Summary
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע ויוו ג'ין לב עריכה בעכברים באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-Associated (rAAV)-מתווכת משלוח של CRISPR. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת נוקאאוט ספציפיות הלב בעכברים כמחנכת, ומציע אסטרטגיה טיפולית מבטיחה לטיפול dystrophic קרדיומיופתיה ב ניוון שרירים דושן.
Abstract
באשכולות, באופן קבוע interspaced, קצר, palindromic חוזר (CRISPR) המערכת הנחתה במידה רבה את הגנום הנדסת תאים בתרבית והן אורגניזמים חיים מתוך מגוון רחב של מינים. הטכנולוגיה CRISPR חקר גם הוא היה כמו הרומן הרפוי מספר מחלות אנושיות. הוכחה הרעיון נתונים מעודדים מאוד בתיכנונו מחקרים המדגימים את היתכנות והיעילות של ג'ין עריכה המבוססת על הגישה הטיפולית עבור ניוון שרירים דושן (DMD) באמצעות מודל מאתר. בפרט, הזרקה תוך ורידי, בקרום הבטן של וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) אפשרה יעיל לב מסירה של Staphylococcus aureus חלבונים הקשורים CRISPR 9 (SaCas9) ו-2 מדריך RNAs (gRNA) כדי למחוק את האזור גנומית בעל codon מוטציה ב אקסון 23 לייעו Dmd העכבר. גישה זו זהה יכול לשמש גם לדפוק את ג'ין-של-הריבית וללמוד את תפקוד הלב שלהם בעכברים כמחנכת כאשר gRNA נועד למטרה האזור קידוד של הגן. ב פרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט איך להנדס וקטור rAAVrh.74-CRISPR, איך להשיג יעילים ביותר משלוח הלב בעכברים neonatal.
Introduction
באשכולות, באופן קבוע interspaced, קצר palindromic חוזר (CRISPR) מייצג את ההתקדמות האחרונה בהנדסת הגנום והטכנולוגיה יש מהפכה ונוהגין לגנטיקה תאים, אורגניזמים. עריכת מבוססי CRISPR הגנום מנצל מדריך בודד RNA (gRNA) לכוון endonuclease CRISPR-הקשורים כגון חלבונים הקשורים CRISPR 9 (Cas9), Cpf1 ליעד דנ א גנומי משלים ברצף protospacer מקודד על ידי gRNA עם protospacer ספציפיים מוטיב סמוכים (פאם)1,2. פאם משתנה בהתאם למין חיידקי של הגן Cas9 או Cpf1. נוקלאז Cas9 הנפוץ ביותר נגזר הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס (SpCas9) מזהה רצף פאם הגולה שנמצא ישירות במורד הזרם של הרצף היעד ב- DNA גנומי, על סטרנד-יעד. באתר היעד, החלבונים Cas9 ו- Cpf1 לייצר הפסקה כפולה-סטרנד (DSB), אשר לאחר מכן תיקון דרך מהותי DNA תיקון המנגנונים התאיים כולל קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מסלולים3, 4. בהיעדרו של תבנית ה-DNA עבור רקומבינציה הומולוגית, DSB בעיקר יתוקן על ידי השביל NHEJ לשגיאות, אשר עלולה לגרום שהתוספות או המחיקות (indels) של נוקלאוטידים גרימת מוטציות frameshift אם נוצרו DSB הקידוד אזור של ג'ין5,6. לפיכך, מערכת CRISPR כבר בשימוש נרחב להנדס אובדן-של-פונקציה מוטציות מגוון דגמי הסלולר של אורגניזם שלם, על מנת לחקור את הפונקציה של הגן. יתר על כן, Cas9 ואת Cpf1 catalytically לא פעיל פותחו כדי transcriptionally, epigenetically לווסת את הביטוי של היעד הגנים7,8.
לאחרונה, הן SpCas9 והן SaCas9 (נגזר Staphylococcus aureus) יש היה ארוז לתוך וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV) וקטורים לתיקון ג'ין כמחנכת במודל החייתי של מחלות האדם, במיוחד, דושן ניוון שרירים (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD זה X-linked רצסיבי מחלה קטלנית הנגרמת על ידי מוטציות בגן dmd, שמקודד הדיסטרופין החלבון16,17, להשפיע על אחד ב 3500 לידות זכר על פי ההקרנה היילוד18 , 19. הוא מאופיין על ידי חולשת שרירים פרוגרסיבית לבזבז. החולים DMD מאבדים בדרך כלל את היכולת ללכת בין 10 ל- 12 שנים של גיל למות מהתקף נשימה ו/או הלב כבר בגיל 20-30 שנים20. ראוי לציין, קרדיומיופתיה מתפתחת אצל > 90% של חולים DMD והוא מייצג המובילים לגרום מוות DMD חולים21,22. למרות Deflazacort (תרופה נגד דלקת), Eteplirsen (אקסון דילוג על רפואה שפיספסו אקסון 51) לאחרונה אושרו עבור DMD על ידי מזון, והתרופות האמריקני (FDA)23,24, אף אחד הטיפולים האלה לתקן את הפגם הגנטי ברמת הדנ א הגנומי. העכבר mdx, אשר נושאת מוטציה ב אקסון 23 של הדיסטרופין, כבר בשימוש נרחב כמו מודל DMD25. יתר על כן, בעבר להדגים כי הביטוי הדיסטרופין פונקציונלי שוחזר על ידי מחיקה בתוך מסגרת של ה-DNA גנומי כיסוי exons 21, 22 ו 23 בשרירי השלד של עכברים mdx באמצעות Ad-SpCas9/gRNA תוך שרירית משלוח9 , ואת השרירים הלב של mdx/utrophin+ /- עכברים באמצעות משלוח rAAVrh.74-SaCas9/gRNA תוך ורידי, בקרום הבטן26.
ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט בכל שלב בעריכת כמחנכת ג'ין הלב כדי לשחזר הדיסטרופין mdx/utrophin+ /- עכברים באמצעות וקטורים rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, מ gRNA עיצוב הדיסטרופין לניתוח בסעיפים שריר הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
החיות בשימוש פרוטוקול זה היו ומתוחזק על מעבדה מדינת אוהיו האוניברסיטה חיה משאבים לפי הנחיות שימוש בבעלי חיים. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל קיבלת אישור על טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש בהם לוועדת הביקורת של אוניברסיטת מדינת אוהיו.
1. עיצוב, שיבוט של gRNAs לתוך וקטור CRISPR
- בחר gRNAs 2 מיקוד הדיסטרופין אינטרון 20 ואינטרון 23 (i20 ו i23) עבור SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT , i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (הרצף פאם מודגש, נטוי).
הערה: האתרים היעד ועבור i20 i23 הם בערך 23 קילו זוג בסיסים, (kbp) משם. לשבש גן קידוד, שני gRNAs מיקוד את exons משותפת עם פאם NNGRRT רצף SaCas9 (רצוי NNGAAT, NNGGGT ו- NNGAGT), מרחק בתוך 20 kbp מומלצים. - השתמש בפרמטרים PCR הבאים כדי anneal את oligos gRNA (100 µmol/L) ב 1 x חישול מאגר (5 x חישול מלאי מאגר מכיל 0.5 מול/ליטר K-אצטט, 150 mmol/L HEPES-קו, 10 מ ג-אצטט mmol/L, pH7.4): 95 מעלות 10 דקות, מחזורי 90 95 עד 59 ° C ב- 0.4 ° C להקטין לכל מחזור 20 s, מחזורי 90 של 59 עד 32 ° C עם ירידה 0.3 מעלות צלזיוס בכל מחזור 20 s, 20 מחזורים של 32 עד 26 ° C עם ירידה 0.3 מעלות צלזיוס בכל מחזור 20 s.
- מאתרים ומפסיקים את oligos annealed gRNA לתוך pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA באמצעות BsaI ו- T4 DNA ליגאז בתגובה אחת (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, oligos 1 µL annealed, µL 1.5 10 x T4 DNA ליגאז מאגר, 0.5 µL T4 DNA ליגאז, 1 µL BsaI, 10 µL ddH2O ), עם התנאי התגובה הבא ב הצנטרפוגה ה-PCR: 5 מחזורי [37 ° C 5 min ו- 16 ° C 10 דקות]; 37 ° C 20 דקות; 80 ° C 5 דקות.
- להפוך את המוצר מצדו 15 µL 30 µL תאים המוסמכת, צלחת התאים צלחת אגר עם 100 µg/mL אמפיצילין, ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- לאסוף 5-10 המושבות והתרבות במדיום LB המכיל 100 µg/mL אמפיצילין ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד ב חממה שאכר עבור 3-4 שעות.
- מסך המושבות על-ידי ה-PCR: 10 µL 2 x מיקס מאסטר PCR, 8 µL ddH2O, תרבות 1 של e. Coli µL, 1 µL 10 µmol/L U6-קדימה פריימר, 1 µL i20 או i23 gRNA הפוכה פריימר. הפרמטרים אופניים PCR: 95 ° C 5 דקות, 35 מחזורי s 95 ° C 30, 61 ° C 30 s, s 72 ° C 30.
- הכן מ ל תרבות של שיבוטים חיובי על ידי הוספת 4 מ"ל טריים LB containing100 בינוני µg/mL אמפיצילין, והתרבות בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד.
- לטהר את פלסמיד הדנ א באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד המתאים, וודא את פלסמיד מאת סנגר רצף עם ומהצמיגים U6-קדימה.
- התרבות התאים C2C12 DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% עט-דלקת עד שהגיע confluency ~ 70% לבדיקה את הגן עריכה היעילות של פלסמידים.
- Electroporate בסך הכל 5 µg SaCas9/gRNA תערובת פלסמיד ב- 1:1 יחס טוחנת לתאים עונה 1 פרק 106 C2C12 לפי הפרוטוקול של היצרן.
- לאחר 48 שעות שלאחר תרביות תאים, לקצור את התאים C2C12 ולחלץ את הדנ א.
- להשתמש 100 ng גנומית DNA כתבנית כדי לבצע את התגובה PCR עבור העכבר הדיסטרופין לוקוס: קדימה פריימר 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), הפוך פריימר 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x PCR ירוק מאסטר מיקס, 7 µL ddH2O, 1 µL (דנ א גנומי 100 ng). השתמש PCR רכיבה על אופניים תנאים כמו 95 ° C 5 דקות, 35 מחזורי [s 95 ° C 30, 61 ° C 30 s, s 72 ° C 30], 72 ° C 2 דקות.
2. rAAV ייצור
- אל התרבות התאים, זרע תאים AD293 על 20-40 ס מ- 15 מנות ולשמור על-DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% עט-דלקת עד שהגיע ~ 90% confluency על תרביות תאים.
- פלסמידים 3 לדלל עם 200 µL מופחת סרום בינוני (לכל תבשיל): 1) 10 µg pHelper; pXR µg 2) 5 (rh.74 או אחרים אשר נגרמו מהזנים אליהם) ו- 3) סך של 5 µg של תערובת pX601-i20 pX601-i23 (יחס 1:1). לבצע תרביות תאים polyethylenimine (פיי) על ידי ערבוב עם פיי µL 80, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות הוסף התערובת על התרבויות תא AD293 באופן dropwise.
- לייצור וירוס AAV, לאחר 72 h פוסט תרביות תאים, להשתמש במגרדת תא לאסוף כלי התקשורת והן את כדורי תא AD293 על ידי צנטריפוגה ב 1100 g x עבור 10 דקות.
- Resuspend תא כדורי במאגר 15 מ"ל rAAV פירוק (50 mmol/L טריס בסיס, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5) ואחריו 3 מחזורים ההקפאה-הפשרה עם מתחלפים הדגירה חנקן נוזלי, אמבט מים 42 ° C. אחסן את lysates תא-80 ° C לעיבוד בעתיד אם לא להיות מעובד באופן מיידי.
- לסנן את המדיה תרבות עם מסנן 0.45-מיקרומטר ולהוסיף של 40% PEG8000 2.5 מול/ליטר NaCl ריכוז סופי של 8%. דגירה התערובת ב 4 ° C עבור 1 h, צנטריפוגה ב 1100 x g למשך 15 דקות.
- Resuspend כדורי במאגר פירוק rAAV ומשלבים עם lysates תא מהשלב 2.3, ואחריו טיפול benzonase (50 U/mL)-37 מעלות לשעה.
- Centrifuge rAAV שטופלו benzonase המכיל תערובת g 1100 x למשך 15 דקות ב 4 ° C, ולשמור את תגובת שיקוע (הכנת rAAV גולמי).
3. rAAV טיהור וריכוז
- לטעון ההכנה rAAV גס על גבי צבע iodixanol צינור ultracentrifuge לפי הסדר הבא מלמעלה למטה: גולמי AAV lysate (~ 15 מ"ל), 15 מ ל 8% Iodixanol, 6 מ ל 25% Iodixanol, 5 מ ל 40% Iodixanol, 5 מ ל 58% Iodixanol. מילוי נפח ריק הנותרים של הצינור העליון באמצעות 1 x DPBS.
- Centrifuge את הדגימות-230,000 g x ב- רוטור ultracentrifuge עבור 120 דקות ב 10 ° C ולאסוף 3-4 מ"ל של השבר הדרגתיות 40% החלקיקים rAAV עם מחט 18 גרם.
- לדלל את החלקיקים rAAV עם 1 x DPBS, צנטריפוגה באמצעות יחידת צנטריפוגלי מסנן (kDa MWCO 100). חזור על שלב זה עבור 3 - 5 פעמים סוף סוף להתרכז מן ההכנות rAAV µL 300-500.
4. rAAV Titering
- לחלץ את הדנ א של 2 rAAV µL מרוכז, precipitate עם 3 מ' NaOAc אתנול, resuspend 20 µL ddH2O.
- לקבל את עקומת סטנדרטי עבור כימות rAAV על-ידי לדילול סדרתי פלסמיד pX601: עונה 1 פרק 109, עונה 1 פרק 10-8,עונה 1 פרק 107, עונה 1 פרק 10-6, עונה 1 פרק 105 עותקים כל אחד 10 µL ddH2O. Dilute rAAV שטופלו DNAase דוגמאות כמו 1:10, 1:50 מטריים, 1:1000.
- לקבוע כייל rAAV על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) באמצעות qPCR קיט על פי ההוראה של יצרן מערכת זמן אמת PCR: 1 µL 10 µmol/L של כל פריימר (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC ו- 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x מיקס מאסטר PCR, µL 1 מדולל דוגמאות rAAV ו- 2 µL ddH2O. להפעיל את התגובה עם אופניים הפרמטרים הבאים: 95 ° C 3 דקות, 45 מחזורי [95 ° C 5 sec ו 61 ° C 20 שניה].
5. תוך ורידית, הזרקת בקרום הבטן של rAAVrh.74-CRISPR לתוך Neonatal mdx/utrophin+ /- עכברים
- לשתק את mdx/utrophin+ /- העכבר הגורים (יום 3) על ידי הנחת על קרח 1 דקות ולאחר מכן לנהל עם12 עונה 1 פרק 10 נגיפים ב µL 50 לכל העכבר מערכתית דרך בגישה רטרו-מסלולית או זריקה בקרום הבטן.
- לאפשר העכברים לשחזר את המקום בחזרה לתוך הכלובים הביתה. ב- 10 שבועות לאחר rAAV המינהל, המתת חסד העכברים על ידי חשיפה2 CO לאיסוף רקמות.
- Snap-ההקפאה ברקמות גנומית מיצוי DNA ו- RNA ושימוש קירור איזופנטאן בחנקן נוזלי להקפיא רקמות עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך במתחם cryosectioning.
6. ניתוח של ג'ין היעד עריכה תוצאות
-
ניתוח ה-PCR דנ א גנומי
- לבודד את הסיכום הדנ א מן הרקמות הלב של mdx/utrophin+ /- עכברים שטופלו עם או בלי rAAV.
- השתמש באותו הפרוטוקול ב- 1.12 שלב לניתוח ה-PCR.
-
RT-PCR ניתוח הדיסטרופין הביטוי
- לחלץ RNA הכולל רקמות הלב עם ערכת חילוץ RNA בעקבות ידני של היצרן.
- כדי לבצע שעתוק במהופך, מתייחסים מראש את הרנ א סה עם DNase נטולת RNase ומשתמשים µg 5 של RNA שטופלו כתבנית הראשון-strand cDNA סינתזה עם הקיט שעתוק במהופך.
- להשתמש במוצר שעתוק במהופך לניתוח RT-PCR של הביטוי הדיסטרופין תחל cDNA הדיסטרופין: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT ו- 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
מעריכים את הגן עריכת יעילות על ידי ניתוח qPCR
- מעריכים את הגן עריכת יעילות על ידי RT-PCR כמותי כדי לזהות את ההפחתה של אקסון המכיל 22 תעתיקים באמצעות פריימר לפנים את (אקסון 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, ומהצמיגים הפוכה (אקסון 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. להשתמש Gapdh כמו גן הפניה עם פריימר לפנים: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC, ומהצמיגים הפוכה: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- להפעיל את כמותיים בזמן אמת PCR (qPCR) באמצעות qPCR את ערכת לפי הוראות היצרן ב מערכת זמן אמת PCR ותנאי התגובה דו-שלבי: 95 ° C 3 דקות, 45 מחזורי 95 ° C 5 שניה ושל 61 ° C 30 שניה.
-
Immunofluorescence מכתים לנתח הדיסטרופין ביטוי
- חותכים הרקמות הקפוא בעזרת cryostat עובי של 10 מיקרומטר. תיקון הסעיפים קפוא עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- 2 x עם PBS וקונטה דגירה עם חסימת פתרון (10% הסוס סרום) לשעה.
- דגירה נוגדן ראשוני אנטי-הדיסטרופין, ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את השקופיות עם PBS 3 x 5 דקות דגירה עם נוגדנים משניים פלורסנט (שבערך) בטמפרטורת החדר מאובטח.
- לטעון את השקופיות תוך שימוש באמצעי הרכבה עם דאפי והדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה.
7. את המטרה ניתוח לפי T7E1 assay
- לחזות האתרים חופש-יעד פוטנציאליים באמצעות CRISPR באינטרנט את כלי עיצוב כגון < http://crispr.mit.edu>.
- להגביר את האזורים גנומית המכסה את החלק העליון 5-10 אתרי חופש-יעד פוטנציאליים על ידי ה-PCR: ng 200 דנ א גנומי, 1 µL אמינות גבוהה DNA פולימראז, 5 שילוב מאגר ה-PCR של 10 x µL, 1.5 µL 10 µmol/L של תחל ואחורה בייעודי לאתר, התאמת עוצמת הקול סה כ עד 50 µL עם ddH2O.
- להפעיל את המוצרים PCR על ידי אלקטרופורזה, לחלץ ולטהר את הדנ א באמצעות ערכת חילוץ ג'ל. למדוד את הריכוז באמצעות מכשירים.
- לקדם היווצרות heteroduplex באמצעות denaturing, חישול מחדש את amplicons מטוהרים לאט ב 2.1 המאגר באמצעות הצנטרפוגה PCR. השתמש באותם תנאים אופניים כמפורט בשלב 1.2.
- לעכל את המוצרים annealed מחדש במשך 30 דקות ב 37 ° C עם האנזים T7E1 µL 0.5, ולנתח את התגובה על ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל agarose 1-2%.
הערה: amplicons יכול גם להיות מנותח על ידי רצף עמוק יישוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צריך ניתן להעריך את היעילות של gRNAs כדי לעודד את המחיקה של אזור היעד דנ א גנומי בתרבויות תא לפני האריזה לתוך rAAV ללימודי אין ויוו. למטרה זו, gRNAs וקבועים לבטא SaCas9 היו electroporated לתוך תאים C2C12, ה-DNA גנומי היה נותחו על ידי ה-PCR עם תחל איגוף האתרים היעד (איור 1). מוצר ה-PCR של ~ 500 bp מצביע על המחיקה המוצלח ב dna גנומי היעד הנובע ג'ין עריכה ואילו תאי בקרה לא אמור להניב להקה בשל גודלו של ה-DNA גנומי.
ברגע היעילות של gRNAs אושרה של תרביות תאים, הם שניתן לארוז לתוך rAAVrh.74 או אחרים אשר נגרמו מהזנים אליהם (כגון AAV6, 8 או 9, המסירה הגן לב איתנה ' בסה כ מציג כל ') באמצעות תקנים משותף של שלושה פלסמידים לתאים AAV293. מצאנו כי זה לא הכרחי להפוך rAAV בודדים שני, הכנה שני gRNAs, במקום זאת, אנחנו מעורבים המבנה gRNA שני ביחס שן טוחנת שווה והפיק הכנה rAAV יחיד. חלקיקי נגיפי rAAV היו לטהר על-ידי דחיסות צבע ultracentrifugation, הטוהר נותחה על ידי עמודים מרחביות. הכנת rAAV נקיים במיוחד יניב רק שלוש להקות התואם החלבונים capsid VP1 VP2, VP3, בהתאמה, למען חברה דמוקרטית-עמוד כמוצג באיור2.
חלקיקי נגיפי rAAVrh.74 מטוהרים היו מוזרק יום 1-3 neonates של mdx/utrophin+ /- עכברים באמצעות הזרקת רטרו-מסלולית או בקרום הבטן. . מצאנו שתי השיטות פעלה היטב מסירה לב של rAAVrh.74-CRISPR. העכברים מוזרק ניתן לנתח לביטוי הדיסטרופין מאת immunofluorescence מכתים (איור 3) רוב בגיל 10 שבועות.
איור 1: אימות של gRNAs SaCas9 בתיווך גנים עריכה בתאים C2C12. אלקטרופורזה בג'ל נציג agarose הראה את המוצרים ה-PCR של דנ א גנומי שחולצו מן electroporated C2C12 עם או בלי SaCas9/gRNAs. החץ מצביע על שהמוצר PCR נבעה ג'ין עריכה. Gapdh שימש כנקודת התייחסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח של חלקיקים rAAVrh.74 על ידי עמודים מרחביות. RAAVrh.74 מטוהרים נגיפים רוץ בעמוד-מרחביות הראה שלוש להקות, המייצגים שלושת החלבונים capsid של AAV, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) ו VP3 (62 kDa), בהתאמה. הנוכחות של רק הלהקות 3 מציין את טוהר גבוהה של הכנת rAAV בלי לזהם לחלבונים אחרים התאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Immunofluorescence מכתים הסעיפים הלב של mdx/utrophin+ /- עכברים-10 שבועות לאחר הטיפול AAV-SaCas9/gRNAs. הדימויים immunofluorescence נציג הראה את הביטוי של הדיסטרופין (אדום) ו- caveolin-3 (ירוק) בסעיפים הלב של WT, mdx/utrophin+ /- ו mdx/utrophin+ /- עכברים שטופלו vg12 עונה 1 פרק 10 AAV-SaCas9/gRNA מערכתית. דאפי שימש לה תווית הגרעינים (כחול). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנו מפרטים את כל השלבים הנחוצים להשגת ויוו ג'ין לב עריכה בעכברים כמחנכת באמצעות משלוח בתיווך rAAVrh.74 של SaCas9, בשתי gRNAs. כאמור, גישה זו יכול לשמש כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין בעכברים dystrophic כפי שמתואר שלנו לעבוד27, אבל זה יכול גם לאפשר לימודי גנטיקה הפוכה מהירה של גנים הקשורים הלב בעכברים ללא תהליך ממושך של גישה מסורתית נוקאאוט ליצור, מתרבים נוקאאוט העכבר מודלים.
כדי להשיג את ג'ין גבוה עריכת יעילות ברקמות היעד, ישנם מספר שלבים קריטיים לזכור: 1) היעילות של SaCas9/gRNA לזירוז המחיקה של דנ א גנומי יישוב זקוקה לאימות באמצעות שורות תאים המתאימים; 2) חשוב מאוד לבחור serotype AAV תקין זה יכול לתווך רמה גבוהה של התמרה חושית ג'ין לתוך הרקמה היעד ו- 3) לקבוע תוואי אספקה אופטימלים AAV וקטורים עבור העברה גנטית לרקמות הרצוי.
בפרוטוקול הנוכחי, SaCas9/gRNAs מעוצב נארזו אל תוך AAVrh.74 במקום דיווח בעבר AAV8 ו- AAV9 כדי לערוך Dmd ג'ין12,28. AAVrh.74 מוצגים כ- 93% הומולוגיה AAV829 , הוכח להיות פתוגניים שאינם ויעיל transducing שרירי השלד האיבר הבא מבודדים משלוח29,30,31. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים הזרקה רטרו-מסלולית, בקרום הבטן של rh.74 לתוך עכברים neonatal עבור העברה גנטית הלב. מצאנו כי הממשל neonate של rAAVrh.74 היא יעילה במיוחד לשיקום הדיסטרופין ביטוי כ- 30-40% של cardiomyocytes בעכברים שקיבלו מינון גבוה של rAAVrh.74 (vg עונה 1 פרק 10-12 ). מעניין, מצאנו כי הביטוי הדיסטרופין שרירי השלד לא חולץ ביעילות. זה ככל הנראה בגלל tropism שרירי השלד נמוך של serotype rh.74 כאשר ניתנת באמצעות הזרקה תוך ורידי או בקרום הבטן, למרות שמחקרים קודמים הראו כי האיבר מבודד מסירת rAAVrh.74 יכול ביעילות מגלי קוף השלד של עכבר שריר29,30,31. כמו כן, כאשר rAAVrh.74 היה מנוהל לתוך עכברים בוגרים, הבחנו יעילות נמוכה מאוד עבור שחזור ביטוי הדיסטרופין. זה יהיה מעניין לקבוע את המינון המינימלי אשר נדרש כדי להשיג החילוץ הדיסטרופין הגבוהה ביותר. יתר על כן, אחרים אשר נגרמו מהזנים אליהם ושיטות שליחה להיות נבדק, בהשוואה להשגת ג'ין הלב האופטימלי עריכה.
המחיקה מוצלח של חתיכה גדולה דנ א גנומי מחייבת משלוח בו זמנית של שני gRNAs. מצאנו את שזה אין צורך לבצע שני rAAV נפרדים ההכנות להעברת שתי gRNAs. ב פרוטוקול זה, אנו פשוט מעורבים של פלסמידים gRNA שני בסכום שווה במהלך תרביות תאים לייצור rAAV, ייצור משולב זה של rAAV נמצאה יעילה בשימוש בשני gRNAs. גישה משולבת זו היא, אפוא, עלות - ואני חוסך עבודה ומומלץ כאשר מסירה בו זמנית של שתי gRNAs נדרשים.
במקרים רבים, ייתכן צורך לנתח את הגן עריכת יעילות על ידי גישות גנטיות נוגדן טוב אינו זמין עבור המוצר ג'ין היעד. עם זאת, זה מאתגר מבחינה טכנית לכמת במדויק את הגן עריכת יעילות עם שני gRNAs מיקוד מיקומה באותו כיוון ג'ין עריכת המוצרים יכלול מחיקה רצף המטרה היעד רצף היפוך, indels קטן-רק מטרה אחת אתר. במקום זאת, זה ריאלי כדי לכמת את היעילות של מחיקה רצף יישוב הרצויה כמו שלנו במקרה שבו ההפחתה של התרשימים המכיל exons 21-23 ניתן לכמת על ידי בזמן אמת RT-PCR ומשמעותי יותר.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים גם את השימוש T7E1 assay ותחזית חישובית לנתח את הפעילות מחוץ-יעד פוטנציאליים. עבור וזמינותו לעבוד היטב, יש צורך להשתמש אמינות גבוהה DNA פולימראז. כמו כן, זה תמיד רעיון טוב כדי להתכונן ניסוי בקרה שלילית (למשל שליטה DNA מוגבר מן הרקמות/התאים ללא עריכה ג'ין, ומוצרים כאל באותה הדרך הבדיקה דוגמאות), ניסוי בקרה חיובית (למשל ידוע מדגם עם הגן מאופיין היטב עריכה). עם זאת, זה של הערה כי גבול זיהוי T7E1 assay, עומד על 532, וכך זה לא ייתכן לזיהוי על ידי וזמינותו T7E1 אם הפעילות את המטרה הוא מתחת ל 5%. מדריך-seq33 יכול לשמש כדי unbiasedly לנתח את הפעילות את המטרה של SaCas9/gRNA-מתווכת ג'ין העריכה. ניתן לכמת את האתרים את המטרה שזוהו T7E1 assay, חיזוי חישובית ו/או מדריך-seq גישות נוספות לתדרי ויאסין בעקבות vivo בתוך הגן עריכה על-ידי רצף תפוקה גבוהה.
יחדיו, סיפקנו גישה העריכה ג'ין לב ממוטב באמצעות rAAVrh.74. פרוטוקול זה הוקמה יכול להיבדק עוד יותר עבור יישומים טיפוליים של מחקרים גנטיים הפוכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים קיים.
Acknowledgments
ר. ה נתמך על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (R01HL116546 ו- R01 AR064241).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
