Summary
여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.
Abstract
GABAergic 수 (INs)는 인식 및 행동 신경 네트워크의 중요 한 요소입니다. 피 질을 예정 하는 기능 내장 및 외부의 복 부 telencephalon 등는 중간과 꼬리 절 정령 (MGE, CGE)에서 다양 한 응답 등 외피 격판덮개에 그들의 장소에서 접선 마이그레이션 단서. 다른 방법론 유전자 특정 경로 조작 하 고 그들이 적절 한에 필요한 동적 cytoskeletal 변화를 조절 하는 어떻게 조사를 수 년에 걸쳐 개발 된 마이그레이션에서. Electroporation utero에서 광범위 하 게 유전자 억제의 효과 연구 하는 데 사용 되었습니다 또는 형태학 및 마지막 위치에 미치는 영향을 평가 하는 동안 특정에 있는 overexpression 하위. 그러나,이 접근은 쉽게 광선 마이그레이션 피라미드 셀을 수정 하는 데 사용 됩니다, 그것은 더 많은 기술적으로 도전적인 electroporation utero에 기능을 대상으로 주어진 새끼의 감소 생존 율이 낮은 수익률을 생성할 때 때 electroporation은 e14.5, 관례 이다 MGE 파생 기능을 공부 하기 전에 수행 됩니다. 다른 접근 방법, MGE explants는 MGE에 쉽게 액세스를 제공 하 고 촉진 유전자 변형 기능 영상. 그러나, 이러한 explants 기능 생 지도 단서와 thalamic 입력 없는 인공 매트릭스로 마이그레이션합니다. 이 기능 utero에 접근의 기술적인 문제를 우회 하는 동안 더 자연 환경에서 마이그레이션할 수 있는 방법 최적화 하 라는 메시지가 나타납니다. 이 논문에서는, organotypic 슬라이스 문화 쉽게 추적, 이미지 응답으로 그들의 자연적인 경로 따라 이동 하는 유전자 변형된 기능을 재구성 하 여 다음 배아 마우스 두뇌의 전 utero electroporation 조합 설명 생 큐입니다. 이 방법은 마이그레이션 시간 경과 공초점 영상과 동적 측면으로 고정된 immunolabeled 조직에 신경 개조를 사용 하 여 다양 한 형태학 매개 변수의 상세한 분석은 모두 정량화 할 수 있습니다.
Introduction
대뇌 피 질의 GABAergic 수 (INs)는 그들의 생 화 확 적인 속성, 생리 적인 속성과 연결에 관해서는 다양 한 그리고 그들은 성숙 네트워크1,2,3 에에서 다른 기능을 중재 ,45. 대뇌 피 질의 기능의 다른 하위 사양 광범위 하 게 공부1,2되었습니다 유전 계곡을 통해 밀접 하 게 통제 된다. 대뇌 피 질의 GABAergic 기능의 대부분 (70%) 중간 절 예 (MGE) ventrally 위치 미 발달 구조에서에서 창시자에서 발생 하 고 외피 격판덮개1, 에 도달 비교적 긴 거리에 걸쳐 마이그레이션 해야 합니다. 2 , 6. 대뇌 피 질의 각 추 모양 세포 (VZ) 심 실 지역에서 광선으로 마이그레이션할 따라 방사형 명과 비 계 외피 격판덮개, 같은 비 계에 연결 되지 않습니다, 기능의 접선 이동 합니다 다양 한 내장과 비 대뇌 피 질의 구조2,7,8에서 그들을 지도 하는 동안 대뇌 피 질의 판으로 마이그레이션 신경 유치의 외부 단서 세포 주기 후, 기능 화학 불쾌 신호 트리거 외피 격판덮개9,10으로 접선 마이그레이션 MGE VZ 내 표현으로 MGE에서 격퇴는. 마이그레이션 기능 방지 다른 불쾌 신호11 의 도움으로가 고, 외피 격판덮개에 도달, 그들은 접선에서 방사형 마이그레이션 모드로 전환 피라미드에서 신호에 응답 부분에서 그들의 마지막 층 류 위치에 도달 셀12 그리고 다른 세포 인구13. 다른 신경 인구에 관해서는, 기능의 마이그레이션 신경의 실제 움직임을 허용 하도록 다양 한 동적 형태학 상 변화를 포함 한다. 이 소위 신경 운동 3 연속 단계 반복 주기 특징 이다: 주요 과정, 핵 (nucleokinesis)의 활성 참가자 움직임과 후행 프로세스14의 철회의 신장. 마이그레이션에를 개장 하는 분기 및 활성 방향 및 마이그레이션14,15의 속도 결정 올바른 방향으로 기능을 안내 하는 최고의 과정의 수많은 기본 및 외부 신호에 의해 통제 된다 ,16.
최근 몇 년 동안1,2,7,17,18,,1920, 마이그레이션에 대뇌 피 질의 규제 결정 광범위 하 게 연구 그리고 이러한 분자 배우의 일부 장애 neurodevelopmental 장애, 소아 내 화 간 질 또는 자폐증 스펙트럼 장애1,2,21, 등으로 이어질 postulated 되었습니다. 22 , 23 , 24. 따라서, 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 방법의 개발은 이전 검토25이 동적 과정을 공부 하는 우리의 능력을 크게 추구 되었습니다. 생체 외에서 포함 하 여 방법 Boyden 챔버 분석 결과 스트라이프 선택 분석 결과 신경 마이그레이션 중 요구 사항 및 특정 유전자 또는 단백질의 세포 자치 영향 평가의 빠르고 가장 재생 가능한 수단을 제공 없이 다른 요인25의 영향. 이 분석 실험은 라이브 이미징8,,2627와 결합 될 때 특히 유용 합니다. 이러한 기술로 쉽게 e13.5 MGE에서에서 검색 기능과 같이 이전8,28 후 다른 신호 경로 지도 단서 조사 수 있다, 효소 그리고 기계적인 분리 하 여 격리 . 그러나,이 분석 실험은 3 차원 조직 아키텍처, 잠재적으로 셀 이동 또는 생존25에 영향을 미치는 신경 행동 및 셀 속성을 변경할 수 없을 경우에는 인공 기질에서 일어난다. 이러한 한계를 회피, ex vivo MGE explants 계량 동적 형태학 변화 속도 방향14, 같은 매개 변수와 함께 마이그레이션 중 발생 하는 대체 도구로 개발 되었습니다. 29. MGE explants 생성은 비교적 간단 하 고 광범위 하 게 되었습니다30설명 되어. 그것은 비록 후자는 선택적31matrigel과 콜라겐 매력 또는 반발 신호25, 존재의 혼합물 또는 혼합된 대뇌 피 질의 세포의 단층에 MGE의 작은 추출의 도금을 수반. MGE explants 고해상도 띄엄띄엄 레이블이 지정 된 셀의 이미징, 세포내 프로세스, 분기, 주요 과정 cytoskeletal 개장 같이 이전32,33 등의 연구를 단순화에 대 한 허용 34 및 현재 연구에서. MGE explants 성공적으로 (참조, 예를 들어 Tielens 외. 201633) 예를 들어 특정 약리 또는 혈 조작 후 2D 환경에서 마이그레이션에서 동안 동적 cytoskeletal 변화를 평가 하는 데 사용 되었습니다. . 그러나,이 방식으로 인공 매트릭스 내 마이그레이션 기능 그리고이 재현성 및 실험 결과의 의미와 동작 변경할 수 있습니다.
대조적으로, electroporation utero에서 그들의 네이티브 환경에서의 유전자 조작 가능 하 게 그리고 신속 하 고 효율적으로 유전자 기능의 손실과 이득의 영향의 한계를 우회 하는 동안 평가에 널리 사용 되는 방법 비용과 시간이 많이 걸리는 녹아웃 그리고 노크에서 전략25,35. Electroporation utero에서 수 수 편견으로 창시자에 셀 유형 특정 발기인을 사용 하 여와 MGE36를 포함 하 여 ventromedial 구조 쪽으로 전극을 배치 하 여. 또한, utero에서 electroporation 허용 1-2 일 이내 실험적인 구문의 적시 식 구조 식을 사용 하 여 바이러스에 필요한 7-10 일에 비해 벡터25스 그러나 utero에서 electroporation의 창시자에 낮 열매를 산출 하 경향이 있다. 실제로, 지 심 실 지역에 위치한 피라미드 셀 창시자를 효율적으로 페 수 있지만 utero에서 를 사용 하 여 electroporation, MGE, 같은 더 ventrally 위치 구조를 대상으로 더 기술적으로 도전적인, 작은 e13.5에서 특히 배아 및 배아 치 더 높은 속도 실험 수익률25을 감소 시킨다.
생체 외에서 와 관련 된 기술적 제한 중 일부를 회피 MGE explant 실험 및 electroporation utero에서 vivo에서 , organotypic 슬라이스 문화 비보 전 개발된8,37, 38,39. 뇌 organotypic 슬라이스 문화 제공, vivo에서 흉내 낸의 이용 조건, 저렴 하 고 보다 생성 동물 모델25시간이 되는 동안. 사실, 이러한 준비 기능, 특정 시각화 함께 MGE에 쉽게 액세스할 수 있도록 하 고 더 생리 환경8 마이그레이션 기능에 특정 분자 경로 조사 하기 위해 초점 electroporation 결합 될 수 있다 , 39 , 40 , 41. 우리 따라서 organotypic 문화38, 우리 전 utero electroporation와 시간 경과 confocal 영상 결합에 대 한 접근을 최적화는, 추가 발생 하는 형태학 및 동적 프로세스 평가 동안 MGE INs의 접선 마이그레이션. 현재 프로토콜은 적응 하 고 다른 공부 피라미드 세포42,43 의 마이그레이션 전 utero 또는 utero에서 두뇌 electroporation 그리고 organotypic 슬라이스 문화 사용 최적화 및 대뇌 피 질의 기능36,,3944. 특히, 마우스 배아는 참 하 고는 MGE는 electroporated ex vivo 실험 플라스 미드의 intraventricular 주입 후 보다 효율적이 고 정확 하 게 달성 될 수 있다 무엇 보다 MGE 창시자의 타겟팅 electroporation utero에서 . 두뇌는 다음 추출 하 고 몇 일 동안 경작 될 수 있다 뇌 코로나 조각으로 sectioned, 연속 되므로 추적 transfected 기능 이미징. 이 방법은 일반적으로 레이블 뇌 조각 당 5-20 tangentially 마이그레이션 기능을 실험 반복 동안 라벨의 쉽게 분리 되도록 충분히 스파스 신경 인구 통계적 의미에 도달 하는 데 필요한 수를 최소화 재건 및 미세 형태학 평가 하는 개별 신경 또한, organotypic 문화는 마이그레이션 확인 MGE explants에 비해 기능 로컬로 분 비 발산 및 thalamic afferents에서 입력을 포함 하 여 더 많은 자연 환경에 노출 됩니다. 이 접근은 이렇게 방향 및 주요 프로세스 분기 등 미세한 동적 프로세스의 특성을 허용 하도록 충분 한 해 부 세부 정보를 제공 하면서 transfected 기능 채택한 철새 경로 계량에 적합 nucleokinesis 및 후행 프로세스 철회입니다.
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Protocol
모든 실험 동물 관련 위원회 회의 Institutionnel des Bonnes 추구는 레 동물 드 Recherche (CIBPAR) 추 셍 트-쥐스틴 연구 센터에 의해 승인 및 동물 관리의 가이드에 캐나다 위원회에 따라 실시 했다 관리 및 실험 동물 (2 호)의 사용 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜 배아 날 (e) 13.5, 한 번에 때 MGE 파생 기능 적극적으로 생성, 피크의 CGE 파생 기능 생산45,46전에 배아의 electroporation에 최적화 되었다. 또한, 바이어스 GABAergic 기능으로 electroporation, 우리 사용 발기인 기능 (예: 그것의 최소한의 증강으로 Dlx5/6 발기인)47에 선택적으로 표현 합니다.
1. Electroporation 및 Organotypic 슬라이스 문화에 대 한 솔루션의 준비
- 메 마른 문화 매체의 125 mL를 준비 합니다.
- 일반 신경 관련 문화 매체의 125 mL을 측정 참조 테이블의 재료 배합에 대 한 이전 UV 소독 biosafety 내각에 소독된 한 병에 70% 에탄올 뿌리. 혈 청 무료 신경 관련 보충, 1.75 mL 200mm 글루타민 (최종 농도 0.5 m m)의 고 열 비활성화 말 혈 청 이전 무 균 조건 하에서 aliquoted의 6.25 mL x 50의 2.25 mL를 추가 합니다. 믹스 철저 하 게, 약 15 mL에 수 메 마른 원뿔 관, 및 4 ° c.에 저장
참고: 준비 문화 매체는 4 ° c.에서 최대 3 주 동안 저장 될 수 있다 - 무 균 조건 하에서 150 µ L aliquots에 Botteinstein의 N-2 배합48 의 재고 솔루션 X 100을 분할 하 고 사용까지-20 ° C에서 동결.
- 일반 신경 관련 문화 매체의 125 mL을 측정 참조 테이블의 재료 배합에 대 한 이전 UV 소독 biosafety 내각에 소독된 한 병에 70% 에탄올 뿌리. 혈 청 무료 신경 관련 보충, 1.75 mL 200mm 글루타민 (최종 농도 0.5 m m)의 고 열 비활성화 말 혈 청 이전 무 균 조건 하에서 aliquoted의 6.25 mL x 50의 2.25 mL를 추가 합니다. 믹스 철저 하 게, 약 15 mL에 수 메 마른 원뿔 관, 및 4 ° c.에 저장
- 살 균 인공 척수 (실제) 1 리터를 준비 합니다.
- 1 리터 비 커에 증류수 800 mL를 측정 합니다. 추가 자당의 25.67 g, 염화 나트륨 (NaCl)의 5.08 g, 나트륨 중 탄산염 (NaHCO3)의 2.18 g 포도 당, 염화 칼륨 (KCl), 0.19 g의 1.80 g의 이수소 무수 나트륨 인산 염 (NaH2포4), 0.15 g 1 M 주식 CaCl2의 1 mL .2H2O 2 mL 1 M의 주식 MgSO4.7H2실 온에서 녹을 저 어 오. 증류수 1 l.의 총 볼륨에 도달 추가
- 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독된 biosafety 내각에서 무 균 병에 솔루션을 필터 및 4 ° C에서 최대 1 개월 저장.
- 각 실험 하기 전에 실제에 4 %agarose 새로운 솔루션을 준비 합니다.
- 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 이전 준비 실제의 25 mL를 측정 하 고 낮은 녹는 포인트 agarose의 1 g 추가.
- 45 열 렌지에 s. 흘리 고 피하기 위해, 모든 3-4의 시작을 끓는 때 난방 중단, 밖으로, 그것은 다시 닫고는 agarose 혼합 수동으로 선동 압력 수 있도록 튜브를 열고. Agarose 솔루션은 동 질 때까지 반복 합니다. 응고를 피하기 위해 실험의 나머지 기간 동안 42 ° C에서 agarose 솔루션을 유지.
참고: 높은 온도 뇌 조직 손상 됩니다.
2입니다. 주입을 위한 플라스 미드의 준비
- 유리 microinjection 피 펫을 당겨
- Micropipette 끌어당기는 적절 한 매개 변수를 설정 하 고 제공 된 공간에 유리 모 세관을 확보는 필 라 멘 트와 함께 중심 다는 것을 확인 한다.
- 풀 버튼을 누릅니다.
- 추가 사용 팁의 손상을 방지 하려면 때까지 새로 만든된 microinjection 펫 열 끌어당기는 사람 및 상자 또는 깨끗 한 페 트리 접시에 장소에서 조심 스럽게 제거.
- 설정 모든 악기와 함께 캐비닛 biosafety 필요한이 ( 그림 1A참조), 아낌없이 모든 악기 biosafety 내각에 70% 에탄올 스프레이 실험 악기 및 15-20 분 동안 자외선과 환경 소독.
- 살 균 단계 얼음 (4 ° C)에 플라스 미드를 녹여.
- 깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브로 재고 솔루션 (4 µ g / µ L)에서 플라스 미드의 10 µ L를 측정 합니다. 빠른 녹색 FCF의 0.01%를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 짧게 스핀 사용까지 얼음에 계속.
참고: 맥시 prep DNA도 없는 맥시-준비 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 준비 되어야 한다. DNA는 TE 버퍼 또는 nuclease 무료 solubilized 수 H2O와 무 균 조건 하에서 수행 될 필요가 없습니다 하지만 염료 솔루션 수 있는 플라스 미드의 준비. 맥시 prep에서 플라스 미드는 여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 aliquoted 이어야 한다. Aliquoted 플라스 미드 아니 더 그 2 h 사용 하기 전에 염료와 혼합 해야 하 고 추가 사용에 대 한 refrozen 안 한다. - 후 살 균, 나노-인젝터를 다음과 같이 준비 합니다.
- 깨끗 한 상자 또는 페 트리 접시에 약 15 µ m의 외부 직경을 달성 하는 경사진된 방법에는 피 펫의 끝을 잘라 작은 핀셋을 사용 하 여 저장 된 이전 준비 유리 microinjection 피 펫 중 하나를 선택 합니다.
참고: 여기에서 주어진 외경 사용자는의 아이디어를 주고 우리가 우리의 실험에서는 대략적인 측정값 이며 액체 한 뇌 손상 없이 플라스 미드 주입에 대 한 두개골의 피어 싱을 촉진 하기 위해 최적화 된 로드 그리고 DNA의 출시입니다. 밝은 분야 현미경 미세 눈금 막대에 apposed 유리 microinjection 피 펫의 끝에 컷 보고 외부 직경을 측정할 수 있습니다. - 주사기를 사용 하 여 (모든 공기를 추방)을 unpulled 끝에서 광 유는 micropipette 채우기 위해.
- 제조업체의 지침에 따라 나노 인젝터에 채워진된 유리 제 micropipette를 삽입 합니다.
- (공기 항목을 방지 하기 위해 충분 한 석유를 유지 하는) 유리 제 micropipette의 빈 2/3rds.
- 깨끗 한 상자 또는 페 트리 접시에 약 15 µ m의 외부 직경을 달성 하는 경사진된 방법에는 피 펫의 끝을 잘라 작은 핀셋을 사용 하 여 저장 된 이전 준비 유리 microinjection 피 펫 중 하나를 선택 합니다.
- 신중 하 게 준비 micropipette 플라스 미드/염료 솔루션이 포함 된 튜브에 넣고 유리 제 micropipette 플라스 미드/염료 솔루션 작성 합니다.
3. 마우스 배아 임신 여성에서의 컬렉션
- 질 연결 해, 낫게 동시에 매일 (이른 오후)에 대 한 평가를 매일 번 식 암컷을 모니터링 합니다. 하루 e0.5 질 플러그 관찰 때 첫 번째 날에 해당 합니다.
참고: 여기에 설명 된 실험 야생-타입 마우스에서 수행할 수 있습니다. 그러나,는 MGE의 식별을 용이 하 게 하 고 모든 GABAergic 기능 (또는 기능 MGE 파생 된 특정 하위 집합)를 유전자 변형 동물 사용할 수 있습니다 (예: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre Cre 기자 대립 유전자, 등47,49와 함께). 이 상황에서 주입 실험 플라스 미드 transfected 기능의 시각화 (노란색) 하 비 페 기능 (녹색)와 비교 될 수 있도록 다른 fluorophore (예: mCherry 또는 TdTomato)를 표현 한다. - 목 전위에 의해 배아 일 e13.5에서 여성을 희생.
참고: 희생의 때에 주어진 마 취 에이전트 및 마이그레이션 및 생존50,51 에 영향을 줄 수 있습니다 피해 야 한다. - 제왕 절 개 하 여 태아를 다음과 같이 수집 합니다.
- 아낌없이 여성 복 70% 에탄올 스프레이. 소독된 집게의 쌍 복 부 피부를 당겨 하 고, 다른 한편으로는를 사용 하 여 멸 균된 수술가 위 복 부 피부를 잘라.
- 소독된 집게와가 위의 두 번째 쌍, 복 부 근 막 올려와 신중 하 게 자 궁을 피하고 있는 동안 그것을 잘라.
- 3 켤레 소독된 집게와가 위를 사용 하 여 자 궁 뿔을 당겨 하 고 골반 구멍에서 그들을 잘라. 해 부 자 궁 뿔 신경 기반 문화 매체 아미노산, 비타민 및 무기 염 (상용 제품에 대 한 재료의 표 참조) 보충으로 가득 살 균 60 mm 페 트리 접시에 놓습니다.
- 살 균 biosafety 내각에 태 반 으로부터 태아를 해 부와 머리 잘린 격리 고급 핀셋 (각 손에 하나)의 두 쌍을 사용 합니다.
- 베벨 컷 불 임 3 mL 플라스틱 전송 피 펫의 끝 발음 머리 그리고 전송 새로운 살 균 60 mm 페 트리 접시에 그들 응고 블랙 왁 스 층과 같은 신경 기반으로 가득 보충 위와 문화 매체.
참고:이 단계는 오염 물질 (마우스 머리, 혈액)의 전송을 최소화합니다. 블랙 왁 스 해 부 동안 머리를 안정화 하는 데 사용 됩니다. 문화 미디어가이 절차 동안 산소 수 필요가 없습니다.
4. intraventricular 플라스 미드 주사 및 전 비보 Electroporation MGE는의
참고: 다음 단계는 이전 준비 biosafety 내각에서 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
- 장소 60 mm 페 트리 접시 블랙 왁 스와 겹쳐 고 biosafety 캐비닛에 쌍안경에서 문화 매체 보충 신경 기반에 목 잘린된 머리를 포함 하.
- 머리, 오른쪽, 왼손으로 정밀한 핀셋으로 직면 rostral 부분을 안정 하 고 오른손의 나노-인젝터를 사용 하 여 오른쪽 측면 뇌 실에 플라스 미드/염료 해결책의 1-2 µ L를 주입.
참고: 공동 식 실험 수 실시 공동 electroporating 구조 플라스 미드와 shRNA 표현 플라스 미드 아데닌 농도에서 두 플라스 미드를 혼합 하 여. - Electroporate 주입된 두뇌입니다.
- Dorsally 위치 및 머리에 병렬 부정적인 전극으로 전극 및 대상 MGE는 머리의 복 부 쪽을 향해 긍정적인 전극 사이 머리를 놓습니다.
- 전극이 잘 위치 하 고, 일단 간 펄스 간격 40 V 500 ms에서 50 ms의 4 평방 펄스를 제공 합니다.
- 이미에 배치는 biosafety 캐비닛 핀셋을 사용 하 여 전극에서 모든 잔여 조직을 제거 합니다.
참고: 이러한 매개 변수는 특별히 우리의 실험에 사용 된 electroporator에 대 한 최적화 되었습니다. 사용자가 수행 하는 최적화 테스트 미리 electroporator의 다른 종류를 사용 하는 것이 좋습니다. - 모든 나머지 두뇌 4.1 4.3 단계를 반복 합니다.
참고:이 프로토콜 설명 한 두뇌에 필요한 조작, 하지만 그것은 주사 electroporating 전에 순차적으로 최대 4 두뇌 수확량 증가, 각 뇌 수 있습니다. 이 전략은 특히 유리한 주입 했을 때 2 또는 더 다른 플라스 미드는 순차적으로 (예: 컨트롤 또는 실험 플라스 미드) (littermates 사이 비교에 대 한 허용 하는) 동일한 실험 기간 동안. 또한, 그것은 가능한 삽입 하 고 electroporate 동시에 완전히 뇌 표면에 병렬 전극 배치 하 여 수율을 증가 두뇌의 양측.
5. 뇌 해 부와 Organotypic 조각 문화
- 여전히 biosafety 캐비닛의 메 마른 환경에서 조작 하는 동안 두개골에서 뇌를 해 부.
- 신중 하 게 두뇌를 피하는 동안 각각의 눈에 바늘을 삽입 하 여 블랙 왁 스의 층에 머리를 고정 시켜야 합니다.
- 고급 핀셋의 쌍을 사용 하 여 목의 왼쪽와 눈물 앞에 다시에서 두개골에서 피부에 좋은 족집게의 두 번째 쌍.
- 한 손으로 핀셋으로 옆 머리를 잡고, 신중 하 게 두개골 brainstem의 수준에서 잘라내어 부드럽게 두개골을 올려 또 한 쌍의 다른 한편에서 핀셋을 사용 합니다. 각 트위터, 전면, 화살 비행기 (중간)에 두개골을 잘라와 다음 옆으로 두개골 파편을 해방 하기 위하여 incise.
- Brainstem 들어올린 조심 스럽게 잘라 meninges 및 두개골 신경 두뇌는 두개골에서 완전히 될 때까지.
참고: 5.1에 설명 된 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 엄격한 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
- 단면에 대 한 4% 낮은 녹는 포인트 agarose에 두뇌를 포함 합니다.
- 채워 35 mm 페 트리 접시 위에 준비 agarose 솔루션 (42 ° C에 액체 유지).
- Electroporated 두뇌 agarose 가득 접시 이전 컷된 전송 피 펫을 사용 하 여 신속 하 게 전송. 실 온에서 접시를 유지.
- (침 몰 방지)을 잘 중간 뇌를 유지 하는 금속 막대기로 agarose를 저 어 접시에 병렬 rostro 꼬리 평면에서 뇌를 위치. 중지는 agarose 공고히 하, 어떤 뇌 손상 방지 하기 시작 될 때 교 반 합니다.
- 뇌 주변의 1-2 밀리미터의 마진을 떠나 직사각형 블록을 형성 하기 위하여 뇌를 둘러싼 agarose를 잘라 면도날을 사용 합니다. 두뇌의 rostral 부분 수직 단면 후속 단계에 대 한 오리엔테이션을 촉진 하기 위하여 블록의 앞쪽도 인지 확인 합니다.
- 각 두뇌에 대 한 반복 합니다.
참고: 그것은 다른 고도에 각 두뇌를 설정 하는 동안 별도 agarose 블록을 형성 하 여 (최대 3) 한 번에 하나 이상의 뇌를 잘라 수 있습니다.
- Vibratome 코로나 섹션와 슬라이스 문화입니다.
- 100 X N-2의 해 동 한 약 수 얼음에 (150 µ L)를 보충 하 고 메 마른 조건 하에서 15 mL aliquoted 문화 매체에 추가.
- 6 잘 문화 접시의 각 음을 (1 X N2 보충)와 문화 매체의 750 µ L를 전송 합니다.
- 곡선된 핀셋으로 각 매체 잘 가득 한 셀 문화 삽입 (직경 30 m m, 0.4 µ m 기 공 크기, PTFE)를 배치 합니다.
- Vibratome 목욕을 지속적으로 산소 실제 채우십시오. 얼음 목욕, 주변 4 ° C에 냉각 하거나 냉장된 vibratome를 사용 합니다.
- 0.150 m m/s와 80 헤르츠 주파수 vibratome 속도 설정 합니다.
- 접착제 vibratome 플랫폼, 아래로 rostral 가장자리와 복 부에 agarose 블록 가장자리 사용자를 직면 하 고.
- (4 ° C)에서 250 µ m 두께 섹션을 얻기 위해 코로나 섹션에 뇌를 잘라.
- 소독된 주걱와 MGE 장소 신중 하 게 섹션 사이의 중복을 피하는 동안 하나의 30 m m 막에 한 동물에서 모든 뇌 섹션 삽입을 포함 하는 2-3 섹션을 수집 합니다. (위에서 설명한 대로 보충된 문화 매체의 750 µ L 포함) 6-잘 문화 판의 한 잘에 삽입을 배치 합니다. 또는, 각 섹션은 500 µ l 보충 문화 매체 가득 12 잘 문화 접시에 별도 13 m m 직경 멤브레인에 놓일 수 있다. 각 잘 권장 하는 문화 매체의 금액 없이 침수 되는 미디어에 의해 영양 수 뇌 섹션 수 있습니다.
참고: 5.3.6과 5.3.7에 설명 된 단계는 실시 하지 완전 한 무 균 조건 하에서 vibratome을 소독 하 고 biosafety 캐비닛에 사용 수 있습니다. 따라서, 그것은 어떤 오염을 피하기 위하여 신중 하 게 다음이 단계를 수행 하는 중요 한입니다. 적절 한 보호 장비 (깨끗 한 마스크, 수술 장갑 및 실험실 코트) 착용 되어야 한다 모든 시간과 신체 부위도 포함, 머리, 얼굴, 손, 배양 배지 (또는 문화 매체 없이) 통해 전달 한다와 같은. 그것은 또한 자주 장갑 뇌 섹션을 수집 하는 데 사용 하는 주걱에 70% 에탄올을 스프레이 것이 좋습니다. - 48 또는 72 h에 대 한 60% 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 통풍이 무 균 인큐베이터에서 문화 접시를 놓습니다.
참고: 이러한 보육 시간 했다 최적화 MGE 파생 기능의 경과 이미징 및 고정 조각의 confocal 영상 각각. 최적의 부 화 시간 각 실험 설계에 대 한 사전 시험 되어야 한다. 또한, 선택한 보육 72 h 고 아래, 문화 매체를 변경할 필요가 없습니다입니다. 더 이상 보육 시간에 대 한 문화 매체 2-3 일 마다 변경 되어야 합니다. - 원하는 보육 시간 후 관심의 섹션 8 연 발 coverslip 전송 하 고 문화 매체의 3-5 µ L를 추가 합니다. 장소 (37 ° C, 습도 60%, 5% CO2) 환경 챔버에 coverslip 거꾸로 연결 된 회전 디스크 confocal 시간 경과 영상 세션 설정 하는 컴퓨터 기반 수집 소프트웨어를 갖춘.
참고: 또는, 섹션 고쳐질 수 있다 4 %paraformaldehyde (4 ° C에서 하룻밤 또는 실 온에서 2 h)와 이후에 confocal 아래 기능 electroporated의 형태학 상 특징의 시각화를 위한 다른 항 체와 immunostained 현미경입니다. EGFP 및 mCherry 어떤 반대 얼룩 절차 없이 confocal 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다, 좋습니다 immunohistochemistry GFP와 mCherry 이후 고정 프로세스 형광, 줄일 수 있습니다 신호를 향상 시키기 위해 수행 감소 선행 또는 후행 프로세스에서 작은 가지 같은 배아 신경의 미세한 구성 요소 탐지 합니다.
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Representative Results
이 섹션에서 제공 하는 대표적인 결과 얻은 다음 컨트롤 플라스 미드 또는 e13.5 마우스 배아 organotypic 슬라이스 문화 뒤의 MGE에서 관심사의 유전자를 대상으로 한 실험 플라스 미드의 전 utero electroporation (시간 경과 영상)에 대 한 48 시간 또는 72 h (고정 및 immunohistochemical 라벨) 37 ° C에서 incubated (도식 프로토콜에 대 한 그림 1B 를 참조). MGE explant에서 마이그레이션 기능의 대표적인 예는 그림된 (참조 그림 1 c 도식 프로토콜) 여기에서 설명 하는 방법에 대 한 비교로 있습니다. MGE 창시자에 플라스 미드의 electroporation MGE는 기능의 종료 지연 같고 문화 시간을 적절 하 게 조정 해야 합니다.
성공적인 실험에서 organotypic 조각 confocal 현미경 건강, 즉 피 질 레이어는 밝은 필드 모드를 사용 하 여 쉽게 구별할 수 나타나고 (강렬한에 의해 인식할 수 있는 조각 표면에 오염 없이 볼 수 있다 autofluorescence 그리고 epifluorescence 아래 보이는 형광 필 라 멘 트의 존재). 건강 만성 organotypic 조각, 셀의 약 20%는 72 h 문화 (그림 2), 이전 만성 organotypic 문화 (예: 출생 후 문화)52에서 설명에 후 apoptosis를 받 다. 그럼에도 불구 하 고, 총 cytoarchitectural 뇌 구조 그림 (그림 2A) 얼룩 DAPI를 사용 하 여 여기로 잘 정의 된 남아 있습니다. Ex vivo electroporation MGE는의 대 한 우리의 프로토콜 dorsally 문화에서 72 h 후 마이그레이션 5-20 셀 볼 수의 조각 (그림 3AB), 당 50-100 transfected 세포의 평균을 생성 합니다. 고정 후 immunohistochemical 얼룩, 외피 격판덮개 향해 tangentially 마이그레이션 기능 쉽게 확인할 수 있습니다 confocal 현미경 검사 법으로 그들은 현재의 길쭉한 타원형 세포 체, 가끔 후행 프로세스 및 주요 프로세스 접선 지향. 주요 프로세스 일반적으로 하나 또는이 분 지 하 고 핵 (nucleokinesis 전에 centrosome 주택)와 각 분기의 끝에 성장 콘 앞 가끔 붓기의 존재에 의해 인식할 수 있다. (그림 3C-G).
이 프로토콜 마이그레이션 MGE 파생 기능 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 단일 세포 수준에서의 관측을 위해 설계 되었습니다. 이 특정 실험 (그림 4), 코로나 organotypic 뇌 조각 Dlx5/6Cre;에서 생성 했다 RCEEGFP 배아는 실험 shRNA (관심사의 유전자를 대상으로)와 TdTomato 카세트는 플라스 미드와 e13.5에서 electroporated. 슬라이스 48 h에 대 한 인 큐베이 팅, 8 잘 연 발된 coverslip 접시 (1 조각 보충된 문화 매체의 얇은 층에 떠 있는 챔버 당) 전송 되었고 몇 군데는 거꾸로 한 현미경 장비에 20 배 공기 (0.70 없음) 목표를 사용 하 여 6-8 시간 3 분 마다 회전 디스크 confocal 머리, 컴퓨터 기반 수집 소프트웨어 및 무대 최고 환경 챔버 이미징, 동안 조각 37 ° C에서 유지 했다 했다 지속적으로 산소와 습도 환경 챔버 (5% CO2 와 60% H2O). Electroporated MGE 파생 기능 확인 되었다 같은 eGFP의 그들의 표정에 의해 확인 하는 그들의 GABAergic에 정체성, 그리고 TdTomato, 그들은 실험 플라스 미드 (그림 4AB)를 표현 하는 것을 확인의 표현. Electroporated 기능은 쉽게 식별 하 고 잘 절연, 그림 4, 속도 거리 여행 같은 마이그레이션 동적 매개 변수를 세밀 하 게 분석에 대 한 허용. 또한, 분류 기능 볼 수 있습니다 그들의 자연 환경에 외피 격판덮개 향해 tangentially 마이그레이션 동적 형태학 변화는 최고의 프로세스와 nucleokinesis (그림 4C 의 분기 등을 식별 하기 위해 우리 있게 -F)입니다.
MGE 파생의 비보 전 electroporation MGE 또한 결합 될 수 있다 explants 방향 및 철새 역학의 연구를 보완으로 마이그레이션 중 발생 하는 동적 cytoskeletal 프로세스의 고해상도 이미지를 사용 하려면 organotypic 문화. 예를 들어, 신경 운동 organotypic 슬라이스 문화에서의 접선 마이그레이션 중 발생 하는 그의 연상의 다른 단계는 관찰 될 수 있다 electroporated는 MGE에서 마이그레이션 기능 electroporation, 선도 등 후 48 h explant neurite 확장 하 고 nucleokinesis (그림 5B-E). 다양 한 cytoskeletal 프로세스 다음 격리 된 셀 F 걸 phalloidin (그림 6A), organotypic 조각에 최적으로 구현할 수 없는 구조 얼룩에 의해 예를 들어 MGE explant에서 마이그레이션에 높은 해상도에서 공부 될 수 있다 높은 세포 밀도 주어진 (및 cytoskeletal 요소) 네이티브 환경에서. 이러한 cytoskeletal 프로세스, 그리고 특히 F-말라 리 모델링, 더 공부 될 수 있다 동적으로 시간 경과 영상 Lifeact 식을 결합 하 여. 우리는 고해상도 시간 경과 이미징의 예를 표시 하는 예를 들어, Nkx2.1Cre;에서 얻은 MGE explant에서 파생 된 RCEEGFP 쥐의 뇌 유전자의 기능에 대 한 관심의 대상된 삭제를 들고. 이 CMV 발기인 (마이클 데이비슨에서 선물)의 통제는 mCherry-Lifeact-7 플라스 미드와 페 되었다 그림 1 c, F-말라 실시간 (그림에서에서 발생 하는 리 모델링의 추적에 대 한 허용에 도식화 하는 메서드를 사용 하 여 6B). 따라서, organotypic 문화 유전자 변형된 기능에 대 한 방향 또는 마이그레이션 경로 제대로 평가 하는 데 필요한 반면, MGE explants 수 보완 등 연구의 고해상도 영상에 대 한 격리 된 세포에 더 나은 접근을 제공 하 여 동적 cytoskeletal 프로세스입니다.
기술 함정 위에서 설명한 실험의 실패 될 수 있습니다. 예를 들어, 42 ° C 보다 따뜻한 agarose 솔루션에 두뇌를 포함 조직 파괴와 신경 죽음, 뇌 또는 불투명 될 조각의 반투명의 손실에 의해 공개 될 수 있습니다. 그러나, 온도 하지 보관 해야 너무 낮은 응고 agarose 솔루션 포함 과정 깨지기 쉬운 배아 두뇌를 파괴할 수 있다. 둘째, 오염 크게 여기에 설명 된 실험적인 접근의 수익률을 줄일 수 있습니다. 따라서, 모든 단계는 주의 가능한 엄격한 무 균 조건 하에서 밖으로 실행 되어야 한다. 모든 솔루션 및 장비는 사용 전에 소독 해야 하 고 장비는 자주 세균 이나 곰 팡이에서 오염을 피하기 위하여 70% 에탄올과 살포 한다. 문화 매체 된다 노란색 또는 불투명 오염 문화 우물에 직접 표시 될 수 있습니다. 문화 매체 명확 하 고 유체 때 오염 주목 갈 수 있습니다. 그러나, 조각 표면에 형의 층은 일반적으로 관찰 될 수 있다 또는 슬라이스 정착 및 얼룩 단계 동안 지나치게 연약 될. 이러한 조각 현미경 시각화는, 오염 레이블이 뉴런을 통해 autofluorescence의 층으로 매니 페스트 수 있습니다 또는 형광 긴 필 라 멘 트의 존재에 의해 밝혀. Organotypic 조각 오염 된 우물에 보관, 밖으로 던져 질 해야 하지만 같은 접시의 다른 우물에서 교양 조각 추가 단계에 대 한 유지 될 수 있다. 세균성 오염 매우 희귀 하지만 취해야 한다 심각 하 게, 의미는 공유 incubators 및 문화를 포함 한 모든 장비 해야 수동으로 청소 하 고 소독.
그림 1: electroporation utero ex 에 대 한 프로토콜의 도식 표현 뒤에 organotypic 슬라이스 문화 또는 MGE explants. A. 여기에 설명 된 프로토콜에 필요한 모든 살 균된 장비와 biosafety 캐비닛 설치의 예. B. 전 utero electroporation 그리고 organotypic 슬라이스 문화에 대 한 사용 하는 프로토콜의 도식 대표. 간단히, 배아는 참, 실험 플라스 미드 측면 뇌 실 (1) 및 (2) MGE에서 electroporated에 주입 됩니다. 뇌는 두개골 (3)에서 microdissected 이며 agarose (4)에 포함 된. Organotypic 섹션 vibratome (5)에 생성 하 고 48 h 경과 현미경 (7.1)에 대 한 37 °C(6) 또는 72 셀 개조 (7.2)에 대 한 h 문화에 배치 됩니다. 마이어스 외. 201353 에서 적응 하 고 MGE의 생성에 사용 되는 프로토콜의 C. 도식 표현 explants. 간단히, dorsolateral 외피가 먼저 e14.5 야생-타입 마우스 배아를 e12.5에서 밖으로 해 부 (1) 및 보충 문화 매체 (2) 기계적으로 해리. 대뇌 피 질의 세포 5.25 x 105 대뇌 피 질의 세포/c m2 의 조밀도에 도금 고는 콜라겐/폴 리-L-리 신-코팅 8 연 발 coverslip (3)에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한 교양. 그런 다음 e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP 배아의 MGE (4, 5), electroporation utero ex 에 대 한 처리 되 고는 MGE 수동으로 두뇌에서 격리 하 고 100 µ m2 조각 (6)에서 잘라. 이러한 explants는 이전 준비 대뇌 피 질의 급지대 레이어 위에 배치, 문화 매체 덮여 그리고 시간 경과 영상 (7) 전에 48 h에 대 한 공동 경작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 유지 건강 한 organotypic 조각에 cytoarchitecture. Organotypic의 Nkx2.1Cre;의 비보 전 electroporation 후 문화를 슬라이스 RCEEGFP 보존된 cytoarchitecture (DAPI (파란색)과 Cre-기자 (GFP))에 의해 공개 마우스 배아 (A) 중요 한 조직 손상에서 초래 하지 않습니다 Nkx2.1Cre;에서 18 µ m 두께 cryosection에 비교 될 때, RCEEGFP 태아 transcardially 4% 끼얹는다 PFA e15.5에서. D와 M dorso-복 부 및 latero 중간 축, 각각 나타냅니다. (B). 거꾸로 confocal 현미경으로 촬영 한 고배율 이미지를 갖춘 63 x / 안티-죽 습-Caspase 3 항 체 (Cl-cas3)와 함께 얼룩 후 1.4 석유 목표 공개 외피 격판덮개에 셀의 약 20% 받 다 apoptosis (흰색 화살표) 72 h 문화, GFP-긍정적인 기능 유지 건강 한 동안에 (흰색 화살표)에서 photomicrographs에 exemplified로 후 C C ' '. 비교 함으로써, 세포 apoptosis는 거의 완전 하 게 perfused 동물에서 얇은 cryosection에서 결 석 (-D ' '). 바 규모: 250 µ m (A-B) 및 15 µ m (C-D ' '). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 쥐의 Organotypic 조각 뇌 배아와 electroporated 수 (INs)의 고배율 photomicrographs. A. Dlx5/6Cre;에서 organotypic 조각 문화 RCEEGFP 쥐의 뇌 (모든 기능 있는 녹색)와 electroporated는 Dlx5/6::shRNA발진-IRES-TdTomato 플라스 미드. 조각 4%로 고정 되었다 PFA 후 문화와 GFP와 mCherry immunostained에서 72 h. Electroporated 기능 3D (50-60 µ m 두께 z-스택 촬영 마다 0.5 µ m 광학 섹션)에서 촬영 했다 63 x을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 / 1.3 나 오일 목표. 접선 등 팔리움의 하위 심 실 지역에서 마이그레이션 기능은 쉽게 식별 (빨간색, 오픈 화살표). D와 M dorso-복 부 및 latero 중간 축, 각각 나타냅니다. B. 대표 organotypic 슬라이스 문화 컨트롤 wildtype (WT) 태아 electoporated에서 Dlx5/6::shRNA발진-IRES-TdTomato 72 h와 mCherry만에 대 한 immunostained에 고정 하는 플라스 미드. Electroporated 기능 (레드) 외피 격판덮개 향해 dorsally 마이그레이션 볼 수 있습니다. Dlx5/6Cre;에서 TdTomato 의 EGFP 그들의 공동 식으로 Electroporated 기능 식별 RCEEGFP 쥐 (C D), 또는 WT 쥐 (E-H)에서 서만 TdTomato 의 그들의 표정 및 그들의 일반적인 형태, 즉 타원형 몸, 분기 최고의 프로세스 (흰색 화살표, D-H), 세포는 가끔 후행 프로세스 (흰색 화살표, C-D)와 nucleokinesis 전에 centrosome 주택 주요 프로세스의 가끔 붓기 (화이트 스타에서 C C' 및 G). 바 규모: 250 µ m (A-B)와 25 µ m (C H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 시간 경과 라이브 이미징 electroporated 기능 organotypic 조각 48 헤에 대 한 교양의 TdTomato 카세트와 관심사의 유전자를 대상으로 한 shRNA 실험 플라스 미드와 e13.5에서 기능 electroporated Dlx5/6Cre;에서 얻은 organotypic 뇌 조각에 접선 이동에서 볼 수 있습니다. RCEEGFP 문화 (A, 흰색 사각형)의 48 h 후 마우스 배아. B, (흰색 사각형)에 있는 동일한 electroporated가 피 질, 즉 pial 표면에 병렬에서 접선 마이그레이션하는 동안 nucleokinesis, 과정에서 볼 수 있으며 시간 경과 영상 8 h / 0.85 x 20를 사용 하 여 매 3 분 뒤 나 어 목적 (확대 상자, C-F). 신경은 처음 후행 프로세스 (흰색 화살표) 및 분기 최고의 프로세스 (흰색 화살표) nucleokinesis (C), 과정 된 길쭉한 세포 체 (오픈 화살표)을 표시합니다. 후 라이브 이미징의 3 h는 nucleokinesis 완료 되 하 고 후행 프로세스 철회는 최고의 프로세스 두 긴 분기 (D, 흰색 화살표) 연장. 5 h 30 분 후 최고의 프로세스 분기 중 하나 (흰색 화살표)를 철회 했다 고 신경 셀 시체 (오픈 화살표) 앞으로 약 10 µ m (E)를 이동 했다. 마지막으로, 후 영상의 8 h, 마이그레이션 일시 중지, 신경의 주요 프로세스를 다시 연장 했다 고 후행 프로세스 (흰색 화살표), 등장 했다 하지만 핵 (오픈 화살표)가 아직 이동 하지 앞으로 (F). 바 규모: 250 µ m (A), 70 µ m (B) 및 30 µ m (C-F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 48 헤에 대 한 교양된 MGE explant에서 파생 된 기능의 시간 경과 영상 기능은 Nkx2.1Cre;는 에서 얻은 MGE explant에서 마이그레이션 볼 수 있습니다. RCEEGFP 마우스 (에 있는 모든 MGE 파생 기능 표현 eGFP) electroporated 메서드를 사용 하 여 e13.5에서 CMV::mCherry-LifeAct-7 플라스 미드와 마이어스 외. 201353 에서 적응 하 고 그림 1C, 도식화 그리고 48 h (A)에 대 한 교양. 기능 5 h (B-E)에 대 한 시간 경과 라이브 이미징 사용 하 여 시각화 했다. 이 예제에서 공동 eGFP 및 LifeAct를 표현 하나 nucleokinesis (오픈 화살표) 과정에서 처음 본 하 고 확장 하는 두 가지 주요 프로세스 분기 (흰색 화살표; B).이 1 시간 후 nucleokinesis 완료 (열기 화살표 참조), 셀 몸 앞으로 이동 하고있다 그리고 후행 프로세스 (흰색 화살표), 세포 체의 뒤쪽에 등장 했다 두 지점 (흰색 화살표; 한 최고의 프로세스 표시 C). 두 번째 nucleokinesis은 2 h 30 분 (오픈 화살표) 후와 IN은 지금 세포 체와 더 이상 후행 프로세스 (흰색 화살표;에서 발생 하는 두 개의 주요 프로세스와 부여 D). 마지막으로, 5 h 후에 버릴 한 neurite centrosome 나머지 주요 프로세스 분기 (흰색 화살표)에서 translocating 동안 3 nucleokinesis, 후행 프로세스 (흰색 화살표)의 뒤쪽에 여전히 존재에 대 한 준비 셀 바디 (E)입니다. 바 규모: 70 µ m (A)와 20 µ m (B-E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 48 h. A.에 대 한 고해상도 이미징 MGE explant에서 기능에 개장 하는 걸의 시간 경과 교양 Nkx2.1Cre;에서 organotypic 슬라이스 RCEEGFP 마우스 뇌 filamentous 말라의 시각화에 대 한 허용 e15.5, 알 렉 사-594 Phalloidin, 물에 고정 됩니다. 기능 63 x를 사용 하 여 몇 군데는 1.3 / confocal 현미경에 나 오일 목표. 건강 한 기능, filamentous 말라 보이는 nucleokinesis의 완성 후 후행 프로세스의 철회 다음 세포 체의 후면 컵 (흰색 화살표, A'-A ' '). B. 한 MGE explant 위에서에서 가져온 Nkx2.1Cre; RCEEGFP mCherry-Lifeact-7 CMV 발기인의 통제를 표현 하는 플라스 미드와 관심 및 electroporated 유전자의 표적으로 삭제를 들고 마우스 뇌. 시간 경과 라이브 영상 문화의 48 h 후 수행 됩니다 및 electroporated 기능 뒤에 3 h / 0.85 x 40을 사용 하 여 3 분 마다 공기 목표. 주요 프로세스 및 성장 콘 (흰색 화살표) 및의 뒤쪽에 형광 점 레드 (흑인과 백인 이미지에 흰색)의 움직임에 의해 exemplified LifeAct로 페에 발생 말라 골격의 개장 하는 활성는 nucleokinesis 중 세포 체 (B B ' ', 흰색 화살표). 바 규모: 7 µ m (A-A ' ') 및 10 µ m (B B ' '). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서에서는, 우리는 e13.5에서 마우스 MGE electroporation utero 전 을 수행 하기 위한 배아 뇌 조각의 organotypic 문화의 세대에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 비록 체 외에 , Boyden 챔버 시험 등 비교적 쉽게 수행 하는 방법과 다른 유전자와 다른 요인의 간섭 없이 단백질의 특정 역할을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다, 그들은 조사 배제 마이그레이션 역학 방향 및 마이그레이션 경로25에 관해서. MGE explants 발생 동안 마이그레이션, 우리가 여기에 표시 하지만 그들은 대부분 생 단서 없는 동적 cytoskeletal 변화를 연구 하 고 (비록 이것이 신경 마이그레이션 홍보 지침 단서의 추가 요구 하는 유용한 수단을 제공 크게 대뇌 피 질의 급지대 레이어에 MGE explants 교양 개선)25,54. 그럼에도 불구 하 고, 분석 실험 MGE explants 기반 감지 기능29의 특정 방향 또는 마이그레이션 경로 안내 같이 더 미묘한 메커니즘에 관련 된 분자 신호의 의미를 실패할 수 있습니다. 이 문제는 결국 utero에서 electroporation25MGE 파생의 특정 라벨에 대 한 그들의 네이티브 환경13,,2941에서 마이그레이션할 수 있는 피할. 그러나, 그 기술을 기술 도전, 참여, 수술 절차 때문 이며 그 수율은 MGE는 utero에서, 대상 어렵다 자주를 여러 새끼의 사용을 필요로 하는 사실 및 배아의 낮은 생존 율에 의해 제한 됩니다. 의미55에 도달 합니다. 따라서, MGE 쥐 두뇌 배아의 organotypic 문화 뒤의 utero ex electroporation 마이그레이션 역동성 및 그들의 자연적인 기능 MGE 파생의 형태를 조사 하는 낮은-비용, 시간 효율적이 고 신뢰할 수 있는 방법 제공 환경, electroporation utero에서 그리고 지도 대 한 필요의 수술 절차를 우회 하는 동안 MGE explants에 단서. 또한,이 기술은 MGE 직접 목 및 머리에 utero채택 하기 어려운 구성 위에 부정적인 것에서 긍정적인 전극 apposing 여 대상이 될 수 있는 한 쉽게 액세스할을 수 있습니다. 또는,는 MGE focally 주입 수 있습니다 하 고 직접 organotypic 조각13,,2529, 하지만 그 기법을 생성 한 후 electroporated 더 어렵고 우리 손에 덜 효과 입증 했다 여기에서 설명 하는 프로토콜 보다. 이 문서에서 설명 하는 단계에 따라, 한 50-100 electroporated organotypic 슬라이스, 5-20는 tangentially는 MGE에서 마이그레이션 후에 72 h. Transfected 기능 시간 경과 영상과 라이브 구상 될 수 있다 볼 수 당 MGE 파생 기능을 얻을 것 이다 또는 이미지와 후 복원 고정 및 immunohistochemical 라벨.
여기에 설명 된 프로토콜 마이그레이션 ex vivo에서 공부 하도록 최적화 했다와 MGE 파생 기능, ex vivo MGE 주입 및 electroporation, electroporation utero에서 설명 하는 다양 한 게시 된 프로토콜에 의해 영감을 했다 또는 만성 organotypic 뇌 조각 문화36,38,39,42,43,56,,5758의 세대. 우리의 접근 방식을 사용 하 여 낮은 펄스 강도 (40 V) intraventricular 플라스 미드 주사 내 MGE 주사 보다는 고전압 펄스 (100 V),39,56 설명 되어 있는 대로 MGE 창시자의 손상 제한 ,,5758. 또한, 다른 세균 오염39,56,,5758을 방지 하기 위해 페니실린, 스와 gentamycin 조합해 서 사용, 우리는 하기로 항생제를 피하기 위해 우리의 문화 매체 그들은 이론적으로 마이그레이션에 영향을 수 있습니다. 특히, 페니실린은 GABAA 수용 체59,60, 길 항 근 및 GABAA 수용 체 활성화를 활성화 하 고 세포내 염화 그라디언트 및 KCC2에 따라 마이그레이션 후 중지 마이그레이션61에서 다양 한 단계에서 식. 그러나, 현재 프로토콜에 명시 된 다양 한 예방 조치를 사용 하 여 오염을 피할 수 있습니다 효과적으로 항생제의 부재에도.
우리의 손에 있는이 접근의 효율성에도 불구 하 고 또한 utero ex electroporation는 그것의 단점이 있습니다. 마이그레이션할 세포 자연 3 차원 환경을 제공 하는 동안에 마이그레이션에의 맥락에서 organotypic 조각에 약리 분석 실험을 수행 어려울 수 있습니다. 실제로, MGE 파생 된 기능의 마이그레이션 주로 extracellular 신호2,,1319 와 약리 억제제의 응용 프로그램에 따라 다릅니다 또는 organotypic 조각에 활성 제는 정확한 허용 하지 않습니다. 전체 조각 상태 또는 활동에 영향을 세계에서 셀 자치 효과의 분리. explant에서 마이그레이션 기능을 더 쉽게 격리 하 고 선택적으로 특정 화합물62노출 수 같은 실험에 대 한 혼합된 천연된 대뇌 피 질의 세포 성장 MGE explants는 organotypic 슬라이스 문화, 하는 것이 좋습니다 될 수도 있습니다. 또한, 비록 electroporation utero 전 utero에서 electroporation 보다 수행 쉽습니다, 아직도 수 기술적으로 도전적인 여기 작은 크기 및 깨지기 쉬운 상태에서 미 발달 두뇌의 일러스트 배아 나가에 e13.5. 수 사관 뇌 표면 손상 없이 e13.5에서 electroporated 두뇌를 효율적으로 추출 하는 몇 가지 재판을 해야 합니다. 또한, 출생 후 슬라이스, 반대로 배아 organotypic 조각 수 없다에 보관 문화 시간의 오랜 기간 동안. 비록 배아 organotypic 조각 문화는 생체 외에서적어도 7 일63지켜질 수 있다, electroporation와 결합 하지이 있고 여기에 설명 된 실험 테스트에 대 한 최대 3 일에서 생체 외에서 신뢰할 수 있는 결과 함께 우리의 손에. 따라서, 조사 수행 한다 최적화 테스트 미리 부 화 시간이 더 오래 필요 하다 면. 또한, 늦은 배아 또는 이른 출생 후 단계에서 개발에의 조사 권장 되지 않습니다이 기술 e13.5 배아25를 사용 하는 경우 어디에 성공적으로 electroporation utero에서 달성 될 수 있다 하지만 electroporated 배아는 다시 자 궁 캐비티에 넣고 태어난 하 나중 단계21,64에서 분석 남아 있을 수 있습니다. 마지막으로, 전 utero electroporation organotypic 슬라이스 문화 뒤 모두 형태 분석 및 개발 기능의 마이그레이션 역학에 대 한 수 있습니다. 그러나, 그것은 이전 지적에 utero에서 electroporation 기술은36, utero ex electroporations 뇌 조각 당 50-100 electoporated 셀을 양보 고 인구 분석에 적합 하지 않습니다 따라서. 이러한 조사는 더 나은 동물 모델 전체 또는 조건부 삭제 (또는 노크에서) 관심사의 유전자의 운반에 실시 됩니다. 사용 가능한 경우 같은 모델 사용할 수 있습니다 효율적으로 organotypic 조각 문화를 생성 하 또는 MGE explants 마이그레이션, 실제 역학을 시각화 하기 위해 같이 여기 ( 그림 5 참조 및 그림 6).
이 프로토콜의 많은 단계 최적의 결과 얻기 위하여 밖으로 신중 하 게 수행 합니다. 예를 들어, 그것은 원시 오염 아주 쉽게 발생할 수 있습니다 모든 단계 엄격한 무 균 조건 하에서 수행 됩니다. 장갑 및 biosafety 캐비닛 외부에서 사용 하는 악기 전체 절차 동안 자주 70% 에탄올으로 분무 한다. 또한, 문화 미디어 및 인공 중추 솔루션 유지 되어야 한다 살 균 및 감기 (4 ° C), 그리고 만든된 신선한 매 2-3 주. MGE 파생 기능을 좀 더 구체적으로 분류 하에 특정 발기인 통제 같은 실험에 사용 되는 플라스 미드를 복제 (예: Dlx5/649, Lhx665), 간단 하 게는 해부학에 의존 하지 않고 MGE는의 타겟팅. Organotypic 조각 생성 살아남기 위해 뇌를 필요 합니다. 따라서, 셀 건강과 생존을 유지 하기 위해이 실험 한다 실시 순간부터 3 시간 이내에 배아 organotypic 조각 문화에 배치 됩니다 때까지 검색 됩니다. 시간 효율성에 대 한 문화 접시 미리 만든 배양 실험을 시작 하기 전에 단지 가득 고 사용까지 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에 넣어 될 수 있습니다. 또한, 두뇌 해야 될 신중 하 게 해 부 대뇌 피 질의 표면에 어떤 손상도 없이 두개골에서 agarose 솔루션 및 후속 vibratome 단면에 포함 하는 적절 한 달성 하기 위해. 예를 들어, 주변 agarose 젤에서 250 µ m 두께 섹션의 분리 또는 vibratome 단면 중 섹션의 저하에서도 최소화 하 고, 대뇌 피 질의 표면에 손상을 발생할 수 있습니다. 생존을 위해 신경, 그것은 또한 중요 agarose 솔루션 온도 42 ° C 가까이 남아 높은 온도 낮은 온도 뇌의 적절 한 포함 배제 됩니다 반면 조직 손상과 세포 죽음, 리드 (동안에 그것을 손상 또는 과정 포함). 일단 문화,을 피하기 위해 다른 오염 소스, 슬라이스 해야 하지 조작할 수 그들은 이미징에 대 한 현미경 전송 되기 전 까지는. 다음이 단계는 멸 균된 환경에서 실행 되어야 한다 그리고 그들은 이후 다시 이미징에 대 한 문화에 다시 넣어야 하 필요로 하는 경우에 특히 이러한 조작 후 번호판을 오염 하지 않기 위하여 관심을 지불 합니다. 마지막으로, 우리가 이러한 자료와 electroporated의 수확량에 상당한 감소를 관찰 미래 사용을 위해 이전 실험에서 염료를 로드 섞인 DNA 약 수를 회복 하지 않는 것이 좋습니다.
결론적으로, utero ex electroporation 그리고 organotypic 슬라이스 문화 프로토콜 위에서 설명한 MGE 파생 기능 단일 세포 수준에서의 특정 라벨에 대 한 허용 하 고 유전자를 특정 분자 경로 조작 하는 데 사용할 수 있습니다. 형태학 상 변화 및 마이그레이션 역학의 통제에서 그들의 역할을 연구 tangentially 마이그레이션 기능. 이 방법은 신속 하 고 저렴 한 비용 초기 기능 조사 철새 기능66,67 의 단일 셀 RNA 시퀀싱을 통해 또는 환자의 다음 세대 시퀀싱을 통해 식별 하는 소설 후보 유전자의 수 neurodevelopmental 장애68,,6970. 이 기술은 광범위 하 게 공부는 피 질과 해 마70,,7172,73에 피라미드 세포를 포함 하 여 다른 세포 인구에서 마이그레이션에 사용 되었습니다. 일단 마스터, 그것은 잠재적으로 사용 될 수 이미지 재활용 및 막 단백질, GFP 태그 단백질;를 사용 하 여 채널 수용 체 등의 인신 매매 바이오 센서74;를 사용 하 여 특정 세포 신호 폭포의 활성화 또는 모니터링 및 칼슘 이미징 대뇌 피 질의 기능 뿐만 아니라 다른 뇌 영역, 해 마, 편도 체 등도 optogenetics에 결합을 사용 하 여 세포 활동의 조작.
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Disclosures
저자는 공개 없다. 언급 된 조회는 반드시 보건 장관 또는 캐나다 정부 의견을 대표 하지 않는다.
Acknowledgments
이 작품 운영 사 재단 및 치료 간 질 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 하 고 장비에 의해 혁신을 위한 캐나다 기초에서 E.R (confocal 현미경) 및 처리 (회전 디스크 confocal 현미경)을 부여 합니다. 응급실에서 경력 상을 받습니다는 Fonds de 검색 뒤 퀘벡-건강 (FRQ-S; Clinician-scientist 수상) 뿐만 아니라 건강 연구 (CIHR; 위한 캐나다 학회에서 젊은 수 사관 상)입니다. G.H.는 FRQ 미의 고위 학자 이다 르 사 재단, 추 셍 트-쥐스틴 재단 박사 훈련 수상 FRQ S 박사 교육 상 별 재단 협력에서에서 Steriade 사 박사 교육 상 받는 사람입니다. 이 프로젝트는 만들어진 가능한 르에 게 수 여 하는 건강 캐나다의 재정 지원으로 캐나다 뇌 연구 기금을 통해 뇌 캐나다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
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