Summary
Здесь мы предоставляем подробный протокол для проведения в естественных условиях сердечной гена редактирования мышей с использованием рекомбинантного вируса Adeno-Associated (rAAV)-опосредованной доставки ТРИФОСФАТЫ. Этот протокол предлагает многообещающие терапевтические стратегии для лечения дистрофических кардиомиопатия в мышечной дистрофии Дюшенна и может использоваться для создания сердца конкретных нокаут в послеродовой мышей.
Abstract
Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие, рецидивирующий повторить (ТРИФОСФАТЫ) системы в значительной степени способствовало генома в культивируемых клеток и организмов из различных видов техники. ТРИФОСФАТЫ технология была также изучена как Роман терапии для целого ряда заболеваний человека. Доказательства в концепция данные являются весьма обнадеживающими, как свидетельствуют последние исследования, демонстрирующие осуществимость и эффективность генов на основе редактирования терапевтический подход для мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) с помощью мышиных модели. В частности внутривенные и внутрибрюшинного введения rh.74 серотип рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) (rAAVrh.74) позволила сердца эффективности стафилококк ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (SaCas9) и два Руководство РНК (gRNA) для удаления геномной региона с мутант кодон в экзона 23 гена Dmd мыши. Этот же подход может также использоваться для Нокаут гена интереса и изучить их функции сердца в послеродовой мышей, когда gRNA предназначен для кодирования региона гена. В этом протоколе мы подробно показать, как инженер-rAAVrh.74 ТРИФОСФАТЫ вектор и как добиться высокоэффективных сердца доставки в новорожденных мышей.
Introduction
Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие палиндром повторить (ТРИФОСФАТЫ) технология представляет самые последние улучшения в геном инженерии и изменил существующую практику генетики в клетки и организмы. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования использует один руководство РНК (gRNA) направить связанные ТРИФОСФАТЫ эндонуклеазы например ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) и Cpf1 геномной ДНК цель, которая дополняет в последовательности protospacer кодируемых gRNA с конкретных protospacer прилегающие мотив (PAM)1,2. Диспетчер PAM варьируется в зависимости от бактериальных вида Cas9 или Cpf1 гена. Наиболее часто используемым Cas9 Нуклеаза, производный от Streptococcus pyogenes (SpCas9) признает PAM последовательность NGG, найденной в геномной ДНК, на стренги непромысловых прямо вниз по течению от последовательности целевого объекта. На конечном сайте Cas9 и Cpf1 белки генерировать двухручьевой перерыв (DSB), который затем отремонтировать через встроенные клеточных ДНК ремонт механизмов, включая не гомологичных конец присоединения (NHEJ) и ориентированные на гомологии ремонт (HDR) пути3, 4. В отсутствие шаблона для гомологичная рекомбинация ДНК DSB главным образом отремонтированы по ошибкам NHEJ пути, что может привести к вставки или удаления (indels) нуклеотидов, вызывая мутации фреймшифт если ОУС были созданы в кодирование региона гена5,6. Таким образом система ТРИФОСФАТЫ широко использовался для инженер функция потерь мутации в различных клеточных моделях и весь организмов, для того, чтобы исследовать функции гена. Кроме того каталитически неактивных Cas9 и Cpf1 были разработаны для транскрипционно и эпигеномно модулировать выражение целевых генов7,8.
Совсем недавно, SpCas9 и SaCas9 (производное от золотистого стафилококка) были упакованы в векторы рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) для коррекции послеродовой гена в животной модели заболеваний человека, в частности, Дюшенна мышечная дистрофия (ДМД)9,10,11,12,13,14,15. ДМД это роковой Х-хромосомой рецессивных заболеваний вызванных мутациями в гене DMD , который кодирует белок делеций16,17, затрагивающих примерно один в 3500 мужчин рождений по данным обследования новорожденных18 , 19. Он характеризуется прогрессивная мышечная слабость и тратить. ДМД пациентов обычно теряют способность ходить между 10 и 12 лет и умирают дыхательной или сердечной недостаточности в возрасте 20-30 лет20. В частности, развивается кардиомиопатия > 90% пациентов DMD и является ведущей причиной смерти в ДМД пациентов21,22. Хотя Deflazacort (противовоспалительным наркотиков) и Eteplirsen (экзона, пропуская медицины для пропуска экзона 51) недавно были одобрены для ДМД продовольствия и медикаментов (FDA)23,24, ни один из этих методов лечения Исправьте генетический дефект на уровне геномной ДНК. Mdx мышь, которая носит Точечная мутация в экзона 23 делеций гена, широко используется как модель DMD25. Кроме того ранее мы показали, что функциональные делеций выражение был восстановлен в кадр удаления геномной ДНК, охватывающих экзонов, 21, 22 и 23 в скелетных мышцах мышей многомерных выражений с помощью внутримышечной Ad-SpCas9/gRNA доставки9 и в сердечной мышцы mdx/utrophin+ / мышей с помощью внутривенного и внутрибрюшной rAAVrh.74-SaCas9/gRNA доставки26.
В этом протоколе мы подробно каждый шаг в послеродовой сердечной гена редактирования для восстановления делеций в многомерных выражений/utrophin+ / мышей с использованием rAAVrh.74-SaCas9/gRNA векторов, от проектирования gRNA делеций анализа в разделах мышцы сердца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животные, используемые в настоящем протоколе были сохранены в Огайо государственного университета лабораторных животных ресурсов в соответствии с руководящими принципами использования животных. Все исследования на животных были санкционированы институциональный уход животных, использования и Комитет по обзору из университета штата Огайо.
1. дизайн и клонирование оформления в ТРИФОСФАТЫ вектор
- Выберите 2 оформления ориентации делеций Интрон 20 и Интрон 23 (i20 и i23) для SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT и i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (Пэм последовательность подчеркнул и курсивом).
Примечание: Целевые сайты для i20 и i23 являются около 23 килограмм пары (kbp) прочь. Сорвать кодирования ген, два оформления ориентации общего экзонов с Пэм NNGRRT последовательность для SaCas9 (желательно NNGAAT, NNGGGT и NNGAGT) и рекомендуемое расстояние в пределах 20 kbp. - Используйте следующие параметры ПЦР для отжига gRNA oligos (100 мкмоль/Л) в 1 x отжига буфера (5 x отжига буферный запас содержит 0,5 моль/Л K-ацетат, 150 ммоль/Л HEPES-Кох, 10 ммоль/Л мг ацетат, pH7.4): 95 ° C 10 мин, 90 циклов 95 до 59 ° c с 0,4 ° C уменьшение в цикл для 20 s, 90 циклов 59-32 ° c с уменьшением 0,3 ° C за цикл для 20 s, 20 циклов 32 до 26 ° C с уменьшением 0,3 ° C за цикл для 20 s.
- Перевязать отожженная gRNA oligos в pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA с использованием BsaI и T4 ДНК лигаза в одном реакция (1 мкл 50 нг/мкл pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 мкл отожженная oligos, 1,5 10 x мкл T4 ДНК лигаза буфера, 0.5 мкл T4 ДНК лигаза 1 мкл BsaI, 10 мкл ddH2O ), с следующее условие реакции в PCR циклователь: 5 циклов [37 ° C 5 мин и 16 ° C 10 мин]; 37 ° C 20 мин; 80 ° C 5 мин.
- Трансформировать продукт перешнуровки 15 мкл в 30 мкл сведущие клетки, плиты клетки в агар пластины с 100 мкг/мл Ампициллин и культуры при 37 ° C в течение 24 ч.
- Возьмите 5-10 колоний и культуры в LB среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллин при 37 ° C, 250 об/мин в шейкер-инкубатор для 3-4 ч.
- Экран колоний методом ПЦР: 10 мкл 2 x мастер смесь ПЦР, 8 мкл ddH2O, 1 мкл культуры е. Coli, 1 мкл грунт 10 мкмоль/Л U6-вперед, 1 мкл i20 или i23 gRNA обратный грунтовка. Велоспорт параметры ПЦР: 95 ° C 5 мин, 35 циклов 95 ° C 30 s, s 61 ° C 30, 72 ° C 30 s.
- Подготовьте 5 мл культуры позитивного клонов путем добавления 4 мл свежего LB средних containing100 мкг/мл Ампициллин и культуры на ночь при 37 ° C, 250 об/мин.
- Очистить плазмидной ДНК, используя комплект для извлечения соответствующей плазмида, и проверить плазмида Сэнгером секвенирования грунтом U6-вперед.
- Культура клетки C2C12 в среде DMEM, дополненная 10% FBS и 1% перо-стрептококк до достижения confluency ~ 70% для тестирования редактирования эффективность плазмид ген.
- Electroporate в общей сложности 5 мкг SaCas9/gRNA плазмида смесь в молярное соотношение 1:1 в 1 x 10-6 C2C12 клетки согласно протоколу производителя.
- После 48 ч после трансфекции урожай C2C12 клеток и экстракта геномной ДНК.
- Использование 100 нг геномной ДНК как шаблон для выполнения реакции PCR для мыши делеций локуса: вперед грунтовка 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 мкл 10 мкмоль/Л), обратный грунтовка 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 мкл 10 мкмоль/Л), 10 мкл 2 x зеленый ПЦР Мастер микс, 7 мкл ddH2O, 1 мкл геномной ДНК ( 100 нг). Использование ПЦР Велоспорт условия как 95 ° C 5 мин, 35 циклов [95 ° C 30 s, s 61 ° C 30, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 мин.
2. rAAV производство
- К культуре клетки, семян AD293 клеток на 20-40 см 15 блюд и поддерживать в среде DMEM, дополненная 10% FBS и 1% перо-стрептококк до достижения confluency ~ 90% для transfection.
- Разбавить 3 плазмид с 200 мкл сокращение сыворотке среднего (за блюдо): 1) 10 мкг pHelper; pXR 2) 5 мкг (rh.74 или другие серотипы) и 3) В общей сложности 5 мкг смеси pX601-i20 и pX601-i23 (соотношение 1:1). Выполните transfection polyethylenimine (PEI) путем смешивания с 80 мкл пей и инкубации при комнатной температуре на 10 минут добавить смесь на AD293 клеточных культур в духе прикапывают.
- Для производства вирус AAV, после 72 ч пост трансфекции используйте скребковых ячейка для сбора средства массовой информации и гранулы AD293 клетки центрифугированием при 1100 x g за 10 минут.
- Ресуспензируйте клетки окатышей в 15 мл rAAV литического буфера (50 ммоль/Л Tris база, 150 ммоль/Л NaCl, рН 8,5) следуют 3 циклов замораживания оттаивания с чередующимися инкубации в жидком азоте и ванну воды 42 ° C. Храните lysates клетки в-80 ° C для будущей обработки, если они не обрабатываются немедленно.
- Фильтр СМИ культуры с 0,45 мкм фильтром и добавить 40% PEG8000 в 2,5 моль/Л NaCl в конечной концентрации 8%. Инкубируйте смеси на 4 ° C для 1 h и центрифуги на 1100 x g 15 мин.
- Ресуспензируйте гранулы rAAV литического буфера и объединить с lysates клетки от шаге 2.3, следуют лечение benzonase (50 ед/мл) при 37 ° C в течение 1 ч.
- Центрифуги benzonase лечение rAAV, содержащие смесь 1100 x g 15 мин при температуре 4 ° C и сохранить супернатант (подготовка сырой rAAV).
3. rAAV очищения и концентрации
- Загрузить подготовки сырой rAAV на iodixanol градиент в ультрацентрифуга трубку в следующем порядке от верхней до нижней: сырой AAV lysate (~ 15 мл), 8 мл 15% Iodixanol, 6 мл 25% Iodixanol, 5 мл 40% Iodixanol, 5 мл 58% Iodixanol. Заполните оставшиеся пустой объем трубки в верхней, используя 1 x DPBS.
- Центрифугуйте образцы на 230 000 x g в ротор Ультрацентрифуги для 120 мин на 10 ° C и сбор 3-4 мл 40% градиента фракции, содержащие частицы rAAV с иглой 18 G.
- Развести rAAV частиц с 1 x DPBS и центрифуги с помощью центробежного фильтра блока (MWCO 100 кДа). Повторите этот шаг для 3 - 5 раз и наконец сосредоточиться rAAV подготовке к 300-500 мкл.
4. rAAV Titering
- Извлечь геномной ДНК из 2 мкл сосредоточены rAAV, осадка с 3 M NaOAc в этаноле и Ресуспензируйте в 20 мкл ddH2O.
- Получения калибровочной кривой для rAAV количественный путем последовательного растворения плазмида pX601: 1 x 109, 1 x 10-8,1 x 10-7, 1 x 10-6, 1 х 105 копий в каждом 10 мкл ddH2O. развести DNAase лечение rAAV образцы как 1:10, 1:50, 1: 100 и 1: 1000.
- Определение титра rAAV, Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР) с помощью ПЦР комплект согласно инструкции производителя в реальном масштабе времени PCR системы: 1 мкл 10 мкмоль/Л каждого праймера (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC и 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 мкл 2 x ПЦР Мастер микс, разводят 1 мкл образцы rAAV и 2 мкл ddH2O. запускать реакции с параметрами Велоспорт: 95 ° C 3 мин, 45 циклов [95 ° C 5 сек и 61 ° C 20 сек].
5. внутривенные и внутрибрюшинного введения rAAVrh.74 ТРИФОСФАТЫ в неонатальной mdx/utrophin+ / мыши
- Иммобилизации mdx/utrophin+ / мыши щенков (день 3) путем размещения на льду за 1 мин, а затем применять с 1 x 1012 вирусных частиц в 50 мкл на мышь системно через ретро орбиталь подход или внутрибрюшинной инъекции.
- Разрешить мышей, чтобы восстановить и место обратно в свои дома клетки. В десяти недель после приема rAAV усыпить мышей на CO2 экспозиции для коллекции тканей.
- Snap замораживания тканей геномной ДНК и РНК добыча и использование охлаждения изопентана в жидком азоте для замораживания тканей с оптимального раскроя температуры смеси для cryosectioning.
6. анализ целевого гена редактирования результатов
-
Геномная ДНК ПЦР-анализа
- Изолируйте всего геномной ДНК из тканей сердца mdx/utrophin+ / мышей относились с или без rAAV.
- Используйте тот же протокол в шаге 1.12 для ПЦР-анализа.
-
ПЦР-анализ делеций выражения
- Экстракт всего РНК из тканей сердца с РНК добыча комплект после инструкцией производителя.
- Для выполнения обратной транскрипции, предварительно лечения всего РНК с DNase РНКазы бесплатно и использовать 5 мкг очищенных РНК в качестве шаблона для синтеза cDNA перв стренги с обратной транскрипции Кит.
- Используйте продукт обратной транскрипции для ПЦР-анализа делеций выражения с праймерами cDNA делеций: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT и 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
Оценить Гене редактирования эффективность анализа ПЦР
- Оценить Гене редактирования эффективность количественного RT-ПЦР для выявления сокращение экзона 22-содержащих стенограммы с использованием вперед грунтовка (экзона 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA и обратный грунтовка (экзона 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Используйте Gapdh в качестве ссылки ген грунтом вперед: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC и обратный грунтовка: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- Запустить Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР) с помощью ПЦР комплект согласно инструкции производителя в реальном масштабе времени PCR системы и условий реакции 2-шаг: 95 ° C 3 мин, 45 циклов 95 ° C 5 сек и 61 ° C 30 сек.
-
Иммунофлюоресценции, пятнать для анализа делеций выражение
- Вырежьте замороженные ткани с помощью криостата при толщине 10 мкм. исправить замороженных секции с параформальдегида 4% при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Вымойте 2 x с PBS и инкубировать с блокировкой раствора (10% лошадь сыворотки) за 1 ч.
- Инкубируйте основного антитела анти делеций, при температуре 4 ° C на ночь.
- Вымойте слайды с PBS 3 x 5 мин и проинкубируйте с флуоресцентные вторичные антитела (1: 500) при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Смонтируйте слайдов с помощью средства монтажа с DAPI и изображений с помощью Перевернутый конфокального микроскопа.
7. off Целевой анализ T7E1 assay
- Предсказать потенциальные пробить сайты, используя онлайн ТРИФОСФАТЫ инструменты проектирования, такие как < http://crispr.mit.edu>.
- Усилить геномной регионов, охватывающие сверху 5-10 потенциальных пробить сайтов методом ПЦР: геномной ДНК 200 ng, 1 мкл высококачественный ДНК-полимеразы, 5 мкл 10 x буфер ПЦР микс, 1.5 мкл 10 мкмоль/Л праймеров участкам прямого и обратного, регулируя общий объем до 50 мкл с ddH2O.
- Запустите продукты PCR, электрофорез, извлечь и очистить ДНК, используя набор для извлечения геля. Измерение концентрации с помощью спектрофотометров.
- Способствуем формированию гетеродуплексного денатурации и повторно отжига очищенный ампликонов медленно в буфер 2.1 с помощью ПЦР cycler. Используйте те же условия велосипедного как описано в шаге 1.2.
- Дайджест повторно отожженная продуктов для 30 минут при 37 ° C с 0.5 мкл T7E1 фермента и анализировать реакцию, электрофорез с применением геля агарозы 1-2%.
Примечание: Ампликонов также могут быть проанализированы путем целенаправленной глубокой sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективность оформления побудить удаления целевого региона геномной ДНК должны оцениваться в клеточных культурах до упаковки в rAAV в vivo исследований. С этой целью оформления и выражая SaCas9 конструкции были electroporated в C2C12 клетки и геномной ДНК была проанализирована методом ПЦР с праймерами фланговые целевых сайтов (рис. 1). ПЦР продукта ~ 500 bp указывает успешного удаления целевого геномной ДНК результате гена редактирования в то время как клетки управления не должна принести группы из-за большого размера геномной ДНК.
После того, как эффективность оформления был подтвержден в клеточных культурах, они могут быть упакованы в rAAVrh.74 или другие серотипы (например, AAV6, 8 или 9, все доставки надежных сердца гена показаны) с помощью совместного трансфекции три плазмид в AAV293 клетки. Мы обнаружили, что это не нужно сделать два отдельных rAAV подготовку для двух оформления, вместо этого, мы смешиваются две конструкции gRNA в равных молярное соотношение и производится подготовка единого rAAV. RAAV вирусных частиц были очищены с помощью градиента плотности ultracentrifugation и чистоту был проанализирован SDS-PAGE. Подготовка высокоочищенных rAAV принесет только три полосы, соответствующие капсульных белков VP1, VP2 и VP3, соответственно, на SDS-PAGE, как показано на рисунке 2.
Очищенный rAAVrh.74 вирусных частиц вводили в день 1-3 новорожденных mdx/utrophin+ / мышей через ретро орбиталь или внутрибрюшинной инъекции. Мы нашли оба метода, работал хорошо для сердца доставки rAAVrh.74 ТРИФОСФАТЫ. Вводили мышам могут быть проанализированы для выражения делеций иммунофлюоресценции, окрашивание (рис. 3) в возрасте 10 недель.
Рисунок 1: Проверка оформления для SaCas9-опосредованной гена редактирования в ячейках C2C12. Представитель геля агарозы показал продукты PCR геномной ДНК, извлеченные из electroporated C2C12 с или без SaCas9/оформления. Стрелка указывает, что продукт PCR в результате редактирования ген. GAPDH служил в качестве ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: анализ частиц rAAVrh.74, SDS-PAGE. Очищенный rAAVrh.74 вирусных частиц на SDS-PAGE показал три полосы, соответствующие три капсульных белков AAV, VP1 (87 кДа), VP2 (72 кДа) и VP3 (62 кДа), соответственно. Наличие только эти 3 полосы указывает высокой чистоты rAAV подготовки, не загрязняя других клеточных белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Иммунофлюоресценции окрашивание участков сердца от многомерных выражений/utrophin+ / мышей на 10 недель после лечения AAV-SaCas9/оформления. Представитель иммунофлюоресценции изображения показали выражение делеций (красный) и Кавеолин-3 (зеленый) в сердце разделах WT, mdx/utrophin+ / и mdx/utrophin+ / мышей относились с vg12 1 x 10 AAV-SaCas9/gRNA системно. DAPI использовался для обозначения ядер (синий). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы подробно все шаги, необходимые для достижения в естественных условиях сердечной гена редактирования в послеродовой мышей с помощью rAAVrh.74 опосредованной доставки SaCas9 и два оформления. Как отмечалось ранее, этот подход может использоваться для восстановления делеций выражение дистрофические мышей, как описано в нашей работе27, но он также может позволить быстрый обратной генетики исследования сердечно связанных генов мышей без длительного процесса традиционные нокаут подход к генерации и породы нокаут мыши модели.
Для достижения высокой гена редактирования эффективность в ткани-мишени, существует несколько критических шагов, чтобы иметь в виду: 1) эффективность SaCas9/gRNA побудить удаление целевых геномной ДНК должна быть проверена с помощью соответствующих клеточных линий; 2) очень важно выбрать надлежащий серотип AAV, который может посредничать высокий уровень трансдукции гена в ткани-мишени и 3) определить оптимальную доставку маршрут векторы AAV для переноса генов в желаемой ткани.
В текущий протокол разработанный SaCas9/оформления были упакованы в AAVrh.74, а не сообщалось ранее AAV8 и AAV9 для редактирования гена Dmd 12,28. AAVrh.74 экспонатов около 93% гомологии AAV829 и было показано непатогенные и эффективным в скелетных мышцах преобразователя ниже изолированные конечностей доставки29,,3031. В этом протоколе мы используем ретро орбитальных и внутрибрюшной инъекции rh.74 в новорожденных мышей для перевода сердечных ген. Мы обнаружили, что новорожденный администрация rAAVrh.74 очень эффективна для восстановления экспрессии делеций в около 30-40% кардиомиоцитов мышей, получение высокой дозировке rAAVrh.74 (1 x 1012 vg). Интересно мы обнаружили, что выражение делеций скелетных мышц не был спасен эффективно. Это, вероятно, из-за низкой скелетных мышц тропизма rh.74 серотип при приеме через внутривенное или внутрибрюшинной инъекции, хотя предыдущие исследования показали, что поставка изолированных конечности rAAVrh.74 может эффективно передают обезьяна скелетных и мыши мышцы29,30,31. Кроме того когда rAAVrh.74 вводили в взрослых мышей, мы наблюдали очень низкая эффективность в восстановлении делеций выражение. Было бы интересно определить минимальные дозы, которая необходима для достижения высоких делеций спасения. Кроме того другие серотипы и методы доставки можно протестированы и сравнении для достижения оптимального сердца гена редактирования.
Успешное удаление большой кусок геномной ДНК требует одновременной доставки двух оформления. Мы нашли, что это не нужно сделать два отдельных rAAV препараты для доставки двух оформления. В этом протоколе мы просто смешали два gRNA плазмид в сумме, равной во время transfection rAAV производства, и это комбинированного производства rAAV оказался эффективным в предоставлении обоих оформления. Этот комбинированный подход, таким образом, стоимость трудосберегающих и рекомендуется при одновременной доставки двух оформления необходимы.
Во многих случаях это может быть необходимо проанализировать гена, редактирования эффективность генетические подходы, когда хорошее антитело не доступен для целевого продукта гена. Однако это технически сложно точно подсчитать гена, редактирования эффективность с двумя оформления ориентации же локус, поскольку редактирования продукты гена будет включать целевой последовательности удаления, целевой последовательности инверсии и небольшие indels на только один целевой объект сайт. Вместо этого он более значимой и возможности дать количественную оценку эффективности удаления желаемых целевых последовательности как в нашем случае, когда сокращение стенограммы, содержащие экзонов 21-23 может быть определена количественно в реальном времени RT-PCR.
В этом протоколе мы также описывают использование T7E1 пробирного и вычислительной предсказание для анализа потенциальной деятельности пробить. Для assay хорошо работать необходимо использовать высококачественный ДНК-полимеразы. Кроме того, это всегда хорошая идея, чтобы подготовиться к отрицательным эксперимент управления (управления ДНК продукция усиливается от клеток/тканей без редактирования гена и обрабатывается так же, как образцы) и позитивного управления эксперимент (например известный пример с хорошо изученных генов редактирования). Однако это следует отметить, что предел обнаружения T7E1, пробирного составляет около 532и таким образом он не может быть обнаруживаемых T7E1 assay, если действие пробить ниже 5%. Гид seq33 может использоваться для unbiasedly анализа деятельности мимо SaCas9/gRNA опосредованной гена редактирования. Выявленных пробить сайты от T7E1 assay, вычислительной предсказание и/или гид seq подходы могут быть количественно далее indel частот после в vivo гена редактирования путем sequencing высокой пропускной способности.
Взятые вместе, мы предоставили оптимизированный сердечной гена редактирования подход с использованием rAAVrh.74. Этот протокол может испытываться далее для терапевтического применения и обратный генетических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не существует.
Acknowledgments
О.в. поддерживается США национальные институты здравоохранения грантов (R01HL116546 и R01 AR064241).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
