Summary
ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR の配信を介する。このプロトコルは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋ジストロフィーの心筋症を治療するために有望な治療戦略を提供しています、生後マウス心臓固有ノックアウトを生成する使用ことができます。
Abstract
クラスター化、定期的に空間、短い、回文の繰り返し (CRISPR) システムは、培養細胞のさまざまな種から生きている有機体のゲノム工学を促進しています。CRISPR 技術は、人間の病気の治療薬として検討されています。概念実証データは可能性とマウスモデルを用いたデュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) の遺伝子編集ベース アプローチの有効性を示す最近の研究に代表される非常に心強いものです。黄色ブドウ球菌CRISPR 関連タンパク質 9 の効率的な心筋配信 (SaCas9) と 2 つの特に、組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) 血清型 rh.74 (rAAVrh.74) の静脈内投与と腹腔内注入が有効になって23 マウスDmd遺伝子のエクソンに変異のコドン ゲノム領域を削除する Rna (gRNA) をご案内します。興味の遺伝子をノックアウトして生後マウスの心機能を研究、gRNA の遺伝子のコーディングの地域をターゲットに設計されている場合、これと同じアプローチを使用もできます。このプロトコルでは rAAVrh.74 CRISPR ベクトルをエンジニア リングする方法と新生児マウスで高効率な心臓配送を達成するために詳細に示します。
Introduction
クラスター化、定期的に空間、短い回文リピート (CRISPR) 技術はゲノム工学の最も最近の進歩を表し、細胞および生物における遺伝学の現在の習慣をもたらしました。CRISPR 関連のエンドヌクレアーゼ CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) などを直接単一ガイド RNA (gRNA) を利用してゲノムの CRISPR ベース編集とは、protospacer に補足シーケンスのゲノム DNA ターゲットに Cpf1 と gRNA でエンコードされた、特定の protospacer の隣接するモチーフ (PAM) の1,2。PAM は、Cas9 または Cpf1 の遺伝子の細菌種によって異なります。化膿連鎖球菌(SpCas9) から派生した一般的に使用される Cas9 ヌクレアーゼは、非ターゲット鎖に DNA に直接下流ターゲット シーケンスのある NGG の PAM のシーケンスを認識します。ターゲット ・ サイトで Cas9 と Cpf1 蛋白質を生成する非相同末端結合 (NHEJ) と相同性向け修理 (HDR) 経路3を含む組み込みの細胞 DNA 修復機構によって修復され、二重鎖切断 (DSB) 4。相同組換えの DNA のテンプレートがない場合は、DSB は主に修復に挿入や削除 (オクターリピート) 生じるエラーを起こしやすい NHEJ 経路による DSB がコーディングで作成された場合、フレーム シフト突然変異を引き起こしているヌクレオチドの遺伝子5,6の領域。したがって、遺伝子の機能を調べるために、CRISPR システムを様々 な細胞モデルと全有機体の機能喪失変異をエンジニアに広く使用がされています。また、触媒非アクティブの Cas9 と Cpf1 発現に開発されている、epigenetically ターゲット遺伝子7,8の発現を調節します。
最近では、SpCas9 と SaCas9 (黄色ブドウ球菌由来) パッケージ化されている遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) ベクトルの人間の病気の動物モデルの生後遺伝子補正のために特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー筋ジストロフィー (DMD)9,10、11,12,13,14,15。DMD はジストロフィン蛋白質16,17をエンコード、 DMDの遺伝子で突然変異によって引き起こされる致命的な X 連鎖劣性病気新生児マスス クリーニング18によると約 1 つで 3500 男性出産に影響を与える,19. 進歩的な筋肉弱さと無駄が特徴です。DMD 患者は通常 20-30 年20歳で 10 歳以上 12 歳未満と呼吸や心臓の障害で死ぬと歩行能力を失います。心筋症を開発する特に、> 90% の DMD 患者と DMD 患者21,22の死の主要な原因を表します。Deflazacort (抗炎症薬) と Eteplirsen (エクソン 51 をスキップのための薬をスキップ エクソン) 最近によって承認されている DMD の食品医薬品局 (FDA)23,24、これらの治療のどれもがゲノム DNA レベルで遺伝的欠陥を修正します。エクソン 23 ジストロフィン遺伝子の点突然変異を運ぶ、mdx マウスは、DMD モデル25として広く使用されています。さらに、我々 は以前、機能的なジストロフィン式カバー エクソン 21、22、23 筋肉内の広告-SpCas9/gRNA 配信9 を使用してmdxマウス骨格筋でゲノム DNA のフレームの削除によって復元された実証、および静脈内、腹腔内の rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 配信26を使用してmdx/研究+/-マウスの心臓の筋肉。
このプロトコルで生後心臓遺伝子の心臓の筋肉のセクションでジストロフィン解析 gRNA 設計からの rAAVrh.74-SaCas9/gRNA ベクトルを使用してmdx/研究+/-マウスでジストロフィンを復元する編集のあらゆるステップ詳細に述べる。
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Protocol
このプロトコルで使われる動物は、動物使用のガイドラインに従って、オハイオ州大学研究所動物資源で維持されました。すべての動物の研究は、制度的動物のケア、使用、およびオハイオ州立大学の審査委員会によって承認されました。
1. デザイン gRNAs CRISPR ベクターにクローニング
- 対象 20 ジストロフィン イントロンとイントロン (i20 と i23) 23 SaCas9 2 gRNAs を選択: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM シーケンスは、下線、斜体)。
注: i20 と i23 のターゲット ・ サイトには、約 23 キロ塩基対 (kbp) 離れて。コーディングの遺伝子を破壊する 2 つの gRNAs NNGRRT PAM と共通のエクソンをターゲット シーケンス SaCas9 の (できれば NNGAAT、NNGGGT、NNGAGT) および 20 kbp の範囲内の距離をお勧めします。 - 次の PCR パラメーターを使用して 1 アニーリング バッファー x gRNA oligos (100 µmol/L) をアニール (緩衝在庫をアニール x 5 には 0.5 mol/L 150 ミリ モル/L HEPES K 酢酸が含まれています-島、10 ミリ モル/L Mg 酢酸、pH7.4): 95 ° C 10 分の 0.4 の ° C と 95 に 59 ° C 90 サイクル減少あたりサイクルの 20 s、20 サイクルあたり 0.3 ° C 減少と 59 ~ 32 ° C の 90 サイクル s、20 サイクルあたり 0.3 ° C 減少 32 に 26 ° C の 20 サイクル s。
- PX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA に焼鈍 gRNA oligos を縛る反応の 1 つで BsaI と T4 DNA リガーゼを使って (1 μ L 50 ng/μ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 焼鈍 1 μ L oligos、1.5 μ 10 x T4 DNA リガーゼ バッファー、0.5 μ L T4 DNA リガーゼ、1 μ 10 μ L ddH2O BsaI)、PCR サーマルサイクラーに次の反応条件を持つ: 5 サイクル [37 ° C 5 分および 16 ° C 10 分];37 ° C 20 分。80 ° C 5 分。
- 100 μ g/ml、アンピシリン寒天培地で 24 h の 37 ° C で培養細胞をプレート、15 μ L 結紮製品を 30 μ L の有能なセルに変換します。
- 5-10 コロニーと 37 ° C, 3 4 h のシェーカーのインキュベーターで 250 rpm で 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地での培養を拾います。
- 画面の PCR によるコロニー: PCR のマスターの組合せ、8 μ L ddH2O、1 μ L 大腸菌文化、1 μ L の 10 µmol/L U6 前方プライマー、1 μ L i20 または i23 gRNA 逆プライマー x 10 μ L 2。PCR の循環パラメーター: 95 ° C、95 ° C 30 秒、61 ° C 30 s、72 ° C 30 秒の 35 サイクル 5 分。
- 追加 4 mL 新鮮な LB 培地 containing100 μ G/ml、アンピシリンと 37 ° C, 250 rpm で一晩文化肯定的なクローンの 5 mL 文化を準備します。
- 適切なプラスミド抽出キットを使用して DNA のプラスミッドの浄化し、サンガーでプラスミドを確認 U6 前方プライマーによるシーケンスします。
- 10 %fbs と 1 %dmem で C2C12 細胞の培養テスト遺伝子プラスミッドの効果を編集するための 〜 70% の confluency に到達するまでペン連鎖球菌。
- Electroporate 5 μ g 製造元のプロトコルに従って 1 × 106 C2C12 細胞に 1:1 のモル比で SaCas9/gRNA プラスミドの混合物の合計。
- 48 時間後のトランスフェクション後 C2C12 細胞を収穫し、ゲノム DNA を抽出します。
- マウス ジストロフィン遺伝子座の PCR の反作用を実行するテンプレートとしての使用 100 ng ゲノム DNA: プライマー 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA を転送 (1 μ 10 µmol/L)、逆プライマー 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 μ 10 µmol/L) 10、緑の PCR x 2 μ L マスター ミックス 7 μ L ddH2O 1 μ L ゲノム DNA (100 ng)。PCR を使用してサイクリング条件 95 ° C、5 分として [95 ° C 30 s、61 ° C 30 s、72 ° C 30 s] 35 サイクル 72 ° C 2 分。
2. 下さい rAAV 生産
- 細胞を培養する 20 に 40 15 cm 皿の上に AD293 細胞を播くし、10 %fbs と 1 %dmem で維持ペン-連鎖球菌の transfection のための ~ 90% の confluency に到達するまで。
- 200 μ L で希釈 3 プラスミド減少 (一皿) 血清中: 1) 10 μ g の pHelper;2) 5 μ g pXR (rh.74 または他の血清型)、3) pX601 i20 と pX601 i23 混合物 (1:1) の 5 μ g の合計。80 μ L PEI と混合してポリエチレンイミン (PEI) トランスフェクションを行い、滴状に 10 分追加 AD293 細胞培養に混合物を室温で孵化させなさい。
- AAV ウイルス産生、72 h ポスト トランスフェクション後 10 分 1100 × g で遠心分離してメディアと AD293 細胞ペレットの両方を収集するのに細胞スクレーパーを使用します。
- 液体窒素と 42 ° C の水浴でインキュベーションを交互に 3 凍結融解サイクルに続いて 15 mL 下さい rAAV 換散バッファー (50 ミリ モル/L 150 ミリ モル/L 塩化ナトリウム、pH 8.5、トリス基地) 内細胞ペレットを再懸濁します。-80 ° C、彼らがすぐに処理されていない場合は将来、処理セル lysates を格納します。
- 0.45 μ m フィルターでフィルター文化メディアと 8% の最終的な集中に 2.5 mol/l 塩化ナトリウム 40 %peg8000 を追加します。4 ° C 1 時間の混合物と 1100 × g で 15 分間遠心を孵化させなさい。
- 下さい rAAV 換散バッファーでペレットを再懸濁します、ステップ 2.3, 1 h 37 ° C で benzonase (50 U/mL) 治療が続きますからのセル lysates と結合します。
- 4 ° C で 15 分間混合物 1100 x g を含有する benzonase 処理下さい rAAV を遠心し、上清 (原油下さい rAAV 準備)。
3. 下さい rAAV 浄化と濃度
- 上から下に次の順序で遠心管の iodixanol 勾配に原油下さい rAAV 準備をロード: 原油 AAV ライセート (〜 15 mL) 8 mL の 15 パーセント 6 mL 25% Iodixanol Iodixanol、5 mL 40 %5 mL 58% Iodixanol Iodixanol。1 x DPBS を使用してトップ チューブの残りの空のボリュームを埋めます。
- 遠心分離機のサンプル 10 ° C で 120 分の超遠心機ローターで 230,000 x g で 18 G 針で下さい rAAV 粒子を含む 40% 勾配率の 3-4 mL を収集しています。
- 1 x DPBS と遠心遠心フィルター ユニット (MWCO 100 kDa) を使用して下さい rAAV 粒子を希釈します。に対してこの手順を繰り返します 3-5 回、最終的に 300-500 μ L に下さい rAAV 準備を集中。
4. 下さい rAAV あります。
- 2 μ L 集中して下さい rAAV、エタノール、3 M NaOAc と 20 μ L ddH2o. で再懸濁します沈殿物からゲノム DNA を抽出します。
- PX601 プラスミドのシリアル希釈して下さい rAAV 定量用標準曲線を取得: 1 × 109, 1 x 108,1 x 10 の71 x 106、各 10 μ L ddH2O. Dilute DNAase 処理下さい rAAV で 1 x 10 の5枚サンプルとして 1:10、1:50、1: 100、1: 1000。
- リアルタイム PCR システムの製造元の指示に従って qPCR キットを使用して量的なリアルタイム PCR (qPCR) して下さい rAAV 価を決定する: 1 μ 10 各プライマーの µmol/L (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC、5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC)、5 PCR マスター ミックス、希釈 1 μ L x 2 μ L下さい rAAV サンプルと 2 μ L ddH2修次サイクリング パラメーター反応を実行: 95 ° C [95 ° C 5 秒、61 ° C 20 秒] 45 サイクル 3 分。
5. 静脈と新生児mdx/研究+/-マウスに rAAVrh.74 CRISPR の腹腔内投与
- 1 分間氷の上を置くことによって、 mdx/研究+/-マウスの子犬 (3 日目) を固定し、1 x 1012 50 μ L/マウス レトロ軌道アプローチまたは腹腔内注射で全身でウイルス粒子とを管理します。
- 回復し、彼らのホームのケージに戻しマウスを許可します。下さい rAAV 投与後 10 週間で組織の採取の CO2の露出によってマウスを安楽死させます。
- ゲノム DNA および RNA の抽出、イソペンタン セクショニング化合物最適切削温度と組織を凍結する液体窒素を冷却の使用のためのティッシュのスナップ-凍結。
6. 成果を編集ターゲット遺伝子の解析
-
ゲノム DNA の PCR 解析
- Mdx/研究+/-マウスの心臓組織からのゲノム DNA 治療下さい rAAV 有無合計を分離します。
- Pcr のステップ 1.12 で同じプロトコルを使用します。
-
ジストロフィンの発現の RT-PCR 解析
- 製造元のマニュアルに従って RNA 抽出キットの心臓組織からの総 RNA を抽出します。
- 逆のトランスクリプションを実行、RNase フリーの DNase の総 RNA の事前治療し、最初繊維の cDNA を合成する逆転写キットのテンプレートとして扱われた RNA の 5 μ g を使用します。
- ジストロフィン cDNA プライマーのジストロフィン式の RT-PCR 解析で逆のトランスクリプション製品を使用: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT、5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC。
-
QPCR による効果を編集遺伝子を推定します。
- 編集 (エクソン 21) の前方のプライマーを用いたエクソン 22 含む転写産物の減少を検出する RT-PCR によって有効性遺伝子を推定: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA、および逆プライマー (エクソン 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT。前方のプライマーと参照の遺伝子としての Gapdh の使用: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC と逆プライマー: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT。
- リアルタイム PCR システムと 2 段階反応条件の製造元の指示に従って qPCR キットを使用して量的なリアルタイム PCR (qPCR) を実行: 95 ° C 3 分、95 ° C 5 秒、61 ° C 30 秒 45 サイクル。
-
ジストロフィンの発現を分析する染色蛍光抗体法
- 修正プログラムは、10 μ m の厚さでクライオスタットを用いた凍結組織で 15 分間室温で 4% パラホルムアルデヒド凍結切片をカットします。
- PBS で 2 倍を洗って、1 h のソリューション (10% 馬血清) をブロックで孵化させなさい。
- 4 ° c 夜間、抗ジストロフィンの一次抗体を孵化させなさい。
- PBS でスライドを洗って 3 x 5 分と蛍光二次抗体 (1: 500) 1 時間室温で孵化させなさい。
- DAPI でメディアをマウントを使用し、倒立の共焦点顕微鏡とイメージングのスライドをマウントします。
7 T7E1 法によるオフのターゲット分析
- オンライン CRISPR を使用して潜在的なターゲットをサイト デザイン ツールなどを予測する < http://crispr.mit.edu>。
- PCR によって 5-10 潜在的なターゲットをサイト上部を覆っているゲノムの領域を増幅する: ゲノム DNA 200 ng、1 μ L 高忠実度 DNA ポリメラーゼ、5 μ L の 10 倍 PCR バッファーのミックス、1.5 μ 10 50 μ L に容量を調整すること、サイト固有の前方および逆引きのプライマーの µmol/LddH2o.
- 電気泳動で PCR の製品を実行、抽出し、ゲル抽出キットを使用して DNA を浄化します。分光光度計を使用して濃度を測定します。
- 変化と再アニーリング PCR サーマルサイクラーを使用してバッファー 2.1 でゆっくりと精製 amplicons ヘテロ二本鎖形成を促進します。ステップ 1.2 の詳細として同じサイクリング条件を使用します。
- 0.5 μ L T7E1 酵素、37 ° C で 30 分間再熱処理製品を消化し、1 2% アガロースゲルを用いた電気泳動による反応を分析します。
注: ターゲットのディープ シーケンスによって、amplicons 分析もできます。
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Representative Results
体内研究下さい rAAV に包む前に培養細胞の標的ゲノム DNA 領域の削除を誘導する gRNAs の有効性を評価しなければなりません。このため、gRNAs と SaCas9 を表現する構造であった C2C12 細胞に electroporated とターゲット サイト (図 1) を側面プライマーと PCR によるゲノム DNA を調べた。PCR の製品の ~ 500 bp ターゲット DNA 遺伝子制御の細胞ゲノム DNA のサイズが大きいためバンドが得しないでください中に編集に起因の成功の削除を示します。
GRNAs の有効性を培養細胞で確認されている、一度 AAV293 細胞に 3 つのプラスミドの共トランスフェクションによる rAAVrh.74 または他の血清型 (AAV6、8、9、すべての示す堅牢な心臓遺伝子デリバリーなど) にパッケージすることができます。わかりました、それは 2 つの gRNAs の 2 つの個別下さい rAAV 準備する必要はありません、代わりに、等しいモル比で 2 つの gRNA 構造を混合し、1 つ下さい rAAV 準備を生産します。下さい rAAV ウイルス粒子の密度勾配超遠心法を使用して精製した、純度は SDS-PAGE により分析しました。高純度下さい rAAV 準備は、SDS ページの図 2に示すように、それぞれ、カプシド タンパク質 VP1、VP2、や VP3 に対応する唯一の 3 つのバンドをもたらすでしょう。
レトロな軌道または腹腔内注入でmdx/研究+/-マウスの 1-3 新生児日に浄化された rAAVrh.74 ウイルス粒子を注入しました。RAAVrh.74 CRISPR の心臓の配信のためによく働いて、両方の方法を発見しました。注入されたマウスは、10 週齢でジストロフィン式の蛍光染色 (図 3) で分析できます。
図 1: C2C12 細胞で SaCas9 を介した遺伝子編集用 gRNAs の検証です。代表的な agarose のゲルの電気泳動は、electroporated C2C12 SaCas9/gRNAs の有無から抽出したゲノム DNA の PCR の製品を示した。矢印は、PCR の製品に起因する遺伝子編集を示します。Gapdhの参照として提供しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: SDS-PAGE による rAAVrh.74 粒子の解析。SDS ページ上で実行精製 rAAVrh.74 ウイルス粒子が AAV、VP1 の 3 つのキャプシドに対応する 3 つのバンドを示した (87 kDa)、VP2 (72 kDa) と VP3 (62 kDa)、それぞれ。のみこれらの 3 バンドの存在は、他の細胞の蛋白質を汚染することがなく下さい rAAV 準備の高純度を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:10 週間の AAV-SaCas9/gRNAs 治療後の免疫蛍光染色mdx/研究+/-マウスから中心部。代表的な蛍光画像は+/- mdx/研究の WT の心のセクションで (緑) ジストロフィン (赤) とカベオリン 3 の式を示し、 mdx/研究+/-マウス処理 1 x 1012英領バージン諸島AAV-SaCas9/gRNA 全身。DAPI は核 (青) に使用されます。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、生体内で心臓遺伝子 SaCas9 と 2 つの gRNAs の rAAVrh.74 を介した配信を使用して産後のマウスで編集を達成するために必要なすべての手順を詳しく説明します。前述のとおり、このアプローチは、私たちの仕事の27日に記載されている筋ジストロフィー マウスにおけるジストロフィン式を復元する使用ことができますがそれはの長いプロセスを使用せずマウス心臓関連遺伝子の急速な逆遺伝学の研究もできる、伝統的なノックアウトを生成し、ノックアウト マウス モデルの繁殖の方法
高い遺伝子編集ターゲット組織の効率を達成するために留意すべきいくつかの重要なステップがある: 1) 対象となるゲノム DNA の削除を誘発する SaCas9/gRNA の有効性は、適切なセルは並ぶ; を使用して検証する必要2) それは標的組織に 3 遺伝子伝達の高レベルを仲介することができます適切な AAV 血清型を選択する非常に重要な) 目的の組織への遺伝子導入のための AAV のベクトルの最適な配送ルートを決定します。
現在のプロトコルの設計された SaCas9/gRNAs AAVrh.74 にパッケージ化されたよりもむしろDmd遺伝子12,28を編集するには、AAV8 と AAV9 を報告しました。AAVrh.74 展示約 93% AAV829に相同性が示されていると非病原性と骨格筋の伝達に効果的な次の分離した四肢配信29,30,31。このプロトコルでは心臓遺伝子の新生仔マウスに rh.74 のレトロな軌道および腹腔内注入を使用します。RAAVrh.74 の新生児管理がジストロフィン式約 30-40% の rAAVrh.74 (1 x 1012英領バージン諸島) の高用量を受信マウスの心筋細胞の修復のため非常に効率的なことがわかった。興味深いことに、骨格筋ジストロフィン式が効果的に救出されたないことがわかった。以前の研究はマウスとサルの骨格 rAAVrh.74 の分離四肢配信することができます変換効果的にことを示したが、これは大抵 rh.74 血清型静脈または腹腔内注入で投与した際の骨格筋の低親和性筋肉29,30,31。またときに、rAAVrh.74 は、大人のマウスに投与したところ、ジストロフィンの発現を復元する際の非常に低い効率を見ました。それは最高のジストロフィンの救助を達成するために必要な最小投与量を決定するは興味深いでしょう。さらに、他の血清型および配信メソッドをテストおよび比較が可能最適な心臓遺伝子編集を実現するため。
ゲノム DNA の大部分の成功の削除には、2 つの gRNAs の同時配信が必要です。わかった 2 つの gRNAs を提供するための 2 つの独立した下さい rAAV 準備をする必要はありません。このプロトコルでトランスフェクション下さい rAAV 生産中に等しい量で 2 つの gRNA プラスミドを混ぜ合わせるだけと下さい rAAV のこの生産は両方の gRNAs を提供する上で効果的なことが判明しました。この手法は、したがって、コストと労力を節約し、推奨 2 gRNAs の同時配信が必要です。
多くの場合、良い抗体がターゲット遺伝子産物の利用できない場合、遺伝的アプローチによって効率を編集遺伝子を分析する必要がある場合があります。しかし、それは技術的に困難なターゲット シーケンスの削除、ターゲット シーケンスの反転と 1 つだけターゲットに小さなオクターリピート遺伝子編集製品が含まれますので、同じ軌跡をターゲットと 2 つの gRNAs の有効性を編集遺伝子を正確に定量化するにはサイト。代わりより意味のある、エクソン 21-23 を含む成績証明書の削減をリアルタイム RT-PCR 法により示すことができる私たちの場合と同様に目的のターゲット シーケンス削除の効率性を定量化することは不可能です。
このプロトコルの T7E1 試金および潜在的なターゲットを離れて活動を分析する計算予測の使用について述べる。うまくアッセイの高忠実度 DNA ポリメラーゼを使用する必要は。また、それは常に否定的な制御実験のために準備することをお勧め (例えばコントロール DNA 製品細胞/組織から遺伝子を編集することがなく増幅し、テスト サンプルとして同じように扱われます) と肯定的な制御実験 (例えば、知られていたサンプルとよ特徴付けられた遺伝子編集)。しかし、532、およびこうしてそれについての試金は T7E1 の検出限界ことがありますいない T7E1 法による検出ターゲットを離れての活動が 5% 以下の場合のです。ガイド seq33は unbiasedly SaCas9/gRNA を介した遺伝子編集のターゲットをオフ動作の分析を使用できます。T7E1 試金、計算予測やガイド seq アプローチから特定のオフのターゲット サイトは、塩基周波数高スループット シーケンスによってin vivo遺伝子編集、次のさらに定量化できます。
一緒に取られて、私達は rAAVrh.74 を使用して最適化された心臓遺伝子編集アプローチを提供しました。この確立されたプロトコルは、逆遺伝学的研究と治療への応用にさらにテストできます。
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Disclosures
利害の対立は存在しません。
Acknowledgments
相対湿度は、米国国立衛生研究所健康補助金 (R01HL116546 および R01 AR064241) によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
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