج من أجل أورجانوتيبيك الثقافات38، التي نحن جنبا إلى جنب مع انهانسر الرحم السابقين والوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، لمواصلة تقييم حدوث عملية دينامية والمورفولوجية أثناء الهجرة عرضية ل MGE الإضافية. تم تكييف هذا البروتوكول والأمثل من الآخرين الذين استخدموا الرحم السابقين أو في الرحم المخ انهانسر أورجانوتيبيك شريحة الثقافات ودراسة هجرة الخلايا الهرمية42،43 و القشرية الإضافية36،،من3944. على وجه التحديد، الأجنة الماوس يتم قطع رأسه و MGE اليكتروبوراتيد السابقين فيفو بعد حقن داخل البطيني والبلازميدات التجريبية، مما يسمح أكثر كفاءة ودقة استهداف MGE موروث من ما يمكن تحقيقه مع انهانسر في الرحم . ثم يتم استخراج العقول ومقطوع إلى شرائح الاكليلية الدماغ الجامع الذي يمكن أن يكون مثقف لبضعة أيام، مما يتيح استمرار تتبع والتصوير من الوظائف ترانسفيكتيد. وهذا النهج عادة تسميات الوظائف عرضية ترحيل 5-20 كل شريحة الدماغ، تقليل عدد مرات التكرار التجريبية اللازمة للتوصل إلى دلالة إحصائية، بينما وصف سكان العصبية متفرقة بما فيه الكفاية لضمان سهولة فصل الخلايا العصبية الفردية لإعادة الإعمار وتقييم الخصائص المورفولوجية غرامة. وعلاوة على ذلك، مقارنة ب explants MGE، أورجانوتيبيك الثقافات ضمان أن ترحيل الوظائف يتعرض لبيئة أكثر طبيعية، بما في ذلك المستقطبات يفرز محلياً والمدخلات من أفيرينتس ثالاميك. وهذا النهج هكذا مناسبة تماما لتحديد اتجاه ومسار الهجرة اعتمدته transfected الإضافية، بينما تقدم التفاصيل التشريحية كافية للسماح لتوصيف أدق العمليات الحيوية مثل رائد عملية التفريع، نوكليوكينيسيس وتراجع عملية زائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات قد وافقت ليه avec الممارسات المنازل des إينستيتوتيونيل لجنة البحوث الحيوانات الأليفة (سيببار) في مركز أبحاث سانت جوستين تشو وأجريت وفقا "المجلس الكندي" دليل "رعاية الحيوان" رعاية واستخدام الحيوانات التجريبية (الطبعة 2).

البروتوكول هو موضح هنا كان الأمثل انهانسر أجنة في اليوم الجنينية (ه) 13.5، في وقت فيه بنشاط إنشاء الإضافية المستمدة من MGE، قبل المستمدة من الذروة لفريق الخبراء الاستشاري وظائف الإنتاج45،46. وعلاوة على ذلك، للتحيز انهانسر نحو الوظائف جابايرجيك، فإننا نستخدم مروج أعرب بشكل انتقائي في الوظائف (على سبيل المثال المروج Dlx5/6 مع محسن الحد الأدنى)47.

1. إعداد حلول انهانسر والثقافات شريحة أورجانوتيبيك

  1. تعد 125 مل من العقيمة الثقافة المتوسطة.
    1. قياس 125 مل متوسطة الثقافة الخاصة بالخلايا العصبية العادية (انظر الجدول للمواد لصياغة) في زجاجة معقمة في السلامة الأحيائية سابقا للأشعة فوق البنفسجية-التعقيم مجلس الوزراء رش مع الإيثانول 70%. إضافة 2.25 مل 50 س الملحق خالية من المصل العصبية على حدة، 1.75 مل من الجلوتامين 200 ملم (تركيز النهائي من 0.5 مم) و 6.25 مل من مصل الحصان إبطال الحرارة الكوتيد سابقا تحت ظروف معقمة. مزيج دقيق، قاسمة في 15 مل أنابيب مخروطية العقيمة، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين إعداد الثقافة المتوسطة لمدة تصل إلى 3 أسابيع في 4 درجات مئوية.
    2. تقسم 100 × الحل الأسهم في بوتينستين N-2 صياغة48 إلى 150 ميليلتر مختبرين تحت ظروف معقمة وتجميد في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تحضير 1 لتر النخاعي الاصطناعي المعقمة (قام).
    1. قياس 800 مل ماء المقطر في كوب 1 لتر. إضافة 25.67 ز السكروز، 5.08 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl)، ز 2.18 من بيكربونات الصوديوم (ناكو3)، ز 1.80 الجلوكوز، 0.19 غ كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، 0.15 غ فوسفات الصوديوم اللامائى (نة2بو4)، 1 مل من م 1 الأسهم كاكل2 س.2H2و 2 مل 1 م الأسهم.7H مجسو42إثارة سين تذوب في درجة حرارة الغرفة. إضافة الماء المقطر للوصول إلى إجمالي حجم 1 ل.
    2. استخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر، تصفية الحل في زجاجة معقمة في السلامة الأحيائية معقمة مجلس الوزراء وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. إعداد حل [اغروس] 4% في قام قبل كل تجربة جديدة.
    1. قياس 25 مل قام المجهز سابقا في أنبوب 50 مل مخروطية عقيمة وإضافة 1 غرام من [اغروس] نقطة انصهار منخفضة.
    2. الحرارة ل 45 ثانية في فرن ميكروويف. لتجنب تسرب، المقاطعة تدفئة كل 3-4 ثانية عندما يبدأ الغليان، فتح الأنبوب للسماح للضغط بها وإغلاقه مرة أخرى وتحرض يدوياً مزيج في [اغروس]. كرر حتى يتم الحل [اغروس] متجانسة. يبقى الحل [اغروس] في 42 درجة مئوية خلال ما تبقى من هذه التجربة لتجنب التجميد.
      ملاحظة: ارتفاع درجات الحرارة سوف تلف أنسجة المخ.

2-إعداد والبلازميدات لحقن

  1. سحب ماصة microinjection الزجاج
    1. تعيين ساحبة ميكروبيبيتي مع المعلمات المناسبة وتأمين الشعرية الزجاج في المساحة المتوفرة، وتأكد من أنه يتم توسيط مع الشعيرة.
    2. اضغط على زر السحب.
    3. بعناية إزالة الماصات microinjection حديثا جعلت من ساحبة الحرارة ومكانه في مربع أو طبق بيتري نظيفة حتى المزيد من استخدام لتجنب إتلاف التلميح.
  2. إنشاء مجلس الوزراء مع جميع الصكوك المتعلقة السلامة الأحيائية بحاجة لهذا التجربة (انظر الشكل 1A) وسخاء رش جميع الصكوك المتعلقة بالسلامة البيولوجية مجلس الوزراء مع الإيثانول 70% وتعقيم الأدوات والبيئة مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15-20 دقيقة.
  3. أثناء الخطوة التعقيم، ذوبان الجليد والبلازميدات على الجليد (4 درجات مئوية).
  4. قياس 10 ميليلتر من بلازميد من حل أسهم (4 ميكروغرام/ميليلتر) في أنبوب نظيف 1.5 مل أجهزة الطرد مركزي. إضافة 0.01 في المائة قرر الخضراء سريعة. المزيج بلطف وتدور بإيجاز والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
    ملاحظة: ينبغي إعداد الإعدادية ماكسي الحمض النووي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة باستخدام مجموعة الإعدادية ماكسي خالية من الذيفان. يمكن solubilized الحمض النووي في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات أو خالية من نوكلاس ح2س وإعداد بلازميد مع الصبغ ويمكن الحل، لكن لا تحتاج إلى أن تتم تحت ظروف معقمة. ينبغي أن تكون البلازميدات من ماكسي الإعدادية الكوتيد لتجنب دورات تجميد أذاب متعددة. ينبغي أن تكون مختلطة مع الصبغ لا أكثر أن 2 ح قبل استخدام البلازميدات الكوتيد ولا ينبغي أن يكون ريفروزين لاستخدامها مرة أخرى.
  5. بعد التعقيم، إعداد النانو-الحاقن كما يلي.
    1. اختر واحداً من ماصة microinjection الزجاج معدّة مسبقاً المخزنة في مربع نظيفة أو طبق بيتري واستخدام ملاقط صغيرة لقطع غيض من الماصة بطريقة مشطوف الحواف لتحقيق قطر خارجي لحوالي 15 ميكرون.
      ملاحظة: القطر الخارجي هنا هو تدبير تقريبي لإعطاء المستخدم فكرة لماذا نستخدم في تجاربنا وقد الأمثل بغية تيسير ثقب الجمجمة لحقن بلازميد دون الأضرار الدماغ، بينما يسمح للسائل تحميل والإفراج عن الحمض النووي. ويمكن قياس القطر الخارجي بالنظر إلى طرف قطع ماصة microinjection الزجاج apposed إلى شريط مقياس مكرمترك تحت مجهر حقل مشرق.
    2. استخدام المحاقن لملء في ميكروبيبيتي مع الزيت المعدني من نهايته أونبوليد (بطرد جميع الهواء).
    3. إدراج ميكروبيبيتي الزجاجية المشغولة في النانو-محقن باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    4. فارغة 2/3rds من ميكروبيبيتي الزجاج (الاحتفاظ بما يكفي من النفط للحيلولة دون دخول الهواء).
  6. إدراج ميكروبيبيتي المعدة في أنبوب يحتوي على الحل بلازميد/صبغ وملء ميكروبيبيتي الزجاج مع الحل بلازميد/صبغ بعناية.

3-جمع الماوس الأجنة من الإناث الحوامل

  1. مراقبة تربية الإناث يوميا لتقييم ليسد المهبل، يفضل أن تكون في نفس الوقت يوميا (بعد الظهر). E0.5 يوم يناظر اليوم الأول عندما يلاحظ سداده مهبلية.
    ملاحظة: يمكن إجراء التجارب الموضحة هنا في البرية من نوع الفئران. ومع ذلك، لتسهيل التعرف MGE وتسمية جميع الوظائف جابايرجيك (أو مجموعات فرعية محددة مثل الإضافية المستمدة من MGE)، الحيوانات المحورة وراثيا يمكن استخدامها (مثل: GAD67اجفب؛ Dlx5/6لجنة المساواة العرقية مع اليل مراسل لجنة المساواة العرقية، إلخ،من4749). في هذه الحالة، ينبغي التعبير عن بلازميد التجريبية حقن فلوروفوري آخر (على سبيل المثال مشري أو تدتوماتو) للسماح للتصور من دائرة الهجرة والتجنيس transfected (أصفر) التي يمكن مقارنتها مع وظائف غير ترانسفيكتيد (أخضر).
  2. التضحية بالأنثى في e13.5 يوم الجنينية، بخلع العنق.
    ملاحظة: وكلاء مخدر نظراً لوقت التضحية قد تؤثر في الهجرة والبقاء على قيد الحياة50،51 وينبغي تجنبها.
  3. جمع الأجنة بعملية قيصرية كما يلي.
    1. سخاء رش البطن الإناث مع الإيثانول 70%. سحب الجلد البطن مع زوج من الملقط المعقم، وناحية أخرى، استخدام مقص التعقيم الجراحي لقطع الجلد من البطن.
    2. مع زوج ثاني من الملقط المعقم ومقص، سحب لفافة البطن وقطع عليه مع تجنب بعناية في الرحم.
    3. استخدام زوج ثالثة الملقط المعقم ومقص، سحب قرون الرحم وقطع منها خارج تجويف الحوض. ضع قرون الرحم تشريح في طبق بتري 60 ملم معقمة مليئة المتوسطة الثقافة القائم على العصبية وتستكمل مع الأحماض الأمينية والفيتامينات والأملاح غير العضوية (انظر الجدول للمواد للمنتجات المتاحة تجارياً).
  4. في السلامة الأحيائية عقيمة مجلس الوزراء، استخدام اثنين من أزواج من ملاقط غرامة (واحد في كل يد) لتشريح الأجنة من المشيمة وعزل الرؤساء بقطع الرأس.
  5. مجسم مشطوف الحواف-قص طرف ماصة نقل البلاستيك المعقمة 3 مل، نضح الرؤساء ونقل لهم في طبق بتري 60 ملم معقمة جديدة والطبقات بالشمع الأسود الصلب ومليئة بنفس القائم على العصبية تكمل المتوسطة الثقافة كما ذكر أعلاه.
    ملاحظة: هذه الخطوة يقلل نقل الملوثات (الماوس الشعر والدم). الشمع الأسود يستخدم لتحقيق الاستقرار في الرأس أثناء التشريح. وسائط الثقافة لا تحتاج إلى أن يكون اﻷوكسيجين خلال هذه الإجراءات.

4-داخل البطيني بلازميد الحقن وانهانسر فيفو السابقين من MGE

ملاحظة: يجب إجراء الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في السلامة البيولوجية المعدة سابقا مجلس الوزراء.

  1. الطبقات مكان طبق بيتري 60 ملم مع الشمع الأسود والتي تحتوي على رؤوس مقطوعة الرأس في القائم على العصبية يستكمل المتوسطة الثقافة تحت منظار في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  2. استقرار الرأس والجزء روسترال التي تواجه الحق، مع غرامة ملاقط مع اليد اليسرى واستخدام النانو-الحاقن في اليد اليمنى لحقن 1-2 ميليلتر من الحل بلازميد/صبغ البطين الجانبي الحق.
    ملاحظة: يمكن أن يكون تعبير المشاركين تجارب أجرتها co-اليكتروبوراتينج بلازميد إنقاذ وبلازميد معربا عن شرنا بخلط كلا والبلازميدات تركيزات اكويمولار.
  3. اليكتروبوراتي حقن الدماغ.
    1. وضع رأسه بين الأقطاب مع مسرى السلبية المتمركزة في دورسالي وموازية للرأس ومسرى إيجابية نحو الجانب البطني من الرأس إلى الهدف MGE.
    2. متى جيدا يتم وضع أقطاب كهربائية، تسليم 4 نبضات مربعة من 40 الخامس ل 50 مللي ثانية في 500 مللي نبض بين الفواصل الزمنية.
    3. قم بإزالة أي الأنسجة المتبقية من أقطاب استخدام الملقط وضعت بالفعل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
      ملاحظة: لقد تم تحسين هذه المعايير على وجه التحديد اليكتروبوراتور المستخدمة في تجاربنا. أننا نوصي المستخدمين بإجراء اختبارات الأمثل مسبقاً إذا كان استخدام نوع مختلف من اليكتروبوراتور.
    4. كرر الخطوات من 4.1 إلى 4.3 لجميع العقول الباقية.
      ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول وصف المعالجات اللازمة للمخ واحد، من الممكن حقن العقول تصل إلى 4 التتابع قبل اليكتروبوراتينج كل الدماغ، مما يؤدي إلى زيادة المحصول. هذه الاستراتيجية مفيد خصوصا عندما والبلازميدات 2 أو أكثر مختلفة يتم حقن التتابع (مثل عنصر التحكم أو بلازميد التجريبية) خلال التجربة ذاتها (السماح للمقارنة بين ليتيرماتيس). وباﻹضافة إلى ذلك، هو ممكن لحقن واليكتروبوراتي في نفس الوقت كلا الجانبين من المخ لزيادة الغلة، عن طريق وضع أقطاب كهربائية موازيا تماما لسطح الدماغ.

5-الدماغ التشريح والثقافات شريحة أورجانوتيبيك

  1. بينما ما زال التلاعب في بيئة معقمة للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تشريح المخ خارج الجمجمة.
    1. استقرار الرأس على طبقة الشمع الأسود بإدخال إبرة في كل عين مع تجنب بعناية في الدماغ.
    2. استخدام زوج من ملاقط غرامة للاحتفاظ بالجانب الأيسر من الرقبة وزوج ثاني من ملاقط غرامة للدموع الجلد من الجمجمة، من الخلف إلى الأمام.
    3. حين عقد استخدام الرأس جانبياً بملاقط في يد واحدة، زوج آخر من ملاقط في اليد الأخرى لقطع الجمجمة بعناية على مستوى الدماغ وسحب بلطف في الجمجمة. مع كل الملاقط، قطع الجمجمة في الطائرة السهمي (خط الوسط) نحو الأمام، ومن ثم جداً جانبياً لتحرير جمجمة.
    4. رفع جذع الدماغ وقطع بعناية في السحايا واعصاب حتى الدماغ تماما خارج الجمجمة.
      ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات الموضحة في 5.1 تحت ظروف معقمة الصارمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  2. تضمين في الدماغ في 4% انخفاض ذوبان نقطة [اغروس] لتمزيقها.
    1. ملء طبق بتري 35 ملم مع الحل [اغروس] أعد أعلاه (الاحتفاظ السائل في 42 درجة مئوية).
    2. نقل بسرعة المخ اليكتروبوراتيد للطبق [اغروس] مملوءة باستخدام ماصة نقل قطع سابقا. نضع الطبق في درجة حرارة الغرفة.
    3. يحرك [اغروس] مع عصا معدنية للحفاظ على الدماغ في منتصف البئر (لمنع غرق) ووضع الدماغ في طائرة rostro والذيلية موازية للطبق. التوقف عن إثارة عندما يبدأ [اغروس] يصلب، لتجنب أي تلف في المخ.
    4. استخدام شفرة الحلاقة لقص [اغروس] المحيطة بالدماغ من أجل تشكيل كتلة مستطيلة الشكل، وترك هامش 1-2 ملليمتر حول الدماغ. التأكد من أن الجزء روسترال من الدماغ عمودي إلى الحد الأمامي من كتلة تيسيرا للتوجه لتقطيع الخطوات اللاحقة.
    5. كرر لكل الدماغ.
      ملاحظة: من الممكن خفض الدماغ واحد أو أكثر في وقت واحد (الحد الأقصى 3) بتشكيل كتل منفصلة [اغروس] أثناء إعداد كل الدماغ على ارتفاعات مختلفة.
  3. أقسام فيبرتوم الاكليلية وثقافة شريحة.
    1. ذوبان الجليد قاسمة واحد من 100 X N-2 الملحق (150 ميليلتر) على الجليد، وإضافة إلى 15 مل متوسط الثقافة الكوتيد تحت ظروف معقمة.
    2. نقل 750 ميليلتر من مستنبت (مع الملحق X N2 1) لكل بئر من لوحة الثقافة 6-جيدا.
    3. مع ملاقط المنحنية، مكان إدراج الثقافة خلية واحدة (30 مم، 0.4 حجم المسام ميكرومتر، PTFE) في كل شغل المتوسطة أيضا.
    4. ملء حمام فيبرتوم مع قام اﻷوكسيجين بشكل مستمر. كول إلى 4 درجات مئوية مع الجليد المحيطة بالحمام، أو استخدام فيبرتوم مبردة.
    5. تعيين سرعة فيبرتوم 0.150 مم/s والتردد إلى 80 هيرتز.
    6. الصق في الكتلة [اغروس] على منصة فيبرتوم وحافة روسترال إلى الأسفل والبطني الحافة التي يواجهها المستخدم.
    7. قص الدماغ في أقسام الاكليلية للحصول على 250 ميكرومتر سميكة المقاطع (في 4 درجات مئوية).
    8. مع ملاعق معقمة، جمع الأجزاء 2-3 التي تتضمن MGE ومكان إدراج جميع أقسام الدماغ من الحيوان واحدة على غشاء عيار 30 ملم واحد، مع تجنب التداخل بين أبواب الميزانية بعناية. وضع الإدراج في بئر واحدة للوحة الثقافة 6-جيدا (تحتوي على 750 ميليلتر لتستكمل الثقافة المتوسطة، كما هو موضح أعلاه). بدلاً من ذلك، يمكن وضع كل مقطع في غشاء منفصل 13 مم في لوحة ثقافة 12-بئر مليئة 500 ميليلتر تكمل الثقافة المتوسطة. كمية متوسطة الثقافة الموصى بها لكل بئر يسمح أقسام الدماغ أن تغذيها وسائل الإعلام دون أن تغمرها المياه.
      ملاحظة: الخطوات الموضحة في 5.3.6 و 5.3.7 لا تنفذ تحت ظروف معقمة كاملة، ما لم يمكن تعقيمها فيبرتوم والمستخدمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. ولذلك، من الأهمية بمكان إجراء هذه الخطوات بعناية لتجنب أي تلوث. معدات الوقاية المناسبة (قناع النظيفة، والقفازات الجراحية ومعطف مختبر) يجب أن تلبس في جميع الأوقات وأجزاء الجسم، حتى تغطي، مثل الشعر والوجه واليدين، ينبغي أن يمر ابدأ عبر لوحات الثقافة (مع أو دون المتوسط الثقافة). من المستحسن أيضا لرش الإيثانول 70% غالباً على قفازات وملاعق المستخدمة في تجميع أجزاء الدماغ.
    9. ضع لوحة الثقافة في حاضنة عقيمة التهوية في 37 درجة مئوية مع 60% رطوبة و 5% CO2 48 أو 72 ساعة.
      ملاحظة: هذه الأوقات الحضانة كانت الأمثل لتصوير الوقت الفاصل بين الوظائف المستمدة من MGE وتصوير [كنفوكل] شرائح ثابتة، على التوالي. وينبغي اختبار مرات حضانة الأمثل مسبقاً لكل تصميم تجريبي. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان الحضانة المختار ح 72 وتحت، ليس هناك حاجة لتغيير الثقافة المتوسطة. لأوقات أطول في الحضانة، والمتوسطة الثقافة ينبغي تغيير كل 2-3 أيام.
    10. بعد الوقت المطلوب من الحضانة، نقل مقاطع الفائدة إلى ساترة 8 غرف وإضافة 3-5 ميليلتر من مستنبت. مكان ساترة في دائرة للبيئة (37 درجة مئوية، والرطوبة 60%، 5% CO2) متصلاً المقلوب الغزل القرص [كنفوكل] مزودة ببرنامج اقتناء الحاسوب لإعداد الدورة الوقت الفاصل بين التصوير.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأقسام يمكن أن تكون ثابتة مع بارافورمالدهيد 4% (بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 2 في درجة حرارة الغرفة)، وبعد ذلك إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة المختلفة لتصور السمات المورفولوجية اليكتروبوراتيد الوظائف تحت [كنفوكل] المجهر. على الرغم من أن يمكن تصور اجفب ومشري بالفحص المجهري [كنفوكل] دون أي إجراءات مضادة المصبوغة، نوصي بإجراء إيمونوهيستوتشيميستري ضد بروتينات فلورية خضراء ومشري لتعزيز الإشارات منذ عملية التثبيت يمكن أن تقلل من الأسفار، الحد الكشف عن العناصر الدقيقة للخلايا العصبية الجنينية، مثل فروع أصغر في عمليات سابقة أو لاحقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا القسم، نحن نقدم الممثل النتائج التي تم الحصول عليها عقب انهانسر الرحم السابقين بلازميد تحكم، أو بلازميد تجريبية استهداف جين اهتمام، في MGE أجنة الفأر e13.5 تليها أورجانوتيبيك شريحة الثقافات المحتضنة في 37 درجة مئوية ح 48 (للتصوير بمرور الزمن) أو ح 72 (للتثبيت والوسم المناعي) (انظر الشكل 1 باء للبروتوكول التخطيطي). الممثل الوظائف المهاجرة من explant MGE أمثلة أيضا المصور (انظر الشكل 1 لبروتوكول التخطيطي) كمقارنة بالطريقة الموضحة هنا. انهانسر من بلازميد في فروعه MGE ويبدو أن تأخير خروج وظائف من MGE ويجب تعديل الوقت الثقافة تبعاً لذلك.

في تجربة ناجحة، تظهر الشرائح أورجانوتيبيك صحية تحت المجهر [كنفوكل]، الطبقات القشرية أي تمييزها بسهولة استخدام الوضع الميداني مشرق وليس هناك أي تلوث مرئية على سطح شريحة (المعروفة بكثافة أوتوفلوريسسينسي ووجود خيوط نيون مرئية تحت ابيفلوريسسينسي). شرائح أورجانوتيبيك صحية مزمنة، يخضع حوالي 20% خلايا المبرمج بعد 72 ساعة في الثقافة (الشكل 2)، كما هو موضح سابقا في أورجانوتيبيك المزمن الثقافات (الثقافات بعد الولادة مثلاً)52. ومع ذلك، تظل بنية الدماغ الإجمالي سيتوارتشيتيكتورال محددة تحديداً جيدا، كما يتضح هنا باستخدام DAPI تلطيخ (الشكل 2A). لدينا بروتوكول السابقين فيفو انهانسر من MGE غلة في متوسط 50-100 transfected الخلايا كل شريحة (الشكل 3 ألف، باء)، سوف ينظر فيها الخلايا 5-20 يهاجرون دورسالي بعد 72 ساعة في الثقافة. بعد التثبيت والتلوين المناعي، وظائف ترحيل عرضية نحو لوحة القشرية يمكن بسهولة تحديد مع الفحص المجهري [كنفوكل] كما أنها تعرض هيئة الخلية ممدود البيضاوي، عملية زائدة عرضية، وعملية رائدة الموجه عرضية. عادة ما تكون العملية الرائدة يثير فرع واحد أو اثنين ويمكن التعرف عليه بسبب وجود تورم أحياناً أمام نواة (الإسكان سينتروسومي قبل نوكليوكينيسيس) والأقماع النمو في نهاية كل فرع. (الشكل 3-G).

تم تصميم هذا البروتوكول للمراقبة لترحيل الإضافية المستمدة من MGE على صعيد خلية واحدة باستخدام التصوير بمرور الزمن. لهذه التجربة خاصة (الشكل 4)، تم إنشاؤها شرائح المخ أورجانوتيبيك الاكليلية من Dlx5/6لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب اليكتروبوراتيد الأجنة في e13.5 مع بلازميد الإعراب شرنا تجريبية (استهداف جين للفائدة) والكاسيت تدتوماتو . الشرائح المحتضنة ح 48، ونقل إلى طبق جيدا 8 غرف ساترة (شريحة 1 كل دائرة تطفو على طبقة رقيقة من تستكمل الثقافة المتوسطة) وتصويرها كل 3 دقائق ح 6-8 استخدام هدف جوي (0.70 غ) 20 x مجهر مقلوب مجهزة مع رئيس [كنفوكل] قرص غزل وبرمجيات الحاسوب اقتناء وغرفة بيئية لمرحلة أعلى. أثناء التصوير، والشرائح وأبقى على 37 درجة مئوية بشكل مستمر اﻷوكسيجين وهوميديفيد في قاعة البيئية (5% CO2 و 60 ٪ ح2س). وحددت الإضافية المستمدة من MGE اليكتروبوراتيد على هذا النحو بالتعبير عنها من اجفب، تأكيد هويتهم "في جابايرجيك"، وعلى التعبير عن تدتوماتو، مما يؤكد أن يعربون بلازميد التجريبية (الشكل 4 أ، ب). INs اليكتروبوراتيد يتم التعرف عليها بسهولة ومعزولة جيدا، كما هو مبين في الشكل 4، مما يسمح لتحليل أدق للهجرة المعاملات الحيوية، مثل السرعة والمسافة سافر. وباﻹضافة إلى ذلك، الوظائف المسمى ينظر إلى ترحيل عرضية نحو لوحة القشرية، بينما في بيئتها الطبيعية، تمكننا من تحديد التغييرات الشكلية الحيوية مثل المتفرعة من هذه العملية الرائدة ونوكليوكينيسيس (الشكل 4 -F).

كما يمكن أن تقترن انهانسر السابقين فيفو الأدوات المستمدة من MGE MGE explants لتمكين التصوير عالية الدقة للعمليات cytoskeletal الدينامية التي تحدث أثناء الهجرة، كتكملة لدراسة اتجاهية وديناميات الهجرة في الثقافات أورجانوتيبيك. على سبيل مثال، يمكن ملاحظة المراحل المختلفة للحركة العصبية تشبه تلك التي تحدث أثناء الترحيل عرضية من الوظائف في الثقافات شريحة أورجانوتيبيك explant الوظائف المهاجرة من MGE في اليكتروبوراتيد 48 ساعة بعد انهانسر، مثل الرائدة ملحق نورت ونوكليوكينيسيس (الشكل 5B-E). يمكن ثم دراسة مختلف العمليات سيتوسكيليتال بدقة عالية في عزل الخلايا المهاجرة من explant MGE، على سبيل المثال تلطيخ الهياكل و الأكتين مع فالويدين (الشكل 6A)، الذي لا يمكن تحقيقه على النحو الأمثل في شرائح أورجانوتيبيك نظراً لارتفاع الكثافة الخلوية (وبالتالي من العناصر سيتوسكيليتال) في بيئة أصلية. هذه العمليات سيتوسكيليتال، وخاصة أكتين و يعيد البناء، يمكن مواصلة دراستها بشكل حيوي عن طريق الجمع بين التعبير ليفيكت مع الوقت الفاصل بين التصوير. على سبيل المثال، نعرض مثالاً لتصوير عالي الدقة الوقت الفاصل بين IN المستمدة من explant MGE الحصول عليها من Nkx2.1لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الدماغ الماوس يحمل حذف مورثة فائدة في الوظائف مستهدفة. في هذا كان transfected مع بلازميد مشري-ليفيكت-7 تحت سيطرة المروج CMV (هدية من مايكل ديفيدسون)، باستخدام الأسلوب المخططة في الشكل 1، مما يسمح لتعقب والاكتين يعيد البناء التي تحدث في الوقت الحقيقي (الشكل 6B). وهكذا، بينما الثقافات أورجانوتيبيك مطلوبة لتقييم مسار اتجاهية أو الهجرة من وظائف معدلة وراثيا بشكل صحيح، MGE explants يمكن أن تكمل هذه الدراسات بتوفير وصول أفضل إلى الخلايا المعزولة لتصوير عالي الدقة من عمليات ديناميكية cytoskeletal.

مطبات التقنية قد يؤدي إلى فشل التجارب الموصوفة أعلاه. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي تضمين العقول في حلاً [اغروس] أكثر دفئا من 42 درجة مئوية في تدمير الأنسجة وموت الخلايا العصبية، كشفت عنها فقدان الشفافية من الدماغ أو شرائح، التي تصبح معتمة. بيد درجة الحرارة لا ينبغي منخفضة للغاية، كما حل [اغروس] توطيد يمكن أن تدمر الدماغ الجنينية الهشة أثناء عملية الدمج. وثانيا، يمكن أن تقلل التلوث عائد النهج التجريبي هو موضح هنا. وهكذا، ينبغي أن تنفذ جميع الخطوات بعناية، تحت ظروف معقمة صارمة قدر الإمكان. جميع الحلول والمعدات ينبغي أن تكون تعقيمها قبل الاستخدام، وينبغي رش معدات كثيرا مع الإيثانول 70% لتفادي التلوث من البكتيريا أو العفن. التلوث يمكن أن تكون مرئية مباشرة في آبار الثقافة، متوسطة الثقافة يصبح أصفر أو مبهمة. التلوث قد تمر مرور الكرام عند المتوسطة الثقافة لا تزال واضحة والسوائل. ومع ذلك، طبقة من العفن على سطح شريحة يمكن ملاحظتها عادة أو تصبح الشرائح الهشة مفرطة أثناء التثبيت والخطوات المصبوغة. عندما يتم تصور هذه الشرائح تحت المجهر، التلوث قد تظهر كطبقة من أوتوفلوريسسينسي عبر الخلايا العصبية المسماة أو الكشف عنها بوجود خيوط طويلة الفلورية. ينبغي أن يتم طرح شرائح أورجانوتيبيك أبقى في الآبار الملوثة، ولكن يمكن الاحتفاظ بالشرائح مثقف في آبار أخرى من نفس لوحة لاتخاذ مزيد من الخطوات. التلوث البكتيري نادرة جداً ولكن ينبغي أن تؤخذ على محمل الجد، بمعنى أن جميع المعدات، بما في ذلك حاضنات الأعمال المشتركة، وغرفة الثقافة ينبغي تنظيفها يدوياً وتعقيمها.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي من البروتوكولات تحويله الرحم انهانسر تليها الثقافة شريحة أورجانوتيبيك أو MGE explants. ألف مثال لإعداد مجلس الوزراء السلامة الأحيائية مع جميع الصكوك التعقيم اللازمة للبروتوكول هو موضح هنا. ب-التمثيل التخطيطي للبروتوكول المستخدم لثقافات شريحة انهانسر وأورجانوتيبيك الرحم السابقين . بإيجاز، هي جثث مقطوعة الرأس في الأجنة، يتم حقن بلازميد التجريبية في البطين الجانبي (1) واليكتروبوراتيد في MGE (2). المخ ميكروديسيكتيد خارج الجمجمة (3) وجزءاً لا يتجزأ من [اغروس] (4). أقسام أورجانوتيبيك يتم إنشاؤها في فيبرتوم (5) ووضعها في الثقافة في °C(6) 37 عن 48 ساعة للوقت الفاصل بين الفحص المجهري (7.1) أو 72 ح للخلية إعادة البناء (7.2). جيم- التمثيل التخطيطي للبروتوكول مقتبس من مايرز et al. عام 201353 واستخدامها لتوليد MGE explants. بإيجاز، كورتيسيس دورسولاتيرال هي أولاً تشريح للخروج من e12.5 الأجنة الفأرة البرية من نوع e14.5 (1) وفصل ميكانيكيا في تستكمل الثقافة المتوسطة (2). الخلايا القشرية مطلي في كثافة 5.25 بوصة × 105 الخلايا القشرية/سم2 ومثقف ح 2 في 37 درجة مئوية في الكولاجين/بولي-L-يسين-المغلفة 8 غرف ساترة (3). ثم، e13.5 Dlx5/6لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الأجنة وتجهز تحويله الرحم انهانسر من MGE (4، 5)، والمعزولة من المخ MGE وقطع في الأجزاء2 ميكرومتر 100 (6) يدوياً. هذه explants ثم وضعت على رأس الطبقة المغذية القشرية معدّة مسبقاً، مغطاة بالثقافة المتوسطة وشارك مثقف عن 48 ساعة قبل الوقت الفاصل بين التصوير (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الحفاظ على سيتوارتشيتيكتوري في شرائح أورجانوتيبيك صحية- شريحة جيل أورجانوتيبيك الثقافات بعد السابقين فيفو انهانسر من Nkx2.1لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الماوس الأجنة (A) لا يؤدي تلف الأنسجة الهامة، كما كشفت عن طريق الحفاظ على سيتوارتشيتيكتوري (DAPI (أزرق) ولجنة المساواة العرقية-مراسل (بروتينات فلورية خضراء))، إذا ما قورنت كريوسيكشن ميكرومتر سميكة 18 من Nkx2.1لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب ترانسكارديالي الجنين perfused مع 4% منهاج عمل بيجين في e15.5. د وم الإشارة إلى محاور دورسو البطني والانسي لاتيرو، على التوالي. (ب)-تضخم عالية الصور الملتقطة مجهر [كنفوكل] مقلوب مزودة بعلامة x 63/1.4 الهدف النفط بعد تلطيخ مع جسم المضادة-المشقوق-كاسباسي 3 (Cl-cas3) تكشف عن أن حوالي 20% الخلايا الموجودة في لوحة القشرية الخضوع المبرمج (رؤوس بيضاء) بعد ح 72 في الثقافة، بينما الإقامة الإضافية الإيجابية بروتينات فلورية خضراء صحية (السهم الأبيض)، كما يتجلى في photomicrographs في ج ج '' '. وعلى سبيل المقارنة، المبرمج الخلوي تماما تقريبا غائبة عن كريوسيكشن رقيقة من حيوان بيرفوسيد (د-د '' '). تغيير حجم أشرطة: 250 ميكرومتر (أ-ب) و 15 ميكرون (ج د '' '). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: شرائح أورجانوتيبيك من الفئران الدماغ الأجنة وتضخم عالية photomicrographs من اليكتروبوراتيد إينتيرنيورونس (INs). ألف بثقافة شريحة أورجانوتيبيك من Dlx5/6لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الدماغ الماوس (التي كافة الوظائف الخضراء) اليكتروبوراتيد مع Dlx5/6::shRNAسارعت-آيريس--تدتوماتو بلازميد. تم إصلاح الشريحة مع 4% منهاج عمل بيجين بعد 72 ساعة في الثقافة، وإيمونوستينيد للتجارة والنقل ومشري. INs اليكتروبوراتيد تم تصويرها في 3D (50-60 ميكرومتر سميكة z-مداخن مع المقاطع البصرية اتخذت كل 0.5 ميكرومتر) باستخدام مجهر [كنفوكل] مزودة بعلامة x 63/1.3 غ النفط الهدف. وظائف ترحيل عرضية في منطقة البطين شبه pallium الظهرية يمكن تحديدها بسهولة (سهم أحمر، وفتح). د وم الإشارة إلى محاور دورسو البطني والانسي لاتيرو، على التوالي. ب ثقافة شريحة تمثيلية أورجانوتيبيك من اليكتوبوراتيد جنين wildtype (WT) مع عنصر تحكم Dlx5/6::shRNAسارعت-آيريس--تدتوماتو بلازميد، ثابتة في ح 72 وإيمونوستينيد مشري فقط. وتعتبر الوظائف اليكتروبوراتيد (أحمر) ترحيل دورسالي نحو لوحة القشرية. INs اليكتروبوراتيد يتم تحديدها بواسطة التعبير عنها المشارك تدتوماتو و اجفب في Dlx5/6لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الفئران (ج-د)، أو التعبير عنها من تدتوماتو فقط في وزن الفئران (ه-ه)، وعن مورفولوجيا نموذجية، أي الخلية بيضاوي الجسم، عملية رائدة تشعبت (رؤوس بيضاء، ح د)، أحياناً الزائدة عملية (السهم الأبيض، ج-د) وتورم أحياناً العملية الرائدة السكن سينتروسومي قبل نوكليوكينيسيس (نجمة بيضاء في ج ج ' وز). تغيير حجم أشرطة: 250 ميكرومتر (أ-ب) و 25 ميكرومتر (ج-ح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الوقت الفاصل بين التصوير العيش من اليكتروبوراتيد الوظائف في شرائح أورجانوتيبيك مثقف ل 48 h. تعتبر الوظائف اليكتروبوراتيد في e13.5 مع بلازميد تجريبية الإعراب عن كاسيت تدتوماتو وشرنا استهداف جين لمصلحة الهجرة عرضية في شريحة الدماغ أورجانوتيبيك التي تم الحصول عليها من Dlx5/6لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الجنين الماوس بعد 48 ساعة للثقافة (مربعأ، بيضاء). في ب، اليكتروبوراتيد نفسه في (المربع الأبيض) تعتبر عملية نوكليوكينيسيس، أثناء ترحيل عرضية في القشرة، أي موازية للسطح بيل، ويتبع في الوقت الفاصل بين التصوير كل 3 دقائق ح 8 20 س/0.85 باستخدام الهواء نا الهدف (مربعات الموسع، ج-F). في البداية يعرض العصبية هيئة خلية ممدود (السهم مفتوحة) عملية نوكليوكينيسيس (ج)، فضلا عن عملية زائدة (السهم الأبيض) وعملية رائدة تشعبت (رؤوس بيضاء). بعد 3 ح للعيش-التصوير، نوكليوكينيسيس اكتمال وقد تراجع عن عملية زائدة، وهو تمديد هذه العملية الرائدة فرعين طويلة (د، رؤوس الأسهم البيضاء). بعد 5 ساعة و 30 دقيقة، واحدة من فرع العملية الرائدة قد تراجع (رؤوس بيضاء) والجسم الخلايا العصبية (السهم مفتوحة) انتقلت إلى الأمام نحو 10 ميكرومتر (ه). أخيرا، بعد 8 ساعات تصوير، قد توقف الهجرة، الخلايا العصبية وسعت عمليتها رائد مرة أخرى وقد بدأ عملية زائدة (السهم الأبيض)، ولكن النواة (السهم مفتوحة) لم تتحرك حتى الآن إلى الأمام (F). تغيير حجم أشرطة: 250 ميكرومتر (A)، 70 ميكرومتر (ب) و 30 ميكرومتر (ج-و). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تصوير الوقت الفاصل بين الوظائف المستمدة من explant MGE مثقف ل 48 h. وتعتبر الوظائف المهاجرة من أصل explant MGE الحصول عليها من Nkx2.1لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الماوس (الذي اجفب إكسبرس MGE المستمدة من جميع الوظائف) اليكتروبوراتيد مع بلازميد CMV::mCherry-ليفيكت-7 في e13.5، باستخدام الأسلوب مقتبس من مايرز et al. عام 201353 والمخططة في الشكل 1، ومثقف ح 48 (A). وظائف كانت تصور استخدام الوقت الفاصل بين التصوير ويعيش 5 ح (ب ه). في هذا المثال، واحدة في المشاركة الإعراب عن اجفب وليفيكت وينظر في البداية عملية نوكليوكينيسيس (السهم مفتوحة) ويمتد فرعين العملية الرائدة (رؤوس الأسهم البيضاء؛ ب). "في هذا" يكمل نوكليوكينيسيس بعد ح 1 (انظر السهم مفتوحة)، والجسم خلية تحركت إلى الأمام، وهي عملية زائدة وقد ظهرت في الجزء خلفي جسم الخلية (السهم الأبيض)، ولا يزال يعرض عملية رائدة واحدة مع فرعين (رؤوس الأسهم البيضاء؛ ج)-يجري نوكليوكينيسيس ثانية بعد 2 ساعة 30 دقيقة (الأسهم مفتوحة) وفي الآن هبت مع اثنين من العمليات الرائدة التي تنشأ من جسم الخلية وعملية تعد زائدة (السهم الأبيض؛ د). وأخيراً، بعد 5 ساعات، في تتراجع عن نورت واحد بينما ترانسلوكاتينج سينتروسومي في فرع العملية الرائدة المتبقية (السهم الأبيض) تحضيرا نوكليوكينيسيس ثالث، مع عملية زائدة (السهم الأبيض) لا تزال موجودة في الجزء الخلفي من جسم الخلية (E). تغيير حجم أشرطة: 70 ميكرومتر (A) و 20 ميكرومتر (ب ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: مثقف الوقت الفاصل بين التصوير من الأكتين يعيد البناء في وظائف إضافية من explant MGE عالية الاستبانة ل h. 48 ألف شريحة أورجانوتيبيك من Nkx2.1لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الدماغ الماوس هو ثابت في e15.5، ملطخة "فالويدين" أليكسا-594، مما يسمح لتصور أكتين الخيطية. وظائف يتم تصويرها باستخدام علامة x 63/1.3 غ النفط الهدف في مجهر [كنفوكل]. في وظائف صحية، يعتبر أكتين الخيطية الحجامة الجزء خلفي الجسم خلية بعد سحب عملية زائدة بعد انتهاء نوكليوكينيسيس (السهم الأبيض، أ '-A '''). ب explant MGE الحصول على النحو الوارد أعلاه من Nkx2.1لجنة المساواة العرقية؛ RCEاجفب الدماغ الماوس يحمل حذف مستهدفة للجينات للفائدة واليكتروبوراتيد مع بلازميد الإعراب عن مشري-ليفيكت-7 تحت سيطرة المروج CMV . الوقت الفاصل بين التصوير الحي تتم بعد 48 ساعة ثقافة، وتتبع اليكتروبوراتيد الوظائف كل ثلاث دقائق ح 3 استخدام 40 ×/0.85 الهدف الجوي. يعيد البناء النشطة من cytoskeleton أكتين يحدث في transfected مع ليفيكت، كما يتجلى في حركة الأحمر (الأبيض في الصور الأبيض والأسود) نقاط مضيئة داخل الأقماع العملية والنمو الرائدة (رؤوس بيضاء)، وفي الجزء الخلفي من جسم الخلية أثناء نوكليوكينيسيس (ب-ب '' '، الأبيض الأسهم). تغيير حجم أشرطة: 7 ميكرومتر (A-أ '' ') و 10 ميكرومتر (ب-ب '''). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، نحن نقدم وسيلة موثوق بها لأداء السابقين الرحم انهانسر الماوس MGE في e13.5 وتوليد أورجانوتيبيك ثقافات شرائح الدماغ الجنينية. على الرغم من أن في المختبر أساليب، مثل المقايسة الدائرة Boyden, هي سهلة نسبيا لتنفيذ، ويمكن استخدامها لتقييم الأدوار المحددة لمختلف الجينات والبروتينات دون تدخل عوامل أخرى، أنها تحول دون التحقيق ديناميات الهجرة فيما يتعلق ب مسار اتجاهية والهجرة25. MGE explants توفر وسيلة مفيدة دراسة التغيرات cytoskeletal الديناميكية التي تحدث أثناء الهجرة، كما نعرض هنا، إلا أنها تخلو من الرموز الأكثر الذاتية، وغالباً ما تتطلب إضافة إشارات التوجيه لتعزيز الهجرة العصبية (على الرغم من أن هذا تحسن كبير عند MGE explants تستزرع في الطبقات القشرية التغذية)25،54. ومع ذلك، يمكن أن تفشل الاختبارات استناداً إلى MGE explants للكشف عن الأثر المترتب على الرموز الجزيئية المشاركة في آليات أكثر دهاء مثل تلك التي توجه مسار اتجاهية أو الهجرة محددة من وظائف29. وكان في نهاية المطاف الالتفاف حول هذه المشكلة في الرحم انهانسر25، مما يسمح للعلامات المحددة للوظائف المستمدة من MGE المهاجرة في تلك البيئة الأصلية13،29،41. ومع ذلك، هذا الأسلوب تحدي المهارة، بسبب الإجراءات الجراحية التي تنطوي عليها، ومحدود الغلة بمعدل بقاء منخفضة للأجنة، وحقيقة أن MGE من الصعب على الهدف في الرحم، غالباً ما تتطلب استخدام ليتر متعددة تصل إلى55من أهمية. ومن ثم تحويله الرحم انهانسر من MGE متبوعاً بالثقافة أورجانوتيبيك من أجنة الفئران الدماغ يوفر طريقة منخفضة التكلفة والوقت فعالة وموثوق بها للتحقيق في ديناميات الهجرة ومورفولوجية الإضافية المستمدة من MGE في الطبيعية البيئة، بينما التحايل على الإجراءات الجراحية في الرحم انهانسر والحاجة إلى توجيه العظة في MGE explants. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يسمح سهولة وصول إلى MGE، التي يمكن أن تكون مستهدفة بمباشرة أبوسينج مسرى إيجابية تحت الرقبة وواحد سلبي على قمة الرأس، وتكوين أكثر من صعب اعتماد في الرحم. بدلاً من ذلك، يمكن أن يكون حقن MGE فوكالي وأثبت اليكتروبوراتيد مباشرة بعد إنشاء أورجانوتيبيك شرائح13،،من2529، ولكن هذا الأسلوب أكثر صعوبة وأقل فعالية في أيدينا من البروتوكول هو موضح هنا. عن طريق اتباع الخطوات الموضحة في هذه المقالة، واحد سيحصل على 50-100 اليكتروبوراتيد الإضافية المستمدة من MGE كل شريحة أورجانوتيبيك، 5-20 الذي سيتبين ترحيل عرضية من MGE بعد 72 h. Transfected الإضافية يمكن تصور لايف مع الوقت الفاصل بين التصوير أو المصورة وأعيد بناؤها بعد تثبيت والوسم المناعي.

البروتوكول الموصوفة هنا هو الأمثل للدراسة في الهجرة السابقين فيفو ومستوحاة من مختلف البروتوكولات المنشورة تصف في الرحم انهانسر الإضافية المستمدة من MGE و السابقين فيفو حقن MGE انهانسر، أو جيل من أورجانوتيبيك المزمن الدماغ شريحة الثقافات36،38،39،42،43،56،،من5758. نهجنا يحد من الأضرار المحتملة إلى MGE المتكفل باستخدام النبض أقل كثافة (40 الخامس) والحقن داخل البطيني بلازميد بدلاً من حقن MGE البينية مع نبضات الجهد العالي (100 V)، كما هو موضح في مكان آخر من39،56 ،،من5758. وعلاوة على ذلك، في حين أن البعض الآخر استخدام مزيج البنسلين، ستربتوميسين، ومع الجنتامايسين لمنع التلوث البكتيري39،56،،من5758، اخترنا لتجنب المضادات الحيوية لدينا ثقافة المتوسط نظراً لأنها يمكن أن تؤثر على الناحية النظرية في الهجرة. على وجه الخصوص، البنسلين خصم59،مستقبلات GABAA 60، وتنشيط مستقبلات GABAA ينشط وتوقف في وقت لاحق في الهجرة اعتماداً على التدرجات كلوريد داخل الخلايا و KCC2 التعبير في مراحل مختلفة في61من الهجرة. ومع ذلك، استخدام الاحتياطات المختلفة المذكورة في البروتوكول الحالي، التلوث يمكن فعلياً تجنبها حتى في غياب المضادات الحيوية.

وعلى الرغم من فعالية هذا النهج في أيدينا، قد ت الرحم انهانسر أيضا عيوبها. في حين توفير بيئة ثلاثية الأبعاد طبيعية للخلايا على الهجرة، يمكن أن يكون صعباً لإجراء فحوصات الدوائية في شرائح أورجانوتيبيك في سياق الهجرة. والواقع أن هجرة الإضافية المستمدة من MGE يعتمد في الغالب على الإشارات خارج الخلية2،،من1319 وتطبيق الدوائية مثبطات أو المنشطات على شرائح أورجانوتيبيك لا تسمح دقة تفكك خلية التأثيرات المتمتعة بالحكم الذاتي من آثار عالمية على الصحة العامة في شريحة أو النشاط. لمثل هذه التجارب، explants MGE نمت عبر الخلايا القشرية ينتابها المختلطة قد يكون الأفضل بالثقافات شريحة أورجانوتيبيك، يمكن معزولة ومعرضة بشكل انتقائي لمركبات محددة62INs يهاجرون من explant أكثر سهولة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن ت الرحم انهانسر أسهل لأداء من انهانسر في الرحم ، لا يزال يمكن صعبة من الناحية التقنية في العصور الجنينية يتضح هنا نظراً لصغر حجم وحالة هشة من أدمغة الأجنة في e13.5-المحققون ستحتاج بعض المحاكمات لكفاءة استخراج العقول اليكتروبوراتيد في e13.5 دون إلحاق الضرر بسطح المخ. وبالإضافة إلى ذلك، بدلاً من الشرائح بعد الولادة، لا يمكن إبقاء شرائح أورجانوتيبيك الجنينية في الثقافة على مدى فترات طويلة من الزمن. على الرغم من أن أورجانوتيبيك الجنينية شريحة الثقافات يمكن أن تظل على الأقل 7 أيام في المختبر63وهذا عدم الجمع بين انهانسر والتجارب الموصوفة هنا وقد تم اختبارها لما يصل إلى 3 أيام في المختبر مع نتائج يمكن الاعتماد عليها في أيدينا. ولذلك، المحققين يجب إجراء اختبارات الأمثل مسبقاً إذا كان هناك حاجة إلى وقت أطول للحضانة. علاوة على ذلك، التحقيق في التنمية في أواخر مراحل الولادة الجنينية أو المبكر لا ينصح بهذا الأسلوب عند استخدام الأجنة e13.525، لكن يمكن أن يتحقق مع انهانسر في الرحم ، حيث نجحت يتم وضع مرة أخرى في تجويف الرحم الأجنة اليكتروبوراتيد ويمكن أن يترك ليكون ولد وتحليلها في مراحل لاحقة21،64. وأخيراً، يسمح السابقين الرحم انهانسر متبوعاً أورجانوتيبيك شريحة الثقافات لتحليل كل مورفولوجية وديناميات الهجرة INs النامية. ومع ذلك، كما أنه قد تم سابقا في الرحم انهانسر تقنية36، السابقين الرحم اليكتروبوريشنز تسفر عن 50-100 اليكتوبوراتيد الخلايا كل شريحة الدماغ وبالتالي ليست مناسبة لتحليل السكان. أفضل تجري هذه التحقيقات في نماذج حيوانية تحمل كامل أو شرطية حذف (أو تدق في) الجينات للفائدة. عندما تكون متاحة، مثل هذه النماذج ثم كفاءة استخدامها لتوليد أورجانوتيبيك شريحة الثقافات أو MGE explants لتصور ديناميات الفعلية في الهجرة، كما هو موضح هنا (انظر الشكل 5 و الشكل 6).

العديد من الخطوات في هذا البروتوكول ينبغي أن يتم بعناية من أجل الحصول على أفضل النتائج. على سبيل المثال، فمن الأساسي أن جميع الخطوات التي تتم تحت ظروف معقمة صارمة كما يمكن أن يحدث التلوث بسهولة تامة. ينبغي رش القفازات والأدوات المستخدمة خارج مجلس الوزراء السلامة الأحيائية مع الإيثانول 70% كثيرا أثناء الإجراء بأكمله. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تبقى الحلول مثل وسائل الإعلام الثقافة ومصطنعة النخاعي العقيمة والباردة (4 درجة مئوية)، وجعلت الطازجة كل 2-3 أسابيع. لتسمية الإضافية المستمدة من MGE وبصورة أكثر تحديداً، ينبغي استنساخ والبلازميدات التي ستستخدم في هذه التجارب تحت سيطرة المروج محددة في (ت: Dlx5/649، Lhx665)، بدلاً من الاعتماد ببساطة على التشريحية استهداف MGE. ويتطلب جيل شرائح أورجانوتيبيك الدماغ للبقاء على قيد الحياة. وهكذا، للحفاظ على صحة الخلية والبقاء على قيد الحياة، هذه التجربة ينبغي أن تجري في أقل من 3 ساعات من اللحظة أن الأجنة يتم استردادها حتى يتم وضع الشرائح أورجانوتيبيك في الثقافة. للوقت-الكفاءة، يمكن مملوءة مسبقاً محلية الصنع الثقافة المتوسطة فقط قبل البدء التجربة ووضع في حاضنة الثقافة الخلية 37 درجة مئوية حتى استخدام لوحات الثقافة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يكون تشريح لعناية العقول خارج الجمجمة دون أي ضرر للسطح القشرية بغية تحقيق الدمج السليم في حل [اغروس] وتمزيقها فيبرتوم اللاحقة. على سبيل المثال، قد يؤدي الضرر إلى السطح القشرية، وحتى الحد الأدنى، مفرزة المقاطع 250 ميكرومتر سميكة من [اغروس] هلام المحيطة أو تدهور في الأقسام أثناء تقطيع فيبرتوم. لبقاء الخلايا العصبية، من المهم أيضا أن درجة حرارة [اغروس] الحل لا يزال ما يقرب من 42 درجة مئوية، ارتفاع درجات الحرارة يؤدي إلى موت الأنسجة الأضرار والخلية، في حين أن درجات الحرارة المنخفضة سوف يحول دون تضمين السليم للدماغ (أو إتلافها خلال تضمين عملية). مرة واحدة في الثقافة، لتجنب مصادر التلوث الأخرى، الشرائح لا ينبغي استغلال حتى يتم نقلها إلى المجهر للتصوير. وينبغي أن تنفذ هذه الخطوات في بيئة معقمة ويجب إيلاء الاهتمام لا لتلويث اللوحات بعد هذه التلاعبات، خاصة إذا كانوا بحاجة لتوضع مرة أخرى في الثقافة لإعادة التصوير اللاحقة. وأخيراً، لا ننصح يتعافى من قاسمة الحمض النووي مختلطة مع تحميل صبغ من التجارب السابقة لاستخدامها في المستقبل كما لاحظنا انخفاضا كبيرا في المحصول الخلايا العصبية اليكتروبوراتيد مع مثل هذه المواد.

وفي الختام، خارج الرحم انهانسر وأورجانوتيبيك شريحة الثقافة البروتوكول المذكورة أعلاه يسمح للعلامات المحددة المستمدة من MGE الوظائف على مستوى خلية واحدة ويمكن استخدامها للتلاعب وراثيا مسارات جزيئية محددة إلى دراسة دورها في تنظيم التغييرات الشكلية وديناميات الهجرة INs ترحيل عرضية. يسمح هذا الأسلوب للتحقيق الفنية أوائل سريعة ومنخفضة التكلفة للجينات المرشحة رواية حددت من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة من الوظائف الكثيرة الارتحال66،67 أو "تسلسل الجيل القادم" من المرضى الذين يعانون من الاضطرابات النمائية68،،من6970. هذه التقنية قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة الهجرة في السكان خلية أخرى، بما في ذلك الخلايا الهرمية في قشرة والحصين70،71،،من7273. حالما يتقن، فإنه يمكن استخدامها بصورة إعادة التدوير والاتجار بالبروتينات الغشاء، مثل مستقبلات والقنوات باستخدام البروتينات معلم التجارة والنقل؛ تتالي التنشيط للإشارات الخلوية محددة باستخدام أجهزة استشعار العوامل البيولوجية74؛ أو حتى بالرصد والتلاعب بنشاط الخلوية باستخدام تصوير الكالسيوم بالإضافة إلى أوبتوجينيتيكس في وظائف القشرية، ولكن أيضا في مناطق أخرى من الدماغ، مثل الحصين، اللوزة أو حتى في المخطط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن. الآراء التي أعرب عنها هنا لا تمثل بالضرورة آراء وزير الصحة أو حكومة كندا.

Acknowledgments

هذا العمل وأيده العاملة المنح المقدمة من مؤسسة سافوي ومؤسسة الصرع علاج بمعدات المنح المقدمة من "المؤسسة الكندية" للابتكار إلى أ (مجهر [كنفوكل]) و G.H (الغزل القرص مجهر [كنفوكل]). الطوارىء يستلم جائزة مهنة من Fonds de بحوث دو كيبيك والصحة (فرق-S; جائزة كلينيسيانسسينتيست) كذلك من "المعاهد الكندية" "البحوث الصحية" (استوفوا؛ جائزة الشباب الباحث). الزمان أحد علماء كبار فرق-س. جنيه مصري من جائزة التدريب ما بعد الدكتوراه ستيريادي-سافوي من "مؤسسة سافوي"، مؤسسة سانت جوستين تشو التدريب ما بعد الدكتوراه والجائزة دا فرق التدريب ما بعد الدكتوراه، في شراكة مع "مؤسسة النجوم". هذا المشروع قد أصبح ممكناً الدماغ في كندا من خلال "الصندوق الكندي لأبحاث الدماغ"، بدعم مالي من وزارة الصحة الكندية، منحت إلى جنيه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325 (2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834 (2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031 (2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897 (2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

Tags

علم الأعصاب، 134 قضية، ونمو الدماغ، مجهرية [كنفوكل]، القشرية جابايرجيك إينتيرنيورونس، الجنين e13.5، انهانسر، القمع الجينات، الماوس، الهجرة العصبية، ثقافة أورجانوتيبيك، تدخل الجيش الملكي النيبالي، عرضية الهجرة، في الوقت الفاصل بين التصوير
<em>الرحم السابقين</em> انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G.,… More

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter