Summary
Her giver vi en detaljeret protokol til at udføre i vivo hjerte gen redigering i mus ved hjælp af rekombinante Adeno-Associated Virus (rAAV)-medieret levering af CRISPR. Denne protokol tilbyder en lovende terapeutisk strategi for at behandle dystrofe kardiomyopati i Duchenne muskeldystrofi og kan bruges til at generere hjerte-specifikke knockout i postnatal mus.
Abstract
Grupperet, regelmæssigt interspaced, kort, palindromiske Gentag (CRISPR) systemet har høj grad lettet genom engineering i både dyrkede celler og levende organismer fra en lang række arter. CRISPR-teknologi er også blevet undersøgt som roman therapeutics for en række af sygdomme hos mennesker. Proof-of-concept data er yderst opmuntrende, som eksemplificeret af nylige undersøgelser, der viser gennemførligheden og effektiviteten af genet redigering-baserede terapeutisk tilgang til Duchenne muskeldystrofi (DMD) ved hjælp af en murine model. Især har intravenøs og intraperitoneal injektion af rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) aktiveret effektiv hjerte levering af Staphylococcus aureus CRISPR-forbundet protein 9 (SaCas9) og to guide RNA'er (gRNA) for at slette en genomisk region med en mutant codon i exon 23 af musen Dmd -genet. Denne samme fremgangsmåde kan også bruges til at udskære gen af interesse og studere deres hjertefunktion i postnatal mus når gRNA er designet til at målrette den kodende region af genet. I denne protokol viser vi i detaljer hvordan du ingeniør rAAVrh.74-CRISPR vektor og hvordan man kan opnå meget effektiv hjerte levering i neonatal mus.
Introduction
De klynger, regelmæssigt interspaced, korte palindromiske Gentag (CRISPR) teknologi repræsenterer den seneste avancement i genom engineering og har revolutioneret den nuværende praksis med genetik i celler og organismer. CRISPR-baseret genom-redigering anvender en enkelt guide RNA (gRNA) for at lede en CRISPR-associerede liv1975 såsom CRISPR-forbundet protein 9 (Cas9) og Cpf1 til genomisk DNA mål, der supplerer i sekvens til protospacer kodet af gRNA med en specifikke protospacer tilstødende motiv (PAM)1,2. PAM varierer afhængigt af den bakterielle arter af Cas9 eller Cpf1-genet. De mest almindeligt anvendte Cas9 nukleasen afledt af Streptococcus pyogenes (SpCas9) genkender en PAM sekvens af NGG, der findes direkte neden for target sekvens i genomisk DNA, på ikke-målarter strand. Mål-webstedet genererer Cas9 og Cpf1 proteiner en dobbelt-strenget pause (DSB), som derefter repareret via iboende cellulære DNA reparation mekanismer, herunder ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) og homologi-instrueret reparation (HDR) veje3, 4. I mangel af en DNA-skabelon til homolog rekombination, er DSB primært repareret af den fejlbehæftede NHEJ vej, hvilket kan resultere i indrykninger eller sletninger (indels) af nukleotider forårsager frameshift mutationer, hvis DSB blev oprettet i kodning region af en gen5,6. Således, CRISPR systemet har været meget anvendt til ingeniør tab af funktion mutationer i forskellige cellulære modeller og hele organismer, for at undersøge funktionen af et gen. Derudover katalytisk inaktive Cas9 og Cpf1 er blevet udviklet til transcriptionally og modulere epigenetically udtryk for target gener7,8.
Mere nylig, både SpCas9 og SaCas9 (afledt af Staphylococcus aureus) har været pakket ind i rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) vektorer for postnatal gen korrektion i dyremodel af sygdomme hos mennesker, især, Duchenne muskeldystrofi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD er en fatal X-linked recessive sygdomme skyldes mutationer i DMD -genet, som koder dystrofin protein16,17, der påvirker omkring én i 3500 mandlige fødsler ifølge nyfødte screening18 , 19. det er karakteriseret ved fremadskridende muskelsvækkelse og spilde. DMD patienter miste normalt evnen til at gå mellem 10 og 12 år og dø af luftvejssygdomme og/eller hjerte svigt i en alder af 20-30 år20. Navnlig, kardiomyopati udvikler i > 90% af DMD patienter og repræsenterer førende forårsage død i DMD patienter21,22. Selv om Deflazacort (en anti-inflammation medicin) og Eteplirsen (en exon overspringelse medicin for overspringning exon 51) har for nylig blevet godkendt til DMD af Food and Drug Administration (FDA)23,24, ingen af disse behandlinger rette den genetiske defekt på genomisk DNA-niveau. MDX-mus, som bærer et punkt mutation på exon 23 i dystrophin genet, har været meget anvendt som en DMD model25. Desuden demonstreret vi tidligere, at det funktionelle dystrofin udtryk blev restaureret af-frame sletning af genomisk DNA dækker exons 21, 22 og 23 i skeletmuskulatur af mdx mus ved hjælp af intramuskulær Ad-SpCas9/gRNA levering9 , og i hjertet muskler af mdx/utrophin+ /- mus ved hjælp af intravenøs og intraperitoneal rAAVrh.74-SaCas9/gRNA levering26.
I denne protokol beskriver vi i detaljer hvert trin i postnatal hjerte gen redigering til at gendanne dystrofin i mdx/utrophin+ /- mus ved hjælp af rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vektorer, fra gRNA design dystrofin analyse i afsnittene hjerte muskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyr, der anvendes i denne protokol blev opretholdt ved The Ohio State University laboratorium animalsk ressourcer i overensstemmelse med retningslinjer for brug af dyr. Alle dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care, brug og bedømmelsesudvalg i Ohio State University.
1. design og kloning af gRNAs i CRISPR vektor
- Vælg 2 gRNAs målretning dystrofin intron 20 og intron 23 (i20 og i23) for SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT og i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM sekvens er understreget og kursiv).
Bemærk: Målwebsteder for i20 og i23 er omkring 23 kilo basepar (kbp) væk. For at forstyrre et kodning gen, to gRNAs rettet mod de fælles exons med NNGRRT PAM sekvens for SaCas9 (fortrinsvis NNGAAT, NNGGGT og NNGAGT) og afstand inden for 20 kbp anbefales. - Brug de følgende PCR-parametre til at anneal gRNA oligos (100 µmol/L) i 1 x udglødning buffer (5 x udglødning stødpudelager indeholder 0,5 mol/L K-acetat, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetat, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 cyklusser af 95 og 59 ° C med en 0,4 ° C nedsætte cyklus for 20 s, 90 cyklusser af 59 til 32 ° C med en 0,3 ° C fald pr. cyklus for 20 s, 20 cyklusser på 32-26 ° C med en 0,3 ° C fald pr. cyklus for 20 s.
- Ligate udglødet gRNA oligos ind i pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA ved hjælp af BsaI og T4 DNA ligase i én reaktion (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µL udglødet oligos, 1,5 µL 10 x T4 DNA ligase buffer, 0,5 µL T4 DNA ligase, 1 µL BsaI, 10 µL ddH2O ), med følgende reaktion betingelse i en PCR cycler: 5 cyklusser af [37 ° C 5 min og 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min. 80 ° C 5 min.
- Omdanne 15 µL ligatur produkt til 30 µL kompetente celler, plade celler i agar plade med 100 µg/mL Ampicillin og kultur ved 37 ° C i 24 timer.
- Pick up 5-10 kolonier og kultur i LB medium indeholdende 100 µg/mL Ampicillin ved 37 ° C, 250 rpm i en shaker inkubator i 3-4 timer.
- Skærmen kolonier af PCR: 10 µL 2 x PCR master mix, 8 µL ddH2O, 1 µL E. Coli kultur, 1 µL 10 µmol/L U6-forward primer, 1 µL i20 eller i23 gRNA omvendt primer. PCR cykling parametre: 95 ° C 5 min, 35 cykler på 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
- Forberede 5 mL kultur af positiv kloner af tilføjer 4 mL frisk LB medium containing100 µg/mL Ampicillin og kultur natten over ved 37 ° C, 250 rpm.
- Rense plasmid DNA ved hjælp af passende plasmid udvinding kit, og kontrollere plasmid af Sanger sekventering med U6-forward primer.
- Kultur C2C12 celler i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% Pen-Strep indtil nå ~ 70% confluency for at teste genet redigering effekten af plasmider.
- Electroporate ialt 5 µg SaCas9/gRNA plasmid blandingen i 1:1 molar forholdet til 1 x 106 C2C12 celler efter producentens protokol.
- Efter 48 timer efter Transfektion, høste C2C12 cellerne og udtrække genomisk DNA.
- Brug 100 ng genomisk DNA som skabelon til at udføre PCR reaktion til musen dystrofin locus: videresende primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), vende primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x grøn PCR master mix, 7 µL ddH2O, 1 µL genomisk DNA ( 100 ng). Bruge PCR cykling betingelser som 95 ° C 5 min, 35 cykler [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.
2. rAAV produktion
- For at kultur cellerne, frø AD293 celler på 20 til 40 af 15-cm retter og vedligeholde i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% Pen-Strep indtil nå ~ 90% confluency for Transfektion.
- Fortyndes 3 plasmider med 200 µL reduceret serum medium (pr. parabol): 1) 10 µg pHelper; 2) 5 µg pXR (rh.74 eller andre serotyper) og 3) ialt 5 µg for pX601-i20 og pX601-i23 blanding (1:1 ratio). Udføre polyethylenimine (PEI) Transfektion ved at blande med 80 µL PEI og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Tilføj blandingen på cellekulturer AD293 på en måde, dråbevis.
- AAV virus produktion, efter 72 h post Transfektion, bruge en celle skraber til at indsamle både medierne og AD293 celle pellets af centrifugering ved 1100 x g i 10 minutter.
- Resuspend celle træpiller i 15 mL rAAV lysisbuffer (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) efterfulgt af 3 fryse-tø cykler med skiftevis inkubation i flydende nitrogen og et 42 ° C vandbad. Gemme cellelysater i-80 ° C for fremtidige behandling, hvis de ikke behandles omgående.
- Filtrer kultur medier med et 0,45 µm filter og tilføje en 40% PEG8000 i 2,5 mol/L NaCl til en endelig koncentration på 8%. Inkuber blanding på 4 ° C i 1 time og centrifugeres ved 1100 x g i 15 min.
- Resuspend pellets rAAV lysisbuffer og kombinere med cellelysater fra trin 2.3, efterfulgt af benzonase (50 U/mL) behandling ved 37 ° C i 1 time.
- Centrifugeres benzonase-behandlet rAAV indeholder blanding 1100 x g i 15 min. ved 4 ° C, og gemme supernatanten (rå rAAV forberedelse).
3. rAAV rensning og koncentration
- Indlæse rå rAAV forberedelsen på et iodixanol forløb i et ultracentrifuge rør i følgende rækkefølge fra toppen til bunden: rå AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5 mL 40% Iodixanol, 5 mL 58% Iodixanol. Udfyld de resterende tomme volumen af rør til toppen ved hjælp af 1 x DPBS.
- Centrifugeres prøver på 230.000 x g i en ultracentrifuge rotor for 120 min ved 10 ° C og indsamle 3-4 mL af de 40% gradient fraktion indeholdende rAAV partikler med en 18 G nåle.
- Fortynd rAAV partikler med 1 x DPBS og centrifugeres ved hjælp af centrifugal filterenhed (MWCO 100 kDa). Gentag dette trin for 3 - 5 gange og til sidst koncentrere rAAV forberedelse til 300-500 µL.
4. rAAV Titering
- Uddrag af genomisk DNA fra 2 µL koncentreret rAAV, bundfald med 3 M NaOAc i ethanol og resuspend i 20 µL ddH2O.
- Få Standardkurven for rAAV kvantitering ved seriel fortynding af pX601 plasmid: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 eksemplarer i hver 10 µL ddH2O. Dilute DNAase-behandlet rAAV prøver som 1:10, 1:50, 1: 100, og 1:1000.
- Bestemme rAAV titer af kvantitative real-time PCR (qPCR) ved hjælp af qPCR Kit ifølge fabrikantens anvisninger i en Real-Time PCR system: 1 µL 10 µmol/L af hver primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC og 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x PCR master mix, 1 µL fortyndet rAAV prøver og 2 µL ddH2O. køre reaktionen med følgende cykling parametre: 95 ° C 3 min, 45 cyklusser af [95 ° C 5 sek og 61 ° C 20 sek].
5. intravenøs og Intraperitoneal injektion af rAAVrh.74-CRISPR i Neonatal mdx/utrophin+ /- mus
- Immobilisere mdx/utrophin+ / mus hvalpene (dag 3) ved at placere i isbad i 1 min og derefter administrere med 1 x 1012 viruspartikler i 50 µL pr. mus systemisk via en retro-orbital tilgang eller en intraperitoneal injektion.
- Tillad mus at restituere sig og placere tilbage til deres hjem bure. Ti uger efter rAAV administration, aflive mus af CO2 eksponering for væv samling.
- Snap-freeze væv for genomisk DNA og RNA udvinding og anvendelse køling isopentane i flydende kvælstof til at fryse væv med optimal opskæring temperatur stof til cryosectioning.
6. analyse af Target gen redigering resultater
-
Genomisk DNA PCR analyse
- Isolere den samlede genomisk DNA fra hjertet væv af mdx/utrophin+ /- mus behandlet med eller uden rAAV.
- Bruge samme protokol i trin 1.12 til PCR analyse.
-
RT-PCR analyse af dystrofin udtryk
- Uddrag total RNA fra hjertet væv med RNA udvinding kit efter producentens manual.
- Til at udføre reverse transkription, pre behandle den samlede RNA med en RNase-fri DNase og bruger 5 µg af behandlede RNA som skabelon for første-streng cDNA syntese med reverse transkription kit.
- Bruge reverse transkription produkt RT-PCR analyse af dystrofin udtryk med dystrofin cDNA primere: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT og 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
Anslå genet redigering effekten af qPCR analyse
- Anslå genet redigering effekten af kvantitativ RT-PCR til at påvise en reduktion af exon 22-holdige udskrifter ved hjælp af den fremskudte primer (exon 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, og den omvendte primer (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Bruge Gapdh som en reference gen med den fremadrettede primer: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC og den omvendte primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- Kør den kvantitative real-time PCR (qPCR) ved hjælp af qPCR Kit ifølge fabrikantens anvisninger i en Real-Time PCR system og 2-trins reaktionsbetingelser: 95 ° C 3 min, 45 cyklusser af 95 ° C 5 sek og 61 ° C 30 sek.
-
Immunfluorescens farvning for at analysere dystrofin udtryk
- Skær de frosne væv ved hjælp af en kryostaten på en tykkelse på 10 µm. Fix frosne sektioner med 4% PARAFORMALDEHYD ved stuetemperatur i 15 min.
- Vask 2 x med PBS og inkuberes med blokering løsning (10% hest serum) i 1 time.
- Inkubér de anti-dystrofin primære antistof, ved 4 ° C natten over.
- Vaske dias med PBS 3 x 5 min og inkuberes med fluorescerende sekundære antistoffer (1: 500) ved stuetemperatur i 1 time.
- Montere dias ved hjælp af montering medium med DAPI og imaging med en inverteret Konfokal mikroskop.
7. off-target analyse af T7E1 analyse
- Forudsige de potentielle off target websteder ved hjælp af den online CRISPR design værktøjer som < http://crispr.mit.edu>.
- Forstærke genomisk regionerne der dækker toppen 5-10 potentielle off-målwebsteder ved PCR: genomisk DNA 200 ng, 1 µL high-fidelity DNA polymerase, 5 µL 10 x PCR Buffer mix, 1,5 µL 10 µmol/L af lokationsspecifikke frem og bak primere, justere det samlede volumen til 50 µL med Hedeselskabet2O.
- Køre PCR-produkter af elektroforese, uddrag og rense DNA ved hjælp af en gel udvinding kit. Måle koncentrationen ved hjælp af spektrofotometre.
- Fremme heteroduplex dannelsen af denaturering og re udglødning den renset amplikoner langsomt i Buffer 2.1 ved hjælp af en PCR cycler. Brug de samme cykel betingelser som beskrevet i trin 1.2.
- Fordøje de re udglødet produkter i 30 minutter ved 37 ° C med 0,5 µL T7E1 enzym, og analysere reaktionen ved elektroforese bruger 1-2%-agarosegel.
Bemærk: Amplikoner kan også analyseres af målrettede dyb sekventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten af gRNAs til at fremkalde sletning af målområde for genomisk DNA bør evalueres i cellekulturer før emballage i rAAV for in vivo-undersøgelser. Med henblik herpå, gRNAs og SaCas9-udtrykker konstruktioner var electroporated i C2C12 celler og genomisk DNA blev analyseret af PCR med primere flankerende målwebsteder (figur 1). En PCR produkt på ~ 500 bp angiver vellykkede sletning af den indskyde genomisk DNA fra gen redigering mens kontrol celler ikke bør give et band på grund af den store størrelse af genomisk DNA.
Når effekten af gRNAs er blevet bekræftet i cellekulturer, kan de være pakket ind i rAAVrh.74 eller andre serotyper (f.eks. AAV6, 8 eller 9, alle viser robust hjerte gen levering) ved hjælp af tre plasmider Co Transfektion i AAV293 celler. Vi fandt, at det er ikke nødvendigt at gøre to individuelle rAAV forberedelse for de to gRNAs, i stedet, vi blandet de to gRNA konstruktioner i et lig molære forhold og produceret en enkelt rAAV forberedelse. RAAV viruspartikler blev renset ved hjælp af tæthed gradient ultracentrifugering og renheden blev analyseret af SDS-PAGE. Højt oprenset rAAV forberedelse ville give kun tre bands svarende til kapsid proteiner VP1, VP2 og VP3, henholdsvis på SDS-PAGE som vist i figur 2.
Renset rAAVrh.74 viruspartikler blev sprøjtet ind i dag 1-3 nyfødte af mdx/utrophin+ / mus via retro-orbital eller intraperitoneal injektion. Vi fandt begge metoder fungeret godt for hjerte levering af rAAVrh.74-CRISPR. De injicerede mus kan analyseres for dystrofin udtryk ved immunfluorescens farvning (figur 3) på 10 uger gammel.
Figur 1: validering af gRNAs for SaCas9-medieret gen redigering i celler, C2C12. Repræsentative Agarosen gelelektroforese viste PCR-produkter af genomisk DNA ekstraheret fra electroporated C2C12 med eller uden SaCas9/gRNAs. Pilen angiver PCR produktet resulterede fra gen redigering. Gapdh serveres som en reference. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: analyse af rAAVrh.74 partikler af SDS-PAGE. Renset rAAVrh.74 viruspartikler køre på SDS-PAGE viste tre bands, svarende til de tre kapsid proteiner af AAV, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) og VP3 (62 kDa), henholdsvis. Tilstedeværelsen af kun disse 3 bands angiver den høje renhed af rAAV forberedelse uden forurener andre cellulære proteiner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immunofluorescens farvning af sektionerne hjerte fra mdx/utrophin+ / mus på 10 uger efter AAV-SaCas9/gRNAs behandling. Repræsentative immunofluorescens billeder viste udtryk af dystrofin (rød) og caveolin-3 (grøn) i afsnittene hjertet i WT, mdx/utrophin+ /- og mdx/utrophin+ /- mus behandlet med 1 x 1012 vg AAV-SaCas9/gRNA systemisk. DAPI blev brugt til at mærke kerner (blå). Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol detaljer vi alle de skridt, der er nødvendige for at nå i vivo hjerte gen redigering i postnatal mus ved hjælp af rAAVrh.74-medieret levering af SaCas9 og to gRNAs. Som tidligere nævnt, denne fremgangsmåde kan bruges til at gendanne dystrofin udtryk i dystrofe mus som beskrevet i vores arbejde27, men det kunne også aktiverer hurtig omvendt genetik undersøgelser af hjerte-relaterede gener i mus uden den langvarige proces med den traditionelle knockout tilgang til at generere og avle knockout musemodeller.
For at opnå høj gen redigering effektivitet i målvæv, der er flere vigtige skridt til at huske: 1) effekten af SaCas9/gRNA at fremkalde sletning af målrettede genomisk DNA skal valideres ved hjælp af passende cellelinjer; 2) det er meget vigtigt at vælge en ordentlig AAV serotype, som kan mægle et højt niveau af genet transduktion i målvæv og 3) bestemme optimal leveringsbetingelser rute AAV vektorer for genoverførsel til det ønskede væv.
I den nuværende protokol, de designede SaCas9/gRNAs blev pakket ind i AAVrh.74 snarere end tidligere rapporteret AAV8 og AAV9 til at redigere Dmd -genet12,28. AAVrh.74 udstiller omkring 93% homologi til AAV829 og har vist sig for at være ikke-patogene og effektiv i transducing skeletmuskulatur følgende isoleret limb levering29,30,31. I denne protokol bruger vi retro-orbital og intraperitoneal injektion af rh.74 i neonatal mus for kardiale genoverførsel. Vi fandt, at nyfødte administrationen af rAAVrh.74 er yderst effektiv genskabelse af dystrofin udtryk i omkring 30-40% af cardiomyocytes i mus modtage en høj dosis af rAAVrh.74 (1 x 1012 vg). Interessant, fandt vi, at skeletmuskulaturen dystrofin udtryk ikke var effektivt reddet. Dette er sandsynligvis på grund af den lave skeletmuskulatur tropisme af rh.74 serotype når det administreres via intravenøs eller intraperitoneal injektion, selv om tidligere undersøgelser viste, at isolerede lemmer levering af rAAVrh.74 kan effektivt transduce mus og abe skelet muskel29,30,31. Også, når rAAVrh.74 blev administreret til voksen mus, vi observeret meget lav effektivitet i genoprette dystrofin udtryk. Det ville være interessant at bestemme minimum dosering, som kræves for at opnå den højeste dystrofin redning. Andre serotyper og leveringsmetoder kan desuden testet og sammenlignet for at opnå optimal hjerte gen redigering.
Vellykkede sletning af et stort genomisk DNA stykke kræver samtidig levering af to gRNAs. Vi har fundet det ikke er nødvendigt at foretage to separate rAAV forberedelser for at levere to gRNAs. I denne protokol, vi simpelthen blandet de to gRNA plasmider i et tilsvarende beløb under Transfektion for rAAV produktion, og dette kombineret produktion af rAAV blev fundet for at være effektiv i at levere begge gRNAs. Denne kombinerede tilgang er derfor cost - og arbejdsbesparende og anbefales når samtidig levering af to gRNAs er påkrævet.
I mange tilfælde kan det være nødvendigt at analysere genet redigering effektivitet af genetiske metoder, når en god antistof ikke er tilgængelig for target gen produkt. Det er dog teknisk udfordrende at nøjagtigt kvantificere genet redigering effektivitet med to gRNAs rettet mod det samme locus da redigering genprodukter ville omfatte mål sekvens sletning, target sekvens inversion, og små indels på kun ét mål site. I stedet er det mere meningsfuld og muligt at opgøre effektiviteten af den ønskede målrettede sekvens sletning som i vores tilfælde, hvor en reduktion af de udskrifter som indeholder exons 21-23 kan kvantificeres ved real-time RT-PCR.
I denne protokol beskriver vi også brugen af T7E1 analyse og beregningsmæssige forudsigelse til at analysere potentielle off-målaktiviteten. For analysen at fungere godt, er det nødvendigt at benytte en high-fidelity DNA polymerase. Også, det er altid en god ide at forberede en negativ kontrol eksperiment (f.eks. kontrol DNA produkter amplificeret fra celler/væv uden gene redigering, og behandles på samme måde som de klargjorte prøver) og en positiv kontrol eksperiment (f.eks. et kendt eksempel med godt karakteriseret gen redigering). Det er imidlertid bemærke at detektionsgrænsen for den T7E1 analyse er omkring 5%32, og dermed ikke må kunne påvises ved T7E1 assay hvis off-målaktiviteten er under 5%. GUIDE-seq33 kan bruges til at analysere unbiasedly off-målaktiviteten SaCas9/gRNA-medieret gen redigering. De identificerede off-målwebsteder fra T7E1 assay, computational forudsigelse og/eller GUIDE-seq tilgange kan yderligere kvantificeres for indel frekvenser efter in vivo gen redigering af høj overførselshastighed sekventering.
Tilsammen har vi givet en optimeret hjerte gen redigering tilgang ved hjælp af rAAVrh.74. Denne etableret protokol kan yderligere testet for terapeutisk anvendelse og omvendt genetiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der findes nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
R.H. er støttet af U.S. National Institutes sundhed tilskud (R01HL116546 og R01 AR064241).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
