Summary
Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.
Abstract
Interneuroni GABAergici (INs) sono componenti fondamentali delle reti neuronali che guidano la cognizione e comportamento. INs destinato per popolare la corteccia tangenzialmente migrano dal loro luogo di origine nel telencefalo ventrale (compresi da eminenze gangliare mediale e caudale (MGE, CGE)) alla piastra corticale dorsale in risposta ad una varietà di intrinseche ed estrinseche Stecche pool. Diversi metodi sono stati sviluppati nel corso degli anni per geneticamente manipolare percorsi specifici e indagare come regolano le modifiche dinamiche del citoscheletro necessari per una corretta migrazione. Nell'utero elettroporazione è stato ampiamente utilizzato per studiare l'effetto di repressione genica o sovraespressione in specifici IN sottotipi durante la valutazione dell'impatto sulla morfologia e posizione finale. Tuttavia, mentre questo approccio viene prontamente utilizzato per modificare radialmente migrazione delle cellule piramidali, più tecnicamente è difficile quando ins nell'utero elettroporazione di targeting genera un rendimento basso dato i tassi di sopravvivenza in diminuzione di cuccioli quando l'elettroporazione è condotta prima e 14.5, come di consueto quando si studia INs MGE-derivato. In un approccio alternativo, MGE espianti consentono un facile accesso a MGE e facilitano l'imaging del INs geneticamente modificati. Tuttavia, in questi espianti, INs migrare in una matrice artificiale, priva di spunti di orientamento endogeno e thalamic ingressi. Questo li ha spinti per ottimizzare un metodo dove INs possono migrare in un ambiente più naturalistico, mentre eludere le sfide tecniche di approcci nell'utero . In questo articolo, descriviamo la combinazione dell'elettroporazione ex utero dei cervelli embrionali del mouse seguita da fetta su colture organotipiche prontamente traccia, immagine e ricostruire geneticamente INs la migrazione lungo i loro percorsi naturali in risposta a Stecche pool endogeno. Questo approccio consente sia la quantificazione degli aspetti dinamici della migrazione con Time-lapse imaging confocale, così come l'analisi dettagliata dei vari parametri morfologici utilizzando un neurone ricostruzioni sul tessuto fisso immunolabeled.
Introduction
Interneuroni GABAergici corticale (INs) sono diverse per quanto riguarda la loro proprietà biochimiche, connettività e proprietà fisiologiche e mediano funzioni diverse in reti maturo1,2,3 ,4,5. La specifica dei diversi sottotipi di INs corticale è strettamente regolata attraverso cascate genetiche che sono stati estesamente studiati1,2. La maggior parte (70%) di corticali GABAergici INs provengono da progenitori nell'eminenza gangliare mediale (MGE), una struttura embrionale situata ventralmente e necessario migrare attraverso le distanze relativamente lunghe per raggiungere la placca corticale1, 2 , 6. mentre le cellule piramidali corticali migrano radialmente dalla zona ventricolare (VZ) alla piastra corticale lungo il patibolo glia radiale, la migrazione tangenziale di INs, che non sono collegati a tali un'impalcatura, richiede una varietà di intrinseca e estrinseche spunti per attirare la migrazione dei neuroni verso la piastra corticale, mentre guidarli lontano da strutture non-corticali2,7,8. Dopo l'uscita del ciclo cellulare, INs sono respinti da MGE da chemio-ripugnante segnali espressi all'interno il VZ di MGE, che innesca la migrazione tangenziale verso il piatto corticale9,10. Migrazione in evitare lo striato con l'ausilio di diversi spunti ripugnante11 e, dopo aver raggiunto la placca corticale, passare da una tangenziale a una modalità di migrazione radiale e raggiungere la loro posizione finale laminare, parzialmente in risposta a stimoli da piramidale le cellule12 e altre popolazioni cellulari13. La migrazione di INs, come per altre popolazioni neuronali, comporta vari cambiamenti morfologici dinamici per consentire l'effettivo movimento del neurone. Questa cosiddetta locomozione neuronale è caratterizzata da cicli ripetitivi di tre fasi successive: l'allungamento di un processo di leader, un movimento attivo anterograda del nucleo (nucleokinesis) e la retrazione del processo finale14. IN migrazione è regolata da numerosi segnali intrinseci ed estrinseci che guidano la ramificazione e rimodellamento attivo del processo di leader per guidare INs nella direzione corretta, determinare l'orientamento e la velocità di migrazione14,15 ,16.
I fattori determinanti che regolano corticale IN migrazione sono stati ampiamente studiati negli ultimi anni1,2,7,17,18,19,20, e la rottura in alcuni di questi attori molecolari è stata postulata per condurre ai disordini dello sviluppo neurologico, quali pediatrici refrattari epilessia o autismo spettro disturbi1,2,21, 22 , 23 , 24. Pertanto, lo sviluppo di diversi approcci in vitro e in vivo è stato perseguito per avanzare in modo significativo la nostra capacità di studiare questo processo dinamico, come precedentemente esaminati25. In vitro i metodi, tra cui l'analisi della camera di Boyden e analisi della scelta di striscia, forniscono il mezzo più veloce e più riproducibile per valutare il requisito e la cella-autonomo impatto di specifici geni o proteine durante la migrazione neuronale, senza l'influenza di altri fattori25. Questi test sono particolarmente utili quando combinato con formazione immagine live8,26,27. Con queste tecniche, INs sono facilmente Estratto da e13.5 MGE e isolato da dissociazione enzimatica e meccanica, dopo di che possono essere studiate diverse vie di segnalazione e spunti di orientamento, come illustrato in precedenza8,28 . Tuttavia, queste analisi si svolgono in una tabella extracellulare artificiale in assenza di architettura tridimensionale del tessuto, che può alterare un neurone proprietà di comportamento e delle cellule, che interessano potenzialmente cella migrazione e/o sopravvivenza25. Per ovviare a queste limitazioni, ex vivo MGE espianti sono stati sviluppati come uno strumento alternativo per quantificare i dinamici cambiamenti morfologici che si verificano durante la migrazione insieme a parametri quali la velocità e l'orientamento14, 29. Generazione di espianti MGE è relativamente semplice ed è stato ampiamente descritto altrove30. Essa comporta la placcatura di un piccolo estratto di MGE su un monostrato di cellule corticali miste o in una miscela di matrigel e collagene in presenza di segnali di attrazione o repulsione25, anche se questi ultimi sono opzionali31. MGE espianti consentono per l'alta risoluzione di imaging delle cellule scarsamente etichettate, semplificando lo studio di processi intracellulari, come rimodellamento del citoscheletro durante processo leader di ramificazione, come illustrato in precedenza32,33 ,34 e nello studio presente. MGE espianti sono stati utilizzati con successo per valutare dinamici cambiamenti citoscheletrici durante la migrazione in un ambiente 2D, ad esempio dopo specifiche manipolazioni farmacologiche o chemiotattiche (Vedi, ad esempio, Tielens et al 201633) . Tuttavia, con questo approccio, INs la migrazione all'interno di una matrice artificiale, e questo potrebbe alterare nel comportamento e la riproducibilità e la significatività dei risultati sperimentali.
Al contrario, nell'utero elettroporazione consente la manipolazione genetica di INs nel loro ambiente nativo ed è un metodo ampiamente usato a rapidamente ed efficientemente valutare l'impatto di guadagno e la perdita di funzione del gene mentre eludere le limitazioni di lunghe e costose knockout e knock-in strategie25,35. Elettroporazione in utero può essere sbilanciata verso nei progenitori utilizzando promotori specifici di tipo cellulare e posizionando gli elettrodi verso le strutture ventromedial, tra cui il MGE36. Inoltre, nell'utero elettroporazione consente l'espressione tempestiva dei costrutti sperimentale entro 1-2 giorni, rispetto al 7-10 giorni necessari per costrutto espressione utilizzando virali vettori25. Tuttavia, nell'utero elettroporazione nei progenitori tende ad essere basso rendimento. Infatti, anche se dei progenitori delle cellule piramidali che si trova nella zona ventricolare dorsale possono essere efficientemente transfected utilizzando nell'utero elettroporazione, targeting più ventralmente trova strutture, come il MGE, è tecnicamente più impegnativo, soprattutto in e13.5 piccoli embrioni e l'alto tasso di letalità embrionale ulteriormente riduce la resa sperimentale25.
Per aggirare alcune delle limitazioni tecniche associate in vitro MGE explant esperimenti e in vivo nell'utero elettroporazione, ex vivo su colture organotipiche fetta sono stati sviluppati8,37, 38,39. Cervello organotipiche fetta culture offerta il vantaggio di che imita in vivo le condizioni, pur essendo meno costoso e che richiede tempo di generazione animale i modelli25. Infatti, queste preparazioni consentono un facile accesso a MGE, insieme con la visualizzazione specifica dell'INs e possono essere combinate con focale elettroporazione per indagare i meccanismi molecolari specifici nella INs la migrazione in un ambiente più fisiologico8 , 39 , 40 , 41. Pertanto abbiamo ottimizzato un approccio per organotipiche culture38, che abbiamo combinato con elettroporazione ex utero e time-lapse imaging confocale, per valutare appieno il processo morfologico e dinamico che si verificano durante la migrazione tangenziale di MGE-INs. Il presente protocollo è stato adattato e ottimizzato da altri che hanno usato le culture di fetta elettroporazione e organotipiche a cervello ex utero o nell'utero per studiare la migrazione delle cellule piramidali42,43 e corticale INs36,39,44. In particolare, gli embrioni del mouse vengono decapitati e MGE è individulamente ex vivo dopo l'iniezione intraventricolare dei plasmidi sperimentali, che permette più efficiente e preciso targeting dei progenitori MGE rispetto a ciò che può essere raggiunto con nell'utero elettroporazione. I cervelli sono quindi estratte e sezionato a fette coronali intero cervello che possono essere coltivate per pochi giorni, consentendo in tal modo continuo monitoraggio e imaging di INs trasfettate. Questo approccio etichette in genere 5-20 INs tangenzialmente la migrazione per fetta di cervello, riducendo al minimo il numero di iterazioni sperimentali necessari per raggiungere la significatività statistica, mentre etichettatura una sufficientemente scarsa densità di popolazione neuronale per garantire facile separazione delle singoli neuroni per la ricostruzione e la valutazione morfologica bene. Inoltre, rispetto al MGE espianti, colture organotipiche garantiscono che la migrazione aggiuntivi sono esposti a un ambiente più naturale, tra cui ingressi da afferenze thalamic e chemochine secrete localmente. Questo approccio è così adatto per quantificare la direzionalità e migratorio percorso adottato da trasfettate INs, offrendo dettagli anatomici sufficienti per consentire la caratterizzazione dei processi dinamici più fini come leader processo ramificazione, nucleokinesis e retrazione del processo finale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) presso il centro di ricerca di CHU Sainte-Justine e sono stati condotti in conformità con il Consiglio canadese su Guida di cura degli animali per la cura e l'uso di animali da esperimento (ed. 2).
Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per elettroporazione di embrioni al giorno embrionale (e) 13.5, in un momento quando INs MGE-derivati vengono generati attivamente, prima il picco della CGE-derivato INs produzione45,46. Inoltre, per polarizzare l'elettroporazione verso GABAergic INs, usiamo un promotore selettivamente espresso in INs (per esempio il promotore Dlx5/6 con relativo minimo enhancer)47.
1. preparazione di soluzioni per elettroporazione e culture organotipiche fetta
- Preparare 125 mL di terreno di coltura sterile.
- Misura 125 mL di terreno di coltura di neurone-specific regolare (Vedi Tabella materiali per formulazione) in un flacone sterilizzato in un precedentemente sterilizzati con UV di biosicurezza spruzzato con etanolo al 70%. Aggiungere 2,25 mL di 50 x supplemento privo di siero di neurone-specific, 1,75 mL di glutamina 200mM (concentrazione finale di 0,5 mM) e 6,25 mL di siero inattivato con calore cavallo precedentemente aliquotato in condizioni sterili. Mescolare accuratamente, aliquota in 15 mL provette coniche sterili e conservare a 4 ° C.
Nota: Il terreno di coltura preparato possono essere memorizzato fino a 3 settimane a 4 ° C. - Dividere un 100 X soluzione di riserva di N-2 formulazione48 di Botteinstein 150 aliquote µ l in condizioni sterili e congelare a-20 ° C fino all'utilizzo.
- Misura 125 mL di terreno di coltura di neurone-specific regolare (Vedi Tabella materiali per formulazione) in un flacone sterilizzato in un precedentemente sterilizzati con UV di biosicurezza spruzzato con etanolo al 70%. Aggiungere 2,25 mL di 50 x supplemento privo di siero di neurone-specific, 1,75 mL di glutamina 200mM (concentrazione finale di 0,5 mM) e 6,25 mL di siero inattivato con calore cavallo precedentemente aliquotato in condizioni sterili. Mescolare accuratamente, aliquota in 15 mL provette coniche sterili e conservare a 4 ° C.
- Preparare 1 L di liquido sterile cerebrospinale artificiale (ACSF).
- Misura 800 mL di acqua distillata in un becher da 1 litro. Aggiungere 25,67 g di saccarosio, 5,08 g di cloruro di sodio (NaCl), 2,18 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3), 1,80 g di glucosio, 0,19 g di cloruro di potassio (KCl), 0,15 g di sodio fosfato monobasico anidro (NaH2PO4), 1 mL di 1 M stock CaCl2 .2H2O e 2 mL di 1 M stock MgSO4.7h2O. mescolare per sciogliere a temperatura ambiente. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume totale di 1 L.
- Usando un filtro da 0,22 µm, filtrare la soluzione in una bottiglia sterile in una cappa di biosicurezza sterilizzato e conservare a 4 ° C per 1 mese.
- Preparare una soluzione fresca di 4% di agarosio in ACSF prima di ogni esperimento.
- Misura 25 mL di ACSF precedentemente preparato in una provetta conica sterile da 50 mL e aggiungere 1 g di agarosio di punto basso punto di fusione.
- Calore per 45 s nel forno a microonde. Per evitare fuoriuscite, interrompere il riscaldamento ogni 3-4 e quando inizia a bollore, aprire il tubetto per consentire la pressione fuori, richiuderlo e agitare manualmente per mescolare l'agarosio. Ripetere fino a quando la soluzione di agarosio è omogenea. Tenere la soluzione di agarosio a 42 ° C durante il resto dell'esperimento per evitare la solidificazione.
Nota: Temperature più elevate possono danneggiare i tessuti cerebrali.
2. preparazione di plasmidi per l'iniezione
- Tirare una pipetta di vetro microiniezione
- Impostare la levetta micropipetta con i parametri appropriati, fissare il capillare di vetro nello spazio fornito e assicurarsi che sia centrato con il filamento.
- Premere il tasto di tiro.
- Rimuovere con cautela le pipette di microiniezione appena effettuata dall'estrattore di calore e posto in una scatola o una capsula di Petri pulita fino all'ulteriore utilizzo per evitare di danneggiare la punta.
- Set-up la cappa di biosicurezza con tutti gli strumenti necessari per questo esperimento (Vedi Figura 1A), Spruzzare generosamente tutti gli strumenti nella cappa di biosicurezza con etanolo al 70% e sterilizzare gli strumenti e l'ambiente con luce UV per 15-20 min.
- Durante la fase di sterilizzazione, scongelare i plasmidi su ghiaccio (4 ° C).
- Misurare 10 µ l del plasmide da una soluzione madre (4 µ g / µ l) in una provetta da centrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 0.01% di Fast Green FCF. Mescolare delicatamente, gira brevemente e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo.
Nota: Maxi-prep DNA dovrebbe essere preparato secondo il protocollo del produttore utilizzando un kit di endotossina-libero maxi-prep. DNA può essere solubilizzato buffer di TE o nucleasi-free H2O e la preparazione del plasmide con colorante soluzione può, ma non non devono essere eseguite in condizioni sterili. Plasmidi da Maxi-prep dovrebbero essere aliquotati per evitare più cicli di gelo-disgelo. Plasmidi aliquotati devono essere miscelati con il colorante più che 2 h prima dell'uso e non devono essere ricongelati per ulteriore uso. - Dopo la sterilizzazione, preparare il nano-iniettore come segue.
- Scegli uno di vetro precedentemente preparato microinjection pipetta memorizzata in una scatola pulita o la capsula di Petri e la uso piccole pinzette per tagliare la punta della pipetta in modo smussato per ottenere un diametro esterno di circa 15 µm.
Nota: Il diametro esterno dato qui è una misura approssimativa per dare all'utente un'idea di ciò che usiamo nei nostri esperimenti ed è stato ottimizzato al fine di agevolare il piercing del cranio per l'iniezione di plasmide senza danneggiare il cervello, pur consentendo il fluido caricamento e rilascio del DNA. Il diametro esterno può essere misurato osservando il tagliata punta della pipetta microiniezione vetro apposto a una barra di scala micrometrica con un microscopio a campo chiaro. - Utilizzare una siringa per riempire la micropipetta con olio minerale dalla sua fine unpulled (per espellere tutta l'aria).
- Inserire la micropipetta di vetro riempito in nano-iniettore seguendo le istruzioni del produttore.
- Vuoto 2/3rds della micropipetta di vetro (mantenendo abbastanza olio per impedire l'immissione di aria).
- Scegli uno di vetro precedentemente preparato microinjection pipetta memorizzata in una scatola pulita o la capsula di Petri e la uso piccole pinzette per tagliare la punta della pipetta in modo smussato per ottenere un diametro esterno di circa 15 µm.
- Inserire la micropipetta preparata nella provetta contenente la soluzione di plasmide/colorante e riempire la micropipetta di vetro con la soluzione di plasmide/colorante.
3. raccolta di embrioni di topo da femmine gravide
- Monitorare femmine riproduttrici quotidianamente per valutare per collegare vaginale, preferibilmente allo stesso tempo ogni giorno (primo pomeriggio). Giorno 0.5 corrisponde al primo giorno quando si osserva un plug vaginale.
Nota: Gli esperimenti descritti qui possono essere condotti in topi wild-type. Tuttavia, per facilitare l'identificazione di MGE e di etichettare tutti i GABAergici INs (o specifici sotto-insiemi come INs MGE-derivato), animali transgenici possono essere utilizzati (ad es.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre con un allele di Cre-reporter, ecc47,49). In questo caso, il plasmide sperimentale iniettato dovrebbe esprimere un altro fluoroforo (per esempio mCherry o TdTomato) per consentire la visualizzazione del INs trasfettate (giallo) che può essere confrontato con INs non trasfettate (verde). - Sacrificare la femmina al e13.5 giorno embrionale, dalla dislocazione del collo.
Nota: Gli anestetici dati al momento del sacrificio possono avere un impatto IN migrazione e la sopravvivenza di50,51 e dovrebbero essere evitati. - Raccogliere gli embrioni con taglio cesareo, come segue.
- Spruzzare generosamente l'addome femminile con etanolo al 70%. Tirare la pelle dell'addome con un paio di pinze sterili e, con l'altra mano, utilizzare forbici chirurgiche sterilizzate per tagliare la pelle dall'addome.
- Con un secondo paio di forbici e pinze sterilizzate, tirare la fascia addominale e tagliarlo, evitando accuratamente l'utero.
- Utilizzando un terzo paio di forbici e pinze sterilizzate, tirare i corni uterini e tagliarli fuori dalla cavità pelvica. Posizionare i corni uterini dissecati in una capsula di Petri 60mm sterile riempito con neurali basati cultura supplementato con aminoacidi, vitamine e sali inorganici (Vedi Tabella materiali per prodotto commercialmente disponibile).
- In una sterile di biosicurezza, utilizzare due coppie di pinzette bene (uno in ogni mano) per sezionare gli embrioni fuori la placenta e isolare le teste per decapitazione.
- Taglio obliquo la punta di una pipetta di trasferimento in plastica sterile mL 3, aspirare le teste e trasferimento in un nuovo piatto di petri sterile di 60 mm a strati con cera nera solidificata e riempito con la stessa base neurale completati terreno di coltura come sopra.
Nota: Questo passaggio riduce al minimo il trasferimento di contaminanti (mouse capelli, sangue). La cera nera viene utilizzata per stabilizzare la testa durante la dissezione. Terreni di coltura non è necessario essere ossigenato durante queste procedure.
4. intraventricolare plasmide iniezioni ed Ex Vivo elettroporazione di MGE
Nota: La procedura seguente deve essere eseguita in condizioni sterili nella biosicurezza precedentemente preparato.
- Posto di Petri 60 mm a strati con cera nera e contenente le teste decapitate in neurale basato completati di coltura sotto il binocolo nella cappa di biosicurezza.
- Stabilizzare la testa, la parte rostrale rivolto verso destra, con una pinzetta bene con la mano sinistra e utilizzare il nano-iniettore nella mano destra per iniettare 1-2 µ l della soluzione plasmide/colorante nel ventricolo laterale di destra.
Nota: Gli esperimenti di co-espressione possono essere condotto da co-electroporating un plasmide di salvataggio e un plasmide che esprimono shRNA mescolando entrambi plasmidi alle concentrazioni equimolari. - Electroporate il cervello iniettato.
- Posizionare la testa tra gli elettrodi con l'elettrodo negativo posizionato dorsalmente e parallelo alla testa e l'elettrodo positivo verso il lato ventrale della testa per indirizzare il MGE.
- Una volta che gli elettrodi siano ben posizionati, consegnare 4 impulsi quadrati di 40 V per 50 ms a 500 ms interpulso intervalli.
- Rimuovere qualsiasi tessuto residuo dagli elettrodi usando la pinzetta già nel pensile la biosicurezza.
Nota: Questi parametri sono stati ottimizzati appositamente per il electroporator utilizzato nei nostri esperimenti. È consigliabile che gli utenti eseguano test di ottimizzazione in anticipo se si utilizza un diverso tipo di electroporator. - Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.3 per tutti i cervelli rimanenti.
Nota: Sebbene questo protocollo descrive le manipolazioni necessarie per un cervello, è possibile inserire fino a 4 cervelli in sequenza prima di electroporating ogni cervello, aumentando così il rendimento. Questa strategia è particolarmente vantaggiosa quando 2 o più diversi plasmidi sono iniettati in sequenza (ad es. controllo o plasmide sperimentale) durante lo stesso esperimento (permettendo per il confronto tra littermates). Inoltre, è possibile iniettare ed electroporate contemporaneamente entrambi i lati del cervello per aumentare il rendimento, posizionando gli elettrodi completamente parallela alla superficie del cervello.
5. dissezione e culture organotipiche fetta del cervello
- Mentre ancora manipolare in ambiente sterile della cappa di biosicurezza, sezionare il cervello dal cranio.
- Stabilizzare la testa sullo strato di cera nera inserendo un ago in ogni occhio, evitando accuratamente il cervello.
- Utilizzare un paio di pinzette bene di tenere il lato sinistro del collo e un secondo paio di pinzette bene per strappare la pelle dal cranio, dal retro al fronte.
- Tenendo la testa lateralmente con le pinzette in una mano, è necessario utilizzare un altro paio di pinzette in altra mano per tagliare con cura il cranio a livello del tronco cerebrale e tirare delicatamente il cranio. Con ogni pinzetta, tagliare il cranio nel piano sagittale (linea mediana) verso la parte anteriore e poi incise lateralmente per liberare i frammenti di cranio.
- Sollevare il tronco cerebrale e tagliare con cura le meningi e dei nervi cranici, fino a quando il cervello è completamente fuori dal cranio.
Nota: Tutti i passaggi descritti in 5.1 devono essere eseguiti in severe condizioni di sterilità in una cappa di biosicurezza.
- Incorporare il cervello in agarosio al punto basso punto di fusione 4% per il sezionamento.
- Riempire una scatola di Petri 35mm con la soluzione di agarosio preparata in precedenza (mantenuto liquido a 42 ° C).
- Trasferire rapidamente un cervello individulamente al piatto pieno di agarosio utilizzando la pipetta tagliato precedentemente. Tenere il piatto a temperatura ambiente.
- Mescolare l'agarosio con un bastone di metallo per mantenere il cervello al centro del pozzo (per evitare l'affondamento) e posizionare il cervello in un aereo rostro-caudale parallelamente al piatto. Smettere di mescolare quando l'agarosio inizia a solidificare, per evitare danni cerebrali.
- Usare una lama di rasoio per tagliare l'agarosio che circonda il cervello al fine di formare un blocco rettangolare, lasciando un margine di 1-2 millimetri intorno al cervello. Assicurarsi che la parte rostrale del cervello sia perpendicolare al limite anteriore del blocco per facilitare l'orientamento per le successive fasi di sezionamento.
- Ripetere per ogni cervello.
Nota: È possibile tagliare più di un cervello alla volta (massimo 3) dalla modellatura dell'agarosi separata blocchi durante l'impostazione di ogni cervello a diverse altezze.
- Sezioni coronali VIBRATOME e fetta di cultura.
- Disgelo un'aliquota di 100 X N-2 supplemento (150 µ l) sul ghiaccio e aggiungere 15 mL di coltura aliquotati in condizioni sterili.
- Trasferire 750 µ l di terreno di coltura (con 1 X N2 supplemento) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti.
- Con una pinzetta curva, inserire un inserto di cultura cellulare (diametro 30 mm, diametro dei pori 0,4 µm, PTFE) in ciascuna medio-riempito bene.
- Riempire il bagno vibratome ACSF continuamente ossigenato. Raffreddare a 4 ° C con il ghiaccio circostante la vasca, o utilizzare una vibratome refrigerate.
- Impostare la velocità del vibratome a 0,150 mm/s e la frequenza a 80 Hertz.
- Incollare il blocco di agarosio su piattaforma vibratome, rostrale bordo rivolto verso il basso e ventrali tagliente rivolto verso l'utente.
- Tagliare il cervello in sezioni coronali per ottenere 250 µm di spessore sezioni (a 4 ° C).
- Con spatole sterilizzate, raccogliere le sezioni 2-3 contenente la MGE e luogo inseriscono tutte le sezioni del cervello da un animale su una singola membrana di 30 mm, mentre con cura evitando sovrapposizioni tra le sezioni. Collocare l'inserto in un pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti (contenente 750 µ l di terreno di coltura completato, come descritto sopra). In alternativa, ogni sezione può essere posizionato su una membrana di diametro 13 mm separato in una piastra di coltura 12-pozzetti riempita con terreno di coltura 500 µ l completati. La quantità di terreno di coltura consigliata per ciascun pozzetto permette le sezioni di cervello deve essere nutrita dai media senza essere sommersi.
Nota: La procedura descritta in 5.3.6 e 5.3.7 non avvengono in condizioni di sterilità completa, a meno che il vibratome possono essere sterilizzate e utilizzate in una cappa di biosicurezza. Di conseguenza, è fondamentale per condurre questi passi attentamente per evitare eventuali contaminazioni. Adeguati dispositivi di protezione (pulire la maschera, guanti chirurgici e camice da laboratorio) devono essere indossato in ogni momento e parti del corpo, anche coperto, come capelli, viso e mani, non dovrebbe mai passare sopra piastre di coltura (con o senza terreno di coltura). Si raccomanda anche di spruzzare etanolo al 70% frequentemente sui guanti e spatole utilizzate per raccogliere le sezioni di cervello. - Posizionare la piastra di coltura in un ventilata sterile incubatore a 37 ° C con 60% umidità e 5% CO2 per 48 o 72 h.
Nota: Questi tempi di incubazione sono stati ottimizzati per l'imaging time-lapse di MGE-derivato INs e imaging confocale di fette fisse, rispettivamente. Tempi di incubazione ottimale dovrebbero essere testati in anticipo per ogni disegno sperimentale. Inoltre, se l'incubazione selezionata è 72 h e sotto, non c'è nessuna necessità di cambiare il mezzo di coltura. Tempi di incubazione più lunghi, il terreno di coltura dovrebbe essere cambiato ogni 2-3 giorni. - Dopo il tempo di incubazione desiderato, trasferire le sezioni di interesse a un vetrino coprioggetti 8-a temperatura ambiente e aggiungere 3-5 µ l di terreno di coltura. Posto il vetrino coprioggetto in una camera climatica (37 ° C, umidità 60%, 5% CO2) collegato a un invertito filatura disco confocale equipaggiato con un software di acquisizione di computer-assistita di set-up la sessione di imaging time-lapse.
Nota: In alternativa, sezioni possono essere fissati con paraformaldeide al 4% (durante la notte a 4 ° C o 2 ore a temperatura ambiente) e, successivamente, immunostained con anticorpi differenti per la visualizzazione delle caratteristiche morfologiche di individulamente INs sotto un confocale microscopio. Anche se eGFP e mCherry possono essere visualizzate mediante microscopia confocale senza alcuna procedura di contro-colorazione, si consiglia di eseguire immunohistochemistry contro GFP e mCherry per migliorare il segnale, poiché il processo di fissazione può ridurre la fluorescenza, riducendo il rilevamento di componenti più fini dei neuroni embrionali, come rami più piccoli nei processi iniziali o finali.
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Representative Results
In questa sezione forniamo risultati rappresentativi ottenuti seguendo l'elettroporazione ex utero di un plasmide di controllo, o di un plasmide sperimentale un gene di interesse, in MGE degli embrioni del mouse e13.5 seguita da colture organotipiche fetta di targeting incubati a 37 ° C per 48 h (per l'imaging di time-lapse) o 72 h (per la fissazione e l'etichettatura immunohistochemical) (cfr. Figura 1B per protocollo schematico). Esempi rappresentativi di INs la migrazione da un explant MGE sono anche illustrati (Vedi Figura 1 per protocollo schematico) come un confronto con il metodo descritto qui. L'elettroporazione di un plasmide nei progenitori MGE sembra ritardare l'uscita di INs da MGE e tempo della coltura deve essere regolato di conseguenza.
In un esperimento riuscito, fette organotipiche appaiono sani al microscopio confocale, strati cioè corticali sono facilmente distinguibili utilizzando la modalità di campo luminoso e non c'è nessuna contaminazione visibile sulla superficie fetta (riconoscibile da intenso autofluorescenza e la presenza di filamenti fluorescente visibile sotto epifluorescenza). A fette sano organotipiche cronica, circa il 20% delle cellule apoptosi dopo 72 h nella cultura (Figura 2), come descritto in precedenza in cronica organotipiche culture (ad es. postnatale culture)52. Tuttavia, struttura cerebrale cytoarchitectural lordo rimane ben definito, come illustrato qui utilizzando DAPI macchiatura (Figura 2A). Il nostro protocollo per l'elettroporazione ex vivo di MGE produce una media di 50-100 cellule trasfettate per fetta (Figura 3AB), delle quali 5-20 cellule saranno visibili la migrazione dorsalmente dopo 72 h nella cultura. Dopo la fissazione e la macchiatura immunohistochemical, INs tangenzialmente migrando verso la placca corticale può essere facilmente identificato con microscopia confocale quanto presentano un corpo cellulare ovale allungata, il processo finale occasionale e un processo leader orientata tangenzialmente. Il processo principale solitamente dà origine a uno o due rami ed è riconoscibile per la presenza di un gonfiore occasionale di fronte al nucleo (che ospita il centrosoma prima nucleokinesis) e dei coni di crescita alla fine di ogni ramo. (Figura 3-G).
Questo protocollo è stato progettato per l'osservazione della migrazione MGE-derivati aggiuntivi a livello di singola cellula usando la formazione immagine di time-lapse. Per questo particolare esperimento (Figura 4), fettine di cervello organotypic della corona sono stati generati da Dlx5/6Cre; RCEEGFP individulamente embrioni alle e13.5 con un plasmide esprimente un shRNA sperimentale (targeting per un gene di interesse) e la cassetta di TdTomato . Le fette sono state incubate per 48 h, trasferite ad un piatto di 8 pozzetti chambered vetrino coprioggetti (1 fetta per alloggiamento galleggia su un sottile strato di terreno di coltura completato) ed imaged ogni 3 minuti per 6-8 h utilizzando un obiettivo di aria (0.70 NA) 20x su un microscopio invertito attrezzato con una testa confocal di filatura disco, un software di acquisizione di computer-assistita e una camera ambientale di palcoscenico-top. Durante la formazione immagine, le fette erano tenute a 37 ° C e sono stati continuamente ossigenate e umidificare nella camera ambientale (5% CO2 e 60% H2O). INs individulamente MGE-derivati sono stati identificati come tali dalla loro espressione di eGFP, confermando la loro identità di GABAergic IN e la loro espressione di TdTomato, confermando che esprimono il plasmide sperimentale (Figura 4AB). Electroporated INs sono facilmente identificabili e ben isolato, come si vede in Figura 4, consentendo l'analisi più fine di parametri dinamici di migrazione, come velocità e distanza percorsa. Inoltre, con etichetta INs sono visti migrazione tangenzialmente verso la piastra corticale, mentre nel loro ambiente naturale, che ci permette di identificare i cambiamenti morfologici dinamici quali ramificazione del processo principale e nucleokinesis (Figura 4 -F).
L'elettroporazione ex vivo di MGE-derivati aggiuntivi possa essere combinato anche con MGE espianti per consentire la formazione immagine di alta risoluzione della dinamica del citoscheletro processi che si verificano durante la migrazione, come complemento allo studio delle dinamiche migratorie e direzionalità in colture organotipiche. Ad esempio, si possono osservare diverse fasi di un neurone locomozione ricordano quelle che si verificano durante la migrazione tangenziale di INs in colture organotipiche fetta in individulamente INs la migrazione da un MGE explant 48 h dopo l'elettroporazione, come leader estensione del neurite e nucleokinesis (figura 5B-E). Vari processi del citoscheletro possono essere quindi studiati ad alta risoluzione in cellule isolate la migrazione da un explant MGE, per esempio dalla macchiatura strutture di F-actina con falloidina (Figura 6A), che non può essere realizzato in modo ottimale nella organotipiche fette Data l'alta densità cellulare (e quindi degli elementi citoscheletrici) in un ambiente nativo. Questi processi del citoscheletro, e in particolare F-actina che ritocca, può più ulteriormente essere studiato dinamicamente combinando Lifeact espressione con formazione immagine di time-lapse. Per esempio, mostriamo un esempio di imaging ad alta risoluzione time-lapse of un IN derivato da un explant MGE ottenuto da un NKX 2.1Cre; RCEEGFP cervello di topo che trasportano un'omissione mirata di un gene di interesse in INs. Questo IN Ultima transfected con il plasmide mCherry-Lifeact-7 sotto il controllo del promotore CMV (regalo da Michael Davidson), utilizzando il metodo schematizzato in Figura 1, che consente il tracciamento di F-actina rimodellamento che si verificano in tempo reale (Figura 6B). così, mentre colture organotipiche sono tenuti a valutare correttamente il percorso direzionalità, ovvero la migrazione di INs geneticamente, MGE espianti possono integrare tali studi fornendo accesso migliore alle cellule isolate per imaging ad alta risoluzione di processi dinamici del citoscheletro.
Insidie tecniche possono provocare il guasto degli esperimenti descritti sopra. Per esempio, incorporare i cervelli in una soluzione di agarosio più calda di 42 ° C può provocare distruzione tissutale e morte neuronale, rivelato da una perdita di traslucenza del cervello o fette, che diventano opache. Tuttavia, la temperatura non dovrebbe essere tenuta troppo bassa, come una soluzione di agarosio solidificazione può distruggere il fragile cervello embrionale durante il processo di incorporamento. In secondo luogo, la contaminazione può ridurre significativamente la resa degli approcci sperimentali descritti qui. Così, tutti i passaggi dovrebbero essere effettuati con cura, in condizioni di sterilità severe quanto fattibile. Tutte le soluzioni e le attrezzature devono essere sterilizzati prima dell'uso e attrezzature devono essere frequentemente irrorate con etanolo al 70% per evitare la contaminazione da batteri o muffe. Contaminazione può essere visibile direttamente nei pozzetti per cultura, come terreno di coltura diventa giallo o opaco. Contaminazione può passare inosservati quando il terreno di coltura rimane chiaro e fluido. Tuttavia, solitamente si può osservare uno strato di muffa sulla superficie fetta o le fette diventano eccessivamente fragili durante la fissazione e la procedura di colorazione. Quando tali fette sono visualizzati sotto il microscopio, contaminazione può manifestarsi come uno strato di autofluorescenza sopra i neuroni con etichettati o essere rivelata dalla presenza di filamenti fluorescente lunga. Organotipiche fette tenuti in pozzi contaminati dovrebbero essere buttati fuori, ma le fette coltivate in altri pozzetti della piastra stessa possono essere mantenute per ulteriori passi. Contaminazione batterica è abbastanza rara, ma dovrebbe essere presa sul serio, che significa che tutte le attrezzature, tra cui incubatori comuni e camera di cultura dovrebbero essere pulite e sterilizzate manualmente.
Figura 1: Rappresentazioni schematiche dei protocolli per ex utero elettroporazione seguirono dalla cultura di fetta organotypic o espianti MGE. R. esempio di un'installazione mobile di biosicurezza con tutti gli strumenti sterilizzati necessari per il protocollo descritto qui. B. rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per le culture di fetta di elettroporazione e organotipiche ex utero . In breve, gli embrioni vengono decapitati, il plasmide sperimentale viene iniettato nel ventricolo laterale (1) e individulamente in MGE (2). Il cervello è microdissected fuori del cranio (3) e incorporato in agarosio (4). Organotipiche sezioni sono generati su un vibratomo (5) e messi in coltura a 37 °C(6) per 48 h per microscopia time-lapse (7.1) o 72 h per ricostruzioni delle cellule (7,2). C. rappresentazione schematica del protocollo adattato da Myers et al 201353 e utilizzato per la generazione di MGE espianti. Brevemente, cortecce dorsolaterale sono in primo luogo dissecate fuori da 12.5 a embrioni di topo di tipo selvatico e 14.5 (1) e dissociate meccanicamente nel terreno di coltura completato (2). Cellule corticali sono placcate con una densità di 5,25 x 105 cellule corticali/cm2 e coltivate per 2 h a 37 ° C in un coprioggetto 8-chambered collagene/poli-L-lisina-rivestito (3). Quindi, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embrioni vengono elaborati per ex utero elettroporazione di MGE (4, 5), e MGE manualmente è isolato dal cervello e tagliare in 100 µm2 frammenti (6). Questi espianti quindi collocati sopra lo strato corticale precedentemente preparato alimentatore, coperti con terreno di coltura e co-coltivate per 48 h prima di time-lapse imaging (7). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: conservato cytoarchitecture a fette sano organotipiche. La generazione di organotipiche affettare culture dopo ex vivo elettroporazione di NKX 2.1Cre; RCEEGFP embrioni del mouse (A) non provoca danni ai tessuti significativi, come rivelato da conservato cytoarchitecture (DAPI (blu) e Cre-reporter (GFP)), rispetto ad un 18 donatrici di µm di spessore da un NKX 2.1Cre; RCEEGFP via embrione con 4% PFA presso e15.5. D e M indicano asse dorso-ventrale e latero-mediale, rispettivamente. (B). immagini ad alto ingrandimento con un microscopio confocale invertito dotate di una x 63 / 1.4 obiettivo di olio dopo colorazione con un anticorpo anti-spaccati-caspasi 3 (Cl-cas3) rivelano che circa il 20% delle cellule nel piatto corticale subiscono apoptosi (frecce bianche) dopo 72 h nella cultura, mentre GFP-positive INs soggiorno sano (freccia bianca), come esemplificato nelle microfotografie in C-C ' '. In confronto, apoptosi cellulare sono quasi completamente assente dalle donatrici sottile da un animale perfuso (D-D ' '). Scala bar: 250 µm (A-B) e 15 µm (C-D ' '). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: organotipiche fette dei topi del cervello embrioni e microfotografie di alto ingrandimento di individulamente interneuroni (INs). R. una cultura di fetta organotypic da un Dlx5/6Cre; RCEEGFP cervello di topo (in cui tutti i aggiuntivi sono verdi) elettroporate con un Dlx5/6::shRNAuova strapazzate-IRES-TdTomato plasmide. La fetta è stata fissata con 4% PFA dopo 72 h in cultura e immunostained per GFP e mCherry. Electroporated INs erano imaged in 3D (50-60 µm di spessore z-stack con sezioni ottiche prese ogni 0,5 µm) utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con una x 63 / 1.3 obiettivo olio NA. In migrazione tangenzialmente nella zona sub-ventricolare del Pallio dorsale sono facilmente identificabile (freccia rossa, aperta). D e M indicano asse dorso-ventrale e latero-mediale, rispettivamente. B. una rappresentante organotipiche fetta cultura da un electoporated di embrione wildtype (WT) con un controllo Dlx5/6::shRNAuova strapazzate-IRES-TdTomato plasmide, fissato a 72 h e immunostained per mCherry solo. Individulamente INs (rosso) sono visti migrando dorsalmente verso la placca corticale. Electroporated INs sono identificati dal loro co-espressione di TdTomato ed EGFP in Dlx5/6Cre; RCEEGFP topi (C-D), o dalla loro espressione di TdTomato solo nei topi WT (E-H) e dalla loro morfologia tipica, cioè un ovale delle cellule corpo, un processo leader ramificato (bianchi punte di freccia, D-H), un occasionali finali processo (freccia bianca, C-D) e un gonfiore occasionale del processo principale ospita il centrosoma prima nucleokinesis (stella bianca in C-C' e G). Scala bar: 250 µm (A-B) e 25 µm (C-H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Time-lapse live-imaging di individulamente INs a organotipiche fette coltivate per 48 h. INs individulamente alle e13.5 con un sperimentale plasmide esprimente la cassetta di TdTomato e un shRNA targeting un gene di interesse sono visti in migrazione tangenziale in una fetta di cervello organotipiche ottenuto da un Dlx5/6Cre; RCEEGFP embrione di topo dopo 48 h di cultura (A, bianco square). In B, la stessa individulamente IN (quadrato bianco) è visto nel processo di nucleokinesis, durante la migrazione tangenzialmente nella corteccia, cioè parallela alla superficie pial ed è seguita in time-lapse imaging ogni 3 minuti per 8 h con un 20 x / 0.85 aria NA obiettivo (allargate scatole, C-F). Il neurone Visualizza inizialmente un corpo allungato di cella (freccia aperta) nel processo di nucleokinesis (C), così come un processo finale (freccia bianca) e un processo leader ramificato (frecce bianche). Dopo 3 h di vivere-imaging, la nucleokinesis è stata completata, il processo finale ha ritrattato e il processo principale si estende due rami lunghi (D, punte di freccia bianche). Dopo 5 h 30 min, uno del ramo principale del processo ha ritrattato (frecce bianche) e il corpo cellulare del neurone (freccia aperta) è spostato in avanti circa 10 µm (E). Infine, dopo 8 ore di formazione immagine, migrazione è stato sospeso, il neurone ha esteso il suo processo leader ancora e un processo finale è apparso (freccia bianca), ma il nucleo (freccia aperta) non ha ancora spostato in avanti (F). Scala bar: 250 µm (A), 70 µm (B) e 30 µm (C-F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Time-lapse imaging di INs derivato da un explant MGE coltivato per 48 h. INs sono visti migrazione fuori un explant MGE ottenuti da un NKX 2.1Cre; RCEEGFP mouse (nel quale tutto MGE-derivato INs express eGFP) elettroporate con il plasmide CMV::mCherry-LifeAct-7 a e13.5, utilizzando il metodo adattato da Myers et al 201353 e schematizzato in Figura 1, e coltivate per 48 h (A). INs sono stati visualizzati facendo uso di time-lapse live-imaging per 5 h (B-E). In questo esempio, una IN cheesprimono eGFP e LifeAct è visto inizialmente nel processo di nucleokinesis (freccia aperta) e si estende due rami principali di processo (punte di freccia bianche; B). IN questa completa nucleokinesis dopo 1 h (vedi freccia aperta), in quanto il corpo cellulare è spostato in avanti e un processo finale è apparso nella parte posteriore del corpo cellulare (freccia bianca) e Mostra ancora il leader un processo con due rami (punte di freccia bianche; C). un secondo nucleokinesis è in corso dopo 2 h 30 min (frecce aperte) e IN questo momento è dotato di due processi principali che proviene dal corpo cellulare e un processo più finale (freccia bianca; D). Infine, dopo 5 h, IN ritrae una neurite mentre dispostamento il centrosoma nel ramo processo leader rimanenti (freccia bianca) in preparazione per un terzo nucleokinesis, con un processo finale (freccia bianca) ancora presente nella parte posteriore il corpo cellulare (E). Scala bar: 70 µm (A) e 20 µm (B-E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: coltivate time-lapse di actina che ritocca in INs da un explant MGE di imaging ad alta risoluzione per 48 h. r. Una fetta organotypic da un NKX 2.1Cre; RCEEGFP cervello del topo è fissato a e15.5, macchiato con falloidina Alexa-594, consentendo la visualizzazione di actina filamentosa. INs sono Imaging utilizzando una x 63 / 1.3 obiettivo olio NA su un microscopio confocale. Nel sano INs, actina filamentosa è visto foggiare a coppa la parte posteriore del corpo cellulare seguendo la retrazione del processo finale dopo il completamento del nucleokinesis (freccia bianca, A'-A ' '). B. espianto An MGE è ottenuto come sopra da un NKX 2.1Cre; RCEEGFP cervello di topo che trasportano un'omissione mirata di un gene di interesse ed elettroporate con un plasmide esprimente mCherry-Lifeact-7 sotto il controllo del promotore CMV . Time-lapse live imaging viene eseguita dopo 48 h di cultura e individulamente INs sono seguiti ogni 3 minuti per 3 h utilizzando un 40 x / 0.85 obiettivo di aria. Attivo rimodellamento del citoscheletro si verifica nel IN transfected con LifeAct, come esemplificato dal movimento del rosso (bianco in immagini in bianco e nero) fluorescente puntini all'interno i coni leader di processo e di crescita (frecce bianche) e nella parte posteriore del corpo cellulare durante nucleokinesis (B-B ' ', bianco di frecce). Scala bar: 7 µm (A-A ' ') e 10 µm (B-B ' '). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo articolo, forniamo un metodo affidabile per l'esecuzione ex utero elettroporazione del mouse MGE presso e13.5 e per la generazione di colture organotipiche di fette del cervello embrionale. Sebbene metodi in vitro , quali l'analisi della camera di Boyden, sono relativamente facili da eseguire e possono essere utilizzati per valutare i ruoli specifici di diversi geni e proteine senza l'interferenza di altri fattori, precludono l'indagine IN dinamiche di migrazione per quanto riguarda la direzionalità e migrazione percorso25. Espianti MGE forniscono un mezzo utile per studiare i cambiamenti dinamici del citoscheletro che si verificano durante la migrazione, come indichiamo qui, ma sono privi di spunti più endogene e spesso richiedono l'aggiunta di spunti di orientamento per promuovere la migrazione neuronale (anche se questo è significativamente migliorato quando MGE espianti sono coltivate su strati corticali alimentatore)25,54. Ciò nonostante, saggi basati su espianti MGE possono non rilevare l'implicazione dei segnali molecolari coinvolti in meccanismi più sottili come quelli guidando il percorso specifico di direzionalità, ovvero la migrazione di INs29. Questo problema alla fine fu aggirato da in utero elettroporazione25, che consente per l'etichettatura specifica di MGE-derivato INs la migrazione nel loro ambiente nativo13,29,41. Tuttavia, tale tecnica è abilità-una sfida, a causa delle procedure chirurgiche coinvolte, e la sua resa è limitata dal basso tasso di sopravvivenza degli embrioni e il fatto che il MGE è difficile all'obiettivo nell'utero, spesso richiedono l'uso di più cucciolate di raggiungere il significato55. Quindi, ex utero elettroporazione di MGE seguita da organotipiche coltura degli embrioni di cervello di topi fornisce un metodo di basso costo, tempo-efficiente e affidabile per studiare le dinamiche di migrazione e la morfologia di MGE-derivati aggiuntivi nella loro naturale ambiente, mentre eludere le procedure chirurgiche di elettroporazione nell'utero e l'esigenza di orientamento spunti in espianti MGE. Inoltre, questa tecnica permette un più facile accesso per MGE, che possa essere mirati da apposite direttamente l'elettrodo positivo sotto il collo e quello negativo in cima alla testa, una configurazione più difficile adottare in utero. In alternativa, MGE focale può essere iniettato e individulamente direttamente dopo la generazione organotipiche fette13,25,29, ma tale tecnica si è rivelata più difficile e meno efficace nelle nostre mani rispetto al protocollo descritto qui. Seguendo la procedura descritta in questo articolo, si otterrà 50-100 individulamente MGE-derivato INs per fetta organotypic, 5-20 dei quali saranno visibili migrazione tangenzialmente dal MGE dopo 72 h. Transfected INs possono essere visualizzati dal vivo con formazione immagine di time-lapse o immaginata e ricostruita dopo la fissazione e l'etichettatura immunohistochemical.
Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per studiare IN migrazione ex vivo e fu ispirato dai vari protocolli pubblicati che descrivono nell'utero elettroporazione di MGE-derivato INs, ex vivo MGE iniezione ed elettroporazione, o il generazione di cronica organotipiche cervello fetta culture36,38,39,42,43,56,57,58. Il nostro approccio limita il danno potenziale ai progenitori MGE utilizzando bassa intensità degli impulsi (40 V) e iniezioni di plasmide intraventricolare, piuttosto che le iniezioni intra MGE con impulsi ad alta tensione (100 V), come descritto altrove39,56 ,57,58. Inoltre, mentre altri utilizzano una combinazione di penicillina, streptomicina e gentamicina per prevenire la contaminazione batterica39,56,57,58, abbiamo optato per evitare gli antibiotici nel nostro terreno di coltura, poiché teoricamente possono influenzare IN migrazione. In particolare, la penicillina è un antagonista del recettore GABAA 59,60, e l'attivazione dei recettori GABAA attiva e successivamente si ferma IN migrazione a seconda delle sfumature di cloruro intracellulare e KCC2 espressione in diverse fasi della migrazione61. Tuttavia, utilizzando le varie precauzioni indicate nel protocollo attuale, contaminazione possa essere efficacemente evitati anche in assenza di antibiotici.
Nonostante l'efficienza di questo approccio nelle nostre mani, ex utero elettroporazione ha anche i suoi svantaggi. Mentre fornendo un naturale ambiente tridimensionale per cellule di migrare, può essere difficile eseguire dosaggi farmacologici in fette organotipiche nel contesto della migrazione. Infatti, la migrazione di INs MGE-derivato principalmente dipende da segnali extracellulari2,13,19 e l'applicazione di inibitori farmacologici o attivatori su organotipiche fette non permette la precisa dissociazione degli effetti autonoma delle cellule dagli effetti globali sulla salute generale fetta o attività. Per tali esperimenti, espianti MGE cresciute miste cellule corticali dissociate potrebbero essere preferibile fetta su colture organotipiche, poiché INs migrazione dall'espianto può essere più facilmente isolato e selettivamente esposti a composti specifici62. Inoltre, sebbene ex utero elettroporazione è più facile da eseguire rispetto nell'utero elettroporazione, può ancora essere tecnicamente impegnativo alle età embrionale illustrato qui data la piccola dimensione e la fragilità dei cervelli embrionali presso E13.5. i ricercatori hanno bisogno di un paio di prove per estrarre in modo efficiente i cervelli individulamente alle e13.5 senza danneggiare la superficie del cervello. Inoltre, al contrario di fette postnatale, embrionale organotipiche fette non possono essere tenute in coltura per lunghi periodi di tempo. Anche se su colture organotipiche embrionali fetta possono essere mantenuti per almeno 7 giorni in vitro63, questo non è stato combinato con elettroporazione e gli esperimenti descritti qui sono stati testati per fino a 3 giorni in vitro con risultati affidabili nelle nostre mani. Pertanto, gli investigatori necessario eseguire test di ottimizzazione in anticipo se sono necessari tempi di incubazione più lunghi. Inoltre, l'indagine IN sviluppo presso stadi embrionali o precoce postnatale non è raccomandato con questa tecnica quando si utilizza e13.5 embrioni25, ma può essere realizzato con elettroporazione nell'utero , dove con successo individulamente embrioni vengono reinseriti nella cavità uterina e possono essere lasciati per essere nato e analizzati alle successive fasi21,64. Infine, elettroporazione ex utero seguita da colture organotipiche fetta consente per l'analisi di sia la morfologia e le dinamiche di migrazione di sviluppo aggiuntivi. Tuttavia, come esso è stato precedentemente sottolineato per in utero elettroporazione tecnica36, ex utero elettroporazioni resa 50-100 electoporated cellule per fetta di cervello e quindi non sono adatti per l'analisi della popolazione. Tali indagini sono svolte meglio nei modelli animali che trasportano un completo o condizionale eliminazione (o knock-in) del gene di interesse. Quando disponibili, tali modelli quindi possono essere utilizzati in modo efficiente per generare colture organotipiche fetta o MGE espianti per visualizzare le effettive dinamiche di IN migrazione, come dimostrato qui (vedere la Figura 5 e Figura 6).
Molti punti in questo protocollo dovrebbero essere effettuate con attenzione per ottenere risultati ottimali. Ad esempio, è primordiale che tutti i passaggi sono eseguiti in severe condizioni di sterilità come contaminazione può avvenire abbastanza facilmente. Guanti e strumenti utilizzati di fuori della cappa di biosicurezza dovrebbero essere spruzzati con etanolo al 70% frequentemente durante l'intera procedura. Inoltre, soluzioni come terreni di coltura e liquido cerebrospinale artificiale dovrebbero essere mantenuti sterile e freddo (4 ° C) e fatta fresca ogni 2-3 settimane. Per etichettare MGE-derivato INs più specificamente, plasmidi che verranno utilizzati in tali esperimenti dovrebbero essere clonati sotto il controllo di un promotore IN specifiche (ex: Dlx5/649, Lhx665), invece di affidarsi semplicemente la forma anatomica targeting di MGE. La generazione di fette organotipiche richiede il cervello a rimanere in vita. Così, per preservare la salute delle cellule e sopravvivenza, questo esperimento deve svolgersi in meno di 3 ore dal momento che gli embrioni vengono recuperati fino a quando le fette organotipiche sono messi in coltura. Per l'efficienza temporale, piastre di coltura possono essere pre-riempite con terreno di coltura in casa appena prima di iniziare l'esperimento e messo nell'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C fino all'utilizzo. Inoltre, il cervello dovrebbe essere dissecato accuratamente fuori del cranio senza alcun danno alla superficie corticale al fine di raggiungere l'incorporamento corretto nella soluzione di agarosio e successiva vibratome-sezionamento. Per esempio, possono provocare danni alla superficie corticale, anche minima, nel distacco delle 250 µm di spessore sezioni dal gel dell'agarosi circostante o nella degradazione delle sezioni durante il sezionamento del vibratome. Per la sopravvivenza neuronale, è inoltre fondamentale che la temperatura della soluzione di agarosio rimane vicino a 42 ° C, come temperature più elevate portano alla morte di danno e delle cellule del tessuto, mentre temperature più basse non consentiranno l'incorporamento corretto del cervello (o danneggiarlo durante il processo di incorporamento). Una volta nella cultura, per evitare altre fonti di contaminazione, le fette non devono essere manipolate fino a quando non vengono trasferiti al microscopio per l'imaging. Questa procedura deve avvenire in un ambiente sterilizzato e dovrà prestare attenzione a non contaminare le piastre dopo queste manipolazioni, soprattutto se hanno bisogno di essere rimesso in coltura per re-imaging delle successive. Infine, si sconsiglia di recuperando un'aliquota di DNA misto con tintura di caricamento da precedenti esperimenti per un utilizzo futuro come abbiamo osservato una notevole riduzione della resa dei neuroni elettroporate con tale materiale.
In conclusione, l'ex utero elettroporazione e organotipiche fetta cultura il protocollo sopra descritto permette l'etichettatura specifica di MGE-derivati aggiuntivi a livello di singola cellula e può essere utilizzato per manipolare geneticamente vie molecolari specifiche per studiare il loro ruolo nel regolare i cambiamenti morfologici e dinamiche di migrazione di INs tangenzialmente la migrazione. Questo metodo consente la rapida e a basso costo ricerca iniziale funzionale di nuovi geni candidati identificati tramite sequenziamento di RNA singola cella di migratori INs66,67 o tramite sequenziamento di nuova generazione dei pazienti con i disordini neurodevelopmental68,69,70. Questa tecnica è stato ampiamente utilizzata per studiare la migrazione in altre popolazioni di cellule, compreso le cellule piramidali della corteccia e nell'ippocampo70,71,72,73. Una volta imparato, esso potenzialmente utilizzabili all'immagine il riciclaggio e il traffico di proteine di membrana, come recettori e canali usando GFP-etichettato proteine; l'attivazione di Cascate di segnalazione cellulare specifiche usando biosensori74; o anche il monitoraggio e la manipolazione di attività cellulare usando la formazione immagine del calcio accoppiata al optogenetica in INs corticale, ma anche in altre zone del cervello, come l'ippocampo, l'amigdala o anche il corpo striato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare. Le opinioni qui espresse non rappresentano necessariamente le opinioni di ministro della sanità o il governo del Canada.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla Fondazione Savoy e Fondazione Epilessia cura di funzionamento e di attrezzature concede dalla Fondazione canadese per l'innovazione al pronto soccorso (microscopio confocale) e Gallo (microscopio confocale del disco di filatura). Pronto soccorso riceve un premio alla carriera dalla Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) così come dalla canadese Institutes for Health Research (CIHR; Premio giovane ricercatore). G.H. è un anziano studioso di FRQ-S. L. e è il destinatario del premio di formazione post-dottorato Steriade-Savoia dal Savoy Foundation, il premio di formazione post-dottorato CHU Sainte-Justine Foundation e il premio di formazione post-dottorato FRQ-S, in collaborazione con la Fondazione delle stelle. Questo progetto è stato reso possibile dal cervello Canada attraverso il fondo di ricerca del cervello Canada, con il sostegno finanziario di Health Canada, assegnato a L.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
References
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