Summary
Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.
Abstract
Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa, palindromik tekrar (CRISPR) sistemi büyük ölçüde kültürlü hücrelerinde ve canlıların çeşitli türlerin genom mühendislik kolaylaştırdı. CRISPR teknoloji aynı zamanda insan hastalıkların bir dizi roman therapeutics olarak keşfedilmeyi. Kanıtı-of-concept veri tarafından fizibilite ve gen düzenleme tabanlı tedavi yaklaşımı Duchenne kas distrofisi (DMD) bir fare modeli kullanarak için etkinliği gösteren çalışmalar olarak son derece cesaret verici. Özellikle, rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) serotip rh.74 (rAAVrh.74) intravenöz ve mayi enjeksiyon Staphylococcus aureus CRISPR ilişkili protein 9 verimli bir şekilde kalp teslim (SaCas9) ve iki sağladı exon 23 fare Dmd gen mutasyona uğramış bir kodon ile genomik bir bölgeyi silmek için (gRNA) RNA'ların yol. Bu aynı yaklaşım gen-in-faiz vurmak ve ne zaman gRNA gen Kodlayıcı bölge hedeflemek için tasarlanmıştır kendi kardiyak fonksiyon postnatal farelerde çalışma için kullanılabilir. Bu protokol için rAAVrh.74-CRISPR vektör mühendis ve yüksek verimli kardiyak teslim yenidoğan farelerde elde ayrıntılı olarak gösterir.
Introduction
Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa palindromik tekrar (CRISPR) teknolojisi en son ilerleme genom Mühendisliği temsil eder ve mevcut uygulama hücrelerinde ve organizmaların genetik devrim yarattı. Genom CRISPR tabanlı düzenleme kullanır CRISPR ilişkili bir endonükleaz CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) gibi yönlendirmek için tek bir rehber RNA (gRNA) ve Cpf1 protospacer için sırayla tamamlayıcı bir genomik DNA hedef için kodlanmış ile gRNA tarafından bir belirli protospacer bitişik motifi (PAM)1,2. PAM Cas9 veya Cpf1 geni bakteriyel türler bağlı olarak değişir. Streptococcus pyogenes (SpCas9) elde edilen en sık kullanılan Cas9 nükleaz sigara hedef iplikçikteki genomik DNA doğrudan hedef dizisi aşağı akım bulunur NGG PAM dizisi tanır. Hedef sitede, sonra homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma ve Homoloji yönetmen onarım (HDR) yolları3de dahil olmak üzere iç hücresel DNA tamir mekanizmaları tamir iki iplikçikli sonu (DSB), Cas9 ve Cpf1 proteinleri oluşturmak, 4. Homolog rekombinasyon DNA şablon yokluğunda, DSB öncelikle eklemeleri veya silmeleri (indels) ile sonuçlanabilir hataya NHEJ yolu tarafından DSB kodlama oluşturulmuşsa frameshift mutasyonlar neden nükleotit, onarılana bölge bir gen5,6. Böylece, CRISPR sistem yaygın olarak işlev kaybı mutasyonlar çeşitli hücresel modelleri ve tüm organizmalar, mühendis bir gen işlevi araştırmak amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Ayrıca, catalytically etkin olmayan Cas9 ve Cpf1 için transcriptionally geliştirilmiştir ve epigenetically hedef genlerin7,8ifade modüle.
Daha yakın zamanlarda, SpCas9 ve SaCas9 ( Staphylococcus aureustüretilmiş) Doğum sonrası gen düzeltme, insan hastalıkları, hayvan modeli için rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektörel çizimler içine paketlenmiş özellikle, Duchenne kas distrofisi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD dystrophin protein16,17-kodlar, DMD gen mutasyonlar neden bir ölümcül X'e bağlı resesif yenidoğan tarama18 göre yaklaşık bir 3500 erkek doğumlular etkileyen bir hastalıktır , 19. progresif kas güçsüzlüğü ve israf ile karakterizedir. DMD hastaları genellikle 10 ile 12 yaş ve solunum ve/veya kalp yetmezliği ölmektedir arasında 20-30 yıl20yaşına yürüyecek yeteneğini kaybetmezsin. En belirgin olarak kardiyomiyopati gelişen > %90 DMD hastaları ve DMD hastaları21,22ölüm önde gelen neden temsil eder. Her ne kadar Deflazacort (anti-inflamasyon ilaç) ve Eteplirsen (bir exon ilacı exon 51 atlama atlama) son zamanlarda DMD için gıda ve İlaç Dairesi (FDA)23,24tarafından bu tedavilerin hiçbiri onaylanmıştır genomik DNA düzeyinde genetik kusur düzeltmek. Bir nokta mutasyon exon 23 dystrophin gen taşır, mdx fare DMD modeli25yaygın olarak kullanmıştır. Ayrıca, biz daha önce fonksiyonel dystrophin ifade çerçeve silme ekzonlar 21, 22 ve 23 Kas içi reklam-SpCas9/gRNA teslim9 kullanarak mdx farelerin iskelet kasları'kapsayan genomik DNA'ın tarafından restore edilerek gösterdi ve intravenöz ve mayi rAAVrh.74-SaCas9/gRNA teslim26kullanarak mdx/utrophin+ /- fareler Kalp kaslarının.
Bu protokol için dystrophin rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vektörler, kalp kas bölümlerde dystrophin analiz gRNA tasarım kullanarak mdx/utrophin+ /- farelerde geri yüklemek için Doğum sonrası kardiyak gen düzenleme her adımı biz ayrıntılı olarak tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için kullanılan hayvanlar Ohio Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan kaynakları hayvan kullanım kılavuzlarınıza uygun olarak muhafaza. Tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım, kullanım ve Ohio State Üniversitesi İnceleme Komitesi tarafından yetkili.
1. tasarım ve gRNAs CRISPR vektör içine klonlama
- 2 gRNAs dystrophin intron 20 ve intron 23 (i20 ve i23) SaCas9 için hedefleme seçin: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT ve i23: (PAM sıra altı çizili ve italik) 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT .
Not: Hedef için i20 ve i23 hakkında 23 kilo baz çifti (kbp) uzak sitelerdir. Kodlama bir gen bozmaya, SaCas9 için iki gRNAs NNGRRT PAM ile ortak ekzonlar hedefleme sıra (tercihen NNGAAT, NNGGGT ve NNGAGT) ve 20 kbp mesafesinde önerilir. - Arabellek tavlama x 1 gRNA oligos (100 µmol/L) tavlamak için aşağıdaki PCR parametrelerini kullanın (0,5 mol/L K-asetat, 150 mmol/L HEPES tampon stok tavlama x 5 içerir-KOH, 10 mmol/L Mg-asetat, pH7.4): 95 ° C 10 dk 59 95 ° C 0.4 ° C ile 90 döngüleri azaltma başına döngüsü için 20 s, 59-32 ° C 20 devir başına 0.3 ° C azalma ile 90 döngüleri s, 32-26 ° C 20 devir başına 0.3 ° C azalma ile 20 döngüleri s.
- Tavlanmış gRNA oligos pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA ligate BsaI ve T4 DNA ligaz bir tepki olarak kullanarak (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µL komplementer oligos, 1,5 µL 10 x T4 DNA ligaz tampon, 0.5 µL T4 DNA ligaz, 1 µL BsaI, 10 µL GKD2O ), PCR cycler aşağıdaki reaksiyon koşulu: [37 ° C 5 dk ve 16 ° C 10 dk]; 5 döngüleri 37 ° C 20 dk; 80 ° C 5 dk.
- 15 µL ligasyonu ürün 30 µL yetkili hücrelere dönüşümü, agar plaka ile 100 µg/mL ampisilin ve kültür için 24 h 37 ° C'de hücrelerde plaka.
- 5-10 kolonileri ve Kültür 100 µg/mL ampisilin 37 ° c, 3-4 h için bir shaker kuluçka 250 d/d içeren LB ortamda almak.
- Koloniler tarafından PCR ekran: 10 µL PCR ana mix, 8 µL GKD2O, 1 µL E. Coli kültür, 1 µL 10 µmol/L U6 ileri astar, 1 µL i20 veya i23 gRNA ters astar x 2. PCR Bisiklete binme parametreleri: 95 ° C 5 dk, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s 35 döngüleri.
- 5 mL kültür pozitif klonların ekleyerek 4 mL taze LB orta containing100 µg/mL ampisilin ve kültür gecede 37 ° C'de, 250 d/d hazırlayın.
- Plazmid DNA uygun plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak arındırmak ve Sanger tarafından plazmid doğrulayın U6 ileri astar ile sıralama.
- %10 FBS ve % 1 ile DMEM hücrelerde C2C12 kültür kalem-Strep plazmid etkinliğinin düzenleme gen testleri için ~ %70 confluency ulaşan kadar.
- Electroporate 5 µg SaCas9/gRNA plazmid karışımı 1:1 molar oranı 1 x 106 C2C12 hücrelere üreticinin protokolüne göre toplam.
- 48 saat sonrası transfection sonra C2C12 hücre hasat ve genomik DNA ayıklayın.
- Fare dystrophin odağı için PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için kullanım 100 ng genomik DNA şablon olarak: ileri astar 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), ters astar 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x yeşil PCR master mix, 7 µL ddH2O, 1 µL genomik DNA () 100 ng). Kullanmak PCR Bisiklete binme koşulları 95 ° C 5 dk 35 döngüsü [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 dk.
2. rAAV üretim
- Hücre kültür için AD293 hücreleri 20-40 cm 15 cm yemekleri üzerine tohum ve %10 FBS ve % 1 ile DMEM korumak kalem-Strep ~ %90 confluency transfection için ulaşan kadar.
- Seyreltik 3 Plasmid'ler ile 200 µL serum Orta (çanak) başına azaltılmış: 1) 10 µg pHelper; 2) 5 µg pXR (rh.74 veya diğer serotipleri) ve 3) 5 µg karışımı pX601 i20 ve pX601-i23 (1:1 oran) toplam. Polyethylenimine (PEI) transfection 80 µL PEI ile karıştırılarak gerçekleştirmek ve 10 dk. Ekle AD293 hücre kültürleri üzerine karışımı oda sıcaklığında dropwise bir şekilde kuluçkaya.
- 72 h sonrası transfection sonra AAV virüs üretim için medya ve AD293 hücre topakları Santrifüjü 1100 x g 10 dakika için de tarafından toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
- Kuluçka sıvı azot ve 42 ° C su banyosu içinde alternatif ile 3 donma-çözülme çevrimleri ve ardından hücre topakları 15 mL rAAV lizis arabelleği (50 mmol/L Tris Bankası, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) resuspend. Hücre lysates onlar hemen işlenmeyen Eğer gelecekte işlenmesi için-80 ° C'de depolayın.
- Kültür medya 0.45 µm ile filtre ve %40 PEG8000% 8 son bir konsantrasyon için 2.5 mol/L NaCl ekleyin. 1s için 4 ° C'de karışımı ve 1100 x g, santrifüj 15dk için kuluçkaya.
- Granül rAAV lizis arabellekte resuspend ve benzonase (50 U/mL) tedavisi için 1 h 37 ° C'de ve ardından adım 2.3, hücre lysates ile birleştirir.
- Karışım 1100 x g 4 ° C'de 15 dakika içeren benzonase tedavi rAAV santrifüj kapasitesi ve süpernatant (ham rAAV hazırlık) kaydedin.
3. rAAV arıtma ve toplama
- Şu sırada bir ultracentrifuge tüp iodixanol degradede üzerine Ham rAAV hazırlık en baştan altına yük: ham AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL % 15 Iodixanol, 6 mL % 25 Iodixanol, 5 mL % 40 Iodixanol, 5 mL % 58'i Iodixanol. 1 x DPBS kullanarak üst tüp boş kalan hacmi doldurun.
- 230,000 x g ultracentrifuge Open End 120 dk 10 ° c de örnekler santrifüj kapasitesi ve 3-4 mL 18 G iğne ile rAAV parçacıkları içeren % 40 degrade fraksiyonunun toplamak.
- 1 x DPBS ve santrifüj filtre ünitesi (MWCO 100 kDa) kullanarak santrifüj ile rAAV parçacıklar sulandırmak. İçin bu adımı yineleyin 3 - 5 kez ve nihayet rAAV hazırlık için 300-500 µL konsantre.
4. rAAV Titering
- 2 konsantre µL rAAV, etanol içinde 3 M NaOAc ve resuspend 20 µL GKD2O. ile acele genomik DNA ayıklamak
- RAAV Nefelometri için standart eğri pX601 plazmid seri seyreltme tarafından elde edilir: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 kopya her 10 µL GKD2O. Dilute DNAase tedavi rAAV örnek olarak 1:10, 1:50, 1: 100 ve 1: 1000.
- QPCR seti üreticisinin yönerge göre bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak rAAV titresi nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) tarafından belirlemek: 1 µL 10 µmol/L her astar (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC ve 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL PCR ana karışımı, 1 µL seyreltilmiş x 2 rAAV örnekleri ve 2 µL GKD2O. çalıştırmak reaksiyon aşağıdaki Bisiklete binme parametrelerle: 95 ° C 3 dk, [95 ° C 5 sn ve 61 ° C 20 sn] 45 döngüleri.
5. Intravenous ve rAAVrh.74-CRISPR Neonatal mdx/utrophin+ /- fareler içine mayi enjeksiyon
- 1 dk. için buz yerleştirerek mdx/utrophin+ /- fare pups (3 gün) hareketsiz ve 1 x 1012 viral parçacıkların bir retro-orbital yaklaşım veya bir mayi enjeksiyon yoluyla sistemik fare başına 50 µL ile yönetmek.
- Fareyi kurtarmak ve geri ev onların kafes yerleştirmek izin. On hafta sonra rAAV yönetim, fareler CO2 maruz doku koleksiyonu için ötenazi.
- Ek-dokular için genomik DNA ve RNA ayıklama ve kullanma isopentane en uygun kesme sıcaklık kurcalayarak cryosectioning için bileşik dondurmak için sıvı azot soğutma donma.
6. sonuçlar düzenleme hedef gen analizi
-
Genomik DNA PCR Analizi
- Mdx/utrophin+ /- fareler kalp dokuları genomik DNA ile veya olmadan rAAV tedavi toplam yalıtmak.
- Aynı iletişim kuralını adım 1.12 PCR çözümleme için kullanın.
-
RT-PCR analiz dystrophin ifade
- Toplam RNA üreticisinin takip RNA ekstraksiyon kiti ile kalp dokulardan ayıklayın.
- Ters transkripsiyon gerçekleştirmek için önceden bir RNase free DNaz ile toplam RNA tedavi ve tedavi RNA'ın 5 µg Ters transkripsiyon kiti ile ilk iplikçikli cDNA sentezi için şablon olarak kullanmak.
- RT-PCR dystrophin ifade dystrophin cDNA astar ile çözümlenmesi için Ters transkripsiyon ürün kullanın: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT ve 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
QPCR analizi ile etkinlik düzenleme gene tahmin
- Tarafından kantitatif RT-PCR ileri astar (exon 21) kullanarak exon 22 içeren transkript azalma tespit etmek için etkinlik düzenleme gene tahmin: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA ve ters astar (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Gapdh bir başvuru gen ileri astar ile kullanın: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC ve ters astar: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- Nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) qPCR seti üreticisinin yönerge göre 2-adım reaksiyon koşulları ve gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak çalıştırın: 95 ° C 3 dk, 95 ° C 5 sn ve 61 ° C 30 sn 45 döngüleri.
-
Ayirt dystrophin ifade analiz etmek için boyama
- Bir cryostat bir kalınlık-in 10 µm. düzeltme kullanarak donmuş doku dondurulmuş bölümleri ile 15 dakika oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde kesti.
- 2 x PBS ile yıkama ve 1 h için çözüm (% 10 at serum) engelleme ile kuluçkaya.
- Gecede 4 ° C'de anti-dystrophin birincil antikor kuluçkaya.
- PBS ile slaytlar yıkama dakika 3 x 5 ve 1 h için oda sıcaklığında floresan ikincil antikorlar (1:500) ile kuluçkaya.
- Montaj orta DAPI ile kullanarak ve bir ters confocal mikroskopla Imaging slaytlar bağlayın.
7. kapalı-hedef analiz T7E1 tahlil tarafından
- Online CRISPR kullanarak potansiyel hedef kapalı siteleri tasarım araçları gibi tahmin < http://crispr.mit.edu>.
- 5-10 potansiyel hedef kapalı siteleri PCR tarafından üst kapsayan genomik bölgeleri yükseltmek: genomik DNA 200 ng, 1 µL yüksek-sadakat DNA polimeraz, 5 µL 10 x PCR arabellek karıştırmak, 1,5 µL 10 µmol/L, siteye özgü ileriye ve geriye doğru astar ile 50 µL için toplam ses düzeyini ayarlama GKD2O.
- PCR ürünleri Elektroforez tarafından çalıştırmak, hulâsa ve koşmak bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA arındırmak. Spektrofotometreler kullanarak toplama ölçmek.
- Denaturing ve yavaş yavaş bir PCR cycler kullanarak arabellek 2.1 içinde saf amplicons yeniden tavlama tarafından heteroduplex oluşumu teşvik. 1.2. adımda açıklandığı gibi aynı Bisiklet koşullarını kullanın.
- Yeniden tavlanmış ürünler için 0.5 µL T7E1 enzim ile 37 ° C'de 30 dk sindirmek ve reaksiyon kullanarak % 1-2 özel jel elektroforez tarafından analiz.
Not: Amplicons da hedeflenen derin sıralama tarafından analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hedef genomik DNA bölgenin silinmesi ikna etmek için gRNAs etkinliği hücre kültürlerinde ambalaj içinde vivo çalışmalar için rAAV içine önce değerlendirilmelidir. Bu amaçla, gRNAs ve SaCas9 ifade yapıları electroporated C2C12 hücre içine ve genomik DNA PCR tarafından hedef siteleri (Şekil 1) kanat astar ile analiz edildi. ~ 500 kan basıncı kontrol hücreleri genomik DNA'ın büyük boyutları nedeniyle bir grup verir iken gen düzenleme sonucu hedef genomik DNA'ın başarılı silme gösterir bir PCR ürünü.
GRNAs etkinliği hücre kültürleri içinde onaylandıktan sonra onlar rAAVrh.74 veya diğer serotipleri (örneğin, AAV6, 8 veya 9, tüm gösteren sağlam kardiyak gen teslim) içine AAV293 hücrelere üç plazmid Co transfection kullanarak paketlenmiş olabilir. Biz iki gRNAs için iki bireysel rAAV hazırlık yapmak gerekli değildir, bunun yerine, bir eşit molar oranı iki gRNA yapıları karışık ve bir tek rAAV hazırlık üretilen bulundu. RAAV viral parçacıkların yoğunluk gradient ultrasantrifüj kullanarak saflaştırılmış ve saflık SDS-PAGE tarafından analiz edildi. Yüksek oranda saflaştırılmış rAAV hazırlık sadece üç grup kapsid protein VP1, VP2 ve VP3, sırasıyla, SDS-sayfasında Şekil 2' de gösterildiği gibi karşılık gelen verim.
Saf rAAVrh.74 viral parçacıkların gündüze 1-3 ventilasyon mdx/utrophin+ /- retro-orbital veya mayi enjeksiyon yoluyla farelerin enjekte edildi. Her iki yöntem de kalp rAAVrh.74 CRISPR teslime çalıştı bulduk. Enjekte fareler dystrophin ifade için 10 haftalık (Şekil 3) boyama ayirt tarafından çözümlenebilir.
Şekil 1: gRNAs C2C12 hücrelerde gen SaCas9-aracılı düzenlenmek doğrulanmasını. Temsilcisi özel jel elektroforez, PCR ürünleri electroporated C2C12 veya SaCas9/gRNAs olmadan çıkarılan genomik DNA'ın gösterdi. Ok gen düzenleme PCR ürünü sonuçlandı gösterir. Gapdh referans olarak görev yaptı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: rAAVrh.74 moleküller tarafından SDS-sayfa analizi. Saf rAAVrh.74 viral parçacıkların SDS-sayfasında çalıştırılan gösterdi AAV, VP1 üç kapsid protein karşılık gelen üç grup (87 kDa), VP2 (72 kDa) ve VP3 (62 kDa), anılan sıraya göre. Sadece 3 Bu bantların varlığını diğer hücresel proteinler bulaşıcı olmadan yüksek saflıkta rAAV hazırlık gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Boyama ayirt mdx/utrophin+ /- fareler gelen kalp bölümlerin AAV-SaCas9/gRNAs tedavi aşağıdaki 10 haftalıkken. Temsilcisi ayirt görüntüleri dystrophin (kırmızı) ve caveolin-3 ifadesi WT, mdx/utrophin+ /- kalp bölümlerde (yeşil) gösterdi ve fareler mdx/utrophin+ /- 1 x 1012 vg ile tedavi AAV-SaCas9/gRNA sistemik. DAPI çekirdekleri (mavi) etiketlemek için kullanıldı. Ölçek çubuğu: 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için biz vivo içinde kalp gen rAAVrh.74-aracılı teslim SaCas9 ve iki gRNAs kullanma Doğum sonrası farelerde düzenleme elde etmek için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak. Yukarıda belirtildiği, bu yaklaşım bizim iş27' açıklandığı gibi dystrophin ifade distrofik farelerde geri yüklemek için kullanılabilir, ancak Ayrıca hızlı ters genetik çalışmalar uzun süreci olmadan farelerde kalp ile ilgili genlerin sağlayabilirsiniz geleneksel nakavt yaklaşım oluşturmak ve nakavt fare modelleri doğurmak.
Düzenleme verimliliği hedef doku yüksek gen elde etmek için akılda tutulması gereken birkaç önemli adımlar vardır: 1) uygun hücre çizgileri; kullanılarak doğrulanacak hedeflenen genomik DNA silinmesi ikna etmek için SaCas9/gRNA etkinliğini ihtiyacı 2) gen iletim hedef doku ve 3 yüksek düzeyde aracılık uygun bir AAV serotip seçmek çok önemli) AAV vektörlerin gen transferi istenilen doku için en uygun teslim yolu belirlemek.
Geçerli protokolündeki tasarlanmış SaCas9/gRNAs AAVrh.74 paketlenmiş yerine daha önce AAV8 ve AAV9 Dmd gen12,28düzenlenecek rapor. AAVrh.74 sergiler yaklaşık %93 AAV829 Homoloji ve gösterilmiştir patojenik olmayan ve etkili bir kas iskelet transducing olmak izole aşağıdaki teslim29,30,31uzuv. Bu protokol için rh.74 retro-orbital ve mayi enjeksiyon yenidoğan fareler içine kalp gen transferi için kullanın. Bulduğumuz rAAVrh.74 yenidoğan yönetimi çok cardiomyocytes rAAVrh.74 (1 x 1012 vg) yüksek doz alma farelerde yaklaşık 30-%40 dystrophin ifade restorasyonu için etkilidir. İlginçtir, iskelet kası dystrophin ifade değil etkili bir şekilde kurtarıldı bulduk. Önceki çalışmalarda rAAVrh.74 teslimini izole uzuv etkili fare ve maymun iskelet transduce olsa da bu intravenöz veya mayi enjeksiyon yolu ile yönetilen zaman rh.74 serotip düşük kas iskelet tropism nedeniyle muhtemeldir Kas29,30,31. Ne zaman rAAVrh.74 yetişkin fareler verildi, Ayrıca, biz dystrophin ifade yeniden çok düşük verimlilik gözlenen. En yüksek dystrophin kurtarma başarmak için gerekli olan en düşük doz belirlemek için ilginç olabilir. Ayrıca, diğer serotipleri ve teslim yöntemleri test ve en iyi kalp gen düzenleme ulaşmak için karşılaştırıldığında.
Başarılı silme bir büyük genomik DNA parçasının iki gRNAs aynı anda teslim gerektirir. Bulduğumuz iki gRNAs teslim etmek için iki ayrı rAAV hazırlık yapmak için gerekli değildir. Bu iletişim kuralı, biz sadece transfection için rAAV üretim sırasında iki gRNA plazmid eşit bir miktar karışık ve rAAV kombine bu üretimin her iki gRNAs teslim etkili olduğu bulundu. Bu kombine yaklaşım, bu nedenle, maliyet ve emek tasarrufu ve ne zaman tavsiye iki gRNAs aynı anda teslim gereklidir.
Birçok durumda, iyi bir antikor hedef gen ürünü için kullanılabilir olmadığında düzenleme verimliliği tarafından genetik yaklaşımlar gen analiz etmek gerekli olabilir. Ancak, doğru bir şekilde iki gRNAs gen düzenleme ürünleri hedef sıra silme, hedef sıra inversiyon ve yalnızca bir hedef, küçük indels yer alacak bu yana aynı locus hedefleme ile etkinlik düzenleme gen ölçmek için teknik olarak zordur site. Bunun yerine, daha anlamlı ve nerede ekzonlar 21-23 içeren transkript azaltma tarafından gerçek zamanlı RT-PCR sayılabilir bizim durumunda olduğu gibi istenen hedef sırayı silme verimliliğini ölçmek için uygulanabilir.
Bu protokol için de T7E1 tahlil ve potansiyel hedef kapalı etkinliğini çözümlemeye Hesaplamalı tahmin nasıl kullanılacağını açıklar. İyi çalışması tahlil için bir yüksek-sadakat DNA polimeraz kullanmak gereklidir. Ayrıca, her zaman bir negatif kontrol deneme için hazırlamak için yararlı olur (örneğin kontrol DNA ürünleri gen düzenleme olmadan hücreler/dokulardan güçlendirilmiş ve test örnekleri aynı şekilde tedavi) ve olumlu bir denetim deney (örneğin bir bilinen örnek ile iyi karakterize gen düzenleme). Ancak, hedef dışı faaliyetin % 5 altında olması durumunda tahlil %532, hakkında böylece olup T7E1 algılama sınırı T7E1 tahlil tarafından tespit olmayabileceğini notun öyle. Kılavuzu-seq33 unbiasedly SaCas9/gRNA-aracılı gen düzenleme hedef dışı etkinlik analiz etmek için kullanılabilir. T7E1 tahlil, Hesaplamalı tahmin ve/veya Rehberi-seq yaklaşımlar tanımlanan hedef dışı sitelerden daha fazla içinde vivo gen düzenleme yüksek üretilen iş sıralama tarafından takip INDEL frekanslar için sayısal.
Birlikte ele alındığında, biz rAAVrh.74 kullanarak bir en iyi duruma getirilmiş kardiyak gen düzenleme yaklaşım sağladı. Bu oluşturulmuş protokol daha fazla tedavi uygulamaları ve ters genetik çalışmalar için test edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması bulunmaktadır.
Acknowledgments
R.H. ABD Ulusal Sağlık hibe (R01HL116546 ve R01 AR064241) Enstitüleri tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
