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Adeno-जुड़े वायरस-चूहों में कार्डियक जीन संपादन के लिए CRISPR की मध्यस्थता डिलीवरी

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program, Ohio State University Wexner Medical Center

Summary

यहां हम रिकॉमबिनेंट Adeno-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) का उपयोग कर चूहों में vivo कार्डियक जीन संपादन में बाहर ले जाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान CRISPR की मध्यस्थता प्रसव. इस प्रोटोकॉल Duchenne पेशी dystrophy में अपक्षयी cardiomyopathy के इलाज के लिए एक होनहार चिकित्सीय रणनीति प्रदान करता है और जन्मोत्तर चूहों में कार्डियक-विशिष्ट नॉकआउट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

संकुल, नियमित रूप से अंतराल, लघु, palindromic दोहराने (CRISPR) प्रणाली बहुत प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता से दोनों प्रसंस्कृत कोशिकाओं और रहने वाले जीवों में जीनोम इंजीनियरिंग की सुविधा है । CRISPR प्रौद्योगिकी मानव रोगों की एक संख्या के लिए उपंयास चिकित्सकीय के रूप में भी पता लगाया गया है । सबूत की अवधारणा डेटा उच्च हाल के अध्ययनों से उदाहरण के रूप में प्रोत्साहित कर रहे है कि व्यवहार्यता और जीन संपादन की प्रभावकारिता Duchenne पेशी dystrophy (DMD) एक murine मॉडल का उपयोग कर के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण आधारित प्रदर्शन । विशेष रूप से, नसों में और रिकॉमबिनेंट adeno के intraperitoneal इंजेक्शन-जुड़े वायरस (rAAV) सीरोटाइप आरएच 74 (rAAVrh. 74) Staphylococcus aureus CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (SaCas9) और दो के कुशल कार्डियक डिलीवरी सक्षम है गाइड RNAs (gRNA) माउस एक्सॉन जीन के Dmd 23 में एक उत्परिवर्ती codon के साथ एक जीनोमिक क्षेत्र को नष्ट करने के लिए । यह एक ही दृष्टिकोण भी बाहर का जीन दस्तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ब्याज और जन्मोत्तर चूहों में उनके हृदय समारोह का अध्ययन जब gRNA जीन के कोडिंग क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से दिखाने के लिए कैसे rAAVrh. 74 इंजीनियर को-CRISPR वेक्टर और कैसे नवजात चूहों में अत्यधिक कुशल हृदय वितरण प्राप्त करने के लिए ।

Introduction

संकुल, नियमित रूप से अंतराल, लघु palindromic दोहराने (CRISPR) प्रौद्योगिकी जीनोम इंजीनियरिंग में सबसे हाल ही में प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है और कोशिकाओं और जीवों में आनुवंशिकी के वर्तमान अभ्यास में क्रांति । CRISPR-आधारित जीनोम संपादन एक एकल गाइड आरएनए (gRNA) CRISPR-एसोसिएटेड प्रोटीन 9 (Cas9) और Cpf1 एक जीनोमिक डीएनए लक्ष्य है कि अनुक्रम में protospacer द्वारा इनकोडिंग gRNA के लिए एक के साथ पूरक है के रूप में एक CRISPR-जुड़े endonuclease प्रत्यक्ष करने के लिए इस्तेमाल करता है विशिष्ट protospacer आसंन आकृति (पाम)1,2। पाम Cas9 या Cpf1 जीन की बैक्टीरियल प्रजातियों के आधार पर बदलता है । सबसे अधिक इस्तेमाल किया Cas9 स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes (SpCas9) से व्युत्पंन nuclease NGG के एक पाम अनुक्रम है कि सीधे जीनोमिक डीएनए में लक्ष्य अनुक्रम के बहाव, गैर लक्ष्य किनारा पर पाया जाता है पहचानता है । लक्ष्य साइट पर, Cas9 और Cpf1 प्रोटीन एक डबल किनारा तोड़ (DSB) है, जो तो गैर सहित आंतरिक सेलुलर डीएनए मरंमत तंत्र के माध्यम से मरंमत मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) और समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) रास्ते3उत्पंन, 4. एक डीएनए मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए टेंपलेट के अभाव में, DSB मुख्य रूप से त्रुटि प्रवण NHEJ मार्ग है, जो संमिलन या विलोपन में परिणाम कर सकते है द्वारा मरंमत की है (indels) न्यूक्लियोटाइड के कारण frameshift उत्परिवर्तनों अगर DSB कोडिंग में बनाए गए थे एक जीन के क्षेत्र5,6। इस प्रकार, CRISPR प्रणाली व्यापक रूप से किया गया है नुकसान के इंजीनियर के लिए इस्तेमाल समारोह विभिंन सेलुलर मॉडल और पूरे जीवों में उत्परिवर्तनों, क्रम में एक जीन के समारोह की जांच करने के लिए । इसके अलावा, उत्प्रेरक निष्क्रिय Cas9 और Cpf1 transcriptionally और epigenetically लक्ष्य जीन7,8की अभिव्यक्ति मिलाना करने के लिए विकसित किया गया है ।

हाल ही में, दोनों SpCas9 और SaCas9 ( Staphylococcus aureusसे व्युत्पंन) रिकॉमबिनेंट adeno में पैक किया गया है-जुड़े वायरस (rAAV) मानव रोगों के पशु मॉडल में जन्मोत्तर जीन सुधार के लिए वैक्टर, विशेष रूप से, Duchenne दमदार dystrophy (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD एक घातक एक्स जुड़ा हुआ अवकाश DMD जीन है, जो encodes dystrophin प्रोटीन16,17में उत्परिवर्तनों की वजह से बीमारी है, ३५०० नवजात शिशुओं18 के अनुसार स्क्रीनिंग में लगभग एक को प्रभावित , 19. यह प्रगतिशील मांसपेशियों की कमजोरी और अपव्यय की विशेषता है । DMD रोगियों को आम तौर पर उंर के 10 और 12 साल के बीच चलने की क्षमता खो देते है और 20-30 साल की उंर20से श्वसन और/ विशेष रूप से, cardiomyopathy > DMD रोगियों के 90% में विकसित और DMD रोगियों21,22में मौत का प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है । हालांकि Deflazacort (एक विरोधी सूजन दवा) और Eteplirsen (एक्सॉन ५१ लंघन के लिए एक एक्सॉन लंघन दवा) हाल ही में खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा DMD के लिए अनुमोदित किया गया है (एफडीए)23,24, इन उपचार में से कोई भी जीनोमिक डीएनए स्तर पर आनुवंशिक दोष को सही । mdx माउस, जो dystrophin जीन के 23 एक्सॉन में एक बिंदु उत्परिवर्तन किया जाता है, व्यापक रूप से एक DMD मॉडल25के रूप में इस्तेमाल कर दिया गया है । इसके अलावा, हम पहले से प्रदर्शन किया है कि कार्यात्मक dystrophin अभिव्यक्ति में जीनोमिक डीएनए exons 21, 22 और 23 को कवर mdx चूहों के कंकाल की मांसपेशियों में इंट्रामस्क्युलर Ad-SpCas9/gRNA वितरण 9 का उपयोग करके बहाल कर दिया गया था , और mdx/utrophin+/- चूहों का उपयोग नसों में और intraperitoneal rAAVrh. 74-SaCas9/gRNA डिलिवरी26के दिल की मांसपेशियों में ।

इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से वर्णन में हर कदम जन्मोत्तर कार्डियक जीन संपादन में dystrophin को बहाल करने के लिए mdx/utrophin+/- चूहों का उपयोग rAAVrh. 74-SaCas9/gRNA वैक्टर, gRNA डिजाइन से dystrophin विश्लेषण करने के लिए दिल की मांसपेशी वर्गों में ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल जानवरों के अनुसार ओहियो राज्य विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु संसाधनों पर बनाए रखा गया पशु उपयोग के दिशा निर्देशों के साथ । सभी पशु अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल, उपयोग, और ओहियो राज्य विश्वविद्यालय की समीक्षा समिति द्वारा प्राधिकृत किया गया ।

1. डिजाइन और CRISPR वेक्टर में gRNAs की क्लोनिंग

  1. चुनें 2 gRNAs लक्ष्यीकरण dystrophin intron 20 और intron 23 (i20 और i23) SaCas9 के लिए: i20:5 '-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT और i23:5 '-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (पाम अनुक्रम रेखांकित और इटैलिक है) ।
    नोट: i20 और i23 के लिए लक्ष्य साइटों के बारे में 23 किलो आधार जोड़ी (kbp) दूर कर रहे हैं । एक कोडिंग जीन बाधित करने के लिए, दो SaCas9 के लिए NNGRRT पाम अनुक्रम के साथ आम exons लक्ष्यीकरण gRNAs (अधिमानतः NNGAAT, NNGGGT और NNGAGT) और दूरी 20 kbp के भीतर की सिफारिश कर रहे हैं ।
  2. 1x एनीलिंग बफर में gRNA ओलिगोस्पर्मिया (१०० µmol/l) के लिए निम्नलिखित पीसीआर मापदंडों का प्रयोग करें (5x एनीलिंग बफर स्टॉक में ०.५ मॉल/L K-एसीटेट, १५० mmol/l HEPES-कोह, 10 mmol/l Mg-एसीटेट, ph 7.4): ९५ ° c 10 min, ९० चक्र ९५ से ५९ ° c प्रति ०.४ ° c कमी के साथ 20 एस के लिए चक्र, ५९ के ९० चक्र के साथ ३२ डिग्री सेल्सियस के लिए 20 एस के लिए चक्र के अनुसार ०.३ डिग्री सेल्सियस की कमी, 20 के लिए ३२ डिग्री सेल्सियस से 26 ° c के लिए प्रति चक्र में कमी 20 एस.
  3. Ligate में annealed gRNA ओलिगोस्पर्मिया को pX601-सीएमवी-SaCas9-mPA-U6-gRNA का प्रयोग BsaI और टी-4 डीएनए ligase एक अभिक्रिया में (1 µ l ५० एनजी/µ l pX601-सीएमवी-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µ l annealed ओलिगोस्पर्मिया, १.५ µ l 10x टी-4 डीएनए ligase बफर, ०.५ µ l टी-4 डीएनए ligase, 1 µ l BsaI, 10 µ l ddH2हे ), एक पीसीआर साइकिल चालक में निम्नलिखित प्रतिक्रिया हालत के साथ: के 5 चक्र [३७ ° c 5 min और 16 ° c 10 min]; ३७ ° c 20 min; ८० ° c 5 min.
  4. 15 µ l बंधाव उत्पाद को 30 µ l सक्षम कक्षों में रूपांतरित करें, १०० µ g/mL एम्पीसिलीन, और संस्कृति को ३७ ° c पर 24 ज के साथ आगर प्लेट में कक्षों को प्लेट में रखें ।
  5. पौंड मध्यम में 5-10 कालोनियों और संस्कृति उठाओ १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन ३७ डिग्री सेल्सियस, २५० rpm में एक शेखर मशीन में 3-4 एच के लिए ।
  6. पीसीआर द्वारा स्क्रीन कालोनियों: 10 µ एल 2x पीसीआर मास्टर मिक्स, 8 µ एल ddH2ओ, 1 µ एल ई. कोलाई संस्कृति, 1 µ l 10 µmol/l U6-फॉरवर्ड प्राइमरी, 1 µ l i20 या i23 gRNA रिवर्स प्राइमर । पीसीआर सायक्लिंग पैरामीटर: ९५ ° c 5 मिनट, ९५ ° c 30 एस के ३५ चक्र, ६१ ° c 30 s, ७२ ° c 30 s.
  7. 4 मिलीलीटर ताजा पौंड मध्यम containing100 µ जी/एमएल एम्पीसिलीन, और संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस, २५० rpm पर रातोंरात जोड़कर सकारात्मक क्लोन की 5 मिलीलीटर संस्कृति तैयार करें ।
  8. प्लाज्मिड डीएनए उचित प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग कर शुद्ध, और U6-आगे प्राइमर के साथ सैंज अनुक्रमण द्वारा प्लाज्मिड सत्यापित करें ।
  9. संस्कृति C2C12 DMEM में कोशिकाओं को 10% FBS और 1% कलम-Strep के साथ पूरक तक पहुंचने तक ~ ७०% plasmids के जीन संपादन प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए प्रवाह ।
  10. Electroporate एक कुल 5 µ g SaCas9/gRNA प्लाज्मिड के मिश्रण में 1:1 दाढ़ अनुपात में 1 x 106 C2C12 कोशिकाओं में निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
  11. ४८ एच पोस्ट-अभिकर्मक के बाद, C2C12 कोशिकाओं फसल और जीनोमिक डीएनए निकालने ।
  12. माउस dystrophin लोकस के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया करने के लिए टेम्पलेट के रूप में १०० एनजी जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें: फॉरवर्ड प्राइमरी 5 '-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ l 10 µmol/l), रिवर्स प्राइमरी 5 '-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ l 10 µmol/l), 10 µ l 2x द ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स, 7 µ l ddH2O, 1 µ l जीनोमिक DNA ( १०० एनजी) । ९५ ° c 5 मिनट, [९५ ° c 30 s, ६१ ° c 30 s, ७२ ° c 30 s], ७२ ° c 2 min के ३५ चक्र के रूप में पीसीआर साइकल चालन शर्तों का उपयोग करें ।

2. rAAV उत्पादन

  1. संस्कृति के लिए कोशिकाओं, बीज AD293 कोशिकाओं पर 20 के लिए ४० 15-मुख्यमंत्री व्यंजन और बनाए रखने में DMEM 10% FBS और 1% कलम-Strep के साथ पूरक तक पहुंचने तक ~ ९०% अभिकर्मक के लिए प्रवाह ।
  2. पतला 3 plasmids विथ २०० µ l कम सीरम मीडियम (प्रति डिश): 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (आरएच. 74 या अन्य serotypes) और 3) कुल 5 µ माम के pX601-i20 और pX601-i23 मिश्रण (1:1 अनुपात) । प्रदर्शन polyethylenimine (पी) ८० µ एल बेई के साथ मिश्रण और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी से अभिकर्मक । एक dropwise तरीके से AD293 सेल संस्कृतियों पर मिश्रण जोड़ें ।
  3. AAV वायरस उत्पादन के लिए, ७२ एच पोस्ट अभिकर्मक के बाद, एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए दोनों मीडिया और AD293 सेल छर्रों में 10 मिनट के लिए ११०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा इकट्ठा ।
  4. 15 मिलीलीटर rAAV lysis बफर में सेल छर्रों resuspend (५० mmol/एल Tris बेस, १५० mmol/l NaCl, पीएच ८.५) तरल नाइट्रोजन और एक ४२ ° c पानी स्नान में बारी मशीन के साथ 3 फ्रीज-गल चक्र द्वारा पीछा किया । यदि वे तुरंत संसाधित नहीं किया जा रहा है, तो भविष्य में संसाधन के लिए कक्ष lysates में-८० ° c संग्रहीत ।
  5. ०.४५-µm फ़िल्टर के साथ कल्चर मीडिया फ़िल्टर करें और 8% की अंतिम एकाग्रता के लिए २.५ मॉल/L NaCl में ४०% PEG8000 जोड़ें । 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण मशीन और 15 मिनट के लिए ११०० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. rAAV lysis बफर में छर्रों resuspend और २.३ कदम से सेल lysates के साथ गठबंधन, benzonase (५० U/एमएल) उपचार के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए ।
  7. benzonase-इलाज rAAV युक्त मिश्रण 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ११०० एक्स जी, और supernatant (कच्चे तेल की तैयारी rAAV) को बचाने के ।

3. rAAV शुद्धि और एकाग्रता

  1. ऊपर से नीचे के क्रम में एक ultracentrifuge ट्यूब में एक iodixanol ढाल पर क्रूड rAAV तैयारी लोड: क्रूड AAV lysate (~ 15 एमएल), 8 मिलीलीटर 15% iodixanol, 6 मिलीलीटर 25% iodixanol, 5 मिलीलीटर ४०% iodixanol, 5 मिलीलीटर ५८% iodixanol । 1x DPBS का उपयोग कर शीर्ष करने के लिए ट्यूब के शेष खाली मात्रा भरें ।
  2. 10 डिग्री सेल्सियस पर १२० मिनट के लिए एक ultracentrifuge रोटर में २३०,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक और ४०% ढाल एक 18 जी सुई के साथ rAAV कणों युक्त अंश के 3-4 मिलीलीटर इकट्ठा ।
  3. 1x DPBS के साथ rAAV कणों को पतला और केंद्रापसारक फिल्टर इकाई का उपयोग कर केंद्रापसारक (MWCO १०० केडीए) । 3-5 बार के लिए इस कदम को दोहराने और अंत में rAAV तैयारी ध्यान केंद्रित करने के लिए 300-500 µ l

4. rAAV Titering

  1. 2 µ एल केंद्रित rAAV से जीनोमिक डीएनए निकालें, इथेनॉल में 3 मीटर NaOAc के साथ हाला, और 20 µ एल ddH2में resuspend ।
  2. pX601 प्लाज्मिड के धारावाहिक कमजोर पड़ने से rAAV quantitation के लिए मानक वक्र प्राप्त करें: 1 x10 9, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 प्रतियां प्रत्येक 10 में µ l ddH2हे. पतला DNAase-स्वास्थ्यकर्मी rAAV 1:10, 1:50, 1:100 और 1:1000 के रूप में नमूने ।
  3. एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में निर्माता के निर्देश के अनुसार qPCR किट का उपयोग करके मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (qPCR) द्वारा rAAV titer निर्धारित करें: 1 µ l 10 µmol/l प्रत्येक प्राइमरी के (5 '-GGATTTCCAAGTCTCCACCC और 5 '-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ l 2x पीसीआर मास्टर मिक्स, 1 µ l पतला rAAV नमूने और 2 µ l ddH2हे. निंनलिखित सायक्लिंग मापदंडों के साथ प्रतिक्रिया भागो: ९५ ° c 3 मिनट, ४५ चक्र के [९५ ° c 5 सेकंड और ६१ ° c 20 सेकंड] ।

5. rAAVrh. 74 की नसों में और Intraperitoneal इंजेक्शन-CRISPR नवजात mdx/utrophin+/- चूहों में

  1. mdx/utrophin+/- माउस पिल्ले (दिन 3) 1 मिनट के लिए बर्फ पर रखकर, और फिर एक रेट्रो कक्षीय दृष्टिकोण या एक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से ५० µ एल प्रति माउस प्रणालीबद्ध में 1 x 1012 वायरल कणों के साथ प्रशासन ।
  2. चूहों को ठीक करने और उनके घर पिंजरों में वापस जगह की अनुमति दें । दस सप्ताह के बाद rAAV प्रशासन, euthanize ऊतक संग्रह के लिए2 जोखिम सह द्वारा चूहों ।
  3. जीनोमिक डीएनए और आरएनए निष्कर्षण के लिए स्नैप-फ्रीज ऊतकों, और तरल नाइट्रोजन में ठंडा isopentane का उपयोग cryosectioning के लिए इष्टतम काटने तापमान यौगिक के साथ ऊतकों फ्रीज करने के लिए ।

6. लक्ष्य जीन संपादन परिणामों का विश्लेषण

  1. जीनोमिक डीएनए पीसीआर विश्लेषण
    1. mdx/utrophin+/- चूहों के साथ या rAAV के बिना इलाज के दिल के ऊतकों से कुल जीनोमिक डीएनए को अलग ।
    2. पीसीआर विश्लेषण के लिए चरण १.१२ में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
  2. RT-पीसीआर dystrophin अभिव्यक्ति का विश्लेषण
    1. निर्माता के मैनुअल निंनलिखित आरएनए निष्कर्षण किट के साथ दिल के ऊतकों से कुल आरएनए निकालें ।
    2. रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करने के लिए, एक RNase मुक्त DNase के साथ कुल आरएनए पूर्व का इलाज और रिवर्स प्रतिलेखन किट के साथ पहली किनारा सीडीएनए संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में इलाज आरएनए के 5 µ जी का उपयोग करें.
    3. dystrophin सीडीएनए प्राइमरों के साथ dystrophin अभिव्यक्ति के आरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए रिवर्स प्रतिलेखन उत्पाद का प्रयोग करें: 5 '-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT और 5 '-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC ।
  3. qPCR विश्लेषण द्वारा जीन संपादन प्रभावकारिता का अनुमान
    1. मात्रात्मक RT-पीसीआर द्वारा जीन संपादन प्रभावकारिता का अनुमान एक्सॉन 22 की कमी का पता लगाने के लिए आगे प्राइमर (एक्सॉन 21): 5 '-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, और रिवर्स प्राइमर (एक्सॉन 23): 5 '-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT का उपयोग कर टेप युक्त । आगे प्राइमर के साथ एक संदर्भ जीन के रूप में Gapdh का प्रयोग करें: 5 '-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC और रिवर्स प्राइमर: 5 '-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT ।
    2. एक रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम में निर्माता के निर्देश के अनुसार qPCR किट का उपयोग करके मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (qPCR) चलाएं और 2-चरणीय प्रतिक्रिया शर्तें: ९५ ° c 3 min, ९५ ° c 5 सेकंड और ६१ ° c 30 सेकंड का ४५ चक्र ।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस dystrophin अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए धुंधला
    1. जमे हुए ऊतकों में कटौती 10 µm की मोटाई पर एक cryostat का उपयोग कर. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% paraformaldehyde के साथ जमे हुए वर्गों को ठीक करें ।
    2. पंजाब और समाधान अवरुद्ध (10% हार्स सीरम) 1 एच के लिए के साथ मशीन के साथ 2x धो लें ।
    3. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर, एंटी-dystrophin प्राथमिक एंटीबॉडी की मशीन ।
    4. पंजाब के साथ स्लाइड धो 3 x 5 मिनट और 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) के साथ गर्मी ।
    5. माउंट DAPI और एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के साथ बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड ।

7. T7E1 परख द्वारा बंद लक्ष्य विश्लेषण

  1. ऑनलाइन CRISPR डिज़ाइन उपकरणों जैसे कि < http://crispr.mit.edu>. का उपयोग करके संभावित ऑफ़-टार्गेट साइट्स का पूर्वानुमान लगाएं
  2. पीसीआर द्वारा शीर्ष 5-10 संभावित बंद लक्ष्य साइटों को कवर जीनोमिक क्षेत्रों बढ़ाना: जीनोमिक डीएनए २०० एनजी, 1 µ एल हाई-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़, 5 µ एल 10x पीसीआर बफर मिक्स, १.५ µ एल 10 µmol/एल साइट की विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमरों, ५० µ एल के लिए कुल मात्रा का समायोजन ddH2हे.
  3. ट्रो द्वारा पीसीआर उत्पादों भागो, निकालने और एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर डीएनए शुद्ध । spectrophotometers का उपयोग कर एकाग्रता को मापने ।
  4. denaturing द्वारा heteroduplex गठन को बढ़ावा देने और पुन: एनीलिंग एक पीसीआर साइकिल चालक का उपयोग कर २.१ बफर में धीरे शुद्ध amplicons । चरण १.२ में विस्तृत के रूप में समान सायकलिंग शर्तों का उपयोग करें ।
  5. ०.५ µ एल T7E1 एंजाइम के साथ ३७ ° c पर 30 मिनट के लिए पुनः annealed उत्पादों को पचाने, और 1-2% agarose जेल का उपयोग ट्रो द्वारा प्रतिक्रिया का विश्लेषण ।
    नोट: amplicons भी लक्षित गहरी अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।

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Representative Results

gRNAs की प्रभावकारिता लक्ष्य जीनोमिक डीएनए क्षेत्र को हटाने के लिए प्रेरित करने के लिए rAAV में vivo अध्ययन में पैकेजिंग से पहले सेल संस्कृतियों में मूल्यांकन किया जाना चाहिए । इस अंत करने के लिए, gRNAs और SaCas9-व्यक्त constructs C2C12 कोशिकाओं में electroporated थे और जीनोमिक डीएनए पीसीआर द्वारा लक्ष्य साइटों (चित्रा 1) पार्श्व प्राइमरों के साथ विश्लेषण किया गया था । ~ ५०० बीपी की एक पीसीआर उत्पाद जीनोमिक डीएनए के बड़े आकार के कारण नियंत्रण कोशिकाओं को एक बैंड नहीं उपज चाहिए, जबकि जीन संपादन से उत्पंन डीएनए जीनोमिक लक्ष्य के सफल विलोपन इंगित करता है ।

एक बार gRNAs की प्रभावकारिता सेल संस्कृतियों में पुष्टि की गई है, वे rAAVrh. 74 या अंय serotypes में पैक किया जा सकता है (जैसे AAV6, 8 या 9 के रूप में, सभी मजबूत हृदय जीन वितरण दिखा) plasmids कोशिकाओं में तीन अभिकर्मक सह AAV293 का उपयोग करके । हमने पाया है कि यह दो gRNAs के लिए दो व्यक्ति rAAV तैयारी बनाने के लिए आवश्यक नहीं है, इसके बजाय, हम एक समान दाढ़ अनुपात में दो gRNA constructs मिश्रित और एक एकल rAAV तैयारी का उत्पादन किया । rAAV वायरल कणों घनत्व ढाल ultracentrifugation और पवित्रता एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया गया था पृष्ठ का उपयोग कर शुद्ध थे । उच्च शुद्ध rAAV तैयारी केवल तीन कैप्सिड प्रोटीन VP1, VP2, और VP3, क्रमशः, एसडीएस पर-पृष्ठ के रूप में चित्र 2में दिखाया गया बैंड उपज होगा ।

शुद्ध rAAVrh. 74 वायरल कणों के दिन में इंजेक्शन थे 1-3 mdx की नवजात शिशुओं /utrophin+/- चूहों रेट्रो कक्षीय या intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से. हम दोनों तरीकों rAAVrh. 74-CRISPR के कार्डियक डिलीवरी के लिए अच्छी तरह से काम मिला । इंजेक्शन चूहों इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (चित्रा 3) द्वारा dystrophin अभिव्यक्ति के लिए उंर के 10 सप्ताह में विश्लेषण किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: C2C12 कोशिकाओं में SaCas9-मध्यस्थता जीन संपादन के लिए gRNAs के सत्यापन. इस प्रतिनिधि agarose जेल ट्रो ने जीनोमिक डीएनए के पीसीआर उत्पादों को electroporated C2C12 से निकालकर दिखाया और SaCas9 के बिना gRNAs/ तीर इंगित करता है पीसीआर उत्पाद जीन संपादन से हुई । Gapdh एक संदर्भ के रूप में कार्य किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एसडीएस द्वारा rAAVrh. 74 कणों का विश्लेषण-पृष्ठ । शुद्ध rAAVrh. 74 वायरल कणों एसडीएस पर चला-पृष्ठ तीन बैंड दिखाया, AAV के तीन कैप्सिड प्रोटीन, VP1 (८७ केडीए), VP2 (७२ केडीए) और VP3 (६२ केडीए), क्रमशः के लिए इसी । केवल इन 3 बैंड की उपस्थिति अंय सेलुलर प्रोटीन दूषित बिना rAAV तैयारी की उच्च शुद्धता को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: mdx/utrophin+/- चूहों से दिल के वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग 10 सप्ताह में AAV-SaCas9/gRNAs उपचार के बाद । प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों WT के हृदय वर्गों में dystrophin (लाल) और caveolin-3 (हरा) की अभिव्यक्ति दिखाया, mdx/utrophin+/- और mdx/utrophin+/- चूहों 1 एक्स 1012 वी. के साथ इलाज किया AAV-SaCas9/gRNA प्रणालीबद्ध. DAPI को नाभिक (नीला) लेबल किया जाता था. स्केल बार: १०० µm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से सभी आवश्यक कदम जन्मोत्तर चूहों में vivo कार्डियक जीन संपादन में प्राप्त करने के लिए rAAVrh का उपयोग कर. 74-SaCas9 और दो gRNAs की मध्यस्थता प्रसव । जैसा कि पहले उल्लेख किया, इस दृष्टिकोण के रूप में हमारे काम27में वर्णित अपक्षयी चूहों में dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी की लंबी प्रक्रिया के बिना चूहों में हृदय संबंधी जीन के तेजी से रिवर्स आनुवंशिकी अध्ययन सक्षम हो सकता है पारंपरिक नॉकआउट दृष्टिकोण उत्पंन करने के लिए और पीटा माउस मॉडल नस्ल ।

आदेश में उच्च जीन संपादन क्षमता को लक्ष्य ऊतक में प्राप्त करने के लिए, वहां कई महत्वपूर्ण कदम को ध्यान में रखना: 1) SaCas9/gRNA की प्रभावकारिता को लक्षित जीनोमिक डीएनए के विलोपन प्रेरित करने के लिए उपयुक्त सेल लाइनों का उपयोग कर पुष्टि की जरूरत है; 2) यह बहुत एक उचित AAV सीरोटाइप कि लक्ष्य ऊतक में जीन transduction के एक उच्च स्तर मध्यस्थता कर सकते है और 3 का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है) वांछित ऊतक को जीन हस्तांतरण के लिए AAV वैक्टर के इष्टतम वितरण मार्ग निर्धारित करते हैं ।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, डिजाइन SaCas9/gRNAs AAVrh. 74 में बजाय पहले की सूचना दी AAV8 और AAV9 को संपादित Dmd जीन12,28में पैक किया गया । AAVrh. 74 प्रदर्श के बारे में ९३% समरूपता29 AAV8 करने के लिए और गैर रोगजनक और प्रभावी अलग अंग प्रसव29,30,31के बाद transducing कंकाल मांसपेशी में दिखाया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम हृदय जीन स्थानांतरण के लिए नवजात चूहों में रेट्रो कक्षीय और आरएच. 74 के intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग करें । हमने पाया है कि rAAVrh. 74 के neonate प्रशासन अत्यधिक rAAVrh. 74 (1 x 1012 वी. पी.) की एक उच्च खुराक प्राप्त चूहों में cardiomyocytes के बारे में 30-40% में dystrophin अभिव्यक्ति की बहाली के लिए कुशल है । दिलचस्प है, हमने पाया कि कंकाल की मांसपेशी dystrophin अभिव्यक्ति प्रभावी ढंग से बचाया नहीं था । यह आरएच. 74 सीरोटाइप के कम कंकाल मांसपेशी tropism के कारण की संभावना है जब नसों या intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित, हालांकि पिछले अध्ययनों से पता चला है कि rAAVrh. 74 के अलग अंग वितरण प्रभावी ढंग से transduce माउस और बंदर कंकाल कर सकते है बलवान२९,३०,३१. इसके अलावा, जब rAAVrh. 74 वयस्क चूहों में प्रशासित किया गया था, हम dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने में बहुत कम दक्षता मनाया । यह सबसे अधिक dystrophin बचाव को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है जो न्यूनतम खुराक का निर्धारण करने के लिए दिलचस्प होगा । इसके अलावा, अंय serotypes और वितरण तरीकों का परीक्षण किया जा सकता है और इष्टतम हृदय जीन संपादन प्राप्त करने के लिए तुलना में ।

एक बड़े जीनोमिक डीएनए टुकड़ा के सफल विलोपन दो gRNAs के एक साथ वितरण की आवश्यकता है । हमने पाया कि दो gRNAs देने के लिए दो अलग rAAV तैयार करना जरूरी नहीं है. इस प्रोटोकॉल में, हम बस rAAV उत्पादन के लिए अभिकर्मक के दौरान एक बराबर राशि में दो gRNA plasmids मिलाया, और rAAV के इस संयुक्त उत्पादन दोनों gRNAs देने में प्रभावी होना पाया गया । इस संयुक्त दृष्टिकोण है, इसलिए, लागत और श्रम की बचत और सिफारिश की जब दो gRNAs के एक साथ वितरण की आवश्यकता है ।

कई मामलों में, जब एक अच्छा एंटीबॉडी लक्ष्य जीन उत्पाद के लिए उपलब्ध नहीं है आनुवंशिक दृष्टिकोण से जीन संपादन क्षमता का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो सकता है । हालांकि, यह तकनीकी रूप से सही जीन संपादन उत्पादों लक्ष्य अनुक्रम विलोपन, लक्ष्य अनुक्रम उलटा शामिल होगा के बाद से एक ही लोकस लक्ष्यीकरण gRNAs के साथ जीन संपादन प्रभावकारिता यों तो चुनौतीपूर्ण है, और छोटे indels केवल एक ही लक्ष्य पर साइट. इसके बजाय, यह और अधिक सार्थक और संभव हमारे मामले में के रूप में वांछित लक्षित अनुक्रम विलोपन की दक्षता यों तो है, जहां exons 21-23 युक्त टेप की कमी वास्तविक समय आर टी-पीसीआर द्वारा quantified जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम भी T7E1 परख और गणना की भविष्यवाणी के उपयोग के लिए संभावित बंद लक्ष्य गतिविधि का विश्लेषण का वर्णन । परख के लिए अच्छी तरह से काम करने के लिए, यह एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, यह हमेशा एक अच्छा विचार है एक नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग के लिए तैयार करने के लिए (उदाहरण के लिए नियंत्रण डीएनए उत्पादों से प्रवर्धित कोशिकाओं/ऊतकों जीन संपादन के बिना, और परीक्षण के नमूनों के रूप में उसी तरह इलाज) और एक सकारात्मक नियंत्रण प्रयोग (उदाहरण के साथ एक ज्ञात नमूना अच्छी तरह से जीन संपादन विशेषता) । हालांकि, यह ध्यान दें की है कि T7E1 परख का पता लगाने की सीमा के बारे में 5%३२है, और इस प्रकार यह T7E1 परख द्वारा detectable नहीं हो सकता है अगर बंद लक्ष्य गतिविधि 5% से नीचे है । गाइड-seq३३ SaCas9/gRNA-मध्यस्थता जीन संपादन के बंद लक्ष्य गतिविधि का विश्लेषण unbiasedly के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । T7E1 परख, गणना की भविष्यवाणी और/या गाइड से लक्ष्य साइटों की पहचान-seq दृष्टिकोण आगे indel आवृत्तियों उच्च प्रवाह अनुक्रमण द्वारा vivo जीन संपादन में निंनलिखित के लिए quantified जा सकता है ।

एक साथ ले लिया, हम एक अनुकूलित कार्डियक जीन संपादन दृष्टिकोण rAAVrh. 74 का उपयोग प्रदान की है । इस स्थापित प्रोटोकॉल आगे चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए परीक्षण किया जा सकता है और आनुवंशिक अध्ययन रिवर्स ।

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Disclosures

हितों का कोई विरोध मौजूद नहीं है ।

Acknowledgments

R.H. हमें स्वास्थ्य अनुदान (R01HL116546 और R01 AR064241) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A-21428
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bio Safety Cabinets Thermo Fisher Scientific 1347 1300 Series A2 Class II, Type A2
BsaI New England BioLabs Inc RO535S
Competent cells Agilent Technologies 200314
Cell culture dishes, 150mm Nest Scientific USA 715001
Cryostat Leica Biosystems Leica CM3050S
DMEM Thermo Fisher Scientific MT10017CV Corning cellgro
Dystrophin antibody Spring Bioscience E2660
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits IBI Scientific IB47111
FBS Thermo Fisher Scientific 26-140-079
Filter Unit, 0.45μm Thermo Fisher Scientific 166-0045
GoTaq Master Mixes Promega M7122
High-speed plasmid mini kit IBI Scientific IB47102
Horse serum Abcam ab139501
Isotemp 2239 Water Bath Thermo Fisher Scientific 15-460-11Q
Isotemp Heat Block Thermo Fisher Scientific 11-718
Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC LSM 780
LightCycler 480 instrument Roche 5015243001 LightCycler 480 Instrument II
Large Capacity Centrifuge Thermo Fisher Scientific 46-910 Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002445 Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop spectrophotometers Thermo Scientific ND2000CLAPTOP NanoDrop™ 2000/2000c
Oligos for i20-F Integrated DNA Technologies CACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
Oligos for i20-R Integrated DNA Technologies AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligos for i23-F Integrated DNA Technologies CACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
Oligos for i23-R Integrated DNA Technologies GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
Oligos Integrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250ML
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 31985070
PEG8000 Sigma-Aldrich 89510-1kg-F
Polyethylenimine Polysciences 23966
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308
Quick-Seal centrifuge tube Beckman Coulter Inc 342414
QIAquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits Alkali Scientific QS2005
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific K1691
Rotor Beckman Coulter Inc 337922 Type 70Ti
T4 DNA ligase New England BioLabs Inc M0202S
Thermal Cycler Bio-rad 1861096
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc 8043-30-1192 Optima le-80k
Ultra centrifugal filter unit MilliporeSigma UFC510096
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories, Inc H-1200

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Xu, L., Gao, Y., Lau, Y. S., Han, R. Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice. J. Vis. Exp. (138), e57560, doi:10.3791/57560 (2018).

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