Summary
Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.
Abstract
Interneurones GABAergiques (INs) sont des composantes essentielles des réseaux neurones qui animent la cognition et le comportement. INs destiné à alimenter le cortex migrent tangentiellement depuis leur lieu d’origine dans le télencéphale ventral (y compris des éminences ganglionnaires médiales et caudales (MGE, CGE)) à la plaque corticale dorsale en réponse à une variété d’intrinsèques et extrinsèques indices. Différentes méthodes ont été développées au cours des années à manipuler des voies spécifiques et étudier comment ils règlent les changements cytosquelettiques dynamiques requis pour la bonne génétiquement en migration. In utero électroporation a été largement utilisée pour étudier l’effet de la répression génique ou des sous-types de surexpression à IN spécifique tout en évaluant l’impact sur la morphologie et position finale. Cependant, alors que cette approche est facilement permettant de modifier les cellules pyramidales radialement migration, il est techniquement plus difficile lorsque Assur In utero électroporation de ciblage génère un rendement faible, étant donné les taux de diminution de la survie des petits lorsque électroporation a lieu avant la e14.5, comme d’habitude lorsque l'on étudie les INs dérivé de MGE. Dans une approche alternative, MGE explants permettent d’accéder facilement à la MGE et facilitent l’imagerie des INs génétiquement modifiés. Toutefois, dans ces explants, INs migrer dans une matrice artificielle, dépourvu de repères d’orientation endogène et thalamiques entrées. Cela nous a amenés à optimiser une méthode où les INs peuvent migrer dans un environnement plus naturaliste, tout en contournant les défis techniques de in utero des approches. Dans cet article, nous décrivons la combinaison de l’ex utero électroporation de cerveaux de souris embryonnaire suivie organotypiques facilement la voie ferrée, image et reconstruire génétiquement modifiés INs migrant le long de leur parcours naturels en réponse à signaux endogènes. Cette approche permet pour les deux la quantification des aspects dynamiques de migration avec l’imagerie confocale Time-lapse, ainsi que l’analyse détaillée des différents paramètres morphologiques à l’aide de reconstitutions neuronales sur les tissus immunomarquées fixe.
Introduction
Corticales interneurones GABAergiques (INs) sont diverses en ce qui concerne leurs propriétés biochimiques, connectivité et les propriétés physiologiques et ils véhiculent des fonctions différentes dans des réseaux matures1,2,3 ,4,5. La spécification de différents sous-types des INs corticale est étroitement contrôlée par le biais de cascades génétiques qui ont été étudiés1,2. La majorité (70 %) des corticales GABAergic INs proviennent de géniteurs dans l’éminence ganglionnaire médial (MGE), une structure embryonnaire située sur le ventre et doit migrer sur des distances relativement longues pour atteindre la plaque corticale1, 2 , 6. tandis que les cellules pyramidales corticales migrent radialement de la zone ventriculaire (VZ) à la plaque corticale le long de l’échafaudage de la glie radiale, la migration tangentielle de l’INs, qui ne sont pas attachés à un tel échafaudage, exige une variété d’intrinsèque et signaux extrinsèques pour attirer la migration des neurones vers la plaque corticale, tout en guidant des structures corticales non2,7,8. Après la sortie du cycle cellulaire, INs sont repoussés de la MGE par chimio-répulsive repères exprimées au sein de la VZ de la MGE, qui déclenche la migration tangentielle vers la plaque corticale9,10. La migration INs éviter le striatum avec l’aide de différents indices répulsive11 et, après avoir atteint la plaque corticale, ils passer d’une tangente à un mode de migration radial et atteint leur position finale laminaire, en partie en réponse aux signaux du pyramidal les cellules12 et autres populations cellulaires13. La migration de l’INs, en ce qui concerne les autres populations neuronales, implique divers changements morphologiques dynamiques afin de permettre le mouvement réel du neurone. Ce que l'on appelle locomotion neuronale est caractérisée par des cycles répétitifs de trois étapes successives : l’allongement d’un processus de premier plan, un mouvement actif antérograde du noyau (nucleokinesis) et la rétraction de la fin du processus14. EN migration est réglementée par les nombreux signaux intrinsèques et extrinsèques qui alimentent la ramification et remodelage actif du processus de premier plan pour guider l’INs dans le bon sens, déterminer l’orientation et vitesse de migration14,15 ,,16.
Les déterminants de la régulation corticale en migration ont été largement étudiées ces dernières années1,2,7,17,18,19,20, et perturbation dans certains de ces acteurs moléculaires a été postulée à conduire à des troubles du développement neurologique, comme pédiatrique réfractaires épilepsie ou l’autisme du spectre des troubles1,2,21, 22 , 23 , 24. par conséquent, le développement de diverses approches in vitro et in vivo a été poursuivi pour faire avancer notre capacité à étudier ce processus dynamique, comme précédemment examiné25. Méthodes in vitro , y compris le test de chambre de Boyden et le test de choix Stripe, fournissent le moyen le plus rapide et plus reproductible d’évaluer le besoin et l’impact cellules autonomes de certains gènes ou de protéines au cours de la migration neuronale, sans l’influence d’autres facteurs25. Ces analyses sont particulièrement utiles lorsqu’il est combiné avec l’imagerie live8,26,27. Avec ces techniques, INs sont facilement Récupérée de e13.5 MGE et isolé par une dissociation enzymatique et mécanique, après quoi les différentes voies de signalisation et signaux de guidage peuvent être étudiées, tel qu’illustré précédemment8,28 . Cependant, ces essais ont lieu dans une matrice extracellulaire artificielle en l’absence d’architecture tissulaire en trois dimensions, qui peut modifier les propriétés neuronales de comportement et de la cellule, susceptibles d’influer sur cell migration et/ou survie25. Pour contourner ces limitations, les explants MGE ex vivo ont été développés comme outil de rechange pour quantifier les modifications morphologiques dynamiques survenant au cours de la migration ainsi que des paramètres tels que la vitesse et l’orientation14, 29. Génération d’explants de MGE est relativement simple et a été abondamment décrit ailleurs30. Elle implique le bordé d’un petit extrait de la MGE sur une monocouche de cellules corticales mixtes ou dans un mélange de matrigel et collagène en présence de signaux attractives ou répulsives25, même si ces derniers sont optionnels31. Des explants MGE permettant de haute résolution d’imagerie de cellules peu marquées, de simplifier l’étude des processus intracellulaires, comme le remodelage du cytosquelette durant les principaux processus de ramification, comme indiqué précédemment32,33 ,34 et dans la présente étude. MGE explants ont été utilisés avec succès pour évaluer les changements cytosquelettiques dynamiques lors de migration dans un environnement 2D, par exemple après des manipulations pharmacologiques ou chimiotactiques spécifiques (voir, par exemple, Tielens al 201633) . Cependant, avec cette approche, INs migrent au sein d’une matrice artificielle, et cela pourrait changer dans le comportement et la reproductibilité et la signification des résultats expérimentaux.
En revanche, dans l’utérus électroporation permet la manipulation génétique des INs dans leur milieu d’origine et est une méthode largement utilisée d’évaluer rapidement et efficacement l’impact du gain et la perte de la fonction du gène tout en contournant les limitations de knockout coûteuse et chronophage et knock-in stratégies25,35. In utero électroporation peut être biaisée vers en cellules souches à l’aide de promoteurs spécifiques de type cellulaire et en positionnant les électrodes vers des structures ventromédian, y compris le MGE36. En outre, dans l’utérus électroporation permet l’expression opportune de constructions expérimentales dans les 1-2 jours, comparativement aux 7-10 jours requis pour construire l’expression utilisant virale vecteurs25. Toutefois, dans l’utérus électroporation d’en progéniteurs tend à être de faible rendement. En effet, bien que les progéniteurs de cellule pyramidale situées dans la zone ventriculaire dorsale peuvent être efficacement transfectées utilisant in utero électroporation, ciblage des structures plus ventralement situés, comme le MGE, est techniquement plus difficile, surtout dans les petites e13.5 embryons et le taux de létalité embryonnaire plus élevé réduit le rendement expérimental25.
Pour contourner certaines limitations techniques associées en vitro MGE explantation des expériences et en vivo in utero électroporation, ex vivo organotypiques ont été développés8,37, 38,39. Cerveau organotypique tranche cultures offre l’avantage d’imiter en vivo les conditions, tout en étant moins long et coûteux que les modèles de production animaux25. En effet, ces préparations permettent un accès facile à la MGE, ainsi que la visualisation spécifique de l’INs et peuvent être combinées avec focale électroporation pour étudier les voies moléculaires spécifiques dans INs migration dans un plus physiologique environnement8 , 39 , 40 , 41. nous avons donc optimisé une approche pour organotypique cultures38, dont nous avons combiné avec l’ex utero électroporation et Time-lapse imagerie confocale, afin d’évaluer les processus morphologiques et dynamiques survenant au cours de la migration tangentielle de MGE-INs. Le présent protocole a été adapté et optimisé d’autres personnes qui ont utilisé des ex utero ou in utero cerveau électroporation organotypique tranche cultures et d’étudier la migration des cellules pyramidales42,43 et corticale INs36,39,44. Plus précisément, des embryons de souris sont décapités et la MGE est électroporation ex vivo après l’injection intraventriculaire des plasmides expérimentales, permettant aux plus précis et efficace ciblant des progéniteurs MGE que ce qui peut être réalisé avec dans l’utérus électroporation. Les cerveaux sont ensuite extraites et sectionnées en tranches coronale de cerveau entier qui peuvent être mis en culture pendant quelques jours, permettant ainsi continu de suivi et d’imagerie ins transfectées. Cette approche étiquettes généralement 5 à 20 tangentiellement migration INs par tranche de cerveau, réduisant au minimum le nombre d’itérations expérimentales nécessaires pour atteindre la signification statistique, tandis que l’étiquetage d’une population neuronale suffisamment rares pour assurer une séparation facile des neurones individuels pour la reconstruction et l’évaluation morphologique fine. En outre, par rapport à des explants MGE, culture organotypique assurer cette migration INs sont exposés à un environnement plus naturel, y compris les chimiokines sécrétée localement et contributions des afférences thalamiques. Cette approche est donc bien adaptée pour quantifier la directivité et la voie de migration adopté par INs transfectées, tout en offrant des détails anatomiques suffisantes pour permettre la caractérisation des processus dynamiques plus fines comme les principaux processus de branchement, nucleokinesis et rétraction fin de processus.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) au centre de recherche CHU Sainte-Justine et ont été menées selon le Conseil canadien sur le guide de protection des animaux à le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation (2e édition).
Le protocole décrit ici a été optimisé pour l’électroporation des embryons à jour embryonnaire (e) 13,5, à la fois lorsque INs dérivé de MGE sont activement généré, avant le pic de CGE-dérivé INs production45,46. En outre, pour biaiser l’électroporation vers GABAergic INs, nous utilisons un promoteur sélectivement exprimé en INs (par exemple le promoteur Dlx5/6 avec ses enhancer minime)47.
1. préparation des Solutions d’électroporation et culture organotypique tranche
- Préparer 125 mL de milieu de culture stérile.
- Mesurer les 125 mL de milieu de culture de neurone-spécifique régulière (voir Table des matières pour la formulation) dans une bouteille stérilisée dans un biosafety préalablement stérilisés UV armoire pulvérisé avec l’éthanol à 70 %. Ajouter 2,25 mL de 50 x Supplément de neurone-spécifique au milieu sans sérum, 1,75 mL de 200mM de glutamine (concentration finale de 0,5 mM) et 6,25 mL de sérum de cheval inactivés par la chaleur déjà aliquoté dans des conditions stériles. Mélanger soigneusement, partie aliquote dans 15 mL tubes coniques stériles et conserver à 4 ° C.
Remarque : Milieu de culture préparé peuvent être stocké pendant 3 semaines à 4 ° C. - Diviser un 100 X solution de N-2 formulation48 de Botteinstein 150 µL d’extraits dans des conditions stériles et congeler à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Mesurer les 125 mL de milieu de culture de neurone-spécifique régulière (voir Table des matières pour la formulation) dans une bouteille stérilisée dans un biosafety préalablement stérilisés UV armoire pulvérisé avec l’éthanol à 70 %. Ajouter 2,25 mL de 50 x Supplément de neurone-spécifique au milieu sans sérum, 1,75 mL de 200mM de glutamine (concentration finale de 0,5 mM) et 6,25 mL de sérum de cheval inactivés par la chaleur déjà aliquoté dans des conditions stériles. Mélanger soigneusement, partie aliquote dans 15 mL tubes coniques stériles et conserver à 4 ° C.
- Préparer 1 L de stérile artificiel liquide céphalo-rachidien (ACSF).
- Mesure 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 L. Ajouter 25,67 g de saccharose, de 5,08 g de chlorure de sodium (NaCl), de 2,18 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 1,80 g de glucose, 0,19 g de chlorure de potassium (KCl), 0,15 g de phosphate monobasique de sodium anhydre (NaH2PO4), 1 mL de 1 M stock ACIC2 .2H2O et 2 mL de 1 M en stock MgSO4.7H2O. remuer pour dissoudre à température ambiante. Ajouter de l’eau distillée pour atteindre un volume total de 1 L.
- À l’aide d’un filtre de 0,22 µm, filtrer la solution dans un flacon stérile dans une armoire de biosécurité stérilisé et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
- Préparer une nouvelle solution de 4 % d’agarose dans FSCA avant chaque expérience.
- 25 ml de FSCA préalablement préparée dans un tube conique stérile de 50 mL et ajouter 1 g d’agarose de point bas point de fusion.
- Chauffer pendant 45 s dans un four à micro-ondes. Pour éviter tout déversement, interrompre toutes les 3-4 s de chauffage lorsque l’ébullition commence, ouvrez le tube pour laisser la pression sortir, refermer le flacon et agiter manuellement pour mélanger le gel d’agarose. Répétez jusqu'à ce que la solution de gel d’agarose est homogène. Conserver la solution de gel d’agarose à 42 ° C pendant le reste de l’expérience afin d’éviter la solidification.
Remarque : Des températures plus élevées endommageront les tissus du cerveau.
2. préparation des plasmides pour Injection
- Tirez une pipette de micro-injection de verre
- Définir les micropipettes avec les paramètres appropriés, d’assurer le capillaire de verre dans l’espace fourni et assurez-vous qu’il soit centré avec le filament.
- Appuyez sur le bouton de la traction.
- Retirer délicatement les pipettes de micro-injection nouvellement formées de l’extracteur de chaleur et les place dans une zone ou une boîte de Petri propre jusqu'à l’utilisation supplémentaire pour éviter d’endommager l’extrémité.
- Set-up de la biosécurité en coffret avec tous les instruments nécessaires pour cela expérimenter (voir Figure 1 a), vaporiser généreusement tous les instruments dans la prévention des risques biotechnologiques armoire avec 70 % d’éthanol et stériliser les instruments et l’environnement avec la lumière UV pendant 15-20 min.
- Au cours de l’étape de stérilisation, décongelez les plasmides sur glace (4 ° C).
- Mesurer 10 µL du plasmide d’une solution mère (4 µg/µL) dans un tube à centrifuger propre de 1,5 mL. Ajouter 0,01 % de vert rapide FCF. Mélanger doucement, tourner brièvement et rester sur la glace jusqu'à utilisation.
NOTE : Maxi-prep ADN doit être préparé selon le protocole du fabricant à l’aide d’un kit maxi-prep exempte d’endotoxine. L’ADN peut être solubilisée dans un tampon TE ou sans nucléase H2O et la préparation du plasmide avec la solution de colorant peut, mais ne doivent ne pas être exécutées dans des conditions stériles. Plasmides de Maxi-prep doivent être aliquotés afin d’éviter de multiples cycles de gel-dégel. Les plasmides aliquotés ne doivent être mélangés avec le colorant, aucun plus que 2 h avant utilisation et ne devraient pas être recongelés pour une utilisation ultérieure. - Après stérilisation, préparer le nano-injecteur comme suit.
- Choisissez l’une de la pipette de micro-injection verre préalablement stockée dans une boîte propre ou la boîte de Pétri et l’utilisation de petites pinces pour couper l’embout de la pipette d’une manière biseautée pour atteindre un diamètre extérieur d’environ 15 µm.
NOTE : Le diamètre extérieur donné ici est une mesure approximative à donner à l’utilisateur une idée de ce que nous utilisons dans nos expériences et a été optimisé afin de faciliter la perforation du crâne pour injection de plasmide sans endommager le cerveau, tout en tenant compte du fluide chargement et la libération de l’ADN. Le diamètre extérieur peut être mesuré en regardant le bout coupé de la pipette de micro-injection de verre apposée à une barre d’échelle micrométrique sous un microscope à champ lumineux. - Utiliser une seringue pour remplir la micropipette avec huile minérale de son extrémité unpulled (pour expulser tout l’air).
- Insérer une micropipette de fibre de verre chargé dans le nano-injecteur en suivant les instructions du fabricant.
- Vide les 2/3 de la micropipette de verre (en gardant suffisamment d’huile pour empêcher l’entrée d’air).
- Choisissez l’une de la pipette de micro-injection verre préalablement stockée dans une boîte propre ou la boîte de Pétri et l’utilisation de petites pinces pour couper l’embout de la pipette d’une manière biseautée pour atteindre un diamètre extérieur d’environ 15 µm.
- Soigneusement insérer une micropipette préparée dans le tube contenant la solution de plasmide/colorant et remplir la verre de micropipette avec la solution de plasmide/colorant.
3. la collecte d’embryons de souris femelles enceintes
- Surveiller les femelles reproductrices quotidiennement à évaluer pour brancher vaginale, préférablement en même temps tous les jours (début d’après-midi). Journée e0.5 correspond au premier jour quand on observe un plug vaginal.
Remarque : Les expériences décrites ici peuvent être menées chez les souris de type sauvage. Toutefois, pour faciliter l’identification de la MGE et de les étiqueter tous les GABAergic INs (ou sous-ensembles spécifiques tels que les dérivés de MGE INs), les animaux transgéniques peuvent être utilisés (p. ex. : GAD67EGFP; Dlx5/6Cre avec un allèle de Cre-journaliste, etc.47,49). Dans cette situation, le plasmide expérimental injecté doit exprimer une autre fluorophore (par exemple mCherry ou TdTomato) pour permettre la visualisation de l’INs transfectées (jaune) qui peut être comparé avec les INs non transfectées (vert). - Sacrifier la femelle à jour embryonnaire e13.5, de la dislocation du cou.
Remarque : Les agents anesthésiques données au moment du sacrifice peuvent avoir un impact dans la migration et la survie de50,51 et devraient être évitées. - Recueillir des embryons par césarienne comme suit.
- Pulvérisez généreusement l’abdomen femelle avec l’éthanol à 70 %. Tirez la peau abdominale avec une paire de pinces stérilisées et, avec l’autre main, utiliser des ciseaux chirurgicaux stérilisés pour couper la peau de l’abdomen.
- Avec une deuxième paire de ciseaux et pinces stérilisées, tirer l’aponévrose abdominale et coupez-le en évitant soigneusement l’utérus.
- À l’aide d’une troisième paire de ciseaux et pinces stérilisées, tirez les cornes utérines et coupez-les dans la cavité pelvienne. Placer les cornes utérines disséqués dans un 60 mm boîte de petri stérile, rempli de milieu de culture axée sur les neurones additionné d’acides aminés, de vitamines et de sels inorganiques (voir Table des matières pour les produits disponibles dans le commerce).
- Dans une armoire de biosécurité stérile, utiliser deux paires de pinces fines (un dans chaque main) de disséquer les embryons dans le placenta et isoler les têtes par décapitation.
- Coupe en biseau l’extrémité de la pipette de transfert en plastique stérile de 3 mL, aspirer les têtes et transfert dans un nouveau 60 mm boîte de petri stérile en couches avec de la cire noire solidifiée et rempli de la même base neurale complétée de milieu de culture comme ci-dessus.
Remarque : Cette étape minimise le transfert de contaminants (souris cheveux, sang). La cire noire sert à stabiliser la tête au cours de la dissection. Milieux de culture n’avez pas besoin d’être oxygénée au cours de ces procédures.
4. intraventriculaire plasmide Injections et électroporation Ex Vivo de la MGE
Remarque : Les étapes suivantes doivent être exécutés dans des conditions stériles dans l’armoire de biosécurité préalablement préparée.
- Place le plat de Pétri de 60 mm en couches avec de la cire noire et contenant les têtes décapitées dans axée sur les neurones complétée milieu de culture sous les jumelles dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
- Stabiliser la tête, la partie rostrale orienté vers la droite, avec des pinces fines avec la main gauche et utilisez le nano-dans la main droite pour injecter 1-2 µL de la solution de plasmide/colorant dans le ventricule latéral droit.
Remarque : Les expériences de co-expression peuvent être dispensés par un co-electroporating un plasmide de sauvetage et un plasmide exprimant le shARN en mélangeant les deux plasmides à concentration équimolaire. - Electroporate le cerveau injecté.
- Placez la tête entre les électrodes avec l’électrode négative placée sur le dos et parallèle à la tête et l’électrode positive vers la face ventrale de la tête pour cibler la MGE.
- Une fois que les électrodes sont bien placés, livrer 4 impulsions carrées de 40 V pour 50 ms à 500 ms intervalles inter impulsions.
- Supprimer n’importe quel tissu résiduel des électrodes à l’aide de pincettes déjà placé dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
Remarque : Ces paramètres ont été optimisées spécialement pour l’électroporateur utilisé dans nos expériences. Nous recommandons que les utilisateurs exécuter optimisation des tests au préalable si vous utilisez un autre type d’électroporateur. - Répétez les étapes 4.1 à 4.3 pour tous les autres cerveaux.
Remarque : Bien que ce protocole décrit les manipulations requises pour un cerveau, il est possible d’injecter jusqu'à 4 cerveaux séquentiellement avant electroporating chaque cerveau, augmentant ainsi le rendement. Cette stratégie est particulièrement avantageuse lorsque 2 ou plusieurs différents plasmides sont injectées dans l’ordre (p. ex. contrôle ou plasmide expérimental) au cours de la même expérience (permettant une comparaison entre autres). En outre, il est possible d’injecter et d’oligonucléotides simultanément les deux côtés du cerveau pour augmenter le rendement, en positionnant les électrodes complètement parallèle à la surface du cerveau.
5. Dissection et culture organotypique tranche de cerveau
- Tout en manipulant encore dans l’environnement stérile de la biosécurité du cabinet, disséquer le cerveau dans le crâne.
- Stabiliser la tête sur la couche de cire noire en insérant une aiguille dans chaque œil, tout en évitant soigneusement le cerveau.
- Utilisez une paire de pinces fines pour contenir le côté gauche du cou et une deuxième paire de pinces fines à déchirer la peau sur le crâne de l’arrière vers l’avant.
- Tout en maintenant la tête latéralement avec la pince à épiler dans une main, utiliser une autre paire de pinces à épiler dans l’autre main pour couper soigneusement le crâne au niveau du tronc cérébral et tirez doucement le crâne. Avec chaque pince, coupez le crâne dans le plan sagittal (ligne médiane) vers l’avant et puis incise latéralement pour libérer les fragments de crâne.
- Soulever le tronc cérébral et découpez soigneusement les méninges et les nerfs crâniens, jusqu'à ce que le cerveau est complètement hors du crâne.
Remarque : Toutes les étapes décrites au point 5.1 doivent être effectués sous strictes conditions stériles dans une armoire de sécurité biologique.
- Incorporez le cerveau dans 4 % bas point de fusion point d’agarose pour le sectionnement.
- Remplir un 35 mm boîte de Pétri avec la solution de gel d’agarose préparée ci-dessus (liquide maintenu à 42 ° C).
- Transférer rapidement un cerveau d’électroporation vers le récipient d’agarose à l’aide de la pipette de transfert précédemment coupé. Garder le plat à température ambiante.
- Remuer l’agarose avec un bâton de métal pour garder le cerveau au milieu du puits (pour éviter le naufrage) et positionner le cerveau dans un plan rostro-caudal parallèle au plat. Arrêter en remuant quand l’agarose commence à se solidifier, pour éviter des dommages de cerveau.
- Utiliser une lame de rasoir pour couper l’agarose entourant le cerveau afin de former un bloc rectangulaire, laissant une marge de 1-2 millimètres autour du cerveau. Veiller à ce que la partie rostrale du cerveau est perpendiculaire à la limite antérieure du bloc pour faciliter l’orientation pour les étapes ultérieures de sectionnement.
- Répétez pour chaque cerveau.
Remarque : Il est possible de couper plus d’un cerveau à la fois (3 maximum) en formant des blocs distincts d’agarose lors de la définition de chaque cerveau à différentes hauteurs.
- Vibratome sections coronales et la culture de la tranche.
- Une aliquote de dégel de 100 X N-2 Supplément (150 µL) sur la glace et ajouter 15 mL aliquotés milieu de culture en conditions stériles.
- Transférer 750 µL de milieu de culture (avec 1 X N2 supplément) dans chaque puits d’une plaque de 6 puits culture.
- Avec la pincette courbée, placez un insert de culture cellulaire (30 mm de diamètre, 0,4 µm taille de pore, PTFE) dans chacun bien remplis de milieu.
- Remplir la baignoire vibratome avec FSCA continuellement oxygéné. Refroidir à 4 ° C avec de la glace autour de la baignoire, ou utiliser un vibratome réfrigéré.
- Régler la vitesse de vibratome à 0.150 mm/s et la fréquence de 80 Hertz.
- Coller le bloc d’agarose vibratome plate-forme, rostral pointe vers le bas et ventrale bord vers l’utilisateur.
- Couper le cerveau dans des sections coronales pour obtenir 250 µm d’épaisseur sections (à 4 ° C).
- Avec des spatules stérilisés, recueillir les sections 2-3 contenant la MGE et le lieu de toutes les sections du cerveau d’un animal sur une membrane unique de 30 mm insert, tout en évitant soigneusement les chevauchements entre les sections. Placer l’insertion dans un puits d’une plaque de 6 puits culture (contenant 750 µL de milieu de culture supplémenté, tel que décrit ci-dessus). Par ailleurs, chaque section peut être placée sur une membrane distincte 13 mm de diamètre dans une plaque de culture de 12 puits remplie de 500 µl complétée de milieu de culture. La quantité de milieu de culture recommandé pour chaque puits permet les sections du cerveau à être nourrie par les médias sans être submergés.
Remarque : Les étapes décrites dans 5.3.6 et 5.3.7 ne sont pas effectués dans des conditions stériles complets, à moins que le vibratome peut être stérilisé et utilisé dans une armoire de sécurité biologique. Par conséquent, il est crucial d’effectuer ces étapes avec soin pour éviter toute contamination. Équipement de protection approprié (propre masque, gants et blouse de laboratoire) doit être porté en tout temps et parties du corps, même couverts, comme les cheveux, visage et les mains, ne doivent jamais passer au-dessus des plaques de culture (avec ou sans milieu de culture). Il est également recommandé de pulvériser 70 % éthanol fréquemment sur les gants et les spatules utilisés pour collecter les sections du cerveau. - Placer la plaque de culture dans une étuve ventilée stérile à 37 ° C, avec 60 % d’humidité et 5 % de CO2 pour 48 ou 72 h.
NOTE : Ces périodes d’incubation ont été optimisées pour l’imagerie Time-lapse de dérivés de MGE INs et imagerie confocale des tranches fixes, respectivement. Temps d’incubation optimale doivent être testés au préalable pour chaque protocole expérimental. En outre, si l’incubation choisie est de 72 heures et moins, il n’y a pas lieu de modifier le milieu de culture. Pour plus longues périodes d’incubation, le milieu de culture doit être changé tous les 2-3 jours. - Après le temps d’incubation désiré, transférer les sections d’intérêt à une lamelle 8 cavités et ajouter 3-5 µL de milieu de culture. Place le couvre-objet dans une chambre (37 ° C, humidité de 60 %, 5 % de CO2) connecté à un inversé tourne disque confocal équipé d’un logiciel d’acquisition assistée par ordinateur de mettre en place la Time-lapse séance d’imagerie.
NOTE : Alternativement, sections peuvent être fixées avec 4 % de paraformaldéhyde (une nuit à 4 ° C ou 2 h à température ambiante) et par la suite immunomarquage avec anticorps différents pour la visualisation des caractéristiques morphologiques d’électroporation INs sous un confocal microscope. Bien qu’eGFP et mCherry peuvent être visualisées par microscopie confocale sans aucune procédure Counter-coloration, nous recommandons de procéder immunohistochimie contre GFP et mCherry à améliorer le signal étant donné que le processus de fixation peut réduire de fluorescence, réduisant la détection de composants plus fines de neurones embryonnaires, comme les petites branches dans les processus de début ou de fin.
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Representative Results
Dans cette section, nous fournissons des résultats représentatifs obtenus suite à l’électroporation ex utero d’un plasmide de contrôle, ou d’un plasmide expérimental ciblant un gène d’intérêt, dans la MGE e13.5 d’embryons de souris suivie organotypiques incubé à 37 ° C pendant 48 h (pour l’imagerie Time-lapse) ou 72 h (pour fixation et marquage immunohistochimique) (voir Figure 1 b pour protocole schématique). Exemples représentatifs des INs migration à partir d’un explant MGE sont également illustré (voir Figure 1 pour protocole schématique) par comparaison à la méthode décrite ici. L’électroporation d’un plasmide dans les cellules souches MGE semble retarder la sortie des INs de la MGE et temps culturel doit être ajusté en conséquence.
Dans une expérience réussie, tranches organotypique apparemment en bonne santés sous le microscope confocal, couches c'est-à-dire corticales sont faciles à distinguer en utilisant le mode champ clair et il n’y a aucune contamination visible sur la surface de la tranche (reconnaissables par leur intense autofluorescence et la présence de filaments fluorescents visibles sous épifluorescence). En tranches organotypique chroniques sains, environ 20 % des cellules apoptose après 72 h de culture (Figure 2), comme décrit précédemment dans la chronique organotypique cultures (cultures par exemple postnatals)52. La structure du cerveau cytoarchitecturaux brut reste néanmoins bien définie, tel qu’illustré ici en utilisant DAPI coloration (Figure 2 a). Notre protocole pour ex vivo électroporation de la MGE donne une moyenne de 50 à 100 cellules transfectées par tranche (Figure 3 aB), de quelles cellules de 5 à 20 on le verra la migration sur le dos après 72 h en culture. Après fixation et coloration immunohistochimique, INs tangentiellement la migration vers la plaque corticale peut facilement être identifié avec la microscopie confocale car ils présentent un corps ovale/allongé de la cellule, le processus de fuite occasionnels et un processus principaux orientés tangentiellement. Habituellement, le principaux processus donne lieu à une ou deux branches et est reconnaissable par la présence d’un gonflement occasionnel devant le noyau (le centrosome avant nucleokinesis de logement) et les cônes de croissance à la fin de chaque branche. (Figure 3-G).
Ce protocole a été conçu pour l’observation des migrateurs INs MGE dérivés au niveau unicellulaire en imagerie en Time-lapse. Pour cette expérience particulière (Figure 4), tranches de cerveau organotypique coronale sont extraits de Dlx5/6Cre; RCEEGFP embryons électroporation à e13.5 avec un plasmide exprimant une shARN expérimentale (ciblant un gène d’intérêt) et la cassette de TdTomato . Les tranches ont été incubées pendant 48 h, transférés dans un plat de 8 puits lamelle couvre-objet (1 tranche par chambre flottante sur une mince couche de milieu supplémenté de culture) et image toutes les 3 minutes pendant 6 à 8 heures avec un objectif 20 x de l’air (0,70 NA) sur un microscope inversé équipé avec une tête confocal de disque de filature, un logiciel d’acquisition assistée par ordinateur et une chambre environnementale phase-haut. En imagerie, les tranches ont été maintenus à 37 ° C ont été constamment oxygénées et humidifiées dans la chambre (5 % de CO2 et 60 % H2O). Dérivé de MGE électroporation INs ont été identifiées comme telles par leur expression d’eGFP, confirmant leur identité en GABAergique et leur expression de TdTomato, confirmant qu’elles expriment le plasmide expérimental (Figure 4 aB). Electroporated INs sont facilement identifiables et bien isolées, comme illustré à la Figure 4, permettant l’analyse plus fine des paramètres dynamiques migratoires, tels que la vitesse et la distance parcourue. En outre, INs étiquetés sont vus tangentiellement la migration vers la plaque corticale, tandis que dans leur milieu naturel, nous permettant d’identifier les changements morphologiques dynamiques comme ramification du processus principaux et nucleokinesis (Figure 4 -F).
L’électroporation ex vivo des dérivés de MGE INs peut également être combinée avec MGE explants permettant l’imagerie à haute résolution des dynamiques du cytosquelette qui se produisent pendant la migration, comme un complément à l’étude de la dynamique migratoire et directionnalité en culture organotypique. À titre d’exemple, les différentes phases de la locomotion neuronale rappelant celles survenant au cours de la migration tangentielle des INs dans organotypiques peuvent être observées dans l’électroporation INs migration à partir d’un MGE explantation 48 h après l’électroporation, comme leader extension des neurites et nucleokinesis (Figure 5 b-E). Divers procédés du cytosquelette peuvent ensuite étudier à haute résolution dans des cellules isolées, migration à partir d’un explant MGE, par exemple par coloration des structures d’actine F avec la phalloïdine (Figure 6 a), qui ne peuvent être atteints de façon optimale en tranches organotypique compte tenu de la densité cellulaire élevée (et donc des éléments du cytosquelette) dans un environnement natif. Ces processus du cytosquelette, et en particulier actine F remodelage, peuvent encore être étudiés dynamiquement en combinant expression Lifeact avec l’imagerie Time-lapse. Par exemple, nous montrons un exemple d’imagerie à haute résolution de Time-lapse d’un dérivé d’un explant MGE obtenu à partir d’un Nkx2.1Cre; RCEEGFP cerveau de souris portant une suppression ciblée d’un gène d’intérêt dans le INs. Cette IN a été transfecté avec le plasmide mCherry-Lifeact-7 sous le contrôle du promoteur du CMV (cadeau de Michael Davidson), à l’aide de la méthode schématisée à la Figure 1, ce qui permet le suivi de l’actine F remodelage se produisant en temps réel (Figure 6 b). ainsi, tandis que la culture organotypique est nécessaires pour évaluer correctement la directionnalité ou migration chemin de INs génétiquement modifiés, MGE explants peuvent compléter ces études par un meilleur accès aux cellules isolées pour l’imagerie haute résolution de dynamiques du cytosquelette.
Écueils techniques peuvent entraîner l’échec des expériences décrites ci-dessus. Par exemple, incorporant le cerveau dans une solution d’agarose supérieure à 42 ° C peut entraîner la mort neuronale, révélée par une perte de transparence du cerveau ou de tranches, qui deviennent opaques et de destruction des tissus. Toutefois, la température ne devrait pas être maintenue trop faible, comme une solution de gel d’agarose solidification peut détruire le cerveau embryonnaire fragile au cours du processus d’incorporation. Deuxièmement, la contamination peut réduire considérablement le rendement des approches expérimentales décrites ici. Ainsi, toutes les étapes devraient être effectués avec soin, dans des conditions stériles rigoureuses autant que possibles. Toutes les solutions et les équipements doivent être stérilisés avant usage et équipement doit être fréquemment avec de l’éthanol 70 % pour éviter la contamination par des bactéries ou des moisissures. La contamination peut être visible directement dans les puits de culture, comme le milieu de culture devient jaune ou opaques. La contamination peut passer inaperçue lorsque le milieu de culture reste claire et fluide. Cependant, observe généralement une couche de moisissure à la surface de la tranche ou les tranches de devient excessivement fragiles lors de la fixation et coloration des étapes. Lorsque ces tranches sont visualisées sous le microscope, contamination peut-être se manifester comme une couche d’autofluorescence sur neurones marqués ou être révélée par la présence de filaments longs fluorescents. Organotypique tranches conservés dans des puits contaminés devront être jetés, mais les tranches cultivées dans les autres puits de la plaque même peuvent être maintenus pour les prochaines étapes. La contamination bactérienne est assez rare, mais doit être prise au sérieux, ce qui signifie que tout matériel, y compris les incubateurs partagées et salle de culture doit être manuellement nettoyé et stérilisé.
Figure 1 : Des représentations schématiques des protocoles pour l’ex utero électroporation suivie organotypique tranche culture ou MGE des explants. A. exemple d’une installation de prévention des risques biotechnologiques coffret avec tous les instruments stérilisés pour le protocole décrit ici. B. représentation schématique du protocole utilisé pour les cultures ex utero électroporation et organotypique tranche. En bref, les embryons sont décapités, le plasmide expérimental est injecté dans le ventricule latéral (1) et électroporation dans le MGE (2). Le cerveau est microdissected hors du crâne (3) et intégré dans l’agarose (4). Organotypique sections sont générées sur un vibratome (5) et mises en culture à 37 °C(6) pendant 48 h pour la microscopie Time-lapse (7.1) ou 72 h pour les reconstructions de cellule (7.2). C. représentation schématique du protocole adapté de Myers et coll. 201353 et utilisé pour la génération de MGE des explants. En bref, cortex dorsolatéral est tout d’abord disséqué sur de e12.5 à e14.5 des embryons de souris de type sauvage (1) et dissocié mécaniquement en milieu supplémenté de culture (2). Les cellules corticales sont plaqués avec une densité de 5,25 x 105 cellules corticales/cm2 et cultivées pendant 2 h à 37 ° C dans une lamelle de 8 cavités collagène/poly-L-lysine-enduit (3). Puis, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embryons sont traités pour l’ex utero électroporation de la MGE (4, 5), et la MGE est isolée du cerveau et coupé en fragments de2 100 µm (6) manuellement. Ces explants sont ensuite posés sur le dessus de la couche de conducteur de corticale préalablement préparée, recouvert de milieu de culture et co cultivés pendant 48 h avant l’imagerie Time-lapse (7). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : préservé cytoarchitecture en tranches saines organotypique. La génération d’organotypique tranche cultures après ex vivo électroporation de Nkx2.1Cre; RCEEGFP des embryons de souris (A) n’entraîne pas de dommages aux tissus significative, telle que révélée par cytoarchitecture préservé (DAPI (bleu) et Cre-reporter (GFP)), par rapport à un cryosection µm d’épaisseur 18 d’un Nkx2.1Cre; RCEEGFP transcardially embryon perfusé avec 4 % PFA à e15.5. D et M indiquent les axes dorso-ventral et latéro-médiale, respectivement. (B). images de fort grossissement prises avec un microscope confocal inversé équipé d’un x 63 / 1,4 objectif d’huile après coloration avec un anticorps anti-clivé-Caspase 3 (Cl-cas3) révèlent qu’environ 20 % des cellules de la plaque corticale subissent l’apoptose (flèches blanches) après 72 h en culture, tandis que GFP-positives INs rester en bonne santé (flèche blanche), comme l’a démontré dans les photomicrographies dans C-C'' '. Par comparaison, l’apoptose cellulaire est presque totalement absente de la cryosection fine provenant d’un animal perfusé (D-D'' '). Barreaux de l’échelle : 250 µm (A-B) et 15 µm (C-D'' '). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : tranches organotypique de souris du cerveau des embryons et microphotographies de fort grossissement des interneurones électroporation (INs). A. une culture organotypique de tranche d’un Dlx5/6Cre; RCEEGFP cerveau de souris (dans lequel tous les INs sont verts) électroporation avec un Dlx5/6::shRNAbrouillés-IRES-TdTomato plasmide. La tranche a été fixée à 4 % PFA après 72 h de culture et immunomarquage GFP et mCherry. Electroporated INs ont été photographié en 3D (50-60 µm d’épaisseur z-piles avec des sections optiques prises chaque 0,5 µm) à l’aide d’un microscope confocal, équipé d’un x 63 / 1.3 objectif huile NA. INs migration tangentiellement dans la zone Sub ventriculaire du pallium dorsal sont facilement identifiable (flèche rouge, ouvert). D et M indiquent les axes dorso-ventral et latéro-médiale, respectivement. B. une culture organotypique représentant tranche d’un electoporated d’embryon de type sauvage (WT) avec un contrôle Dlx5/6::shRNAbrouillés-IRES-TdTomato plasmide, fixé à 72 heures et immunocolorées pour mCherry seulement. Électroporation INs (rouge) sont visibles sur le dos la migration vers la plaque corticale. Electroporated INs sont identifiés par leur coexpression de TdTomato et EGFP dans Dlx5/6Cre; RCEEGFP souris (C-D), ou par leur expression de TdTomato seulement chez les souris WT (E-H) et par leur morphologie typique, c'est-à-dire un ovale cellulaire corps, un processus principaux ramifié (pointes blanches, D-H), une occasionnelle rampante des processus (flèche blanche, C-D) et un gonflement occasionnel du processus principal abritant le centrosome avant nucleokinesis (étoile blanche dans C-C « et G). Barreaux de l’échelle : 250 µm (A-B) et 25 µm (C-H). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : vivre-imagerie Time-lapse d’électroporation INs en tranches organotypique cultivées pendant 48 h. Électroporation INs à e13.5 avec un plasmide expérimental exprimant la cassette de TdTomato et un shARN ciblant un gène d’intérêt sont visibles dans la migration tangentielle dans une tranche de cerveau organotypique obtenue à partir d’un Dlx5/6Cre; RCEEGFP embryon de souris après 48 h de culture (placeA, blanc). B, l’électroporation même dans (carré blanc) est vu en train de nucleokinesis, lors de la migration tangentiellement dans le cortex, c'est-à-dire parallèle à la surface pial et est suivie en Time-lapse imagerie toutes les 3 minutes pendant 8 h, à l’aide d’un 20 x / 0.85 air NA objectif ( C-F, boites élargies). Le neurone affiche initialement un corps allongé de cellule (flèche open) dans le processus de nucleokinesis (C), ainsi qu’un processus de fin (flèche blanche) et un processus principaux ramifié (flèches blanches). Après 3 h de live-imagerie, le nucleokinesis est terminé, le processus de fuite a rentré et le processus principal s’étend de deux longues branches (D, pointes de flèches blanches). Après 5 h 30 min, une de la branche principale de processus a rétracté (flèches blanches) et le corps cellulaire de neurones (flèche open) a déplacé vers l’avant environ 10 µm (E). Enfin, après 8 h de l’imagerie, migration a suspendu, le neurone a étendu ses principaux processus nouveau et un processus de fin est apparu (flèche blanche), mais le noyau (flèche open) n’a pas encore déplacés vers l’avant (F). Barreaux de l’échelle : 250 µm (A), de 70 µm (B) et de 30 µm (C-F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : imagerie Time-lapse de INs dérivé d’un explant MGE cultivée pendant 48 h. INs sont vus migration hors un explant MGE provenant d’un de Nkx2.1Cre; RCEEGFP souris (dans lequel eGFP express tout dérivé de MGE INs) électroporation avec le plasmide CMV::mCherry-LifeAct-7 à e13.5, à l’aide de la méthode adapté de Myers et coll. 201353 et schématisé à la Figure 1, et mis en culture pendant 48 h (A). INs ont été visualisés à l’aide de Time-lapse-imagerie vivent pendant 5 h (B-E). Dans cet exemple, un en co exprimant eGFP et LifeAct est vu au départ dans le processus de nucleokinesis (flèche open) et s’étend des deux principales branches de processus (pointes de flèches blanches ; B). cet en complète nucleokinesis après 1 h (voir flèche ouverte), comme le corps cellulaire a progressé et un processus de fuite est apparue à l’arrière du corps cellulaire (flèche blanche) et affiche toujours un processus principal avec deux branches (pointes de flèches blanches ; C). une deuxième nucleokinesis est en cours après 2 h 30 min (flèches ouverts) et le IN est maintenant doté de deux procédés principaux provenant du corps cellulaire et un processus plus fin (flèche blanche ; D). Enfin, après 5 h, le IN rétracte une neurite tout en translocation centrosome dans la branche restante de processus principaux (flèche blanche) en vue d’une troisième nucleokinesis, avec un processus arrière (flèche blanche) encore présent à l’arrière de le corps cellulaire (E). Barreaux de l’échelle : 70 µm (A) et 20 µm (B-E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : haute résolution Time-lapse d’imagerie de l’actine remodelage dans INs d’un explant MGE cultivés pendant 48 h. A. Une tranche d’organotypique d’un Nkx2.1Cre; RCEEGFP cerveau de souris est fixé à e15.5, colorées avec Alexa-594 phalloïdine, permettant la visualisation des filaments d’actine. INs sont imagés à l’aide d’un x 63 / 1.3 objectif huile NA sur un microscope confocal. Dans INs sain, filaments d’actine sont vu ventouses à l’arrière du corps cellulaire après la rétraction du processus final après l’achèvement des nucleokinesis (flèche blanche, A'-A'' '). B. explant MGE An provient comme ci-dessus d’un Nkx2.1Cre; RCEEGFP cerveau de souris portant une suppression ciblée d’un gène d’intérêt et électroporation avec un plasmide exprimant mCherry-Lifeact-7 sous le contrôle du promoteur du CMV . Time-lapse imagerie direct est effectué après 48 h de culture et électroporation INs sont suivies toutes les 3 minutes pendant 3 h à l’aide d’un 40 x / 0.85 objectif de l’air. Active remodelage du cytosquelette d’actine se produit dans le IN transfecté avec LifeAct, comme en témoigne le mouvement de rouge (blanc dans les images noir et blancs) dots fluorescents dans les cônes et l’expansion principales (flèches blanches) et à l’arrière de la corps de la cellule au cours de la nucleokinesis (B-B'' ', blanc de flèches). Barreaux de l’échelle : 7 µm (A-A'' ') et 10 µm (B-B'' '). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cet article, nous fournissons une méthode fiable pour effectuer ex utero électroporation de souris MGE à e13.5 et pour la génération de culture organotypique de tranches de cerveau embryonnaire. Bien que les méthodes in vitro , tels que l’essai de chambre de Boyden, sont relativement faciles à effectuer et peuvent être utilisés pour évaluer les rôles spécifiques des différents gènes et des protéines sans l’interférence d’autres facteurs, ils s’opposent à l’enquête de po dynamiques migratoires en ce qui concerne la directionnalité et migration chemin25. Des explants MGE fournissent un moyen utile d’étudier les changements cytosquelettiques dynamiques survenant lors de la migration, que nous montrons ici, mais ils sont dépourvus de repères plus endogènes et nécessitent souvent l’ajout de repères d’orientation pour promouvoir la migration neuronale (bien que ce soit considérablement améliorée lorsque des explants MGE sont cultivés sur des couches corticales feeder)25,54. Néanmoins, études basées sur des explants MGE peuvent ne pas détecter l’implication des signaux moléculaires impliquées dans des mécanismes plus subtils comme ceux guidant le chemin de directivité ou de la migration spécifique de INs29. Ce problème a été finalement contourné par in utero électroporation25, qui permet le marquage spécifique des dérivés de MGE INs migrer dans leur environnement natif13,29,41. Cependant, cette technique est habilité-difficile, en raison de procédures chirurgicales, et son rendement est limité par le faible taux de survie des embryons et le fait que la MGE est difficile à cibler dans l’utérus, nécessitant souvent l’utilisation de plusieurs portées à atteindre la signification55. Par conséquent, ex utero électroporation de la MGE suivie par la culture organotypique d’embryons de cerveau de souris fournit une méthode de faible coût, temps-efficace et fiable pour l’enquête sur la dynamique de la migration et la morphologie des dérivés de MGE INs dans leur cadre naturel environnement, tout en contournant les procédures chirurgicales dans l’utérus de l’électroporation et le besoin d’orientation cues des explants de MGE. En outre, cette technique permet un accès plus facile pour le MGE, qui peut être ciblée par relater directement l’électrode positive sous le cou et le négatif sur le dessus de la tête, une configuration plus difficile à adopter in utero. Sinon, le MGE peut être injecté circonscrits et électroporation directement après génération organotypique tranches13,25,29, mais cette technique s’est avérée plus difficile et moins efficace dans nos mains que le protocole décrit ici. En suivant les étapes décrites dans cet article, on obtiendra 50-100 électroporation dérivé de MGE INs par tranche organotypique, 5-20 dont on le verra tangentiellement la migration hors de la MGE après que 72 h. INs Transfected peut être visualisée en direct avec l’imagerie Time-lapse ou image et reconstruite après fixation et marquage immunohistochimique.
Le protocole décrit ici a été optimisé afin d’étudier en migration ex vivo et a été inspiré par différents protocoles publiés décrivant dans l’utérus l’électroporation des INs dérivé de MGE, ex vivo l’injection de MGE et électroporation, ou la génération de chroniques organotypique cerveau tranche cultures36,38,39,42,43,56,57,58. Notre approche limite les dommages potentiels à progéniteurs MGE en utilisant la plus faible intensité des impulsions (40 V) et les injections de plasmide intraventriculaire plutôt que des injections intra MGE avec des impulsions de haute tension (100 V), tel que décrit ailleurs39,56 ,57,58. En outre, alors que d’autres utilisent une combinaison de la pénicilline, la streptomycine et gentamicine pour prévenir la contamination bactérienne39,56,57,58, nous avons opté pour éviter les antibiotiques dans notre milieu de culture car ils peuvent théoriquement touchent en migration. En particulier, la pénicilline est un antagoniste du récepteur GABAA 59,60, et l’activation des récepteurs GABAA active et plus tard s’arrête en migration selon des gradients de chlorure intracellulaire et KCC2 expression à diverses étapes de migration61. Cependant, en utilisant les précautions divers énoncées dans le protocole actuel, la contamination peut être effectivement évitée même en l’absence d’antibiotiques.
Malgré l’efficacité de cette approche dans nos mains, ex utero électroporation a aussi ses inconvénients. Tout en fournissant un environnement naturel en trois dimensions pour les cellules de migrer, il peut être difficile d’effectuer des essais pharmacologiques organotypique tranches dans le contexte de la migration. En effet, la migration des dérivés de MGE INs dépend principalement de signaux extracellulaires2,13,19 et l’application des inhibiteurs pharmacologiques ou activateurs organotypique tranches ne permet pas la précision dissociation des effets autonomes sur les cellules des effets globaux sur l’activité ou l’état de santé général tranche. Pour ces expériences, des explants MGE cultivés sur cellules corticales dissociées mixtes serait préférables d’organotypiques, puisque INs migration hors de l’explant peut être plus facilement isolées et exposées sélectivement à certains composés62. En outre, bien que ex utero électroporation est plus facile à réaliser que dans l’utérus de l’électroporation, il peut encore être techniquement difficile à l’âge embryonnaire illustré ici, étant donné la petite taille et de la fragilité du cerveau embryonnaire à E13.5. les enquêteurs devront quelques essais d’extraire efficacement le cerveau d’électroporation à e13.5 sans endommager la surface du cerveau. En outre, par opposition aux tranches postnatals, embryonnaires organotypique tranches ne peut pas être maintenues en culture sur de longues périodes de temps. Bien qu’organotypiques embryonnaire peuvent être conservées pendant au moins 7 jours in vitro63, ceci n’est pas combiné avec électroporation et expériences décrites ici ont été testés pour jusqu'à 3 jours in vitro avec des résultats fiables dans nos mains. Par conséquent, enquêteurs doivent exécuter optimisation des tests au préalable si le temps d’incubation plus longs sont nécessaires. En outre, l’enquête de développement aux derniers stades embryonnaires ou au début de postnatals n’est pas recommandée avec cette technique lors de l’utilisation d’embryons e13.525, mais peut se faire avec dans l’utérus de l’électroporation, cas avec succès électroporation des embryons sont réinvestis dans la cavité utérine et peuvent être laissés pour être né et analysés plus tard étapes21,64. Enfin, ex utero électroporation suivie organotypiques permet l’analyse de la morphologie et la dynamique de la migration des INs en voie de développement. Toutefois, comme il a été précédemment indiqué pour l’in utero électroporation technique36, ex utero électroporations rendement electoporated de 50 à 100 cellules par tranche de cerveau et ne sont donc pas adaptées à l’analyse de la population. Mieux, ces enquêtes sont effectuées dans des modèles animaux, portant un complet ou conditionnelle suppression (ou knock-in) du gène d’intérêt. Lorsqu’elle est disponible, ces modèles peuvent ensuite être utilisés efficacement pour générer organotypiques ou MGE des explants afin de visualiser la dynamique réelle de migration, comme montré ici (voir la Figure 5 et Figure 6).
Beaucoup d’étapes dans le présent protocole doit être réalisée soigneusement afin d’obtenir des résultats optimaux. Par exemple, il est primordial que toutes les mesures sont effectuées dans des conditions stériles rigoureuses comme la contamination peut se produire assez facilement. Gants et instruments utilisés à l’extérieur de la biosécurité du cabinet doivent être aspergées de l’éthanol à 70 % fréquemment pendant toute la procédure. En outre, des solutions telles que les milieux de culture et le liquide céphalorachidien artificiel doivent être maintenues stériles et froid (4 ° C) et frais fabriqué par 2-3 semaines. Pour étiqueter dérivé de MGE INs plus précisément, plasmides qui seront utilisés dans de telles expériences devraient être clonés sous le contrôle d’un promoteur spécifique IN (ex : Dlx5/649, Lhx6,65), au lieu de compter simplement sur l’anatomie ciblage de la MGE. La génération des tranches organotypique nécessite le cerveau pour rester en vie. Ainsi, pour préserver la survie et la santé de la cellule, cette expérience devrait être effectuée en moins de 3 heures à partir du moment que les embryons sont récupérés jusqu'à ce que les tranches organotypique sont mis en culture. Pour temps-efficacité, plaques de culture peuvent être pré-remplie avec milieu de culture maison juste avant de commencer l’expérience et mis dans l’incubateur de culture de cellules de 37 ° C jusqu'à l’utilisation. Par ailleurs, le cerveau doit être soigneusement disséqué hors du crâne sans aucun dommage à la surface corticale afin d’atteindre le bon enrobage dans la solution d’agarose et coupes ultérieures vibratome. Par exemple, la surface corticale, même minime, pourrait endommager dans le détachement des 250 sections µm d’épaisseur du gel d’agarose environnantes ou dégradation des sections durant vibratome sectionnement. Pour la survie des neurones, il est aussi essentiel que la température de la solution d’agarose reste proche de 42 ° C, comme des températures plus élevées conduisent aux tissus des dommages et la mort cellulaire, alors que des températures plus basses n’empêchera l’intégration appropriée du cerveau (ou de l’endommager au cours de la intégration de processus). Une fois dans la culture, pour éviter d’autres sources de contamination, les tranches de ne doivent pas être manipulés jusqu'à ce qu’elles sont transférées dans le microscope pour l’imagerie. Ces étapes doivent être effectuées dans un environnement stérilisé et faut faire attention ne pas de contaminer les plaques après ces manipulations, surtout s’ils ont besoin d’être remis en culture pour la redéfinition subséquente. Enfin, nous ne recommandons pas récupérer une aliquote d’ADN mélangé avec chargement colorant d’expériences antérieures pour une utilisation ultérieure, que nous avons observé une réduction considérable du rendement des neurones d’électroporation avec ce matériel.
En conclusion, l’ex utero électroporation et organotypique tranche protocole de culture décrit ci-dessus permet le marquage spécifique des dérivés de MGE INs au niveau unicellulaire et peut servir à manipuler génétiquement les voies moléculaires spécifiques à étudier leur rôle dans la régulation des changements morphologiques et dynamiques migratoires de migration tangentiellement INs. Cette méthode permet l’enquête fonctionnelle début rapide et peu coûteuse de gènes nouveaux candidats identifiés par séquençage RNA monocellulaire de migrateurs INs66,67 ou par l’intermédiaire de prochaine génération séquençage des diabétiques 68,,du6970des troubles neurodéveloppementaux. Cette technique a été largement utilisée pour l’étude des migrations dans d’autres populations de cellules, y compris les cellules pyramidales dans le cortex et l’hippocampe70,71,,du7273. Une fois maîtrisé, il pourrait potentiellement être utilisé afin d’imager le recyclage et le trafic des protéines membranaires, telles que récepteurs et chaînes à l’aide de protéines GFP-étiquetées ; l’activation des cascades de signalisation cellulaires spécifiques à l’aide de biocapteurs74; ou encore la surveillance et à la manipulation de l’activité cellulaire à l’aide d’imagerie calcique couplé à optogenetics en INs corticale, mais aussi dans d’autres régions du cerveau, telles que l’hippocampe, l’amygdale ou même le striatum.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer. Les opinions exprimées ici ne représentent pas nécessairement les opinions du ministre de la santé ou le gouvernement du Canada.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation de la Savoie et la Fondation de l’épilepsie CURE de fonctionnement et de matériel des subventions de la Fondation canadienne pour l’Innovation aux E.R (microscope confocal) et Hary (microscope confocal à disque tournant). E.R. reçoit une bourse de carrière de la Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S ; Clinician-Scientist prix) ainsi que des instituts de recherche en santé du Canada (IRSC ; Prix du jeune chercheur). G.H. est chercheur principal de la FRQ-S. L.E est le récipiendaire du prix Steriade-Savoie formation postdoctorale de la Fondation de la Savoie, la bourse de formation postdoctorale de la Fondation CHU Sainte-Justine et la bourse de formation postdoctorale FRQ-S, en partenariat avec la Fondation des étoiles. Ce projet a été rendu possible par cerveau Canada à travers le Fonds de recherche de cerveau de Canada, avec l’appui financier de Santé Canada, attribué à L.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
References
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