Summary
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll att utföra i vivo redigering hjärt genen i möss med rekombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-medierad leverans av CRISPR. Detta protokoll erbjuder en lovande terapeutisk strategi för att behandla dystrofa kardiomyopati Duchennes muskeldystrofi och kan användas för att generera hjärt-specifika knockout i postnatal möss.
Abstract
Klustrade regelbundet mellanliggande, kort, palindromic upprepa (CRISPR) systemet har underlättat genomet engineering i både odlade celler och levande organismer från en mängd olika arter. Den CRISPR-teknologin har också undersökts som romanen therapeutics för ett antal sjukdomar. Proof-of-concept data är mycket uppmuntrande som exemplifieras av senaste studier som visar för genomförbarhet och effekten av genen redigering-baserade behandlingsmetoder för Duchennes muskeldystrofi (DMD) använder en murin modell. I synnerhet har intravenös och intraperitoneal injektion av den rekombinanta adeno-associerade virus (rAAV) serotyp rh.74 (rAAVrh.74) möjliggjort effektiv hjärt leverans av Staphylococcus aureus CRISPR-associerade protein 9 (SaCas9) och två Guide RNAs (gärna) om du vill radera en genomisk region med en mutant kodon i exon 23 av mus Dmd -genen. Denna samma strategi kan också användas för att slå ut den gen-of-intressen och studera deras hjärtfunktion hos postnatal möss när gärna är utformade för att rikta den kodande regionen av genen. I detta protokoll visar vi i detalj hur man ingenjör rAAVrh.74-CRISPR vektor och hur man kan uppnå mycket effektiv hjärt leverans hos neonatala möss.
Introduction
Klustrade, regelbundet mellanliggande, kort palindromic upprepa (CRISPR) tekniken representerar den senaste utvecklingen i genomet engineering och har revolutionerat nuvarande praxis i genetik i celler och organismer. CRISPR-baserade gen editering använder en enda guide RNA (gärna) för direkt en CRISPR-associerade Amiiiiin såsom CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) och Cpf1 till måltavla för genomisk DNA som är ett komplement i sekvens till protospacer kodas av gärna med en specifika protospacer angränsande motiv (PAM)1,2. PAM varierar beroende på bakteriearter av Cas9 eller Cpf1 genen. Den vanligaste Cas9 nuclease härrör från Streptococcus pyogenes (SpCas9) erkänner en PAM sekvens av NGG som finns direkt efter målet sekvensen i genomisk DNA, på det målarter strand. På målplatsen generera Cas9 och Cpf1 proteinerna en dubbel-strand paus (DSB), som sedan repareras via inneboende cellulär DNA reparationsmekanismer, inklusive icke-homolog slutet att gå (NHEJ) och homologi-regisserad reparation (HDR) vägar3, 4. I avsaknad av en DNA mall för homolog rekombination repareras DSB primärt av felbenägna NHEJ vägen, vilket kan resultera i infogningar och borttagningar (indels) av nukleotider som orsakar frameshift mutationer om DSB skapades i kodning regionen en gen5,6. Således, CRISPR systemet har använts till ingenjör förlust-av-funktion mutationer i olika cellulära modeller och hela organismer, för att undersöka funktionen av en gen. Dessutom de katalytiskt inaktiva Cas9 och Cpf1 har utvecklats för att transcriptionally och modulera epigenetiskt uttrycket av mål gener7,8.
Mer nyligen, både SpCas9 och SaCas9 (härlett från Staphylococcus aureus) har förpackats i rekombinant adeno-associerade (rAAV) virusvektorer vid postnatal gen korrigering i en djurmodell av mänskliga sjukdomar, särskilt, Duchennes muskeldystrofi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD är en dödlig X-bunden recessiv sjukdom orsakas av mutationer i genen DMD , som kodar dystrofin protein16,17, som drabbar ungefär en i 3500 manliga födda enligt nyfödda screening18 , 19. den kännetecknas av progressiv muskelsvaghet och slöseri. DMD patienter förlora brukar förmågan att gå mellan 10 och 12 år och dör av respiratoriska och kardiella misslyckande av 20-30 år20år. Särskilt, kardiomyopati framkallar i > 90% av DMD patienter och representerar ledande orsaka död i DMD patienter21,22. Även om Deflazacort (en anti-inflammation läkemedel) och Eteplirsen (en exon hoppa medicin för att hoppa exon 51) har nyligen godkänts för DMD av Food and Drug Administration (FDA)23,24, ingen av dessa behandlingar korrigera den genetiska defekten på genomisk DNA-nivå. MDX-musen, som bär en punktmutation på exon 23 i dystrofingenen, har använts som en DMD modell25. Dessutom har vi tidigare visat att uttrycket funktionella dystrofin restaurerades av i-ram radering av genomisk DNA som omfattar exonerna 21, 22 och 23 i skelettmuskulaturen mdx möss med intramuskulär Ad-SpCas9/gärna leverans9 , och i hjärtat musklerna i mdx/utrophin+ / möss med intravenös och intraperitoneal rAAVrh.74-SaCas9/gärna leverans26.
I detta protokoll beskriver vi i detalj varje steg i postnatal hjärt gen redigering om du vill återställa dystrofin i mdx/utrophin+ / möss med rAAVrh.74-SaCas9/gärna vektorer, gärna design till dystrofin analys i avsnitten hjärtat muskler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De djur som används i detta protokoll upprätthölls på The Ohio State University laboratorium djur resurser i enlighet med riktlinjer för användning av djur. Alla djurstudier bemyndigades av institutionella Animal Care, användning och granskningskommittén av Ohio State University.
1. design och kloning av gRNAs i den CRISPR vektor
- Välj 2 gRNAs inriktning dystrofin intron 20 och intron 23 (i20 och i23) för SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT och i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM sekvensen är understruket och kursiv).
Obs: De mål platserna för i20 och i23 är ca 23 kilo baspar (kbp) bort. För att störa en kodning gen, två gRNAs inriktning de gemensamma exonerna med NNGRRT PAM sekvens för SaCas9 (helst NNGAAT, NNGGGT och NNGAGT) och avstånd inom 20 kbp rekommenderas. - Använd följande PCR parametrar för att glödga den gärna oligos (100 µmol/L) 1 x glödgning buffert (5 x glödgning buffertlagret innehåller 0,5 mol/L K-acetat, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetat, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 cykler av 95 till 59 ° C med en 0,4 ° C minskar cykel för 20 s, 90 cykler av 59 till 32 ° C med en 0,3 ° C minskning per cykel för 20 s, 20 cykler av 32-26 ° C med en 0,3 ° C minskning per cykel för 20 s.
- Ligera av glödgad gärna oligos in pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA med BsaI och T4 DNA-ligase i en reaktion (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µL glödgas oligos, 1,5 µL 10 x T4 DNA ligase buffert, 0,5 µL T4 DNA-ligase 1 µL BsaI, 10 µL ddH2O ), med följande reaktion villkor i en PCR-apparat: 5 cykler av [37 ° C 5 min och 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.
- Omvandla 15 µL ligering produkten till 30 µL behöriga celler, platta celler i agarplatta med 100 µg/mL Ampicillin och kultur vid 37 ° C under 24 h.
- Plocka upp 5-10 kolonier och kultur i LB medium innehållande 100 µg/mL Ampicillin vid 37 ° C, 250 rpm i en shaker inkubator för 3-4 h.
- Skärmen kolonierna av PCR: 10 µL 2 x PCR master mix 8 µL ddH2O 1 µL E. Coli kultur, 1 µL 10 µmol/L U6-forward primer, 1 µL i20 eller i23 gärna reverse primer. De PCR-cykliska parametrarna: 95 ° C 5 min, 35 cykler av 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
- Förbereda 5 mL kultur positiva kloner genom att lägga till 4 mL färsk LB medium containing100 µg/mL Ampicillin och kultur över natten vid 37 ° C, 250 rpm.
- Rena plasmiden DNA med hjälp av lämpliga plasmid utvinning kit och verifierar plasmiden av Sanger sekvensering med U6-forward primer.
- Kultur C2C12 celler DMEM kompletteras med 10% FBS och 1% penna-Strep tills de når ~ 70% konfluens för testning genen redigering effekt av plasmidsna.
- Electroporate sammanlagt 5 µg SaCas9/gärna plasmid blandningen i 1:1 molar förhållandet till 1 x 106 C2C12 celler enligt tillverkarens protokollet.
- Efter 48 h efter transfection, skörda C2C12 cellerna och extrahera genomiskt DNA.
- Använd 100 ng genomiskt DNA som mall för att utföra en PCR-reaktion för mus dystrofin locus: vidarebefordra primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), reverse primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x Grön PCR master mix, 7 µL ddH2O, 1 µL genomisk DNA ( 100 ng). Använda PCR cykling villkor som 95 ° C 5 min, 35 cykler av [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.
2. rAAV produktion
- För att odla cellerna, utsäde AD293 celler på 20 till 40 15-cm rätter och underhålla i DMEM kompletteras med 10% FBS och 1% penna-Strep tills de når ~ 90% konfluens för transfection.
- Späd 3 plasmider med 200 µL minskat serum medium (per maträtt): 1) 10 µg pHelper; (2) 5 µg pXR (rh.74 eller andra serotyper) och 3) totalt 5 µg av pX601-i20 och pX601-i23 blandning (förhållandet 1:1). Utföra polyethylenimine (PEI) transfection genom att blanda med 80 µL PEI och inkubera i rumstemperatur i 10 min. Lägg blandningen på AD293 cellkulturer i ett droppvis sätt.
- AAV-virus produktion, efter 72 h post transfection, använda en cell-skrapa för att samla både media och AD293 cell pellets genom centrifugering vid 1100 x g i 10 minuter.
- Återsuspendera cell pellets i 15 mL rAAV lyseringsbuffert (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) följt av 3 frysning-tining cykler med omväxlande inkubation i flytande kväve och 42 ° C vattenbad. Lagra i cell lysates i-80 ° C för framtida bearbetning om de inte bearbetas omedelbart.
- Filtrera kultur media med 0,45 µm filter och Lägg en 40% PEG8000 i 2,5 mol/L NaCl till en slutlig koncentration på 8%. Inkubera blandningen vid 4 ° C för 1 h och centrifugera vid 1100 x g i 15 min.
- Återsuspendera pellets i rAAV lyseringsbuffert och kombinera med det cell lysates från steg 2,3, följt av bensonas (50 U/mL) behandling vid 37 ° C i 1 h.
- Centrifugera det bensonas-behandlade rAAV innehållande blandning 1100 x g under 15 minuter vid 4 ° C och spara supernatanten (rå rAAV preparatet).
3. rAAV rening och koncentration
- Ladda rå rAAV preparatet på en iodixanol lutning i en ultracentrifugen rör i följande ordning från toppen till botten: rå AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5 mL 40% Iodixanol, 5 mL 58% Iodixanol. Fyll återstående tom mängd röret till toppen med 1 x DPBS.
- Centrifugera proverna på 230 000 x g i en ultracentrifugen rotor för 120 min vid 10 ° C och samla 3-4 mL av 40% lutning fraktionen innehåller rAAV partiklarna med en 18 G nål.
- Späd rAAV partiklarna med 1 x DPBS och centrifug med centrifugal filterenheten (MWCO 100 kDa). Upprepa detta steg för 3 - 5 gånger och äntligen koncentrera rAAV förberedelsen till 300-500 µL.
4. rAAV patientserumprov
- Extrahera den genomiskt DNA från 2 µL koncentrerad rAAV, fällning med 3 M NaOAc i etanol och återsuspendera i 20 µL ddH2O.
- Erhålla standardkurvan för rAAV kvantitering av seriell utspädning av pX601 plasmiden: 1 x 109, 1 x 108,1 x 1071 x 10,6, 1 x 105 kopior i varje 10 µL ddH2O. Dilute den DNAase-behandlade rAAV prover som 1:10, 1:50, 1: 100 och 1: 1000.
- Bestämma rAAV titer av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) med qPCR Kit enligt tillverkarens anvisning i en Real-Time PCR system: 1 µL 10 µmol/L för varje grundfärg (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC och 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x PCR master mix, 1 µL utspädd rAAV prover och 2 µL ddH2O. kör reaktionen med följande cykel parametrar: 95 ° C 3 min, 45 cykler av [95 ° C 5 sec och 61 ° C 20 sec].
5. intravenös och Intraperitoneal injektion av rAAVrh.74-CRISPR till Neonatal mdx/utrophin+ / möss
- Immobilisera de mdx/utrophin+/- musungar (dag 3) genom att placera på is för 1 min, och sedan administrera med 1 x 1012 viruspartiklar i 50 µL per mus systemiskt via en retro-orbital strategi eller en intraperitoneal injektion.
- Låta mössen att återhämta sig och placera tillbaka till sina hem burar. Tio veckor efter rAAV administration, eutanasi möss av CO2 exponering för vävnad samling.
- Snapin-frysa vävnader för genomisk DNA och RNA extraktion och användning kylning isopentan i flytande kväve att frysa vävnader med optimal skärtemperatur förening för kryosnitt.
6. analys av målgenen redigering utfall
-
Genomiskt DNA PCR-analys
- Isolera den totala genomiskt DNA från hjärtat vävnader av mdx/utrophin+ / möss som behandlats med eller utan rAAV.
- Använda samma protokoll i steg 1.12 för PCR-analys.
-
RT-PCR-analys av dystrofin uttryck
- Extrahera total-RNA från hjärtat vävnader med RNA extraktion kit efter tillverkarens handbok.
- För att utföra omvänd Transkription, förbehandla den total-RNA med en RNase-fri DNAS och använder 5 µg behandlade RNA som mall för första-strand cDNA syntes med omvänd Transkription kit.
- Använda omvänd Transkription för RT-PCR-analys av dystrofin uttryck med dystrofin cDNA primers: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT och 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
Uppskatta den genen redigering effekt av qPCR-analys
- Uppskatta den genen redigering effekt av kvantitativ RT-PCR att upptäcka minskning av exon 22-innehållande avskrifter med framåt primern (exon 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, och den reverse primern (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Använda Gapdh som en referens gen med forward primer: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC och reverse primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- Kör den kvantitativ realtids-PCR (qPCR) med hjälp av qPCR Kit enligt tillverkarens anvisning i en Real-Time PCR system och 2-stegs reaktion villkor: 95 ° C 3 min, 45 cykler av 95 ° C 5 SEK och 61 ° C 30 SEK.
-
Immunofluorescens färgning för att analysera dystrofin uttryck
- Skär de frysta vävnader med hjälp av en kryostat med en tjocklek på 10 µm. Fix fryst avsnitten med 4% PARAFORMALDEHYD i rumstemperatur i 15 min.
- Tvätta 2 x med PBS och inkubera med blockering lösning (10% häst serum) för 1 h.
- Inkubera i anti-dystrofin primär antikropp, vid 4 ° C över natten.
- Tvätta i bilderna med PBS 3 x 5 min och inkubera med fluorescerande sekundära antikroppar (1: 500) i rumstemperatur i 1 h.
- Montera bilderna använder monteringsmedium med DAPI och imaging med en inverterad confocal Mikroskop.
7. off-target analys av T7E1 assay
- Förutsäga potentiella off-target webbplatser som använder den online CRISPR design verktyg såsom < http://crispr.mit.edu>.
- Förstärka genomisk regionerna som täcker toppen 5-10 potentiella off-target platser med PCR: genomisk DNA 200 ng, 1 µL HiFi-DNA-polymeras, 5 µL 10 x PCR Buffer mix, 1,5 µL 10 µmol/L av platsspecifika framåt och bakåt primers, justera den totala volymen till 50 µL med ddH2O.
- Köra PCR-produkterna genom elektrofores, extrahera och rena DNA med en gel utvinning kit. Mätning av koncentrationen som använder spektrofotometrar.
- Främja heteroduplex bildandet av denaturering och åter glödgning den renade amplikoner långsamt i buffert 2.1 med hjälp av en PCR-apparat. Använd samma cykling villkor som beskrivs i steg 1.2.
- Smälta de åter glödgad produkterna under 30 minuter vid 37 ° C med 0,5 µL T7E1 enzym och analysera reaktionen genom elektrofores med 1-2% agarosgel.
Obs: Amplikoner kan också analyseras genom riktade djupsekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av gRNAs att framkalla strykningen av målregionen genomisk DNA bör utvärderas i cellodlingar innan förpackningen till rAAV för in vivo-studier. För detta ändamål, den gRNAs och SaCas9-uttryckande konstruktioner var electroporated i C2C12 celler och genomisk DNA var analyseras med PCR med primers flankerande mål webbplatser (figur 1). En PCR produkt av ~ 500 bp indikerar framgångsrika radering av målet genomisk DNA följd gen redigering medan kontroll cellerna inte bör ge ett band på grund av den stora storleken av genomisk DNA.
När effekten av gRNAs har bekräftats i cellkulturer, kan de paketeras i rAAVrh.74 eller andra serotyper (såsom AAV6, 8 eller 9, alla visar robust hjärt gen leverans) med hjälp av de tre plasmider samtidig transfection i AAV293 celler. Vi hittade att det är inte nödvändigt att göra två enskilda rAAV förberedelse för de två gRNAs, istället, vi blandade två gärna konstruktioner i en lika molar förhållandet och producerat en enda rAAV beredning. RAAV viral partiklarna var renas med hjälp av täthet lutning ultracentrifugering och renhet analyserades av SDS-PAGE. Högrenade rAAV preparatet skulle ge endast tre band motsvarande kapsid proteiner VP1, VP2 och VP3, respektive, på SDS-PAGE som visas i figur 2.
De renade rAAVrh.74 viruspartiklarna skulle injiceras i dag 1-3 nyfödda mdx/utrophin+ / möss via retro-orbital eller intraperitoneal injektion. Vi hittade båda metoder som fungerat bra för hjärt leverans av den rAAVrh.74-CRISPR. Injicerade mössen kan analyseras för dystrofin uttryck genom immunofluorescens färgning (figur 3) vid 10 veckors ålder.
Figur 1: validering av gRNAs för SaCas9-medierad gen redigering i C2C12 celler. Representativa agaros gel-elektrofores visade PCR produkter från genomiskt DNA extraheras från electroporated C2C12 med eller utan SaCas9/gRNAs. Pilen anger PCR-produkten resulterade från gen redigering. GAPDH serveras som referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av rAAVrh.74 partiklar av SDS-PAGE. Renade rAAVrh.74 viruspartiklar kör på SDS-PAGE visade tre band, motsvarar de tre kapsid proteinerna av AAV, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) och VP3 (62 kDa), respektive. Förekomsten av bara dessa 3 band indikerar hög renhet av rAAV preparatet utan att förorena andra cellulära proteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunofluorescens färgning av avsnitten hjärtat från mdx/utrophin+ / möss på 10 veckor efter behandling med AAV-SaCas9/gRNAs. Representativa immunofluorescens bilderna visade uttrycket av dystrofin (röd) och caveolin-3 (grön) i avsnitten hjärtat på WT, mdx/utrophin+/- och mdx/utrophin+ / möss behandlades med 1 x 1012 vg AAV-SaCas9/gärna systemiskt. DAPI användes att märka atomkärnor (blå). Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll detalj vi alla stegen för att uppnå i vivo hjärt gen redigering i postnatal möss med rAAVrh.74-medierad leverans av SaCas9 och två gRNAs. Som tidigare nämnts, detta tillvägagångssätt kan användas för att återställa dystrofin uttryck i dystrofa möss som beskrivs i vårt arbete27, men det kan även aktivera snabb omvänd genetik studier av hjärt-relaterade gener hos möss utan den utdragna processen för den traditionella knockout metod att generera och ras knockout musmodeller.
För att uppnå hög gen redigering effektivitet i målvävnaden, finns det flera kritiska steg att tänka: 1) effekten av den SaCas9/gärna att inducera strykningen av riktade genomiskt DNA behöver valideras med lämpliga cellinjer; 2) är det mycket viktigt att välja en ordentlig AAV serotyp som kan medla en hög nivå av genen transduktion i målvävnaden och 3) fastställa optimal leverans rutten av AAV vektorer för genöverföring till önskad vävnad.
I det nuvarande protokollet, de designade SaCas9/gRNAs var förpackade i AAVrh.74 snarare än tidigare rapporterade AAV8 och AAV9 för att redigera Dmd gen12,28. AAVrh.74 uppvisar ca 93% homologi AAV829 och har visat sig icke-patogena och effektiva i transducing skelettmuskulaturen följande isolerade extremiteter leverans29,30,31. I detta protokoll använder vi retro-orbital och intraperitoneal injektion av rh.74 i neonatala möss för hjärt genöverföring. Vi hittade att nyfödda administrationen av rAAVrh.74 är mycket effektiv för restaurering av dystrofin uttryck i ca 30-40% av hjärtmuskelceller i möss som får en hög dos av rAAVrh.74 (1 x 1012 vg). Intressant nog fann vi att skelettmuskulaturen dystrofin uttrycket inte effektivt räddades. Detta beror sannolikt på den låga skelettmuskulaturen tropism av rh.74 serotyp när det administreras via intravenös eller intraperitoneal injektion, även om tidigare studier visade att isolerade lem leverans av rAAVrh.74 effektivt kan transduce mus och apa skelett muskel29,30,31. Också, när rAAVrh.74 administrerades till vuxna möss, vi observerade mycket låg effektivitet i att återställa dystrofin uttryck. Det vore intressant att bestämma den minsta dos som krävs för att uppnå högsta dystrofin undsättning. Dessutom kan andra serotyper och leveransmetoder testas och jämfört för att uppnå optimal hjärt gen redigering.
Framgångsrika radering av en stor genomisk DNA-bit kräver samtidig leverans av två gRNAs. Vi hittade att det inte är nödvändigt att göra två separata rAAV förberedelser för att leverera två gRNAs. Vi blandade helt enkelt de två gärna plasmidsna lika mycket under transfection för rAAV produktion i detta protokoll, och denna samproduktion av rAAV befanns vara effektivt i att leverera både gRNAs. Detta kombinerat tillvägagångssätt är därför kostnaden - och arbetsbesparande och rekommenderas när samtidig leverans av två gRNAs krävs.
I många fall kan det vara nödvändigt att analysera den genen redigering effektivitet genom genetiska metoder när en bra antikropp inte är tillgänglig för produktens mål genen. Det är dock tekniskt utmanande att exakt kvantifiera genen redigering effekt med två gRNAs inriktning i samma locus eftersom genen redigering produkterna skulle innehålla mål sekvens radering, target sekvens inversion och små indels vid endast en target webbplats. Istället är det mer meningsfullt och möjligt att kvantifiera effektiviteten i önskad riktade sekvens strykningen som i vårt fall där minskning av avskrifter som innehåller exoner 21-23 kan kvantifieras med real-time RT-PCR.
I detta protokoll beskriver vi också användningen av T7E1 assay och computational förutsägelse att analysera potentiella off-aktiviteten. För analysen att fungera bra, är det nödvändigt att använda en HiFi-DNA-polymeras. Dessutom är det alltid en bra idé att förbereda för en negativ kontroll-experiment (e.g. DNA produkter amplifierats från cellerna/vävnaderna utan genen redigering och behandlas på samma sätt som proverna) och en positiv kontroll experiment (t.ex. en känd prov med välkarakteriserad gen redigering). Det är dock notera att detektionsgränsen för den T7E1 analysen är ungefär 5%32, och således det inte upptäckas av T7E1 analysen om off-aktiviteten är under 5%. GUIDE-seq33 kan användas för att analysera unbiasedly off-aktiviteten av SaCas9/gärna-medierad gen redigering. De identifiera off-target webbplatser från T7E1 assay, computational förutsägelse eller GUIDE-seq metoder kan ytterligare kvantifieras för ditsatta frekvenser efter i vivo gen redigering av hög genomströmning sekvensering.
Sammantaget har vi tillhandahållit en optimerad hjärt gen redigering metod med rAAVrh.74. Detta etablerat protokoll kan testas ytterligare för terapeutiska tillämpningar och omvänd genetiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen intressekonflikt föreligger.
Acknowledgments
R.H. stöds av amerikanska National Institutes of Health bidrag (R01HL116546 och R01 AR064241).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
