Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57526
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2,4
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology, Université de Montréal, 4Department of Pediatrics, Université de Montréal

Summary

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Abstract

GABAergic interneurons (Ins) sürücü biliş ve davranış nöronal ağların önemli bileşenleridir. Korteks doldurmak için mukadder INs yüzeysel (medial ve Kaudal ganglionic efendiler (MGE, CGE) dorsal kortikal plaka yanıt olarak bir değişiklik de dahil olmak üzere) ventral telencephalon içsel ve dışsal kökenli yerden göç İpuçları. Genetik olarak belirli yolları değiştirmek ve nasıl onlar için uygun gerekli dinamik hücre iskeleti değişiklikleri düzenleyen araştırmak için yıl içinde farklı yöntemleri geliştirilmiştir geçiş içinde. Rahim içinde elektroporasyon yoğun gen baskı etkisini incelemek için kullanılan veya overexpression belirli inç içinde morfoloji ve son konumu üzerinde etki değerlendirme sırasında alt türlerinden. Bu yaklaşım kolayca Radyal geçirme piramit hücreleri değiştirmek için kullanılırken, İzo rahim içinde elektroporasyon hedefleme bir düşük verim azalmıştır sağkalım oranları ve yavrularını verilen oluşturduğunda ancak, bu teknik açıdan daha zorlu bir zaman elektroporasyon MGE kaynaklı INs okurken geleneksel olarak e14.5 önce yapılır. Alternatif bir yaklaşım, MGE explants MGE için kolay erişim sağlar ve görüntüleme genetiği değiştirilmiş ins kolaylaştırmak. Ancak, bu explants içinde endojen rehberlik ipuçları ve talamik girişleri yoksun yapay bir matris içine INs geçirin. Bu bize bir yöntem teknik zorluklar içinde utero yaklaşımların engellemeyi INs daha doğal bir ortamda nerede geçirebilirsiniz optimize etmek için istenir. Bu yazıda, biz eski utero elektroporasyon kolayca izlemek, görüntü ve genetiği değiştirilmiş INs yanıt olarak kendi doğal yolları boyunca göç yeniden oluşturmak için organotypic dilim kültürler tarafından takip embriyonik fare beyin kombinasyonu tanımlamak endojen ipuçları. Her iki miktar geçiş hızlandırılmış confocal görüntüleme ile dinamik açıdan, yanı sıra çeşitli morfolojik parametreleri nöronal rekonstrüksiyonlar sabit immunolabeled doku üzerinde kullanma ayrıntılı bir analiz için bu yaklaşım sağlar.

Introduction

Kortikal GABAergic interneurons (Ins) biyokimyasal özellikleri açısından, fizyolojik özellikleri ve bağlantı, çeşitli ve farklı işlevler olgun ağlar1,2,3 aracılık ,4,5. Kortikal ins farklı alt türlerinden tayini sıkıca kapsamlı eğitimi1,2olmuştur genetik cascades ile düzenlenir. Kortikal GABAergic INs çoğunluğu (% 70) ataları medial ganglionic hazretleri (MGE), ventrally bulunduğu bir embriyonik yapısı içinde kaynaklanan ve kortikal plaka1, ulaşmak için oldukça uzun mesafeler arasında geçirmeniz gerekir 2 , 6. kortikal piramit hücreleri Radyal Radyal glia iskele boyunca kortikal plaka (VZ) ventrikül bölgesinden göç ederken, böyle bir iskele bağlı değil, ins, teğet geçiş içsel çeşitli gerektirir ve uzak olmayan-kortikal yapılar2,7,8rehberlik ederken geçirme nöronlar kortikal plaka doğru çekmek için dış yardımlar. Hücre döngüsü çıktıktan sonra INs püskürtüldü MGE kemoterapi itici cues kortikal plaka9,10doğru teğet geçiş tetikleyen MGE VZ içinde ifade tarafından. INs geçirme striatum farklı itici ipuçları11 yardımı ile önlemek ve, kortikal plaka ulaşan sonra onlar bir teğet bir Radyal geçiş moduna geçin ve onların son Laminer pozisyonda, kısmen yanıt ipuçlarını piramit ulaşmak hücreler12 ve diğer hücresel nüfus13. Bileşenler, geçiş diğer nöron popülasyonları gelince nöron fiili hareketi izin vermek için çeşitli dinamik morfolojik değişiklikleri içerir. Bu sözde nöronal hareket üç ardışık adımlar tekrarlayan döngüleri tarafından karakterize: uzama önde gelen bir süreç, bir etkin anterograd hareket çekirdeği (nucleokinesis) ve retraksiyon izleyen süreç14. Geçiş sırasında sürücü dallanma ve etkin INs Yönlendirme ve geçiş14,15 hızını belirleme uygun yönde rehberlik için önde gelen süreç remodeling çok sayıda iç ve dış yardımlar tarafından düzenlenmiştir ,16.

Geçişinde kortikal düzenleyen belirleyici son yıllarda1,2,7,17,18,19,20içinde kapsamlı bir şekilde inceledik, ve bazı bu moleküler aktörler bozulma Pediatrik dirençli epilepsi veya otizm spektrum bozuklukları1,2,21, gibi nörogelişimsel bozukluklar için öne 22 , 23 , 24. bu nedenle, çeşitli vitro ve in vivo yaklaşımlar geliştirilmesi önemli ölçüde bu dinamik bir süreç, daha önce geçirilmiş25olarak çalışmaya yeteneğimizi ilerlemek için takip. Vitro yöntemleri Boyden odası tahlil ve şerit seçim tahlil de dahil olmak üzere, gereksinim ve belirli genler veya proteinler hücre özerk etkisini nöronal geçiş sırasında değerlendirilmesi en hızlı ve en tekrarlanabilir anlamına gelir sağlamak, diğer faktörler25etkisi. Canlı görüntüleme8,26,27ile birleştirildiğinde bu deneyleri özellikle yararlıdır. Bu teknikleri ile bileşenler kolayca e13.5 MGE alındı ve sonra farklı sinyal yolları ve rehberlik cues soruşturma olması, enzimatik ve mekanik ayrışma tarafından daha önce8,28 gösterildiği gibi izole . Ancak, bu deneyleri yokluğunda potansiyel olarak etkileyen hücre göç ve/veya hayatta kalma25nöronal davranış ve hücre özelliklerini değiştirebilir üç boyutlu doku mimarisi, yapay bir hücre dışı matriks yer almaktadır. Bu sınırlamaları aşmak için ex vivo MGE explants hızı ve yönü14gibi parametreleri ile birlikte taşıma sırasında meydana gelen dinamik morfolojik değişiklikleri ölçmek için alternatif bir araç olarak geliştirilmiştir, 29. MGE explants üreten nispeten basit ve kapsamlı olmuştur başka bir bölümünde30. İkinci isteğe bağlı31olmasına rağmen MGE monolayer karışık kortikal hücrelerinin veya matrigel ve kollajen çekici veya itici cues25, huzurunda karışımı üzerinde küçük bir özü kaplama üzerine kuruludur. MGE explants seyrek etiketli hücreleri görüntüleme, çalışma hücre iskeleti dallanma, önde gelen işlemi sırasında yeniden daha önce32,33 gösterildiği gibi hücre içi süreçlerin basitleştirilmesi yüksek çözünürlük için izin ver ,34 ve çalışmanın içinde. MGE explants başarıyla dinamik hücre iskeleti değişimler sırasında geçiş 2D bir ortamda, örneğin belirli farmakolojik veya kemotaktik manipülasyonlar sonra (bkz, örneğin, Tielens vd. 201633) değerlendirmek için kullanılan . Ancak, bu yaklaşım ile INs göç içinde yapay bir matris ve bu davranış ve tekrarlanabilirlik ve deneysel sonuçlar önemini değiştirebilir.

Buna karşılık, rahim içinde elektroporasyon INs genetik manipülasyon kendi doğal ortamlarında sağlar ve hızla ve verimli bir şekilde değerlendirmek kazanç etkisini ve gen fonksiyon kaybı sınırlamaları engellemeyi süre için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir pahalı ve zaman alıcı nakavt ve çakma stratejileri25,35. Rahim içinde elektroporasyon doğru ataları içinde hücre türü belirli Organizatör kullanarak ve elektrotlar MGE36dahil olmak üzere ventromedial yapılar doğru konumlandırma önyargılı. Ayrıca, rahim içinde adım 1-2 gün içinde deneysel yapıları, zamanında ifade sağlar yapı ifade viral kullanmak için gereken 7-10 gün ile karşılaştırıldığında25Vektörler. Ancak, rahim içinde çoğalmasıyla, ataları olarak düşük verimli olma eğilimindedir. Piramit hücre ataları dorsal ventrikül bölgede bulunan verimli bir şekilde transfected rağmen Nitekim, rahim içinde kullanarak elektroporasyon MGE gibi daha ventrally bulunduğu yapıların hedefleme, daha teknik meydan okuyor, özellikle küçük e13.5 embriyo ve embriyonik ölümcül daha da yüksek oranda deneysel verim25azaltır.

Bazı vitro ile ilişkili teknik sınırlamaları aşmak için MGE explant deneyleri ve vivo rahimde çoğalmasıyla, ex vivo organotypic dilim kültürler gelişmiş8,37edilmiştir, 38,39. Beyin organotypic dilim kültürler teklif vivo içinde taklit avantajı koşulları, daha az pahalı ve zaman alıcı üreten hayvan25modelleri daha olurken. Gerçekten de, bu ürünleri ile birlikte ins, belirli görselleştirme MGE kolay bir erişime ve bileşenler altında bir daha fizyolojik çevre8 ' geçiş belirli moleküler yolları araştırmak için odak elektroporasyon ile birlikte , 39 , 40 , 41. biz bu nedenle bir yaklaşım eski utero elektroporasyon ve hızlandırılmış confocal görüntüleme ile kombine organotypic kültürler için38, optimize, morfolojik ve dinamik bir süreç meydana gelen değerlendirmek için daha fazla MGE-ins teğet geçiş sırasında. Mevcut Protokolü uyarlanmış ve piramidal hücreleri42,43 geçiş çalışmaya eski rahim veya rahim içinde beyin elektroporasyon ve organotypic dilim kültürler kullanan diğerlerinden en iyi duruma getirilmiş ve kortikal INs36,39,44. Özellikle, fare embriyo kesti ve MGE electroporated ex vivo deneysel plazmid, İntraventriküler enjeksiyon sonra ne ile elde edilebilir daha MGE ataları daha verimli ve hassas hedefleme izin vermek olur rahim içinde adım. Beyin sonra ayıklanır ve bir kaç günlüğüne kültürlü bütün beyin koronal dilimler halinde kesitli, böylece sürekli izleme ve sağlar transfected INs görüntüleme. Bu yaklaşım, genellikle 5-20 yüzeysel geçirme INs kolay ayrılması emin olmak için yeterince seyrek nöronal Vaha'da etiketleme istatistiksel anlamlılık, ulaşmak için gerekli deneysel yineleme sayısını en aza indirme başına beyin dilim, etiketleri bireysel nöronlar imar ve iyi morfolojik değerlendirme. Ayrıca, organotypic kültürlerin bu geçirme sağlamak MGE explants için karşılaştırıldığında INs maruz kalmış yerel olarak salgılanan kemokinler ve talamik afferents girdileri de dahil olmak üzere daha doğal bir ortam. Bu yaklaşım böylece yön ve göç yolu önde gelen işlem dallanma gibi daha hassas dinamik süreçler karakterizasyonu izin vermek için yeterli anatomik bilgi sunarken transfected bileşenleri tarafından kabul ölçmek için de uygundur, nucleokinesis ve sondaki işlem geri çekilmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm Deney hayvanları içeren Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les CHU Sainte-Justine araştırma Merkezi'nde Animaux de Recherche (CIBPAR) tarafından kabul edildi ve Kanada Konseyi hayvan bakım'ın rehberinde uygun olarak yapılmıştır Care and Use deneysel hayvan (Ed. 2).

Burada açıklanan protokol için embriyo elektroporasyon embriyonik gün (e) bir anda 13,5, ne zaman INs MGE kaynaklı aktif olarak oluşturulur, tepe CGE kaynaklı INs üretim45,46önce optimize edildi. Ayrıca, doğru GABAergic INs elektroporasyon önyargı için biz seçerek bileşenler (örneğin, en az artırıcı ile Dlx5/6 organizatörü)47yılında ifade bir organizatörü kullanın.

1. adım ve Organotypic dilim kültürler için çözümler hazırlanması

  1. 125 mL steril kültür ortamı hazırlamak.
    1. 125 mL normal nöron özel kültür ortamının ölçmek ( Tablo malzemeleri formülasyon için görmek) bir daha önce UV sterilize Biyogüvenlik kabini steril bir şişede % 70 etanol ile püskürtülür. 50 serum Ücretsiz Nöron özel ek, 1,75 mL 200 mM glutamin (son konsantrasyonu 0.5 mm) ve ısı inaktive at serum steril koşullar altında daha önce bölünmemeli 6.25 mL x 2,25 mL ekleyin. İyice, aliquot 15 ml steril konik tüpler karıştırın ve 4 ° C'de depolayın
      Not: Hazırlanan kültür orta 4 ° C'de 3 hafta kadar depolanabilir
    2. 150 µL aliquots steril koşullarda bir 100 hisse senedi çözüm Botteinstein'ın N-2 formülasyonu48 X böler ve kadar kullanmak-20 ° C'de dondurmak.
  2. Steril yapay serebrospinal sıvı (ACSF) 1 L hazırlayın.
    1. 800 mL distile su bir 1 L ölçek ölçmek. 25.67 g Sükroz, 5,08 g sodyum klorür (NaCl), sodyum bikarbonat (NaHCO3), 2.18 g glikoz, 0,19 g Potasyum klorür (KCl), 1.80 g yem mono susuz sodyum fosfat (NaH2PO4), 0.15 g 1 M stokunun CaCl2 1 mL ekleyin. .2H2O ve 1 m 2 mL stok MgSO4.7H2oda sıcaklığında çözülmeye O. heyecan. Toplam hacmi 1 L. ulaşmak için distile su ilave
    2. 0,22 µm filtresini kullanarak, steril şişede steril Biyogüvenlik kabini içine çözüm filtre ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
  3. ACSF içinde % 4 özel her deneme önce taze bir çözüm hazırlamak.
    1. Önceden hazırlanmış ACSF 50 mL steril konik tüp içinde 25 mL ölçmek ve düşük erime noktası özel 1 g ekleyin.
    2. 45 için ısı fırın mikrodalga bir de s. Dökülmesini önlemek için ne zaman kaynama başlar her 3-4 s Isıtma kesme, tüp basıncı dışarı, tekrar kapatın ve el ile özel karıştırmak için kışkırtmak izin açın. Özel çözüm homojen gelene kadar bunu tekrarlayın. Özel çözüm 42 ° C'de katılaşma önlemek için deney sırasında geri kalanı tutmak.
      Not: Daha yüksek sıcaklıklarda beyin dokuları zarar verir.

2. enjeksiyon için plazmid hazırlanması

  1. Bir cam mikroenjeksiyon pipet çekin
    1. Micropipette çektirme uygun parametrelerle ayarla, cam kılcal sağlanan uzayda güvenli ve filaman ile merkezli olduğundan emin olun.
    2. Çekme düğmesine basın.
    3. Dikkatli bir şekilde yeni yapılan mikroenjeksiyon Pipetler ısı puller ve yerin kutusundaki veya temiz petri kabına ucu zarar görmesini önlemek için daha fazla kullanılmasını kadar kaldırın.
  2. Kurulum tüm aletleri ile kabine Biyogüvenlik bunun için (bkz. şekil 1A) deneme, cömertçe tüm araçları Biyogüvenlik kabini % 70 etanol ile sprey ve sterilize cihazları ve çevre için 15-20 dk UV ışığıyla.
  3. Sterilizasyon adımı sırasında plazmid buz (4 ° C) çözülme.
  4. Plazmid hisse senedi çözüm (4 µg/µL) üzerinden 10 µL temiz 1.5 mL santrifüj tüpüne ölçmek. Hızlı yeşil FCF % 0,01 ekleyin. Karışımı yavaşça, kısaca spin ve buz üzerinde kullanımda kadar devam.
    Not: Maxi-prep DNA bir endotoksin-Alerjik maxi-hazırlık seti üreticinin iletişim kuralı'nı göre hazırlanmalıdır. DNA TE arabellek veya nükleaz ücretsiz çözündürüldükten H2O ve boya çözüm olabilir, ama ile plazmid hazırlanması steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir değil. Plazmid Maxi-hazırlık üzerinden birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek için bölünmemeli olmalıdır. Bölünmemeli Plasmid'ler ile boya yok daha fazla o 2 h kullanmadan önce karışık olabilir ve daha fazla kullanım için refrozen değil.
  5. Sterilizasyon sonra aşağıdaki gibi nano-enjektör hazırlayın.
    1. Bir temiz kutusu veya petri kabına pipet ucu bir dış çapı yaklaşık 15 µm ulaşmak için eğimli bir şekilde kesmek için küçük cımbız kullanın saklanan önceden hazırlanmış cam mikroenjeksiyon pipet birini seçin.
      Not: Burada verilen dış çap kullanıcı bizim deneylerde kullandığımız bir fikir vermek için yaklaşık bir ölçüsüdür ve plazmid enjeksiyon için kafatasının piercing için sıvı izin verirken beynin zarar vermeden kolaylaştırmak için en iyi duruma getirilmiş Yükleme ve DNA'ın yayın. Dış çapı ölçmek kesme parlak alan mikroskop altında micrometric ölçek çubuğu için apposed cam mikroenjeksiyon pipet ucu bakarak.
    2. Bir şırınga ile madeni yağ (tüm havayı çıkarmak için) unpulled sonundan micropipette doldurmak için kullanın.
    3. Doldurulmuş cam micropipette nano-enjektör içinde üreticinin yönergeleri izleyerek ekleyin.
    4. Boş 2/3'ünü (Hava girişini engellemek için yeterli yağ tutma) cam micropipette.
  6. Dikkatle hazırlanmış micropipette plazmid/boya solüsyon içeren tüpe takın ve cam micropipette plazmid/boya çözüm ile doldurun.

3. fare embriyo gelen hamile kadın koleksiyonu

  1. Vajinal, tercihen aynı zamanda her gün (erken öğleden sonra) tanıttığım için değerlendirmek için üreme kadın her gün izlemek. Gün e0.5 ne zaman vajinal bir fiş gözlenen ilk gün karşılık gelir.
    Not: Burada açıklanan deneyler vahşi tipi fareler yapılabilir. Ancak, MGE tanımlaması kolaylaştırmak ve bütün GABAergic INs (veya belirli alt kümelerini MGE kaynaklı bileşenleri gibi) etiket Transjenik hayvanlar kullanılabilir (örneğin: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre Cre-muhabir gen, vb47,49ile). Bu durumda, enjekte deneysel plazmid görselleştirme transfected ins (sarı) (yeşil) transfected INs ile karşılaştırılabilir izin vermek için başka bir fluorophore (örneğin mCherry veya TdTomato) hızlı.
  2. Erkek, embriyonik gün e13.5, boyun çıkığı tarafından kurban.
    Not: anestezik ajanların kurban anda verilen geçiş ve hayatta kalma50,51 de etkileyebilir ve kaçınılmalıdır.
  3. Embriyo sezaryen tarafından aşağıdaki gibi toplamak.
    1. Cömertçe kadın karın % 70 etanol ile sprey. Karın deri çift sterilize Forseps ile yukarı çekin ve diğer elini de steril Cerrahi makas karın derisini kesmek için kullanın.
    2. İkinci bir çift sterilize forseps ve makas ile karın fasya yukarı çekin ve dikkatli bir şekilde rahim kaçınırken kesti.
    3. Üçüncü çifti sterilize forseps ve makas kullanarak, rahim boynuzları çekin ve pelvik kavite dışında kesin. Disseke rahim boynuzları sinirsel tabanlı kültür amino asitler, vitaminler ve inorganik tuzları ( Tablo malzemeleri ticari ürün için görmek) ile takıma orta dolu steril 60 mm petri kabına yerleştirin.
  4. Kabine bir steril Biyogüvenlik içinde iyi cımbız (her biri elinde) iki çift embriyoların plasenta dışında incelemek ve başkanları tarafından işten çıkarma yalıtmak için kullanın.
  5. Eğik kesimli bir steril 3 mL plastik transfer pipet ucu Aspire edin kafaları ve onları yeni steril 60 mm petri kabına katılaşmış siyah balmumu ile katmanlı ve sinirsel tabanlı aynı ile dolu transfer kültür ortamı olarak yukarıdaki desteklenmiştir.
    Not: Bu adımı kirleticileri (fare saç, kan) transferi en aza indirir. Siyah mum baş diseksiyon sırasında stabilize etmek için kullanılır. Kültür medya bu işlemler sırasında oksijenli gerek yok.

4. İntraventriküler plazmid enjeksiyonları ve Ex Vivo elektroporasyon MGE

Not: Aşağıdaki adımları önceden hazırlanan Biyogüvenlik kabini steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Yer 60 mm petri kabına siyah balmumu ile katmanlı ve kesik başları içeren sinirsel tabanlı kültür orta Biyogüvenlik kabini dürbün altında desteklenmiş.
  2. Baş, sağ, sol el ile sorun cımbız ile karşı karşıya rostral bölümü stabilize ve nano-enjektör sağ elinde 1-2 µL plazmid/boya çözüm sağ yanal ventrikül enjekte için kullanın.
    Not:-Ebilmek var olmak eş ifade deneyler her iki plazmid ekimolar konsantrasyonlarda karıştırılarak bir kurtarma Plazmid ve shRNA ifade plazmid co-electroporating tarafından yürütülen.
  3. Electroporate enjekte beyin.
    1. Başını elektrotlar ile negatif elektrot dorsally konumlandırılmış ve kafasına paralel ve ventral MGE hedeflemek için baş tarafına doğru pozitif elektrot arasına yerleştirin.
    2. Sonra elektrotlar iyi yerleştirilmiş, 4 kare bakliyat 40 V 500 ms 50 ms için arası darbe aralıkları teslim.
    3. Zaten içinde Biyogüvenlik kabini yerleştirilir cımbız kullanarak elektrotlar herhangi bir kalıntı dokuyu.
      Not: Bu parametreler özellikle bizim deneylerde kullanılan electroporator için optimize edilmiştir. Biz kullanıcıların en iyi duruma getirme testleri önceden electroporator farklı bir türünü kullanıyorsanız gerçekleştirmenizi öneririz.
    4. 4.1-4.3 tüm kalan beyin için yineleyin.
      Not: her ne kadar bu iletişim kuralı bir beyin için gerekli işlemler açıklanır, bu sırayla electroporating önce 4 beyin böylece verim artan her beyin enjekte etmek mümkündür. 2 veya daha fazla farklı plazmid sırayla (Denetim veya deneysel plazmid) (littermates arasında karşılaştırma için izin verir) aynı deneyi sırasında enjekte edilir bu strateji özellikle avantajlıdır. Buna ek olarak, bu enjekte etmek mümkün ve electroporate aynı anda 's elektrotlar tamamen beyin yüzeyine paralel getirerek verimi artırmak için beynin her iki taraf.

5. beyin diseksiyon ve Organotypic dilim kültürleri

  1. Hala Biyogüvenlik kabini steril ortamda manipüle ederken, kafatası dışında beynini incelememize.
    1. Siyah mum tabakası kafasına dikkatle beyin kaçınırken her gözün içine bir iğne ekleme tarafından stabilize.
    2. Bir çift güzel cımbız boynun sol tarafında ve kafatasından arka ön için deriden gözyaşı iyi cımbız ikinci bir çifti için kullanın.
    3. Baş yanal cımbız bir elinde tutarken, diğer elinde cımbız başka bir çifti dikkatle kafatası beyin düzeyinde kesin ve kafatası yavaşça çekin için kullanın. Her cımbız ile kafatası önüne doğru sagittal düzlemde (ortada) kesme ve kafatası parçasını kurtarmak için yanal deşmek.
    4. Beyin kaldırın ve kranial sinirler ve meninkslerde beyin tamamen dışarı kafatası kadar dikkatle kesin.
      Not: 5. 1'açıklanan tüm adımları bir biyogüvenlik kabini sıkı steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.
  2. Beyin düşük erime noktası özel kesit için % 4 katıştırın.
    1. 35-mm petri kabına (42 ° C'de sıvı tutulması) yukarıda hazırlanan özel çözüm ile doldurun.
    2. Hızlı bir electroporated beyin daha önce kesilmiş transfer pipet kullanarak özel dolu çanak aktarın. Yemek oda sıcaklığında tutmak.
    3. Özel (batan önlemek için) iyi ortasında beyin tutmak için metal bir sopa ile karıştırın ve beyin rostro Kaudal bir düzlemde paralel olarak çanak yerleştirin. Özel başladığında kuvvetlendirmek için herhangi bir beyin hasarı önlemek için karıştırma durdurmak.
    4. Beyin çevresinde 1-2 milimetre bir marj bırakarak dikdörtgen bir blok oluşturmak üzere beyin çevreleyen özel kesmek için jilet kullanın. Beyin rostral parçası sonraki parça adımları için yönlendirme kolaylaştırmak için bloğunun ön sınırlamak için dik olduğundan emin olun.
    5. Her beyin için yineleyin.
      Not: Birden fazla beyin ayrı özel bloklar her beynin farklı heights adlı ayarlanırken şekillendirme tarafından bir anda (en fazla 3) kesmek mümkündür.
  3. Vibratome koronal bölümleri ve dilim kültür.
    1. 100 X N-2 tezcan bir aliquot (150 µL) buz üzerinde ek ve steril koşullarda 15 mL bölünmemeli kültür Orta'ya ekleyin.
    2. Kültür orta (1 X N2 eki ile) 750 µL 6-şey kültür plaka her şey için transfer.
    3. Eğri cımbız ile bir hücre kültür Ekle (30 mm çap, 0.4 µm gözenek boyutu, PTFE) her orta-iyi doldurdu koyun.
    4. Vibratome banyo ile sürekli oksijenli ACSF doldurun. 4 ° C-banyo çevreleyen buz ile serin ya da soğuk hava vibratome kullanın.
    5. 0,150 mm/s ve 80 Hertz frekans vibratome hızını ayarlar.
    6. Vibratome platformu, aşağı bakacak şekilde rostral edge ve ventral özel blokta tutkal kenar kullanıcı karşı karşıya.
    7. 250 µm kalınlığında kesitler (4 ° C'de) elde etmek için koronal bölümleri beyinde kesti.
    8. Steril spatula ile tüm beyin bölümleri tek 30 mm membran üzerinde bir hayvan eklediğiniz, dikkatli bir şekilde bölümler arasında örtüşme kaçınırken yeri ve MGE içeren 2-3 bölümler toplamak. INSERT bir kuyu (yukarıda açıklandığı gibi ilave kültür ortamının 750 µL içeren) bir 6-şey kültür tabak yerleştirin. Alternatif olarak, her bölümün ayrı 13 mm çap membran ile 500 µl takıma kültür orta dolu bir 12-şey kültür plaka yerleştirilebilir. Kültür her şey için önerilen orta miktarda medya tarafından batık olmadan beslenmesi için beyin bölümleri sağlar.
      Not: vibratome sterilize ve bir biyogüvenlik kabini kullanılan sürece 5.3.6 ve 5.3.7 açıklanan adımları tam steril koşullarda gerçekleştirilir değil. Bu nedenle, dikkatli bir şekilde herhangi bir kirlenmesini önlemek için aşağıdaki adımları yapmak çok önemlidir. Saç, yüz ve eller, hiç geçmek gibi kültür plaka (varken veya yokken kültür orta) üzerinde uygun koruma araçlar (temiz maske, cerrahi eldiven ve önlük) tüm kez ve vücut parçaları hatta kaplı, giyilmelidir. Ayrıca % 70 etanol eldiven ve beyin bölümleri toplamak için kullanılan spatula üzerinde sık sık sprey için önerilir.
    9. 48 veya 72 s % 60 nem oranı ve % 5 CO2 37 ° C'de havalandırılmış bir steril kuluçka kültür tabak koyun.
      Not: Bu kuluçka kez MGE kaynaklı ins zaman hata görüntüleme ve sabit dilimleri, confocal görüntüleme için sırasıyla optimize. En uygun kuluçka kez önceden her deneysel tasarım için test edilmelidir. Buna ek olarak, seçilen kuluçka 72 h ve altında kültür ortamı değiştirmeye gerek yoktur. Uzun kuluçka süreleri için kültür orta 2-3 günde değiştirilmelidir.
    10. İstenen kuluçka süre sonra faiz bölümlerini bir 8 odalı coverslip transfer ve 3-5 µL kültür ortamının ekleyin. Coverslip (37 ° C, % 60 nem oranı, % 5 CO2) çevresel bir odasında bir ters bağlı yer disk confocal donatılmış bir edinme bilgisayar destekli yazılım kurulumu için hızlandırılmış görüntüleme oturum iplik.
      Not: Alternatif olarak, Bölüm %4 paraformaldehyde (gecede 4 ° C'de veya oda sıcaklığında 2 h) ve daha sonra immunostained electroporated INs altında bir confocal Morfolojik özellikleri görüntüleme için farklı antikorlar ile sabit olabilir mikroskop. Her ne kadar karşı boyama yordami olmadan confocal mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir eGFP ve mCherry, immünhistokimya GFP ve mCherry fiksasyon işlemi Floresan, azaltabilir beri sinyal artırmak için karşı yapmak tavsiye azaltılması öncü veya izleyen süreçlerde küçük dalları gibi embriyonik nöronların ince bileşenleri algılama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu bölümde, biz temsilcisi sonuçları elde edilen denetim plazmid veya bir gen ilgi e13.5 fare embriyo organotypic dilim kültürler tarafından takip MGE hedefleme bir deneysel plazmid eski utero elektroporasyon takip sağlamak 37 ° C'de 48 h (için hızlandırılmış görüntüleme) veya (fiksasyon ve immunohistokimyasal etiketleme için) 72 saat inkübe (için şematik Protokolü Bkz: şekil 1B ). Temsilcisi bir MGE explant geçiş INs de resimli (bkz. şekil 1 c şematik Protokolü) bir karşılaştırma için burada açıklanan yöntemi örnekleridir. MGE ataları bir plazmid elektroporasyon INs çıkışından MGE gecikme gibi görünüyor ve kültür zaman buna göre ayarlanması gerekir.

Başarılı bir deneme organotypic dilim confocal mikroskop altında sağlıklı görünür, yani kortikal katmanları parlak alan modunu kullanarak kolayca ayırt ve (yoğun tarafından tanınabilir dilim yüzeyinde görünür hiçbir kirlenme autofluorescence ve floresan filamentler epifluorescence altında görünür varlığı). Sağlıklı kronik organotypic dilimler halinde hücre yaklaşık % 20'si kültür (Resim 2), kronik organotypic kültürler (örneğin doğum sonrası kültür)52daha önce açıklandığı gibi 72 h sonra apoptosis tabi. Yine de, brüt cytoarchitectural beyin yapısı iyi tanımlanmış, resimli olarak burada (şekil 2A) Boyama DAPI kullanarak kalır. Bizim protokol MGE ex vivo elektroporasyon için ortalama bir dilim(şekil 3AB), başına 50-100 transfected hücrelerin hangi 5-20 hücre kültüründe 72 h sonra dorsally geçiş görülecektir verir. Onlar bir uzamış/oval hücre gövdesi, ara sıra izleyen süreci ve önde gelen bir süreç takdim ederken fiksasyon ve immunohistokimyasal boyama sonra yüzeysel kortikal plaka doğru göç INs kolayca confocal mikroskobu ile tespit edilebilir Yüzeysel odaklı. Önde gelen işlem genellikle bir ya da iki dalları açmaktadır ve ara sıra bir şişlik (centrosome nucleokinesis önce Konut) çekirdeği ve büyüme koniler her dalın ucunda önünde varlığı ile tanınabilir. (Şekil 3 c-G).

Bu iletişim kuralı gözlem hızlandırılmış Imaging'i kullanma tek hücre düzeyinde geçirme MGE kaynaklı ins için tasarlanmıştır. Bu özel deneme için (şekil 4), Dlx5/6Crekoronal organotypic beyin dilimleri oluşturulan; RCEEGFP embriyo electroporated adlı deneysel bir shRNA (bir gen ilgi hedefleme) ve TdTomato kaset ifade bir plazmid ile e13.5. Dilimleri için 48 saat inkübe, bir 8-şey odacıklı coverslip yemek (odası desteklenmiştir kültür orta ince bir tabaka üzerinde yüzen başına 1 dilim) aktarılır ve 3 dakikada 6-8 h 20 x hava (0.70 NA) amaç donatılmış bir ters mikroskobunun kullanarak yansıma bir iplik disk confocal kafa, bir edinme bilgisayar destekli yazılım ve bir sahne-üst çevre odası. Görüntüleme sırasında dilimleri 37 ° C'de tutulan sürekli oksijenli ve çevre odasında (%5 CO2 ve % 60'ı H2O) nemlendirilmelidir. Electroporated MGE kaynaklı INs tespit edildi gibi eGFP, onların ifade tarafından GABAergic inç kimliklerini ve deneysel plazmid (şekil 4AB) hızlı teyit TdTomato, onların ifade teyit. Electroporated bileşenler kolayca tanımlanabilir ve iyi izole, hız ve mesafe seyahat gibi geçiş dinamik parametreleri, ince analiz için izin şekil 4' te görüldüğü gibi. Buna ek olarak, etiketli INs görülür yüzeysel kortikal plaka, doğal ortamda iken, doğru geçiş önde gelen süreci ve nucleokinesis (şekil 4 c dallanma gibi dinamik morfolojik değişiklikleri tanımlamak olanaklı kılar -F).

Ex vivo elektroporasyon MGE kaynaklı ins da MGE ile kombine edilebilir yüksek kararlılık düşsel dinamik hücre iskeleti süreçlerin, yön ve göçmen dynamics tamamlayacak bir olduğu gibi taşıma sırasında meydana gelen etkinleştirmek için explants organotypic kültürlerde. Örnek olarak, nöronal gezisidir anımsatan Bu organotypic dilim kültürlerde ins teğet taşıma sırasında meydana gelen, farklı aşamalarını gözlenen electroporated içinde bir MGE geçiş INs çoğalmasıyla, lider gibi sonra 48 s explant neurite uzantısı ve nucleokinesis (şekil 5B-E). Çeşitli hücre iskeleti süreçleri daha sonra bir MGE explant örneğin F-aktin yapıları ile en iyi şekilde organotypic dilimler halinde elde edilemez phalloidin (şekil 6A), boyama tarafından geçiş izole hücrelerdeki yüksek çözünürlükte çalıştı yüksek hücresel yoğunluğu göz önüne alındığında (ve böylece hücre iskeleti elemanları) yerel ortamında. Bu hücre iskeleti süreçler ve özellikle F-aktin remodeling, daha da çalışılabilir dinamik olarak Lifeact ifade hızlandırılmış görüntüleme ile birleştirerek. Örneğin, bir inç yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüleme bir örnek göstermek bir MGE explant bir Nkx2.1Cre; elde elde RCEEGFP bir gen INs ilgi hedeflenen silinmesiyle taşıyan fare beyin. Bu inç CMV organizatörü (Michael Davidson hediyesi), kontrol altında mCherry-Lifeact-7 plazmid ile transfected şekil 1 cF-aktin gerçek zamanlı (içinde şekil meydana gelen remodeling izlenmesine izin verme içinde kapsamlıdır yöntemini kullanarak 6B). organotypic kültürler düzgün genetiği değiştirilmiş INs yön veya geçiş yolu değerlendirmek için gerekli olmakla birlikte, bu nedenle MGE explants böyle çalışmalar yüksek çözünürlükte görüntüleme için izole hücrelere daha iyi erişim sağlayarak tamamlayıcı olabilir dinamik hücre iskeleti süreçleri.

Teknik tuzaklar yukarıda açıklanan deney başarısızlıkla sonuçlanabilir. Örneğin, 42 ° C sıcak bir özel çözümde beyin katıştırma doku yıkım ve nöronal ölüm, beyin veya opak haline dilim kalınlığı bir kayıp tarafından ortaya neden olabilir. Tanrıları bir özel çözüm kırılgan embriyonik beyin gömme işlemi sırasında yok edebilir gibi Ancak, sıcaklığı çok düşük tutulmalıdır değil. İkinci olarak, kirlenme önemli ölçüde burada açıklanan deneysel yaklaşımlar verimini azaltabilir. Böylece, tüm adımları mümkün olduğunca sıkı steril koşullarda özenle yapılmalıdır. Tüm çözümler ve ekipman kullanmadan önce sterilize ve ekipman sık bakteri veya kalıp kirlenmesini önlemek için % 70 etanol ile püskürtülür. Kültür orta sarı veya opak olur gibi kirlenme kültür wells doğrudan görünür olabilir. Kültür orta açık ve sıvı kaldığında kirlenme edilmeyecek. Ancak, kalıp dilim yüzeyinde bir tabaka genellikle görülebilir veya dilimleri fiksasyon ve boyama adımları sırasında aşırı kırılgan hale gelir. Böyle dilimleri mikroskop altında görüntülenir, kirlenme autofluorescence bir tabaka olarak etiketli nöronlar üzerinde tezahür veya uzun floresan filamentler varlığı ile açıklanacak. Kirlenmiş wells tuttu Organotypic dilimleri atılmalı, ama aynı plaka diğer wells kültürlü dilimleri-ebilmek saklanmak için daha fazla adımlar. Bakteriyel kontaminasyon oldukça nadirdir ama cidden, tüm ekipman, paylaşılan İnkübatörler ve kültür oda dahil olmak üzere el ile temizlenmiş sterilize ve anlamına gelir alınmalıdır.

Figure 1
Resim 1: Veya rahim elektroporasyon protokollerde şematik gösterimleri organotypic dilim kültür tarafından takip MGE explants. A. burada anlatılan protokolü için gerekli steril aletlerin hepsini bir biyogüvenlik kabine kurulum örneği. B. şematik gösterim eski utero elektroporasyon ve organotypic dilim kültürler için kullanılan iletişim kuralı. Kısaca, embriyo kestiğini, deneysel plazmid lateral ventrikül (1) ve (2) MGE electroporated enjekte edilir. Beyin microdissected dışarı kafatası (3) ve özel (4) gömülü. Organotypic bölümleri bir vibratome (5) oluşturulan ve kültür için hızlandırılmış mikroskobu (7.1) için 48 h 37 °C(6) veya 72 hücre rekonstrüksiyonu (7.2) s yerleştirilir. C. şematik gösterim Myers et al. 201353 uyarlanmış ve MGE oluşturulmasında kullanılan iletişim kuralı explants. Kısaca, dorsolateral cortices ilk dışarı e12.5 e14.5 vahşi tipi fare embriyolar için disseke (1) ve mekanik ayrışmış desteklenmiştir kültür orta (2). Kortikal hücreleri 105 kortikal hücreler/cm2 x 5,25 yoğunluğu, kaplama ve kültürlü bir kollajen/Poli-L-lizin-kaplı 8 odalı coverslip (3) 37 ° C'de 2 h için. Sonra e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embriyo MGE (4, 5) rahim elektroporasyon için işlenir ve MGE el ile beyinden izole ve 100 µm2 parçaları (6) kesti. Bu explants sonra üzerinde önceden hazırlanmış kortikal besleyici katmanı yerleştirilen, kültür orta ile kaplı ve hızlandırılmış görüntüleme (7) önce 48 saat için ortak kültürlü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: cytoarchitecture sağlıklı organotypic dilimleri içinde korunmuş. Organotypic nesil kültürler Nkx2.1Cre ex vivo elektroporasyon sonra dilim; RCEEGFP fare embriyo(a)değil neden önemli doku hasarı olarak korunmuş cytoarchitecture (DAPI (mavi) ve Cre-muhabir (GFP)) saptandı, bir 18 µm kalınlığında cryosection bir Nkx2.1Cre; karşılaştırıldığında RCEEGFP ile % 4 periosteum embriyo transcardially e15.5, PFA. D ve M dorso-ventral ve latero-medial eksenleri, sırasıyla gösterir. (B). yüksek büyütme görüntüleri ters bir confocal mikroskopla çekilen 63 x ile donatılmış / 1.4 petrol objektif bir anti-i ciddi-Caspase 3 antikor (Cl-cas3) ile boyama sonra reveal kortikal plaka hücrelerde yaklaşık % 20'si geçmesi Apoptozis (beyaz ok uçları) 72 h sonra kültür, GFP pozitif INs kalmak sağlıklı iken (beyaz ok), photomicrographs örneği olarak C-C'' '. Buna karşılık, neredeyse tamamen hücresel apoptosis olduğunu yok perfused bir hayvandan ince cryosection üzerinden (D-D'' '). Ölçek çubukları: 250 µm (A-B) ve 15 µm (C-D'' '). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Organotypic dilimleri farelerin beyin embriyo ve electroporated interneurons (Ins) yüksek büyütme photomicrographs. A. bir organotypic dilim kültüründen bir Dlx5/6Cre; RCEEGFP (tüm bileşenler olan yeşil) fare beyin electroporated ile bir Dlx5/6::shRNAşifreli-IRES-TdTomato plazmid. Dilimi %4 ile giderilmiştir PFA kültür ve immunostained GFP ve mCherry için 72 saat sonra. Electroporated INs görüntüsü 3D (50-60 µm kalınlığında her 0,5 µm alınan optik bölümleri ile z-yığınlar) 63 x ile donatılmış confocal mikroskop kullanarak / 1.3 NA petrol amaç. Yüzeysel dorsal pallium alt ventrikül bölgede geçiş kolayca tanımlanabilir (kırmızı, açık ok) bileşenleridir. D ve M dorso-ventral ve latero-medial eksenleri, sırasıyla gösterir. B. bir temsilcisi organotypic dilim kültüründen bir kumanda ile wildtype (WT) embriyo electoporated Dlx5/6::shRNAşifreli-IRES-TdTomato plazmid, 72 h ve immunostained için mCherry yalnızca sabit. Electroporated INs (kırmızı) dorsally kortikal plaka doğru göç görülmektedir. Electroporated INs onların ortak ifadede TdTomato ve EGFP Dlx5/6Cretarafından tanımlanır; RCEEGFP fareler (C-D), veya TdTomato onların ifade sadece farelerde WT (E-H) ve onların tipik Morfoloji, yani bir oval gövde, dallı önde gelen işlem (beyaz ok uçları, D-H), hücre bir ara sıra işlem (beyaz ok, C-D) izleyen ve nucleokinesis önce centrosome konut önde gelen işlem bir zaman zaman şişlik (beyaz yıldız C-C' ve G). Ölçek çubukları: 250 µm (A-B) ve 25 µm (C-H). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: hızlandırılmış canlı görüntüleme electroporated INs organotypic dilimleri için 48 h. kültürlü, INs electroporated e13.5 TdTomato kaset ve bir shRNA bir gen ilgi hedefleme ifade bir deneysel plazmid ile bir Dlx5/6Creelde edilen bir organotypic beyin dilim teğet göç görülmektedir; RCEEGFP fare embriyo kültürü (A, beyaz kare) 48 saat sonra. B, (beyaz kare) aynı electroporated nucleokinesis sürecinde, korteks, yani pial yüzeyine paralel olarak yüzeysel geçirilirken görülür ve hızlandırılmış 3 dakikada 8 h 20 x / 0,85 kullanarak için Imaging'de gelir NA hava Amaç (büyütülmüş kutuları, C-F). Nöron başlangıçta sondaki işlemi (beyaz ok) ve dallı önde gelen işlemi (beyaz ok uçları) yanı sıra nucleokinesis (C) sürecinde uzun bir hücre vücut (açık ok) görüntüler. 3 h canlı görüntüleme sonra nucleokinesis tamamlandı, sondaki işlem çekildi ve önde gelen işlem iki uzun dallar (D, beyaz ok uçları) genişletiyor. 5 saat 30 dk sonra bir önde gelen işlem şubesi (beyaz ok uçları) çekildi ve nöron hücre gövdesi (açık ok) ileriye doğru yaklaşık 10 µm (E) taşındı. Son olarak, 8 h görüntüleme sonra geçiş duraklatıldı, nöron, önde gelen işlem tekrar genişletmiştir ve sondaki işlem (beyaz ok) ortaya çıkmıştır, ama çekirdek (açık ok) değil henüz taşındı ileri (F). Ölçek çubukları: 250 µm (A), 70 µm (B) ve 30 µm (C-F). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: ins zaman hata görüntüleme için 48 h. kültürlü bir MGE explant türetilen INs bir MGE explant dışına göç bir elde Nkx2.1Cregörülür; RCEEGFP (hangi bileşenler tüm MGE elde edilen hızlı eGFP) electroporated e13.5, istimal belgili tanımlık yöntem, CMV::mCherry-LifeAct-7 plazmid ile Myers et al. 201353 uyarlanmıştır ve şekil 1 ciçinde kapsamlıdır fare ve kültürlü 48 h(a)için. INs görselleştirildiği hızlandırılmış canlı görüntüleme 5 h (B-E) kullanarak. Bu örnekte, eGFP ve LifeAct ortak ifade birinde başlangıçta nucleokinesis (açık ok) sürecinde görülür ve iki önde gelen işlem şubesi (beyaz ok uçları; uzanır B). bu inç tamamlar nucleokinesis sonra 1 h (açık ok bakın), hücre vücut ileriye taşındı ve sondaki işlem hücre vücut (beyaz ok) arkatarafında ortaya çıkmıştır ve hala bir önde gelen süreci ile iki dalı (beyaz ok uçları; görüntüler C). ikinci nucleokinesis 2 saat 30 dk sonra (açık oklar) ise şu an yapım ve inç şimdi iki önde gelen işlem hücre vücut ve artık sondaki işlem (beyaz ok;'ile donatılmış D). son olarak, 5 h sonra inç bir neurite içinde kalan önde gelen işlem dal (beyaz ok ucu) centrosome translocating süre sonunda süreci (beyaz ok) arkatarafında hala mevcut ile üçüncü bir nucleokinesis için hazırlık geri çeker hücre vücut (E). Ölçek çubukları: 70 µm(a)ve 20 µm (B-E). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: 48 h. A. yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış aktin bileşenlerinde bir MGE explant remodeling Imaging kültürlü Bir Nkx2.1Crebir organotypic dilimden; RCEEGFP fare beyin sabit e15.5, Alexa-594 Phalloidin ile lekeli, ipliksi aktin görselleştirme için izin. INs görüntüsü 63 x kullanarak / 1.3 NA petrol amaçta confocal mikroskop. Sağlıklı bileşenler altında arka sondaki işlem geri çekilmesi nucleokinesis tamamlanmasından sonra aşağıdaki hücre vücudun çukurluğu ipliksi aktin görülür (beyaz ok, A'-A'' '). B. bir MGE explant yukarıdaki gibi bir Nkx2.1Creelde edilir; RCEEGFP mCherry-Lifeact-7 CMV düzenleyicinin kontrolü altında ifade bir plazmid ile faiz ve electroporated bir gen hedeflenen silinmesiyle taşıyan fare beyin. Hızlandırılmış canlı görüntüleme kültür 48 saat sonra yapılır ve electroporated INs 3 dakikada 3 h bir 40 x / 0,85 kullanarak için takip edilmektedir hava amaç. Etkin aktin sitoiskeleti remodeling oluşur olarak flüoresan noktalar önde gelen süreci ve büyüme koniler (beyaz ok uçları) içinde ve arka kırmızı (beyaz siyah beyaz görüntülerde) hareketi ile LifeAct, transfected inç içinde hücre vücut nucleokinesis sırasında (B-B'' ', beyaz ok). Ölçek çubukları: 7 µm (bir ''') ve 10 µm (B-B'' '). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, biz rahim elektroporasyon e13.5, fare MGE gerçekleştirmek için ve embriyonik beyin dilimleri kültürleri organotypic nesil için güvenilir bir yöntem sağlar. Boyden odası tahlil gibi vitro yöntemleri gerçekleştirmek nispeten kolay ve farklı genler ve proteinler diğer faktörlere müdahale olmadan belirli rolleri değerlendirmek için kullanılabilir olsa da, onlar inç soruşturma engel geçiş dinamiği açısından doğrultu ve geçiş yolu25. MGE explants sırasında göç, biz burada göstermek, ama onlar yoksun en endojen cues meydana gelen dinamik hücre iskeleti değişiklikleri çalışma ve genellikle (ancak bu nöronal göç teşvik etmek için rehberlik cues eklenmesi gerektirir için kullanışlı bir yol sağlar MGE explants kortikal besleyici katmanlarda kültürlü zaman belirgin bir biçimde iyileştirilmiş)25,54. Yine de, deneyleri MGE explants üzerinde dayalı moleküler yardımlar bu belirli doğrultu veya geçiş yolu INs29rehberlik gibi daha ince mekanizmaları dahil dolaylı algılamak başarısız olabilir. Bu sorunu sonunda belirli MGE kaynaklı INs etiketleme için kendi yerel ortamında13,29,41yılında geçiş sağlayan rahim içinde elektroporasyon25tarafından hile. Ancak, bu teknik beceri-dahil cerrahi işlemler nedeniyle, zordur ve onun verim düşük sağkalım oranı embriyo ve MGE kez birden çok çöp için kullanımı gerektiren rahim içindehedef zor olması ile sınırlıdır önemi55ulaşmak. Bu nedenle, farelerde beyin embriyo organotypic kültür tarafından takip MGE rahim elektroporasyon geçiş dinamikleri ve morfolojisi MGE kaynaklı ins doğal ortamlarında soruşturma için düşük maliyetli, zaman etkili ve güvenilir bir yöntem sağlar çevre, rahim içinde elektroporasyon ve rehberlik için ihtiyaç cerrahi işlemler engellemeyi MGE explants ipuçları. Buna ek olarak, bu teknik doğrudan altında boyun ve baş, bir yapılandırma içinde uterobenimsemeye daha zor üzerine olumsuz bir pozitif elektrot apposing tarafından hedeflenebilir MGE daha kolay bir erişim sağlar. Alternatif olarak, MGE focally enjekte edilebilir ve organotypic dilimleri13,25,29, ama bu tekniği üreten hemen sonra electroporated daha zor ve daha az bizim ellerde etkili kanıtlamıştır Burada açıklanan protokol. Bu makalede açıklanan adımları izleyerek, bir 50-100 electroporated MGE kaynaklı INs organotypic dilim, 5-20 olan 72 h. Transfected INs canlı ile hızlandırılmış görüntülemede görüntülenmeyecektir sonra yüzeysel MGE dışarı geçiş görülecektir başına elde edeceksiniz veya görüntülü ve sonra yeniden oluşturulan fiksasyonu ve immunohistokimyasal etiketleme.

Burada açıklanan Protokolü geçiş ex vivo içinde çalışmak için optimize edildi ve rahim içinde elektroporasyon MGE kaynaklı INs, ex vivo MGE enjeksiyon ve çoğalmasıyla, açıklayan çeşitli yayımlanmış iletişim kuralları tarafından esinlenilmiştir veya Kronik organotypic beyin dilim kültürler36,38,39,42,43,56,57,58nesil. Yaklaşımımız içi MGE enjeksiyonları yerine daha düşük darbe yoğunluk (40 V) ve İntraventriküler plazmid enjeksiyonları (100 V), yüksek gerilim darbeleri ile başka bir yerde39,56 açıklandığı gibi kullanarak MGE ataları için potansiyel zararı sınırlar ,57,58. Diğerleri bakteriyel kontaminasyon39,56,57,58önlemek için penisilin, streptomisin ve viomisin bir arada kullanırken, Ayrıca, biz antibiyotik önlemek için seçtiniz bizim kültür teorik olarak geçişinde etkileyebilir beri orta. Özellikle, penisilin GABAA reseptör59,60bir antagonist ve GABAA reseptörü harekete geçirmek etkinleştirir ve daha sonra hücre içi klorid gradyanlar ve KCC2 bağlı olarak geçiş durur çeşitli aşamalarında geçiş61ifade. Ancak, geçerli kuralında belirtilen çeşitli önlemler kullanarak, kirlenme etkili antibiyotik olmadığında da önlenebilir.

Bu yaklaşım bizim ellerde verimlilik rağmen rahim elektroporasyon onun dezavantajları da vardır. Geçirmek için doğal bir üç boyutlu ortamı sağlayarak hücreleri iken, organotypic dilimler halinde göç bağlamında farmakolojik deneyleri yapmak zor olabilir. Nitekim, INs MGE kaynaklı göç çoğunlukla hücre dışı ipuçları2,13,19 ve farmakolojik inhibitörleri uygulanmasına bağlıdır ya da harekete geçirmek organotypic dilimleri üzerinde kesin izin vermez ayrılma genel dilim sağlık veya faaliyet küresel etkilerden hücre özerk etkileri. Beri INs explant dışarı geçiş olabilir daha kolay izole ve seçime bağlı olarak belirli bileşikler62için maruz tür deneyler için karışık Disosiye kortikal hücreleri üzerinde yetiştirilen MGE explants organotypic dilim kültürler için tercih olabilir. Rahim elektroporasyon rahim içinde elektroporasyon gerçekleştirmek daha kolay olsa da, Ayrıca, o hala burada küçük boyutu ve kırılgan embriyonik beyin durumunu göz önüne alındığında resimli embriyonik Çağlar, teknik olarak zor olabilir E13.5. müfettişler verimli bir şekilde e13.5, electroporated beyin beyin yüzeyine zarar vermeden ayıklamak için bir kaç çalışma gerekir. Buna ek olarak, postnatal dilimler olarak karşı embriyonik organotypic dilimleri kültüründe uzun süreler muhafaza edemez. Embriyonik organotypic dilim kültürler-ebilmek saklanmak için en az 7 gün vitro63da, bu elektroporasyon ile Birleşik değil ve burada açıklanan deneyler var 3 gün vitro güvenilir sonuçlar ile kadar için test edilmiştir bizim ellerimizde. Bu nedenle, müfettişler optimizasyonu testleri önceden uzun kuluçka süreleri gerekirse gerçekleştirmelisiniz. Ayrıca, geç embriyonik veya erken postnatal aşamaları at geliştirme incelenmesi bu tekniği ile e13.5 embriyo25, kullanırken tavsiye edilmez ama rahim içinde elektroporasyon ile nerede başarıyla elde edilebilir electroporated embriyo rahim boşluğuna geri koymak ve tarihi ve daha sonraki aşamaları21,64analiz için yaptı. Son olarak, organotypic dilim kültürler tarafından takip rahim çoğalmasıyla hem Morfoloji analizi ve gelişmekte olan INs geçiş dinamikleri sağlar. Ancak, bu daha önce için rahim içinde elektroporasyon tekniği36işaret edilmiştir gibi rahim electroporations beyin dilim başına 50-100 electoporated hücre verim ve böylece nüfus analizi için uygun değildir. Bu tür araştırmalar daha iyi bir tam veya koşullu silme (veya çakma) faiz gen taşıyan hayvan modellerinde yapılmaktadır. Ne zaman elde edilebilir, modelleri gibi daha sonra verimli bir şekilde organotypic dilim kültürler üretmek için kullanılabilir veya MGE explants geçiş içinde gerçek dinamikleri görselleştirmek için aşağıda gösterildiği gibi (bkz şekil 5 ve şekil 6).

Bu iletişim kuralı adım en iyi sonuçları elde etmek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Örneğin, kirlenme rahatlıkla oluşabilir gibi tüm adımları sıkı steril koşullarda gerçekleştirilir ilkel olduğunu. Eldiven ve Biyogüvenlik kabini dışında kullanılan aletler sık sık tüm işlem sırasında % 70 etanol ile püskürtülür. Ayrıca, kültür medya ve yapay serebrospinal sıvı gibi çözümleri steril tutulmalıdır ve soğuk (4 ° C) ve yapılmış taze her 2-3 hafta. MGE kaynaklı bileşenleri daha ayrıntılı olarak etiketlemek için bir inç özel organizatörü kontrolü altında böyle deneylerde kullanılacak plazmid klonlanmış (ex: Dlx5/649, Lhx665), sade bir şekilde anatomik güvenmek yerine MGE hedefleme. Organotypic dilimleri nesil hayatta kalmak için beyin gerektirir. Böylece, hücre sağlık ve hayatta kalma korumak için bu deney andan itibaren 3 saat içinde organotypic dilimleri kültüründe koyana kadar Embriyolardan alınan yapılmalıdır. Zaman-verimlilik için kültür plakaları ile ev yapımı kültür orta sadece deneme başlamadan önce önceden doldurulmuş ve kadar kullanmak 37 ° C hücre kültür kuluçka makinesine koy. Ayrıca, beyin dikkatle kafatası kortikal yüzeye zarar vermeden dışarı uygun özel çözüm ve sonraki vibratome kesit katılmasını sağlamak için disseke. Örneğin, kortikal yüzeye bile en az 250 çevreleyen özel jel µm kalınlığında bölümlerden dekolmanı veya bölümleri bozulma vibratome kesit sırasında zarar verebilir. Olarak düşük sıcaklıklar uygun beyin katıştırma engel, ancak daha yüksek sıcaklıklarda doku hasarı ve hücre ölümüne yol nöronal hayatta kalmak için bu da özel çözüm sıcaklığı 42 ° C yakın kalır önemlidir (veya sırasında zarar «««Katıştırma) işlemi. Görüntüleme için mikroskop için transfer edilene kadar bir kez kültür, diğer kirlenme kaynakları önlemek için dilimleri manipüle edilebilir değil. Aşağıdaki adımları steril bir ortamda gerçekleştirilmesi gerektiğini ve özellikle geri sonraki yeniden görüntüleme için kültür koymak ihtiyacınız varsa dikkat bu manipülasyonlar sonra plakaları kirletmek değil ödenmelidir. Son olarak, bir DNA aliquot recuperating verimi önemli bir azalma electroporated nöronların tür malzeme ile gözlemlediği gibi boya ileride kullanmak üzere önceki deneyler üzerinden yükleme ile karışık önermiyoruz.

Sonuç olarak, yukarıda açıklanan rahim elektroporasyon ve organotypic dilim kültür Protokolü MGE kaynaklı ins tek hücre düzeyinde özel etiketleme için izin verir ve genetik olarak belirli moleküler yolları işlemek için kullanılan morfolojik değişiklikler ve geçiş dinamikleri düzenleyen rollerini çalışma yüzeysel geçirme INs. Bu yöntem hızlı ve düşük maliyetli erken fonksiyonel soruşturma roman aday gen sonraki nesil sıralama hastalarda veya tek hücre RNA sıralama göçmen INs66,67 aracılığıyla tespit sağlar 68,69,70nörogelişimsel bozuklukları. Bu teknik yaygın olarak korteks ve Hipokampus70,71,72,73piramit hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre popülasyonlarının geçişinde eğitim için kullanılmıştır. Hakim sonra potansiyel olarak görüntü geri dönüşüm ve membran proteinleri reseptörleri ve proteinler GFP öğesini kullanarak kanalları gibi ticareti için kullanılabilir; belirli hücresel sinyal cascades biyosensörler74kullanarak etkinleştirme; Hatta izleme ve düzenleme hücresel aktivite optogenetics kortikal INs aynı zamanda hipokampüs, amigdala veya bile striatum gibi diğer beyin bölgeleri için birleştiğinde kalsiyum Imaging'i kullanma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok. Kez burada ifade Sağlık Bakanı veya Kanada hükümeti görüşlerini temsil etmemektedir.

Acknowledgments

Bu eser Savoy Vakfı ve tedavi epilepsi Vakfı'nın hibe işletim tarafından desteklendi ve ekipmanı tarafından yenilik için Kanada Vakfı E.R (confocal mikroskop) ve G.H (iplik disk confocal mikroskop) verir. Acil serviste bir kariyer ödülü alır Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Ödülü) yanı sıra--dan Kanada Enstitüleri gibi Sağlık Araştırma (CIHR; Genç Araştırmacı Ödülü). G.H. FRQ-S. üst düzey bir bilim adamı olduğunu L.E Savoy temelden, CHU Sainte-Justine Vakfı doktora sonrası Eğitim Ödülü ve FRQ-S doktora sonrası Eğitim Ödülü, yıldız Vakfı ile ortaklaşa Steriade-Savoy doktora sonrası Eğitim Ödülü alıcı olduğunu. Beyin Kanada Kanada beyin araştırma fonu, sağlık Kanada, Le için verilen mali desteği ile yoluyla, mümkün yapılmış bu proje

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325 (2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834 (2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031 (2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897 (2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

Tags

Neuroscience sayı: 134 beyin gelişimi confocal mikroskobu kortikal GABAergic interneurons e13.5 embriyo çoğalmasıyla gen baskı fare nöronal göç organotypic kültür RNA müdahale teğet geçiş hızlandırılmış görüntüleme
<em>Eski Utero</em> Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G.,… More

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter