Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex-Utero Электропорация и Organotypic срез культуры мозги эмбриона мыши Live-образов миграции интернейронов ГАМК

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57526
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2,4
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology, Université de Montréal, 4Department of Pediatrics, Université de Montréal

Summary

Здесь мы предлагаем недорогой и надежный метод для создания electroporated мозга organotypic срез культур из эмбрионов мыши подходит для confocal микроскопии и жить изображений техники.

Abstract

ГАМК интернейронов (INs) являются важнейшими компонентами нейрональных сетей, которые управляют познания и поведения. Модули, предназначенные для заполнения коры мигрируют касательной от их места происхождения в вентральной конечного мозга (в том числе от медиальной и хвостовой Ганглиозный Высокопреосвященства (MGE, КГЭ)) спинной пластины корковых в ответ на разнообразные внутренние и внешние подсказки. Были разработаны различные методологии годами генетически манипулировать конкретные пути и исследовать, как они регулируют динамических цитоскелета изменения, необходимые для правильного в миграции. В утробе матери электропорации широко применяется для изучения эффекта генов репрессий или гиперэкспрессия в конкретных в подтипы оценивая влияние на морфологию и окончательную позицию. Однако, хотя этот подход легко используется для изменения радиально мигрирующих пирамидных клеток, это более технически сложно при ориентации соц.страх в утробе матери электропорации генерирует низкой урожайностью, учитывая снижение выживаемости потомства при Электропорация проводится перед e14.5, как это принято при изучении МГЕ производные INs. В альтернативный подход МГЕ эксплантов обеспечивают легкий доступ к МГЕ и облегчить изображений генетически модифицированных модулей. Однако в этих эксплантов INs мигрируют в искусственных матрицы, лишенный эндогенного указания подсказки и таламуса входов. Это побудило нас, чтобы оптимизировать метод, где модули можно перенести в более натуралистических окружающей среды, в обход технических проблем в утробе матери подходов. В настоящем документе мы описываем сочетание бывших utero электропорации мозги эмбриона мыши следуют organotypic срез культур легко отслеживать, изображения и реконструировать генетически модифицированных модулей мигрируют вдоль их естественные пути в ответ на эндогенные подсказки. Этот подход позволяет для количественной оценки динамических аспектов миграции с покадровой конфокальная томография, а также подробный анализ различных морфологических параметров, с помощью нейронов реконструкций на фиксированной полученных ткани.

Introduction

Корковых интернейронов ГАМК (INs) разнообразны в отношении их биохимических свойств, физиологические свойства и связи, и они посредником различные функции в зрелых сетей1,2,3 ,4,5. Спецификация различные подтипы корковых INs жестко регулируется через генетических каскадов, которые были широко изучены1,2. Большинство (70%) корковых ГАМК INs происходят из прародителей в медиальной Ганглиозный возвышение (MGE), вентрально расположен эмбриональной структурой и необходимо перенести на относительно большие расстояния до корковых пластина1, 2 , 6. Хотя кортикального слоя пирамидальных клеток мигрировать радиально от желудочков зоны (VZ) коры пластины вдоль радиальной глии эшафот, тангенциальная миграции модулей, которые не присоединены к такой леску, требует целого ряда внутренних и внешние сигналы для привлечения мигрирующих нейронов к пластину кортикального слоя, при этом направляя их от не корковых структур2,,78. После выхода клеточного цикла, модули отталкиваются от MGE от химио отвратительный подсказки, выраженных в VZ MGE, который вызывает тангенциальная миграции к корковых плита9,10. Перенос INs избежать стриатума с помощью различных отталкивающим подсказки11 и, после достижения корковых пластины, они с тангенциальным переключиться в режим радиальная миграция и добраться до их окончательного ламинарные позиции, частично в ответ на сигналы от пирамидальной клетки12 и других клеточных популяций13. Миграция модули, что касается других нейрональных популяций, включает в себя различные динамические морфологических изменений разрешить фактическое движение нейрона. Этот так называемый нейронов локомоции характеризуется повторяющихся циклов трех последовательных этапов: удлинение ведущих процесс, активно антероградная движения ядра (nucleokinesis) и Ретракция конечные процесса14. В миграции регулируется многочисленные внутренние и внешние сигналы, которые управляют ветвления и активного ремоделирования ведущих процесса для руководства INs в правильном направлении, определение ориентации и скорость миграции14,15 ,16.

В последние годы1,2,7,,1718,19,20, широко изучены факторы, регулирующие корковых в миграции и нарушения в некоторых из этих молекулярных субъектов было постулировано приведет к нервной расстройств, например педиатрических огнеупорных эпилепсии или аутизм спектра расстройства1,2,21, 22 , 23 , 24. Таким образом, чтобы существенно продвинуть вперед нашу способность изучать этот динамичный процесс, как ранее рассмотренных25проводилась разработки различных подходов in vitro и in vivo . В vitro методы, включая Бойден Пробирной палаты и полоса выбор Assay, обеспечивают быстрый и наиболее воспроизводимого средства оценки требования и клеток автономная воздействия конкретных генов и белков во время миграции нейронов, без влияния других факторов25. Эти анализы являются особенно полезными, когда в сочетании с живой изображений8,,2627. С помощью этих методов модули легко извлекаются из e13.5 МГЕ и изолированные ферментативные и механических диссоциации, после чего можно исследовать различные сигнальные пути и указания подсказки, как показано ранее8,28 . Однако эти анализы проходят в искусственных внеклеточного матрикса в отсутствие трехмерные ткани архитектуры, которые могут изменить нейрональных поведение и ячейки свойства, потенциально влияющие ячейки миграции и/или выживание25. Чтобы обойти эти ограничения, ex vivo МГЕ эксплантов были разработаны как альтернативную инструмент для количественной оценки динамических морфологические изменения, происходящие во время миграции, а также такие параметры, как скорость и ориентации в14, 29. Создание МГЕ эксплантов является относительно простым и была широко описано в других разделах30. Это предполагает покрытие небольшой экстракт МГЕ на монослое смешанных корковых клеток или в смеси matrigel и коллагена в присутствии привлекательным или отталкивающего подсказки25, хотя последние являются Факультативным31. МГЕ эксплантов позволяют высоким разрешением изображений малонаселенных помеченных клеток, упрощение исследования внутриклеточных процессов, таких как цитоскелета реконструкции в процессе ведущих ветвления, как показано ранее32,33 ,34 и в настоящем исследовании. МГЕ эксплантов успешно использовались для оценки динамических цитоскелета изменения во время миграции в 2D среде, например после конкретных фармакологических или эозинофилов манипуляций (см., например, Тиленс et al. 201633) . Однако с этим подходом, INs мигрируют в пределах искусственного матрицы, и это может привести к изменению в поведении и воспроизводимость и значимость экспериментальные результаты.

Напротив в утробе матери электропорации позволяет генетические манипуляции INs в их родной среде и широко используемый метод, чтобы быстро и эффективно оценить влияние выгоды и потери функции гена в обход ограничений дорогостоящей и трудоемкой Выбивное и стук в стратегии25,35. В утробе матери электропорации может быть смещенной в отношении в прародителей, используя ячейки типа конкретных промоутеров и позиционирование электрода к вентромедиального структур, в том числе МГЕ36. Кроме того в утробе матери электропорации позволяет своевременно выражение экспериментальных конструкций в течение 1-2 дней, по сравнению с 7-10 дней, необходимых для конструкции выражения с использованием вирусных векторов25. Однако в утробе матери электропорации из в прародителями клонит быть малой мощности. Действительно, хотя пирамидальной клетке прародителями, расположенных в зоне спинной желудочков может эффективно transfected в утробе матери электропорация, ориентации более вентрально расположен структур, таких как MGE, более технически сложных, особенно в небольших e13.5 эмбрионы и высокий уровень эмбриональных летальность далее уменьшает экспериментальная урожайность25.

Чтобы обойти некоторые технические ограничения, связанные с in vitro МГЕ explant экспериментов и в естественных условиях в утробе электропорация, ex vivo organotypic срез культур были развитыми8,37, 38,39. Мозг organotypic срез культур предложение условия преимущество передразнивать в естественных условиях , будучи менее дорогостоящим и длительным, чем формирование животных моделей25. Действительно эти препараты позволяют легко доступ к MGE, наряду с конкретными визуализации INs и могут быть объединены с фокуса электропорации расследовать конкретные молекулярные пути в Син, перенос в более физиологических окружающей среды8 , 39 , 40 , 41. Поэтому мы оптимизировали подход для organotypic культур38, который мы в сочетании с экс-utero электропорации и time-lapse конфокальная томография, для дальнейшей оценки происходящих морфологических и динамичный процесс во время тангенциального миграции МГЕ-модулей. Настоящий Протокол была адаптирована и оптимизирована от других, которые использовали для изучения миграции пирамидальных клеток42,43 бывших внутриутробно или в утробе матери мозга электропорации и organotypic срез культур и корковых INs36,,3944. В частности обезглавлен эмбрионов мыши и MGE является electroporated ex vivo после внутрижелудочкового введения экспериментальной плазмиды, позволяя более эффективной и точной ориентации МГЕ прародителей чем то, что может быть достигнуто с в утробе матери электропорации. Затем извлекаются мозги и секционного корональных ломтиками весь мозг, которые могут быть культивировали на несколько дней, таким образом позволяя непрерывное отслеживание и изображений из transfected INs. Этот подход обычно этикетки вскользь миграция модули 5-20 на срез мозга, свести к минимуму количество экспериментальных итераций, необходимых для достижения статистической значимости, при маркировке достаточно редкий нейронов населения для обеспечения легко разделение отдельных нейронов для реконструкции и тонкой морфологической оценки. Кроме того по сравнению с МГЕ эксплантов, organotypic культур убедитесь, что миграция модули подвергаются более естественной окружающей среды, включая локально выделяется chemokines и входы от таламуса афферентов. Таким образом, этот подход является хорошо подходит для количественного определения направленности и пути миграции, принятых transfected INs, предлагая достаточно анатомические детали, чтобы позволить характеристика тонкой динамических процессов, таких как ведущий процесс ветвления, nucleokinesis и завершающие процесс отзыва.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с участием животных были одобрены Comité Institutionnel des Bonnes сходной avec les Animaux исследований (CIBPAR) в исследовательском центре Сент-Жюстин Чу и были проведены в соответствии с канадского Совета по животных уход Руководство Уход и использование экспериментальных животных (ред. 2).

Протокол, описанные здесь был оптимизирован для электропорации эмбрионов в эмбриональных день (e) 13.5, в то время, когда МГЕ производные INs активно создаются, до45,пик КГЭ-производные модули производства46. Кроме того для смещения электропорации к ГАМК INs, мы используем промоутер выборочно выражена в модули (например, промоутер Dlx5/6 с минимальными enhancer)47.

1. Приготовление растворов для электропорации и ломтик Organotypic культур

  1. Подготовка 125 мл стерильной питательной среды.
    1. Мера 125 мл регулярных нейрон конкретных питательной среды (см. Таблицу материалов для разработки) в стерилизованные бутылки в ранее УФ стерилизации биобезопасности кабинета распыляется с 70% этиловом спирте. Добавление 2,25 мл 50 x сыворотки свободный нейрон конкретные дополнения, 1,75 мл 200 мм глютамина (конечная концентрация 0,5 мм) и 6,25 мл сыворотки тепла инактивированная лошадь, ранее aliquoted в стерильных условиях. Перемешать, Алиготе 15 мл стерильного конические трубы и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Подготовленные питательной среды может храниться до 3 недель при 4 ° C.
    2. Разделите 100 X Стоковый раствор Botteinstein в N-2 формулировка48 на 150 мкл аликвоты в стерильных условиях и заморозить при температуре-20 ° C до использования.
  2. Подготовка 1 Л стерильных искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО).
    1. Мера 800 мл дистиллированной воды в стакан емкостью 1 Л. Добавить 25.67 г сахарозы, 5.08 г хлорида натрия (NaCl), 2.18 г бикарбоната натрия (NaHCO3), 1,80 г глюкозы, 0,19 г хлористого калия (KCl), 0,15 г монокальций фосфат безводного натрия (NaH2PO4), 1 мл 1 М запасов CaCl2 .2H2O и 2 мл 1 м складе MgSO4.7H2O. движение, чтобы растворить при комнатной температуре. Долейте дестилированную воду до общим объемом 1 л.
    2. С помощью фильтра 0.22 мкм, фильтр решение в стерильных бутылку в стерилизованные биобезопасности кабинета и хранить при 4 ° C до 1 месяца.
  3. Готовить свежий раствор 4% агарозы в фаго перед каждой эксперимент.
    1. Мера 25 мл ранее подготовленных фаго в 50-мл стерильного Конические трубки и добавить 1 g легкоплавких точки агарозы.
    2. Тепла для 45 s в микроволновой печи. Чтобы избежать разлив, прерываний, Отопление каждые 3-4 s, когда начинает кипеть, открытая трубка, чтобы позволить давление вне, снова закройте его и вручную агитировать смешать агарозы. Повторяйте до тех пор, пока решение агарозы однородной. Держите агарозы решение при 42 ° C в течение оставшейся части эксперимента, чтобы избежать затвердевания.
      Примечание: Повышение температуры вызовет повреждение тканей мозга.

2. Подготовка плазмиды для инъекций

  1. Вытащить микроинъекции Пипетки стеклянные
    1. Установите микропипеткой съемник с соответствующими параметрами, безопасного стекла капилляров в предоставленный пространстве и убедитесь, что он центрируется с нити накаливания.
    2. Нажмите кнопку извлечения.
    3. Осторожно удалите недавно сделал микроинъекции пипетки от тепла съемник и место в поле или чистой Петри до дальнейшего использования, чтобы избежать повреждения кончик.
  2. Set-up биобезопасности, кабинет с всеми инструментами необходимо для этого эксперимента (см. Рисунок 1A), щедро спрей все инструменты в области биобезопасности кабинета с 70% этанола и стерилизовать инструменты и среды с УФ-излучения для 15-20 мин.
  3. Во время стерилизации шага оттепель плазмид на льду (4 ° C).
  4. Мера 10 мкл плазмиды от Стоковый раствор (4 мкг/мкл) в чистой 1,5 мл пластиковых пробирок. Добавьте 0,01% от быстро зеленый FCF. Осторожно перемешать, спина кратко и держать на льду до использования.
    Примечание: Макси prep ДНК должны быть подготовлены согласно протоколу производителя с помощью комплекта эндотоксинов свободный макси prep. ДНК может быть солюбилизирован в буфере TE или свободной от нуклеиназы H2O и подготовка плазмида с краситель решение может, но не не нужно выполнять в стерильных условиях. Плазмиды от макси подготовка должна быть aliquoted, чтобы избежать нескольких циклов замораживания оттаивания. Aliquoted плазмид должна быть смешанной с красителем не более что 2 ч перед использованием и не должно быть размораживают для дальнейшего использования.
  5. После стерилизации готовят нано инжектор следующим образом.
    1. Выберите один из ранее подготовленных стекла микроинъекции пипетки, хранящиеся в чистое поле или Петри и использования небольших пинцет сократить кончиком пипетки в скошенный способом добиться наружным диаметром примерно 15 мкм.
      Примечание: Наружный диаметр здесь является приблизительной мерой дать пользователю представление о том, что мы используем в наших экспериментах и оптимизирована для облегчения пирсинг черепа для инъекций плазмида без повреждения мозга, позволяя при этом для жидкости Загрузка и выпуск ДНК. Наружный диаметр может измеряться, глядя на вырезать кончик стекла микроинъекции пипетки, соединенный с микрометрическим линейки под микроскопом светлые области.
    2. Используйте шприц для заполнения микропипеткой с минеральным маслом от его unpulled конца (высылать всех воздуха).
    3. Вставьте микропипеткой наполненный стакан в нано инжектор, следуя инструкциям производителя.
    4. Пустой 2/3rds стекла микропипеткой (сохраняя достаточно нефти, чтобы не допустить въезда воздуха).
  6. Тщательно вставьте подготовленный микропипеткой в пробирку, содержащую раствор плазмида/красителя и заполнить стекло микропипеткой плазмида/краска раствором.

3. сбор зародышей мыши от беременных женщин

  1. Контролировать размножающихся самок ежедневно, чтобы оценить для вагинального подключения, предпочтительно в то же время ежедневно (полудня). День e0.5 соответствует первый день, когда наблюдается Вагинальные вилка.
    Примечание: Эксперименты, описанные здесь может проводиться в мышах одичал типа. Однако, чтобы облегчить идентификацию МГЕ и маркировать все ГАМК INs (или конкретных вложенные наборы, например МГЕ производные INs), трансгенных животных могут быть использованы (например: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre с КРР репортер аллеля,47,и т.д.49). В этой ситуации экспериментальной плазмида инъекции следует выразить еще Флюорофор (например, mCherry или TdTomato) чтобы разрешить визуализации transfected INs (желтый), который можно сравнить с не transfected INs (зеленый).
  2. Пожертвуйте девушки на эмбриональных день e13.5, шеи дислокации.
    Примечание: Анестетиков, учитывая в то время жертвоприношения может повлиять в миграции и выживание50,51 и его следует избегать.
  3. Собирайте эмбрионов, кесарево сечение следующим образом.
    1. Щедро спрей Женский живот с 70% этиловом спирте. Подтянуть кожу живота с парой стерильный пинцет и, с другой стороны, использовать стерилизовать хирургические ножницы для резки кожи от живота.
    2. С второй пары стерильный пинцет и ножницы подтянуть брюшной фасции и сократить его тщательно избегая матки.
    3. С помощью третьей пары стерилизованные щипцами и ножницы, тянуть маточные рожки и вырезать их из полости таза. Место расчлененных рога матки в стерильных 60-мм Петри, наполненный нейронной основе культуры среднего дополнена аминокислоты, витамины и неорганических солей (см. Таблицу материалы для коммерчески доступный продукт).
  4. В стерильные биобезопасности кабинета используйте две пары тонкой пинцетов (по одному в каждой руке) вскрыть эмбрионов из плаценты и изолировать головки путем обезглавливания.
  5. Рельеф вырезать кончиком пипетки пластиковые передачи 3 мл стерильного, аспирационная головы и передачи их в новых стерильных Петри 60-мм слоистых с затвердевшей Черный воском и заполнены с тем же нейронной основе дополняется питательной среды как указано выше.
    Примечание: Этот шаг минимизирует переноса загрязнений (мыши волосы, кровь). Черный воск используется для стабилизации голову во время вскрытия. Культура СМИ не нужно быть кислородом во время этих процедур.

4. внутрижелудочкового плазмида инъекции и Ex Vivo электропорации МГЕ

Примечание: Следующие шаги должны выполняться в стерильных условиях в ранее подготовленных биобезопасности кабинета.

  1. Место Петри 60-мм слоистых с черным воском и содержащие обезглавленное головы в нейронной основе дополняется питательной среды под бинокль в кабинете биобезопасности.
  2. Стабилизировать головы, ростральной части вправо, с тонкой пинцет с левой рукой и использовать nano инжектор в правой руке для вставки 1-2 мкл раствора плазмида/краска на правой боковой желудочек.
    Примечание: Сопредседатель выражение эксперименты могут быть проводимых co-electroporating плазмида спасения и выражая индуцируемый плазмиды путем смешивания обоих плазмид в эквимолярных концентрациях.
  3. Electroporate вводят мозга.
    1. Поместите головку между электродами с отрицательным электродом дорзально позиционируется и параллельно с головы и положительного электрода к вентральной стороне головы целевой MGE.
    2. После того, как хорошо расположены электроды, доставить 4 прямоугольных импульсов 40 V для 50 мс в 500 мс интервалами между импульса.
    3. Удалите любой остаточной ткани из электродов с помощью пинцета, уже помещены в биобезопасности кабинета.
      Примечание: Эти параметры были оптимизированы специально для electroporator, используемые в наших экспериментах. Мы рекомендуем, что пользователи выполнять оптимизацию тесты заранее при использовании другого типа electroporator.
    4. Повторите шаги 4.1 до 4,3 для всех остальных мозги.
      Примечание: Хотя этот протокол описывает манипуляции, необходимые для одного мозга, его можно ввести до 4 мозги последовательно до electroporating каждый мозг, тем самым увеличивая урожайности. Эта стратегия особенно выгодно, когда 2 или более различных плазмид вводят последовательно (например, элемента управления или экспериментальных плазмида) во время же эксперимента (позволяя сравнения между однопометники). Кроме того, это можно придать и electroporate одновременно обе стороны мозга для повышения урожайности, путем размещения электродов полностью параллельна поверхности мозга.

5. мозг диссекции и ломтик Organotypic культур

  1. Хотя по-прежнему манипулирования в стерильных условиях кабинета биобезопасности, вскрыть мозг из черепа.
    1. Стабилизировать голову на слой черного воска, вставляя иглу в каждый глаз тщательно избегая мозга.
    2. Использование тонкой пинцет провести с левой стороны шеи и вторая пара тонкой пинцет рвать кожу от черепа, от задней к передней.
    3. Удерживая голову вбок с помощью пинцета в одной руке, используйте другую пару пинцетом в другой тщательно вырезать черепа на уровне ствола мозга и аккуратно потяните черепа. С каждым пинцет вырезать черепа в сагиттальной плоскости (срединная) на фронт и затем надрезать боково освободить фрагменты черепа.
    4. Поднимите ствола мозга и тщательно вырезать мозговых оболочек и черепных нервов, до тех пор, пока мозг полностью выходит черепа.
      Примечание: Все шаги, описанные в разделе 5.1 должно выполняться в строгих стерильных условиях в области биобезопасности кабинета.
  2. Внедрите мозга в 4% легкоплавких точки агарозы для разрезания.
    1. Заполните чашку Петри 35-мм с агарозы раствор, приготовленный выше (сдержано жидкости при 42 ° C).
    2. Быстро передавать electroporated мозга заполнены агарозы блюдо с помощью пипетки ранее вырежьте передачи. Держите блюдо при комнатной температуре.
    3. Перемешать агарозы металлической палкой, чтобы держать мозг в середине также (для предотвращения затопления) и позиции мозга в плоскости rostro хвостового параллельно на блюдо. Остановите, помешивая, когда агарозы начинает закрепить, чтобы избежать повреждений мозга.
    4. Используйте лезвия для резки агарозы, окружающих мозг для того чтобы сформировать прямоугольного блока, оставляя запас 1-2 миллиметров вокруг мозга. Убедитесь, что в ростральной части мозга перпендикулярно передней предела блока для облегчения ориентации для последующих этапов резания.
    5. Повторите для каждого мозга.
      Примечание: Это возможно сократить более чем одного мозга в то время (максимум 3) на формирование отдельных агарозы блоков при установке каждого мозга на разных высотах.
  3. Vibratome корональных секций и ломтик культуры.
    1. Оттепель один Алиготе 100 X N-2 дополнение (150 мкл) на льду и добавить 15 мл aliquoted питательной среды в стерильных условиях.
    2. Передать каждой скважины 6-ну культуры плиты 750 мкл питательной среды (с 1 X N2 за дополнительную плату).
    3. С помощью пинцета, изогнутые место один Вставка культуры клеток (диаметром 30 мм, размер пор 0,4 мкм, ПТФЭ) в каждом средне заполнены хорошо.
    4. Заполните vibratome Ванна с непрерывно кислородом фаго. Охладите до 4 ° C со льдом вокруг ванны, или использовать охлажденных vibratome.
    5. Установите скорость vibratome 0.150 мм/с и частотой 80 Герц.
    6. Приклейте агарозы блок на vibratome платформу, Ростральные край вниз и брюшной кромки, с которыми сталкивается пользователь.
    7. Вырежьте мозг в корональных разделы для получения 250 мкм толстые секции (при 4 ° C).
    8. Стерилизованные шпатели Соберите 2-3 разделы, содержащие МГЕ и место вставки все секции мозга от одного животного на одном 30-мм мембраной, тщательно избегая дублирования между разделами. Место вставки в одной скважиной 6-ну культуры плиты (содержащие 750 мкл, дополненная питательной среды, как описано выше). Кроме того каждый раздел могут быть размещены на отдельный 13-мм Диаметр мембраны в пластине культуры 12-ну заполнены с 500 мкл дополнены питательной среды. Количество питательной среды, рекомендованных для каждой скважины позволяет Секции мозга будет кормиться в средствах массовой информации без затопления.
      Примечание: Шаги, описанные в 5.3.6 и 5.3.7 не проводятся в условиях полной стерильности, если vibratome можно стерилизовать и используется в области биобезопасности кабинета. Таким образом крайне важно проводить эти шаги тщательно, чтобы избежать любого загрязнения. Надлежащие средства защиты (Чистая маска, перчатки хирургические и халате) следует носить во все времена и частей тела, даже охватывает, такие как волосы, лицо и руки, никогда не следует передавать над культуры пластин (с или без культуры среднего). Также рекомендуется опрыскивать часто на перчатки и шпатели используются для сбора секции мозга на 70% спирте.
    9. Место культуры пластины в вентилируемых стерильные инкубатора при 37 ° C с 60% влажности и 5% CO2 48 или 72 ч.
      Примечание: Эти инкубации раз были оптимизированы для покадровой изображений МГЕ производные INs и конфокальная томография фиксированной ломтиками, соответственно. Оптимальной инкубации раз должен испытываться заранее для каждого экспериментального дизайна. Кроме того если выбрали инкубация 72 h и под, существует не нужно изменить питательной среды. За время инкубации питательной среды следует изменить каждые 2-3 дня.
    10. После инкубации желаемого времени передать под патрон 8 coverslip интересующие разделы и добавить 3-5 мкл питательной среды. Место coverslip в экологической палаты (37 ° C, влажность 60%, 5% CO2) подключены к Перевернутый спиннинг диска конфокальный оснащены приобретение компьютерного программного обеспечения для настройки покадровой изображений сессии.
      Примечание: Кроме того, секции может быть исправлено с параформальдегида 4% (на ночь при 4 ° C или 2 ч при комнатной температуре), а впоследствии и immunostained с различных антител для визуализации морфологические особенности electroporated модули под конфокальный Микроскоп. Хотя eGFP и mCherry могут быть визуализированы на confocal микроскопии без какой-либо борьбе окрашивание процедуры, мы рекомендуем иммуногистохимия против GFP и mCherry для повышения сигнал, так как процесс фиксации может уменьшить флуоресценции, сокращение Обнаружение тонкой компонентов эмбриональных нейронов, например мелких ветвей в процессах пробелы в начале или в конце.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом разделе мы предоставляем представитель результаты, полученные после бывших utero электропорации управления плазмида или экспериментальной плазмида, ориентация ген интереса, в MGE зародышей мыши e13.5 следуют organotypic срез культур инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов (для покадровой изображений) или 72 ч (для фиксации и иммуногистохимическое маркировки) (см. Рисунок 1B для схемы протокола). Типичные примеры INs, переход от MGE экспланта являются также иллюстрированный (см Рисунок 1 c схема протокола) как сравнение с методом, описанным здесь. Электропорация плазмида в MGE прародителями, как представляется, задержки выхода INs от MGE и время культуры должны быть скорректированы соответствующим образом.

В успешный эксперимент organotypic ломтиками появляются здоровые под конфокального микроскопа, т.е. кортикального слоя легко различимы светлые области режиме и есть нет видимых загрязнений на поверхности среза (узнаваемой, интенсивные аутофлюоресценция и присутствие флуоресцентные волокна видимые под эпифлуоресцентного). В здоровых хронический organotypic ломтиками примерно 20% клеток проходят apoptosis после 72 ч в культуре (рис. 2), как описано в хронический organotypic культур (например послеродовой культур)52. Тем не менее структура валового cytoarchitectural мозга по-прежнему четко определенной, как показано здесь с помощью DAPI окрашивание (рисунок 2A). Наш протокол для ex vivo электропорации МГЕ урожайность в среднем 50-100 transfected клеток на ломтик (Рисунок 3АB), из которых 5-20 ячеек будет рассматриваться миграции дорзально после 72 ч в культуре. После фиксации и иммуногистохимическое окрашивание INs, перенос касательной к корковых пластины могут быть легко идентифицированы с помощью конфокальной микроскопии, как они представляют, овал и удлиненные клетки тела, иногда конечные процесса и ведущий процесс ориентированных на вскользь. Ведущий процесс обычно дает основание для одной или двух отраслей и узнаваемые наличием иногда отек передней части ядра (жилье Центросома до nucleokinesis) и конусы роста в конце каждой ветви. (Рис. 3 c-G).

Этот протокол был разработан для наблюдения за перенос МГЕ производные INs на уровне одной ячейки с использованием промежуток времени визуализации. Для этого конкретного эксперимента (рис. 4) срезы мозга корональных organotypic были получены из Dlx5/6КРР; RCEEGFP эмбрионов electroporated на e13.5 с плазмида, выражая экспериментальный индуцируемый (таргетинг ген интереса) и кассеты с TdTomato . Ломтики были инкубировали в течение 48 ч, переданы 8-Ну патрон coverslip блюдо (1 ломтик каждой камеры, плавающей на тонкий слой дополнениями питательной среды) и образы каждые 3 минуты для 6-8 ч, используя цель воздуха (0,70 NA) 20 x на инвертированным микроскопом оборудованы с головой конфокальный диска спиннинг, приобретение компьютерного программного обеспечения и стадии Топ экологической палаты. Во время визуализации, ломтики хранились при 37 ° C и были непрерывно кислородом и увлажненный в зале окружающей среды (5% CO2 и 60% H2O). Electroporated MGE-производные INs были определены как таковые их выражение eGFP, подтверждающие их личность ГАМК в и их выражение TdTomato, подтверждающие, что они выражают экспериментальной плазмида (рис. 4AB). Electroporated модули легко узнаваемы и хорошо изолированы, как показано на рисунке 4, что позволяет для более точного анализа динамических параметров миграции, такие как скорость и расстояние ездил. Кроме того помечены INs видны миграции касательной к кортикального слоя плиты, в их естественной среде, позволяет нам выявить динамический морфологические изменения как ветвление ведущих процесса и nucleokinesis (рис. 4 c -F).

Ex vivo электропорации МГЕ производные INs также могут быть объединены с МГЕ эксплантов для включения отображения с высоким разрешением динамических цитоскелета процессов, происходящих в процессе миграции, в дополнение к изучению направленность и динамика миграционных в organotypic культур. В качестве примера, можно наблюдать различные фазы нейрональных локомоции напоминают те происходят во время тангенциального миграции модулей в organotypic срез культур в electroporated Син, переход от MGE explant 48 ч после электропорация, таких как ведущий расширение neurite и nucleokinesis (Рисунок 5B-E). Различные цитоскелета процессы могут затем учился в высоком разрешении в изолированных клеток, переход от MGE экспланта, например путем пятнать F-актина структур с Фаллоидин (рис. 6А), который не может быть достигнута оптимально organotypic ломтиками Учитывая высокую плотность сотовой (и таким образом цитоскелетных элементов) в родной среде. Эти цитоскелета процессы, и в частности F-актина ремоделирования, могут далее изучаться динамически путем объединения Lifeact выражение с покадровой изображений. К примеру, мы показываем пример высокого разрешения покадровой съемки в производный от MGE экспланта, полученные из Nkx2.1КРР; RCEEGFP мозга мыши, проведение целевых удаление гена интереса к INs. Это в был transfected с mCherry-Lifeact-7 плазмида под контролем промотора ЦМВ (подарок от Майкл Дэвидсон), используя метод схематизируются в Рисунок 1 c, позволяя для отслеживания F-актина Ремоделирование, происходящие в реальном времени (Рисунок 6B). Таким образом, в то время как organotypic культур необходимо правильно оценить направленность или миграции путь генетически модифицированных модулей, МГЕ эксплантов могут дополнять такие исследования путем предоставления лучшего доступа к изолированных клеток для изображений с высоким разрешением динамических процессов цитоскелета.

Технических ошибок может привести к сбою эксперименты, описанные выше. Например встраивание мозги в растворе агарозы теплее, чем 42 ° C может привести к разрушению тканей и нейрональных смерти, показал потеря транслюценции мозга или ломтиками, которые становятся непрозрачными. Однако Температура не следует слишком низкой, как застывающих агарозы решение может разрушить хрупкие эмбриональных мозга во время процесса внедрения. Во-вторых загрязнение может значительно снизить доходность экспериментальных подходов, описанных здесь. Таким образом все меры должны осуществляться с осторожностью, в строгих условиях стерильности насколько это возможно. Все решения и оборудование следует стерилизовать перед использованием и оборудование следует часто опрыскивают этанол 70% чтобы избежать загрязнения от бактерий и плесени. Загрязнение может быть видны непосредственно в скважинах культуры, как питательной среды становится желтой или непрозрачным. Загрязнение может остаться незамеченным, когда питательной среды остается четкой и жидкости. Однако слой плесени на поверхности среза обычно можно наблюдать или срезы становятся чрезмерно хрупкими во время фиксации и окраски шаги. Когда такие фрагменты отображаются под микроскопом, загрязнение может проявляться в виде слоя аутофлюоресценция над метками нейронов или показали присутствие долго флуоресцентные волокна. Organotypic ломтиками, хранится в загрязненной скважины должны быть выброшен, но ломтиками, культивируемых на других скважинах же пластины может храниться для дальнейших шагов. Бактериальное загрязнение встречается довольно редко, но следует принимать всерьез, означает, что все оборудование, включая общие инкубаторы и зал культуры следует вручную очистки и стерилизации.

Figure 1
Рисунок 1: Схематических представлений протоколов для бывших utero электропорации следуют organotypic срез культуры или эксплантах MGE. A. пример настройки кабинета биобезопасности с всеми стерилизованные инструменты, необходимые для протокола, описанных здесь. Б. схематическое представление протокола, используемого для бывших utero электропорации и organotypic срез культур. Кратко обезглавлен эмбрионы, экспериментальный плазмида впрыскивается в боковой желудочек (1) и electroporated в MGE (2). Мозг microdissected из черепа (3) и встроенных в агарозном (4). Organotypic разделы создаются на vibratome (5) и помещены в культуре на 37 °C(6) в течение 48 часов для покадровой микроскопии (7.1) или 72 ч для реконструкции ячейки (7.2). C. схематическое представление протокола адаптированный Майерс et al. 201353 и используется для генерации МГЕ эксплантах. Вкратце Дорсолатеральное коре сначала расчлененный от e12.5 до e14.5 одичал тип мыши эмбрионов (1) и механически отделить в дополнение питательной среды (2). Корковых клеток покрытием на плотность 5,25 x 105 корковых клеток/см2 и культивировали в течение 2 ч при 37 ° C в коллагена/поли L-лизин покрытием под патрон 8 coverslip (3). Затем e13.5 Dlx5/6КРР; RCEEGFP эмбрионы, обрабатываются для бывших utero электропорации MGE (4, 5), и MGE вручную изолированы от мозга и режут в 100 мкм2 фрагментов (6). Эти эксплантов затем укладывают поверх слоя ранее подготовленных корковых фидер, покрыты питательной среды и совместно культивируемых за 48 ч до замедленной изображений (7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: сохранились cytoarchitecture ломтиками здоровых organotypic. Поколение organotypic срез культур после ex vivo электропорации Nkx2.1КРР; RCEEGFP эмбрионов мыши (A) не приводит к значительным ткани ущерб, как свидетельствуют сохранившиеся cytoarchitecture (DAPI (синий) и Cre репортер (ГПУП)), когда по сравнению с 18 мкм толщиной cryosection от Nkx2.1КРР; RCEEGFP transcardially эмбриона, увлажненную с 4% ПФА в e15.5. Д и М указывают dorso вентральной и Латеро медиальной оси, соответственно. (B). высокое увеличение изображений, снятых с Перевернутый Конфокальный микроскоп оснащен 63 x / 1.4 цель нефти после окрашивания с анти расщепляется-Caspase 3 антитела (Cl-cas3) показывают, что около 20% ячеек в пластину корковых проходят апоптоз (белые стрелки) после 72 ч в культуре, хотя GFP-позитивных INs оставаться здоровым (белая стрелка), о чем свидетельствует в микрофотографиями в C-C'' '. Сравнения, сотовой апоптоз — почти полностью отсутствует из тонкого cryosection перфузии животных (D-D'' '). Масштаб бары: 250 мкм (A-B) и 15 мкм (C-D'' '). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Organotypic ломтики мышей мозга эмбрионов и высокое увеличение микрофотографиями electroporated интернейронов (INs). A. срез культуры organotypic от Dlx5/6КРР; RCEEGFP мыши мозга (в которой все модули зеленый) electroporated с Dlx5/6::shRNA,яичница-IRES-TdTomato плазмиды. Срез было зафиксировано с 4% PFA после 72 ч в культуре и immunostained GFP и mCherry. Electroporated модули были образы в формате 3D (50-60 мкм толщиной z стеки с оптическим секций, принимать каждые 0,5 мкм) с помощью Конфокальный микроскоп с 63 x / 1,3 NA нефти цель. INs, перенос тангенциально в зоне югу желудочков спинной паллий, легко узнаваемы (красная стрелка, open). Д и М указывают dorso вентральной и Латеро медиальной оси, соответственно. B. культура ломтик представитель organotypic из эмбриона electoporated wildtype (WT) с элементом управления Dlx5/6::shRNA,яичница-IRES-TdTomato плазмиды, зафиксировано на 72 h и immunostained для mCherry только. Син Electroporated (красный) видны дорзально мигрируют к корковых пластины. Electroporated модули определяются выражением их совместно TdTomato и EGFP в Dlx5/6КРР; RCEEGFP мышей (C-D), или их выражение TdTomato только в WT мышей (E-H), а их типичной морфологии, т.е. овальные клетки тела, разветвленные ведущих процесс (белые стрелки, D-H), случайные сопровождения процесса (белая стрелка, C-D) и иногда отек ведущих процесса жилищного Центросома перед nucleokinesis (белая звезда в C-C' и G). Масштаб бары: 250 мкм (A-B) и 25 мкм (C-H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: промежуток времени жить изображений electroporated модули organotypic ломтиками культивировали в течение 48 ч. Модули electroporated в e13.5 с экспериментальной плазмида, выражая TdTomato кассету и индуцируемый ориентации ген интереса видны тангенциальная миграции в срез мозга organotypic, полученные от Dlx5/6КРР; RCEEGFP эмбриона мыши после 48 ч культуры (A, белый квадрат). В B, же electroporated в (белый квадрат) рассматривается в процессе nucleokinesis, во время миграции тангенциально в коре головного мозга, т.е. параллельно сетчаточных поверхности и следует в промежуток времени визуализации каждые 3 минуты для 8 h с помощью 20 x / 0,85 NA воздуха Цель (расширенного коробки, C-F). Нейрон изначально отображает удлиненные клетки тела (открытые стрелка) в процессе nucleokinesis (C), а также конечные процесса (белая стрелка) и разветвленной ведущих процесса (белые стрелки). После 3 h live-образов nucleokinesis завершена, завершающие процесс втянут и ведущий процесс расширения две длинные ветви (D, белые стрелки). После 5 ч 30 мин один из ведущих ветвь процесса убирается (белые стрелки) и клеток тело нейрона (открытые стрелка) переместился вперед около 10 мкм (E). Наконец, после 8 h изображений, миграция приостановлена, нейрон расширила свой ведущий процесс снова и завершающие процесс появился (белая стрелка), но ядро (открытые стрелка) еще не переехали вперед (F). Масштаб бары: 250 мкм (A), 70 мкм (B) и 30 мкм (C-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: покадровый изображений INs производным от MGE экспланта культивировали в течение 48 ч. INs видны мигрируют из МГЕ экспланта, полученные из Nkx2.1КРР; RCEEGFP мышь (в которой все МГЕ производные INs выразить eGFP) electroporated с CMV::mCherry-LifeAct-7 плазмида в e13.5, с помощью метода адаптированный Майерс et al. 201353 и схематизируются в Рисунок 1 c, и культивировали в течение 48 ч (A). Модули были визуализируется с использованием промежуток времени жить визуализации для 5 h (B-E). В этом примере один совместно выражая eGFP и LifeAct изначально рассматривается в процессе nucleokinesis (открытые стрелка) и расширяет два ведущих процесс отделения (белые стрелки; B). это в завершении nucleokinesis после 1 h (см. открытые стрелка), как тело клетки продвинулось вперед и завершающие процесс появился в задней части тела клеток (белая стрелка) и по-прежнему отображается один ведущий процесс с двумя ответвлениями (белые стрелки; C). второй nucleokinesis в настоящее время после 2 ч 30 мин (открытые стрелки) и в настоящее время наделены два ведущих процессов, происходящих из тела клетки и больше конечные процесса (белая стрелка; D). Наконец, после 5 h, в убирается один neurite при translocating центросом в оставшихся ведущих процесс ветви (белая стрелка) в рамках подготовки к третьей nucleokinesis, с трейлинг процесса (белая стрелка), еще присутствует в задней части Келейный корпус (E). Масштаб бары: 70 мкм (A) и 20 мкм (B-E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: с высоким разрешением покадровой изображение актина реконструкции в Син от MGE экспланта культивированный за 48 ч. а. Фрагмент organotypic от Nkx2.1КРР; RCEEGFP мозг мыши установлен в e15.5, окрашенных с Alexa-594 Фаллоидин, позволяя для визуализации нитчатые актина. INs отражаются с помощью 63 x / 1,3 NA нефти цель на конфокального микроскопа. В здоровых INs, нитчатые актина рассматривается купирования задней части тела клетки после втягивания конечные процесса после завершения nucleokinesis (белая стрелка, A'-A'' '). B. экспланта МГЕ как выше получается из Nkx2.1КРР; RCEEGFP мозга мыши, перевозящих целевых удаление гена интереса и electroporated плазмиды, выражая mCherry-Lifeact-7 под контролем промотора ЦМВ . Покадровый прямом изображений выполняется после 48 ч культуры, и electroporated модули следуют каждые 3 минуты за 3 ч, с использованием 40 x / 0.85 воздушные цели. Активного ремоделирования Цитоскелет актина происходит в городе transfected с LifeAct, что подтверждается движение Красного цвета (белый в черно-белых изображений) люминесцентные точки в рамках ведущих процесса и роста шишки (белые стрелки) и на задней части клетки тела во время nucleokinesis (B-B'' ', белые стрелки). Масштаб бары: 7 мкм (A-A'' ') и 10 мкм (B-B'' '). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы предоставляем надежный метод для выполнения ex utero электропорации МГЕ мыши на e13.5 и для поколения organotypic культурах эмбриональных мозга фрагментов. Хотя в vitro методы, такие как Пробирная палата Бойден, сравнительно легко выполнить и могут быть использованы для оценки конкретной роли различных генов и белков без вмешательства других факторов, они исключают расследование в динамика миграции относительно направленности и миграции путь25. МГЕ эксплантов полезным средством для изучения динамических цитоскелета изменения, происходящие во время миграции, как мы показываем здесь, но они лишены самых эндогенного подсказки и часто требуют добавления указания подсказки для содействия миграции нейронов (хотя это существенно улучшена, когда МГЕ эксплантов культивированный на слоях коры фидер)25,54. Тем не менее анализы на основе МГЕ эксплантов может не обнаружить последствия молекулярных сигналов, участвующих в более тонкие механизмы, такие как эти руководящие конкретной направленности или миграции путь INs29. Эта проблема была в конечном итоге обойти, в утробе матери электропорации25, который позволяет для конкретных маркировки МГЕ производные INs миграции в их родной среде13,29,41. Однако что техника мастерство сложно, из-за хирургической процедуры, и его выход ограничивается низкой выживаемости эмбрионов и тот факт, что МГЕ трудно ориентироваться в утробе матери, часто требует использования нескольких пометов для достигать значение55. Таким образом бывший utero электропорации МГЕ следуют organotypic культуры мозга зародышей мыши обеспечивает лоу кост, время эффективный и надежный метод для изучения динамики миграции и морфология МГЕ производные INs в их естественном окружающей среды, во время обхода хирургических процедур в утробе матери электропорации и потребность в руководстве Кии в эксплантов MGE. Кроме того этот метод позволяет более легкий доступ к MGE, которые могут быть объектом непосредственно apposing положительный электрод под шею и отрицательные один на верхней части головы, конфигурации, более трудно принять в утробе матери. В качестве альтернативы можно централизовано вводят МГЕ и electroporated непосредственно после создания organotypic ломтиками13,25,29, но этот метод оказался более сложным и менее эффективной в наших руках описанные здесь, чем протокол. Выполнив шаги, описанные в этой статье, будут получать 50-100 electroporated МГЕ производные INs на organotypic срез, из которых 5-20 будет рассматриваться вскользь мигрируют из МГЕ после 72 ч. Transfected модули могут быть визуализированы жить с покадровой изображений или образ и восстановленный после фиксации и иммуногистохимической маркировки.

Протокол, описанные здесь был оптимизирован для изучения в миграции ex vivo и был вдохновлен различных опубликованных протоколов, описывая в утробе матери электропорации МГЕ производные INs, ex vivo МГЕ инъекций и электропорация, или поколение хронического organotypic мозга ломтик культур36,38,39,42,43,56,57,58. Наш подход ограничивает потенциальный ущерб для МГЕ прародителями ниже интенсивность импульсов (40 V) и внутрижелудочковое плазмида инъекции, а не внутри МГЕ инъекции с помощью высоковольтных импульсов (100 V), как описано в других разделах39,56 ,,5758. Кроме того в то время как другие используют сочетание пенициллин, стрептомицин и гентамицина для предотвращения бактериального загрязнения39,,5657,58, мы предпочли бы избежать антибиотики в нашей культуре среде, поскольку они теоретически могут повлиять на миграцию. В частности пенициллин является антагонистом ГАМК-А рецепторов59,60, и активация ГАМК-А рецепторов активирует и позднее останавливается в миграции от внутриклеточной хлорид градиентов и KCC2 выражение на различных этапах миграции61. Однако используя различные меры предосторожности, заявил в текущем протоколе, загрязнение может эффективно избежать даже в отсутствие антибиотиков.

Несмотря на эффективность этого подхода в наших руках бывший utero электропорации также имеет свои недостатки. Хотя обеспечение естественной трехмерной среде для клетки мигрировать, это может быть трудно выполнить фармакологических проб в organotypic ломтики в контексте миграции. Действительно миграция МГЕ производные INs в основном зависит от Кии внеклеточный2,13,19 и применение фармакологических ингибиторов или активаторы на organotypic ломтики не позволяют точное диссоциации клеток автономной эффектов от глобального воздействия на общее здоровье фрагмента или деятельности. Для таких экспериментов МГЕ эксплантов выросли за смешанных диссоциированных корковых клеток может быть предпочтительнее organotypic срез культур, так как модули, мигрирующих из эксплантов может быть более легко изолированных и выборочно воздействию конкретных соединений62. Кроме того хотя бывший utero электропорации легче выполнить, чем электропорации в утробе матери , она может быть технически сложным в эмбриональных возрастов, показанные здесь, учитывая небольшой размер и хрупкое состояние эмбриональных мозги на E13.5. Следователи потребуется несколько испытаний эффективно извлекать electroporated мозги на e13.5 без повреждения поверхности мозга. Кроме того в отличие от послеродового ломтиками, эмбриональных organotypic фрагменты нельзя держать в культуре более длительных периодов времени. Хотя эмбриональных organotypic срез культур могут храниться для по крайней мере 7 дней в vitro63, это было не в сочетании с электропорации и эксперименты, описанные здесь были протестированы на до 3 дней в пробирке с надежные результаты в наших руках. Таким образом следователи должны выполнить оптимизации тестов заранее, если требуется более длительное время инкубации. Кроме того, расследование в развитии на конце эмбриона или начале послеродового этапах не рекомендуется с этой техникой при использовании e13.5 эмбрионы25, но может быть достигнуто с электропорации в утробе матери , где успешно electroporated Эмбрионы помещаются обратно в полость матки и можно оставить родился и проанализированы на более поздних этапах21,64. Наконец бывший utero электропорации следуют organotypic срез культур позволяет для анализа как морфология и динамика миграции развивающихся модулей. Однако как это уже ранее отмечалось в утробе матери электропорации техника36, бывший utero electroporations дают 50-100 electoporated клеток на срез мозга и таким образом не подходит для демографического анализа. Такие расследования проводятся лучше на животных моделях, перевозящих полное или условное удаления (или забивные) гена интереса. При наличии, такие модели можно эффективно используется для создания organotypic срез культур или МГЕ эксплантах для визуализации фактической динамики миграции, как показано ниже (см. Рисунок 5 и рис. 6).

Многие шаги в этом протоколе должны осуществляться тщательно для того чтобы получить оптимальные результаты. Например это изначальное, что все шаги выполняются в строгих условиях стерильности, как загрязнение может происходить довольно легко. Перчатки и инструменты, используемые за пределами кабинета биобезопасности следует быть распылен с 70% этанол часто во время всей процедуры. Кроме того, решения, такие как культура СМИ и искусственных спинномозговой жидкости должны храниться стерильные и холодной (4 ° C) и сделал свежий каждые 2-3 недели. Более конкретно маркировать МГЕ производные INs, плазмиды, которые будут использоваться в таких экспериментов следует клонирован под контролем IN-конкретной промоутера (ex: Dlx5/649, Lhx665), а не просто полагаться на анатомические нападения на MGE. Поколение organotypic ломтиками требует мозг, чтобы остаться в живых. Таким образом сохранить здоровье клеток и выживания, этот эксперимент должен проводиться в менее чем 3 часов с момента извлечения эмбрионов до тех пор, пока organotypic фрагментов помещаются в культуре. Время-эффективность культура пластины могут быть предварительно заполнены с домашним культуры среднего незадолго до начала эксперимента и положить в инкубатор культуры клеток 37 ° C до использования. Кроме того мозг должен тщательно расчлененный из черепа без повреждения поверхности коры для достижения надлежащего внедрения в агарозном решения и последующего vibratome резании. Например повреждение поверхности коры, даже минимальные, может привести в отряд секции 250 мкм толщиной от окружающих геля агарозы или деградации секций при резании vibratome. Для выживаемость нейронов, это также важно, что температура раствора агарозы остается недалеко от 42 ° C, как более высокие температуры приводят к смерти повреждения и клеток ткани, тогда как низкие температуры будет препятствовать надлежащего внедрения мозга (или повредить его во время внедрение процесса). Однажды в культуре, чтобы избежать других источников загрязнения, срезы должны не манипулировать до тех пор, пока они передаются микроскоп для изображений. Эти шаги должны осуществляться в среде стерилизованные и внимание должно уделяться не загрязнять пластины после этих манипуляций, особенно если они должны положить обратно в культуре для последующих повторно изображений. Наконец мы не рекомендуем выздоравливает ДНК Алиготе смешанного с загрузкой краска от предыдущих экспериментов для использования в будущем, как мы наблюдали значительное сокращение урожайности electroporated нейронов с таким материалом.

В заключение, ex utero электропорации и organotypic срез культуры протокол описанные выше позволяет для конкретных маркировки МГЕ производные INs на уровне одной ячейки и может использоваться для генетически манипулировать конкретные молекулярные пути изучить их роль в регулировании морфологических изменений и динамика миграции вскользь перенос INs. Этот метод позволяет для быстрого и лоу кост раннего функционального расследования Роман кандидат генов определены через одну ячейку РНК последовательности мигрирующих INs66,67 или следующего поколения последовательности пациентов с неврологического расстройства,6869,70. Этот метод широко применяется для изучения миграции в других клеточных популяций, включая пирамидных клеток в коре головного мозга и гиппокампе70,,7172,73. Как только освоил, он потенциально может использоваться для изображения переработка и оборот мембранных белков, таких как рецепторы и каналы с использованием GFP-тегами белков; Активация определенных клеточных сигналов каскады, используя биодатчики74; или даже мониторинг и манипуляции с использованием визуализации кальция в сочетании с Оптогенетика в корковых модулей, но и в других областях мозга, например, гиппокамп, миндалина или даже стриатума клеточной активности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать. Мнения, высказанные здесь не обязательно отражают точку зрения министра здравоохранения или правительство Канады.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана операционной гранты от Фонда Savoy и лечения эпилепсии Фонда и оборудованием гранты от Канадского фонда для инноваций E.R (Конфокальный микроскоп) и G.H (вращение диска конфокального микроскопа). Е.р. получает премию карьеры от Fonds de recherche дю Квебек-Santé (FRQ-S; Премия Clinician-Scientist) также, как от канадской институтов для медицинских исследований (КНИИЗ; Молодой следователь Award). Г.Х. — старший ученый FRQ-S. ЕГ.Ф является получателем Steriade-Savoy докторантура награду от Фонда Savoy, Чу Сент-Жюстин фонд докторантура премии и премии докторантура FRQ-S, в партнерстве с Фондом звёзд. Этот проект стал возможным мозга Канады через Фонд исследований мозга Канады, при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Канады, присуждена л.е.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325 (2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834 (2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031 (2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897 (2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

Tags

Нейронауки выпуск 134 развитие мозга конфокальная микроскопия корковых ГАМК интернейронов e13.5 эмбриона электропорация репрессии гена мышь нейронной миграции organotypic культура РНК-интерференции тангенциальная миграции промежуток времени Обработка изображений
<em>Ex-Utero</em> Электропорация и Organotypic срез культуры мозги эмбриона мыши Live-образов миграции интернейронов ГАМК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G.,… More

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter