Summary
Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.
Abstract
Het doel van deze methode is te verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia verzameld uit losse, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). We hebben geconstateerd dat vijf stappen in de workflow die cruciaal zijn voor het verkrijgen van RNA isolaten van darmen ganglia met voldoende kwaliteit en kwantiteit voor RNA-seq. Ten eerste, bij de voorbereiding van intestinale weefsel, moet elk monster alle overtollige vloeistof verwijderd door bevlekken voorafgaand aan het sereus vlies zoveel mogelijk over de bodem van grote basis mallen afvlakken. Monsters zijn dan snel bevroren bovenop een gier van droogijs en 2-methylbutane. Ten tweede, wanneer afdelen van het weefsel, is het belangrijk om te cryomolds plaatsen, zodat de intestinale secties parallel het volledige vliegtuig van de plexus myenteric, waardoor de opbrengst van de grootste oppervlakte van darmen ganglia per dia. Derde, tijdens de LCM, polyethyleen napthalate (PEN)-membraan dia's bieden de grootste snelheid en flexibiliteit in het overzicht van de niet-uniforme vormen van darmen ganglia bij het verzamelen van darmen ganglia. Ten vierde, voor verschillende visualisatie van darmen ganglia binnen secties, ethanol-compatibele kleurstoffen, zoals Cresyl Violet, bieden uitstekende behoud van RNA integriteit ten opzichte van waterige kleurstoffen. Tot slot, voor de extractie van RNA van vastgelegde ganglia waargenomen we verschillen tussen commerciële RNA extractie kits die leverde superieure RNA hoeveelheid en kwaliteit, terwijl het elimineren van verontreiniging van het DNA. Optimalisatie van deze factoren in het huidige protocol sterk versnelt de workflow en levert darmen ganglia monsters met uitzonderlijke RNA kwaliteit en kwantiteit.
Introduction
Deze methode is ontworpen om kwalitatief hoogwaardige RNA monsters van darmen ganglia van menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM) krijgen. Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om te zorgen voor voldoende RNA kwaliteit en opbrengsten voor RNA sequencing (RNA-seq) en is bedoeld om te worden gebruikt met vers gereseceerd nietgefixeerde, flash-bevroren intestinale menselijk weefsel.
Functionele gastro-intestinale en gut motiliteit aandoeningen invloed op één van de vier mensen in de Verenigde Staten. De darmen zenuwstelsel (ENS), ook wel aangeduid als de tweede hersenen1, is vaak in het midden van deze aandoeningen, zoals het speelt een cruciale rol in de homeostase van de darm en beweeglijkheid. Manipulatie van de beweeglijkheid van de darm is over het algemeen beperkt tot chirurgische resectie van de aganglionic/noncontractile weefsel, chronische dieet wijziging en/of medicijnen. Verrassend, de volledige transcriptoom van de volwassen ENS moet nog worden sequenced, sterk beperken ons vermogen om te identificeren van moleculen binnen de ENS die kunnen worden gericht farmaceutisch of gebruikt in stamcel-therapieën.
Er zijn relatief weinig methoden voor het isoleren van RNA van menselijke darmen ganglia. De eerste benadering, cel dissociatie2, vereist hoge incubatie temperaturen en lange incubatie tijden; zowel waarvan bekend is dat de aantasting van het RNA bevorderen en veranderen van de transcriptome2,3. Een alternatieve benadering, LCM, meer betrouwbaar transcriptome bewaart en beschermt RNA integriteit. Hoewel verscheidene studies hebben LCM gebruikt voor het verzamelen van de ganglia van vers bevroren menselijk intestinale weefsel4,5,6, deze benaderingen of werden gehinderd door de slechte RNA kwaliteit en kwantiteit, waren heel arbeidsintensief is, of benodigde wijziging van kleuring of RNA extractie technieken aan het werk in onze handen. Andere LCM protocollen ontworpen voor het behoud van RNA die werden gevonden in LCM product handleidingen aanvullende verbeteringen7,8, maar aanpassing nodig was geboden wanneer toegepast op het isolement van de darmen ganglia8, 9. om deze redenen, ontwikkelden we een geoptimaliseerde protocol op basis van deze middelen dat aanzienlijke hoeveelheden van hoog-integriteit RNA van menselijke darmen ganglia oplevert, heeft een relatief snelle workflow en produceert consistente resultaten over een grote het aantal monsters.
In deze studie presenteren wij een synopsis van geoptimaliseerde procedures die het isolement van hoge-integriteit RNA van darmen ganglia afkomstig uit gereseceerd intestinale menselijk weefsel vergemakkelijken. Onze methode bevat vijf belangrijke aspecten. Eerste vers gereseceerd, nietgefixeerde menselijke intestinale monsters moeten worden ontdaan op maat, hebben alle overtollige vocht verwijderd met een weefsel van het laboratorium en afgevlakt in een grote basis mal vóór het flash-invriezen bovenop een gier van droogijs en 2-methylbutane (2-MB). Tweede, histologische secties van darm moeten bereid zijn te verkrijgen van het volledige vliegtuig van de plexus myenteric op een dia, met een grote lading van darmen ganglia. Succes met deze stap is grotendeels afhankelijk van het voorbereidingsproces van weefsel. Ten derde, de niet-uniforme structuur van ganglia in de ENS vereist het gebruik van polyethyleen napthalate (PEN) membraan dia's6, die de grootste snelheid en precisie tijdens het LCM bieden. Vierde, ethanol-compatibele kleurstoffen, zoals Cresyl Violet, moeten worden gebruikt om RNA integriteit behouden blijft terwijl kleuring darmen ganglia. Laatst, het RNA extractieproces is essentieel voor een succesvol resultaat met RNA-Seq. We getracht een RNA extractie benadering die produceert hoge RNA integriteit, maximaliseert RNA opbrengsten bij het starten met kleine collecties van darmen ganglia elimineert DNA besmetting en behoudt zo veel RNA soorten mogelijk.
Tezamen, optimalisatie van deze factoren in de huidige studie sterk versnelt de workflow en levert monsters van darmen ganglia met uitzonderlijke RNA kwantiteit en kwaliteit. Resultaten zijn grotendeels overeen onder een omvangrijke groep van monsters, met vermelding van de samenhang van deze aanpak. Verder, wij zijn gewend deze benaderingen met succes tientallen van RNA samples uit de darmen ganglia volgnummer. De strategieën die gemarkeerd hier kunnen ook in grote lijnen worden aangepast voor het uitvoeren van de LCM van gewenste ganglia of kernen van de perifere en centrale zenuwstelsel en andere gevallen waarin het isolement van kwalitatief hoogwaardige RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Vanderbilt Universiteit institutionele Review Board (IRB).
1. voorbereiding voor weefsel aankomst
- Juiste IRB goedkeuring te verkrijgen en te coördineren met menselijke orgaan donatie agentschappen te verkrijgen van vers gereseceerd, nietgefixeerde intestinale weefsel uit donoren die voldoen aan alle criteria van de onderzoek nodig zijn voor de studie.
Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met muizen en andere knaagdieren modellen.- Onmiddellijk na resectie van elk intestinale segment, spoel de lumen met gekoeld PBS of weefsel-opslagmedium te verwijderen van de resterende luminal materiaal of ontlasting.
- Na het spoelen en teruggooi van afval in een geschikte biohazard recipiënt, onderdompelen van het weefsel in een voldoende hoeveelheid weefsel-opslagmedium (zoals 3 - 5 maal het volume van intestinale weefsel) en op te slaan in individueel gelabelde, waterdichte plastic containers, ondergedompeld in ijs of gekoeld tot gebruik).
- Proces het weefsel binnen 18-26 uur vanaf het moment van collectie om te voorkomen dat aanzienlijke aantasting van het RNA.
Opmerking: Afhankelijk van de zuiverheid van de intestinale segment en de opslag, het mogelijk om onze voorgestelde termijn verlengen.
- Bereiden van alle materialen die nodig zijn voor menselijk weefsel collectie van tevoren, zoals aangegeven in dit protocol (Zie de Tabel van materialen voor meer gedetailleerde productinformatie). Zorg ervoor dat alle vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen wordt gedragen te allen tijde.
- Bereiden droogijs emmers samen met een droog ijs drijfmest zoals in Figuur 1.
- Crush voldoende droogijs om te vullen 4 standaard circulaire ijs-emmers en een rechthoekige ijsemmer. Een van de standaard emmers moeten kleine (11 x 21 cm) laboratorium weefsels geplaatst op het oppervlak van het droogijs. Gebruik, indien mogelijk, nieuwe, ongeopende dozen van laboratorium weefsels.
- Maak een droogijs drijfmest door powderizing 2 L van droog ijs in een schone rechthoekige ijsemmer.
- Tel vooraf gekoelde 2-MB tot het oppervlak van het droogijs. Iets mengen en afvlakken van de drijfmest met behulp van een pipet tip vak cover oppervlak van de vorm van de drijfmest in een kanaal omgeven door grotere brokken van droogijs langs de zijkanten van de rechthoekige emmer.
- Plaats meerdere dunne tekstblokken droogijs langs de randen van de ijsemmer ter bevordering van een snellere bevriezing. Er moet ruimte voor ≥4 basis mallen losjes in de droogijs drijfmest emmer past op een bepaald moment.
- Stapel de ijsemmer binnen een ander rechthoekig ijsemmer gevuld optioneel, ¼ met droogijs. Deze positionering helpt beter isoleren de droogijs drijfmest en voorkomt de noodzaak van regelmatige aanpassingen van droogijs en 2-MB tijdens de procedure.
- Positie van de droog-ijs-emmers in een assemblagelijn in de volgende volgorde: 1) droge drijfmest ijsemmer, 2) laboratorium weefsel-droge ijsemmer, 3 & 4) normale droog ijs-emmers, 5) rechthoekige droog ijsemmer(Figuur 1).
2. voorbereiding van Flash-bevroren menselijke intestinale weefsel
Opmerking: Dit hele proces kan duren tussen 45-80 min per intestinale segment, afhankelijk van de kwaliteit van de intestinale weefsel. We raden ook aan het verzamelen van monsters van de kwaliteitscontrole om RNA kwaliteit en histologie voordat u verdergaat met de LCM te beoordelen.
- Vul een grote lade met nat ijs en chirurgische snijplanken bovenop de droogijs plaats.
- Chill een 500 mL en 100 mL bekers voor het opslaan van het weefsel en bijgesneden segmenten in koude opslagoplossing bij deze instelling. Vooraf chill base mallen op de snijplanken, zodat ze zijn klaar om te ontvangen van weefsel.
- Na ontvangst van vers intestinale weefsel, giet af de media waarin het weefsel wordt vervoerd en behouden in de vooraf gekoeld bekers. Voldoende ruimte is in deze bekers voor de tijdelijke opslag van de intestinale weefsel en bijgesneden segmenten, die zal worden voorbereid in opeenvolgende stappen.
- Snijd de intestinale segment tot een lengte van ongeveer 20 cm, waarin ruim voldoende weefsel (40-60 cm2) voor het genereren van RNA voor downstream toepassingen en kwaliteitscontrole monsters. Afhankelijk van de integriteit van weefsel, is het mogelijk te bereiken van RNA isolatie voor downstream processing met een veel kleinere lengte (dat wil zeggen, 5 cm van de darm).
- Trim weg adipeus en het bindweefsel van de darm met behulp van chirurgische scharen. Resterende obesitas langs de intestinale sereus vlies in het gedrang brengt de mogelijkheid om volledig plat weefsel in opeenvolgende stappen. Zorgvuldig trimmen het weefsel, teneinde het sereus vlies tijdens het verwijderen van vet en bindweefsel, die structureel kan schade aan de plexus myenteric of maken van de buitenkant van het weefsel plat ongelijk voor afdelen plukt.
- Maak een longitudinale incisie langs de gehele lengte van de intestinale monster, bij voorkeur op de site van die bijlage.
- Ontleden weg en negeren de tenia coli van de dubbelpunt, zodat het gemakkelijker, worden afgevlakt op spanning wordt verlost.
- Splay de darm mucosa-zijde naar beneden op een gekoelde snijplank en snijd 1,25-cm-brede stroken van de volledige lengte van het weefsel.
Opmerking: Intestinale weefsel vaak breidt na bijsnijden, zodat deze grootte moet dienovereenkomstig worden aangepast. - Tijdelijk opslaan de strips in gekoeld weefsel-opslagoplossing.
Opmerking: We gebruiken Belzer UW koude opslagoplossing, want het heeft een lange houdbaarheid, relatief kosteneffectief is en kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur totdat het nodig is. - Verwijderen van een strook weefsel uit de koude opslagoplossing en snijd het in segmenten ~1.5-2 cm lang.
- Snel wissen de intestinale segmenten op een stapel van laboratorium doekjes, verwijderen overtollige vocht en de vorming van ijskristallen langs de intestinale sereus vlies tijdens flash-bevriezing te voorkomen. Indien weefsel is niet voldoende gedroogd, zou het moeilijk te verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige secties van de myenteric plexus zal zijn.
- Leg de volgelopen stukken van intestinale mucosa-kant omhoog op een vooraf gekoeld, grote, wegwerp plastic basis mal (37 x 24 x 5 mm).
- Zorgvuldig afvlakken elk segment door licht het weefsel die zich uitstrekt over het oppervlak van de base schimmel en het gebruik van pincet gebogen zachtjes druk naar beneden en verdrijven alle luchtbellen die onder het sereus vlies kunnen worden onderschept. Merk op dat het weefsel terwijl afvlakken breidt. Indien nodig, trim de segmenten en snijd de overige monsters op een kleiner formaat.
Opmerking: Als het weefsel overbelast is, zal dit de plexus myenteric verstoren. Nadat alle luchtbellen zijn verwijderd, beoordelen de dikte van het monster vóór bevriezing. Indien nodig, de randen van het specimen naar binnen duwen totdat de intestinale monster de oorspronkelijke dikte benadert. - Plaats het geladen basis schimmel op het oppervlak van het droogijs, 2-MB drijfmest. Het weefsel moet volledig bevriezen binnen 30-60-s, afhankelijk van de grootte en de dikte van de intestinale segment.
- Droog de onderkant van de base schimmel verwijderen van resterende 2-MB door wrijven snel de basis schimmel op de weefsels van de laboratorium vooraf gekoeld in de tweede emmer van droogijs.
- Het gedroogde monster overbrengen in het derde bad van droogijs en begraven onder de oppervlakte van het droogijs totdat het is klaar om te worden verpakt.
- Snel observeren de onderkant van de base schimmel voorafgaand aan zeewieren, onderzoek naar de kwaliteit van de bereiding van de monsters. Noteer alle voorbeelden die worden niet weergegeven in platte of hebben grote luchtbellen, zoals deze voor cryosectioning en LCM moeten worden vermeden.
- Wikkel het monster in vooraf gelabelde aluminiumfolie die wordt gelegd op droog ijs in een emmer zodat inwikkeling van weefsel optreedt terwijl volledig bevroren worden gehouden.
- Wikkel het monster met een laagje plastic omslag, tot een minimum beperken van weefsel uitdroging tijdens de opslag bij-80 ° C.
- Monsters in de rechthoekige emmer opslaan totdat ze klaar om te worden verplaatst naar de vriezer.
- Vooraf label en vooraf chill vriezer vakken-80 ° C voor onmiddellijke opslag van de monsters na collectie.
- Neem een klein gedeelte van weefsel van elk intestinale segment voor beoordeling van RNA integriteit vóór het uitvoeren van de LCM.
- Label vooraf een 2-mL RNase-gratis buis voor elk segment, gevuld met ≥500 µL van lysis buffer. Het is raadzaam om met behulp van RNA extractie Kit "D", vermeld in de Tabel van materialen.
- Meng een kleine (2 x 2 mm) stuk van de darm in een standaard weefsel micro-homogenizer (20-40 s, totdat er geen stukjes weefsel blijven). Vervolgens bevriezen onmiddellijk het RNA lysate op droog ijs en winkel bij-80 ° C tot u verdergaat met RNA extractie.
- Eventueel insluiten enkele van de secties in weefsel bevriezing medium (TFM) als een back-up. Bereiden van weefselsecties in exact dezelfde manier beschreven in deze sectie, maar monsters in TFM binnen de basis mal voorafgaand aan flash-bevriezing dompelen.
3. Cryosectioning
- Voor cryosectioning, voorbereiden van alle benodigde materialen voor de kleuring en uitdroging en breng de gewenste weefselsteekproeven uit de diepvries-80 ° C in een emmer van droogijs.
- Voorbereiden van de cryostaat voor gebruik door op de optimale scherpe temperatuur (-18 tot-22 ° C) en vegen beneden oppervlakken met 100% ethanol en behandeling van het mes en borstel dienblad met RNase decontaminatie oplossing.
- Om het beste voldoen aan de chuck monster, gebruiken de volgende aanpak.
- Plaatsen van de verlostang in droog ijs voor ten minste 30 s voordat de intestinale monster uitpakken en plaatsen van het aan de oppervlakte van het droogijs sereus vlies-side-up.
- Giet een 3-5 mm grafheuvel van weefsel bevriezing medium (TFM) op een grote cryostaat monsterhouder en onmiddellijk overdracht de intestinale monster sereus vlies-side-up op de TFM.
- Snel overbrengen in de monsterhouder droogijs en bedek met powderized droogijs na waardoor de TFM vast te houden aan het monster voor 2-5 s bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de TFM onder het vlak van de plexus myenteric blijft.
Opmerking: in het ideale geval het buitenoppervlak van de intestinale mucosa volledig voldoet aan de TFM voordat de TFM begint te bevriezen zonder ontdooien van het monster.
- Monteren van de monsterhouder in van de cryostaat specimen hoofd en uitlijnen van het model met de cryostaat mes, zodanig dat het vliegtuig van de myenteric plexus zal parallel aan het maaimes.
- De vectorafbeeldingsbestanden dikte aangezet de cryostaat tot 8 µm. Het doel van perfect het uitlijnen van het model is te verkrijgen van de grootst mogelijke oppervlakte van myenteric plexus op elke dia. Deze dikte wordt algemeen aanbevolen voor zowel menselijke als knaagdier weefsel, maar kan worden aangepast, indien nodig.
- Sectie door de sereus vlies en de Musculus longitudinalis tot het bereiken van de myenteric plexus.
- Voor het opzoeken van de plexus myenteric, monteren van een monster sectie op een dia en vlekken van de sectie met een waterige kleurstof, zoals 1% Cresyl violet of toluïdine blauw, enz.
- Zie de sectie onder een lichte Microscoop bij 40-2000 X vergroting te identificeren van de kruising tussen de lengterichting en spier-lagen. Microscoop parameters vindt u in de Tabel van materialen. Aan het begin van het segmenteren, zal het sereus vlies worden gekenmerkt door de aanwezigheid van bindweefsel. Sommige resterende mesenterische vet kan ook worden langs het sereus vlies aanwezig. Een blad van de buitenste Musculus longitudinalis laag dan begint. Zodra de grens tussen de lagen van de lengterichting en spier wordt bereikt, zal een deel van de darmen ganglia in acht worden genomen.
Opmerking: In de volgende verschillende secties, de myenteric plexus zal blijken zeer, met grote zwaden van ganglia aanwezig binnen een enkele sectie (Figuur 2C). Als het weefsel aan het begin van het segmenteren niet volledig vlak is, dan is slechts een gedeelte van de ganglia zullen aanwezig zijn in elke sectie op een bepaald moment. Soms, wellicht de intestinale monster een inherent ongelijke myenteric plexus, ondanks het weefsel perfect vlakke verschijnen. Dit geldt met name voor monsters van de twaalfvingerige darm. In onze ervaring, deze monsters kunnen veel langer duren om te verwerken met de LCM, maar voldoende RNA kan worden verzameld in een enkele dag sessie. De exacte locatie van de plexus myenteric kan aanzienlijk variëren tussen monsters, gebaseerd op het weefsel en de voorbereiding voorafgaand aan invriezen.
- Beginnen met het verzamelen van seriële secties voor LCM, met optimale collecties, het grootste aantal neuronen en glia per dia. Afhankelijk van de oppervlakte van het monster, kunnen meerdere secties worden gecombineerd in een enkele dia PEN-membraan.
- Monteer de secties in PEN membraan dia's, gekoeld kort in de cryostaat voor 5-10 s. Bij het monteren, is het moet dat het weefsel slechts licht, smelt maximaal behoud van RNA integriteit.
4. vlekken
Opmerking: Voor een overzicht van de kleuring proces, verwijzen naar tabel 1. Alle oplossingen gebruikt worden bereid in standaard conische flesjes van 50 mL. Behandeling van de buitenkant van de buisjes met RNase decontaminatie oplossing lijkt niet te verbeteren van de resultaten (gegevens niet worden weergegeven).
- Een verzadigde oplossing van 4% Cresyl violet in 95% ethanol ten minste een dag van tevoren bereiden en volledig resuspendeer de Cresyl violet vóór het laden van de spuit.
Opmerking: De concentratie van ethanol wellicht worden verlaagd voor effectieve kleuring, zoals beschreven in de sectie discussie. We hebben niet getest of RNA integriteit met behulp van 50% of 75% ethanol tijdens kleuring aanzienlijk vermindert. Cresyl violet is lichtgevoelig en dus moet worden beschermd tegen licht. - Na montage secties van myenteric plexus in de dia verschijnt, onmiddellijk dompelen de dia in een conische flesje van 95% ethanol (vooraf gekoeld op-20 ° C) voor 30 s.
- Als de secties niet volledig aan de dia in de vorige stap voldoen, enigszins warm onderin de dia met een gehandschoende hand (het wissen van een laboratorium moet worden geplaatst tussen de dia en handschoen), voor volledige naleving vóór het dompelen in 95% ethanol. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor ten minste 3-6 dia's zonder vermindering van de integriteit van het RNA.
- Leg de gezicht-omhooggaande dia op een lab veeg geplaatst bovenop een vooraf behandeld, RNase-gratis container-8.
- Vul vooraf een 3-mL injectiespuit met 4% Cresyl violet en hechten een 0,2-µm spuit filter.
Opmerking: Het is raadzaam celluloseacetaat filters. - 6-10 druppels van de vlek direct op het weefsel secties8 toepassen en incubeer voor 10-30-s, of totdat voldoende kleurstof blijft behouden wanneer-gekleurd. Terwijl de kleuring, zachtjes draaien de container van de dia met de hand om ervoor te zorgen dat de weefselsecties gelijkmatig zijn bekleed met een vlek.
- Giet af de vlek en de vlek onmiddellijk de dia in een flesje van 75% ethanol. Herhaaldelijk dompelen de dia totdat de overtollige kleurstof meestal off van het monster sijpelde heeft. Dit kan duren tussen 10-20 s.
- Finaliseer de kleuring door herhaaldelijk dompelen het monster in een flesje van 95% ethanol voor 10 s. Submerge het monster herhaaldelijk totdat alle overtollige vlek is verwijderd.
- Wijzig de duur van de destaining, waar nodig, voor het optimaliseren van de kleuring van de ganglia. Als teveel vlek is verwijderd, kan het monster wordt ook transparant en moeilijk te visualiseren
Opmerking: Dit kleuring protocol is geoptimaliseerd op basis van verschillende publicaties5,8,10,11 die wijziging vereist voordat bevredigende resultaten werden verkregen. Dus, de concentratie van ethanol gebruikt in de kleurstof en tijdens de destaining moet worden gewijzigd, indien nodig, om een optimaal resultaat te verkrijgen.
- Wijzig de duur van de destaining, waar nodig, voor het optimaliseren van de kleuring van de ganglia. Als teveel vlek is verwijderd, kan het monster wordt ook transparant en moeilijk te visualiseren
5. uitdroging
- Onmiddellijk Dompel de dia in 100% ethanol 2 - 3 keer, voor een totaal van 10-20 s.
- Onderdompelen van de dia in watervrij 100% ethanol voor ten minste 30 s. Watervrij ethanol is erg hygroscopisch, moleculaire zeef (8-12 mesh) toevoegen aan de flacon van 100% ethanol voor de aanvang van de procedure voor het verwijderen van alle opgenomen water en dus meer volledig uitdrogen van het monster5.
- Herhaaldelijk Dompel de dia in xyleen voor 15-20 s. Deze stap wordt volledig verwijderd van de laag van ethanol op de dia. Moleculaire zeef tevoren aan de buizen van xyleen, om volledig adsorberen overtollige ethanol en water moleculen5toevoegen.
Let op: Xylenen zijn ingedeeld als een irriterend voor de ogen en de bovenste luchtwegen en moeten worden gebruikt in een chemische zuurkast. - De dia in xyleen (met moleculaire zeef, maaswijdte 8-12) voor ten minste 10 min. onderdompelen.
Opmerking: Een korte pauze kan worden genomen nadat deze stap indien nodig. Monsters kunnen worden overgelaten in xyleen voor 4-5 uur zonder nadelige gevolgen aan kleuring, LCM of RNA opbrengst/integriteit. - Optioneel, afzonderlijk bereiden verschillende extra dia's op dit punt. Als voorbereiding een tweede ronde van de dia na het voltooien van de LCM op alle voorbereide dia's, moet het weefsel in de cryostaat mogelijk worden refaced, als gevolg van uitdroging van het oppervlak van het weefsel. Één tot vier gedeelten wellicht moeten worden afgevoerd voordat bruikbaar secties kunnen worden verzameld.
6. de laser vangt Microdissection (LCM)
- Verwijder de dia uit xyleen en het drogen in een chemische zuurkast voor ten minste 1 min. invoegen een cartridge voor LCM caps de LCM Microscoop fase. Laden van de dia op het podium en de afbeelding van een overzicht van de dia te verwerven.
- Identificeren van de gewenste locatie voor LCM en een cap op de dia laden.
- Uitlijnen van de infrarood (IR) laser en aanpassen van zijn kracht en duur om te maken een diameter van 20-30 µm vangen plek.
- Zoek de ultraviolet (UV) laser en stel een passende snijsnelheid en intensiteit.
- Een overzicht van de gewenste ganglia worden verzameld met behulp van de software van de LCM, ervoor zorgend om blijven binnen de grenzen van de collectable gebied op het GLB (afgebeeld in het overzicht van de dia van het softwareprogramma als een groene cirkel).
- Pas in elk van de sporen, de IR-plekken zodanig dat er ten minste één IR spot elke 100-500 µm.
- Druk op de knop IR/UV gesneden om door te gaan met de collectie van alle gemarkeerde ganglia.
- Zodra collecties zijn voltooid, ofwel het GLB te verplaatsen naar een nieuwe locatie en herhaal het proces van het verzamelen of onderzoeken het LCM GLB op het QC-station zodra het GLB wordt voldoende gevuld met ganglia (of totdat de aanbevolen termijn van 60-80 minuten is bereikt).
- Als puin op het GLB aanwezig zijn, veeg het weg met een boete-tipped penseel dat is vooraf behandeld met RNase decontaminatie oplossing, gespoeld met water nuclease-vrij, en volledig gedroogd.
- Zorgvuldig onderzoeken van het GLB op het oog of met vergroting onder een Microscoop helder veld om alle puin is verwijderd. Als het puin kan niet worden verwijderd door gebruik te maken van de vooraf behandelde verfkwast, gebruikt u een fijne pipette uiteinde (RNase-vrij) om het puin weg te schrapen.
- Beveilig het GLB op een 0,5 mL microfuge buis gevuld met 230 µL van RNA lysis buffer (Buffer RLT uit RNA extractie Kit "B", met β-mercaptoethanol toegevoegd in een concentratie van 10 µL/mL).
- Omkeren van het GLB, kort vortex en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij ≥ 5000 x g voor 5 min en dan overdracht de microfuge buis te droog ijs.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. RNA lysates kan worden achtergelaten bij-80 ° C zonder een duidelijke invloed op aantasting van het RNA voor ten minste 1 week. Als RNA isolatie wordt uitgevoerd op dezelfde dag, dan koelen de monsters op ijs totdat ze klaar voor extractie zijn. - Alle extra collecties binnen de aanbevolen maximale termijn van 80-90 min uitvoeren nadat de dia is verwijderd van xyleen. Zoals de gedehydrateerde secties worden blootgesteld aan luchtvochtigheid, kan RNases geleidelijk worden gereactiveerd. Beperking van de periode kan dergelijke effecten te minimaliseren en maximaal RNA integriteit behouden blijft.
7. RNA isolatie
- Een werkstation RNase-gratis voorbereiden op RNA extracties.
- Alle buizen en reagentia volgens de handleiding voorbereiden door de RNA extractie Kit.
Opmerking: Hoewel er veel kits beschikbaar voor RNA isolatie na LCM, we hebben beste succes met behulp van de RNA extractie Kit "B", opgenomen in de lijst van de materialen. Zie Figuur 5 voor een side-by-side vergelijking van RNA extractie reagentia. - Verwijderen van monsters uit de diepvries-80 ° C en snel ontdooien in een waterbad 37 ° C.
- Onmiddellijk vortex ontdooid monsters voor 2-3 s gelijkmatig verdelen de guanidinium kaliumthiocyanaat zouten.
- Elk monster combineren met een gelijk volume van 70% ethanol. Zwembad 2 of meer lysates samen, indien nodig, tot een concentratie van RNA.
- Ga te werk volgens de aanwijzingen in de handleiding voor het proces van extractie van RNA, via het protocol geoptimaliseerd voor microdissected monsters.
- Elueer RNA bij de laatste stap in de minimale aanbevolen hoeveelheid nuclease-gratis water (14 µL).
- Naar aanleiding van RNA isolatie, aliquoot 1-2 µL van RNA van elk monster af in een nieuwe vooraf label RNase-gratis buis voor de beoordeling/kwaliteit kwaliteitscontrole met een microfluidics apparaat dat kleine hoeveelheden van RNA, zoals een Bioanalyzer kunt visualiseren. Aliquot een extra 1 µL in een aparte buis voor kwantificering met een hoog-gevoeligheids RNA kwantificering kit.
- Pas deze stappen, zo nodig, te verkrijgen van een voldoende hoeveelheid van RNA downstream p.a. (dwz., bundelen van een groter aantal LCM caps vóór RNA extractie).
- Winkel RNA bij-80 ° C tot het verzamelen van voldoende monsters voor downstream-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben verschillende verbeteringen aan bestaande protocollen waarmee de relatief snelle collectie van darmen ganglia van menselijke intestinale monsters met behulp van LCM, voldoet aan de normen voor RNA-Seq. aangebracht Ten eerste, we geoptimaliseerd de snelle bevriezing van intestinale weefsel segmenten in grote basis mallen geplaatst op het oppervlak van een gier van droogijs in 2-MB (Figuur 1B). De beste succes tijdens cryosectioning en latere LCM werd verkregen door intestinale segmenten plat binnen een basis mal, geconfronteerd met de mucosa-kant naar boven (cijfers 1B-1 C) te leggen. Zorg ervoor dat de basis mallen zo plat mogelijk aan de basis, zoals enig kromming het veel moeilijker maakt te verkrijgen een grote dwarsdoorsnede van de myenteric plexus. Deze aanpak resulteert in weefsel dat gemakkelijk is gesegmenteerd bij 8-µm dikte (Figuur 1E) en voorziet in de volledige uitbanning van TFM van de kleuring proces. We vonden dat TFM met de kleuring proces interfereert en dus de identificatie van de darmen ganglia verduistert. Positionering van het weefsel in deze oriëntatie ook vermijdt segmenteren via de mucosa, die een hoog gehalte aan RNases12 heeft, hoewel uit onze ervaring blijkt dat het gebruik van ethanolbevattend vlekken grotendeels remt deze RNases. In gevallen waar TFM of optimale snijden temperatuur (OCT) medium nodig is, vonden we het meest betrouwbare aan eerst het afvlakken van de steekproef aan de onderkant van de base schimmel en voeg vervolgens de TFM aan de schimmel na deze stap (Figuur 1D). Dit laat een "venster" waarin de darm gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd, waardoor het gemakkelijk is om het model uitlijnen en produceren secties die volledig parallel aan de myenteric plexus (Figuur 1E).
Voorbereiding van cryosecties lengterichting beneden de lengte van de darm in een richting parallel aan de myenteric plexus (Figuur 2A), genereert secties waarin het grootste gedeelte van de darmen ganglia per dia zijn zichtbaar op de vlekken) Figuur 2 C). bij het naderen van de plexus myenteric (Figuur 2C), bij de bijstelling van de lengterichting en spier lagen (Figuur 2B), 6-12 seriële secties kunnen worden verzameld (Figuur 2A, longitudinale) die bevatten grote zwaden van darmen ganglia (Figuur 2C). LCM caps kunnen worden geladen capaciteit met behulp van een enkele sectie (Figuur 4D). In tegenstelling, bij de voorbereiding van transversale secties van vers bevroren darm (cijfers 2A-2B), is er slechts een klein gedeelte van de myenteric plexus aanwezig zijn op elke dia (Figuur 2B). Zeer weinig darmen ganglia kunnen worden verzameld van transversale weefselsecties, wat resulteert in meer tijd geïnvesteerd en hogere kosten per monster algemene. De aanpak van parallel-afdelen maakt gebruik van minder dan een vijfde van het aantal LCM caps en dia's in vergelijking met dwarse secties en sterk versnelt het proces van het verzamelen.
Voordat de LCM, moeten monsters worden gekleurd en volledig uitgedroogd Voorkom RNase activiteit tijdens de LCM-collectie. We ontwierpen een experiment om te vergelijken direct het effect van waterige vlekken vs. ethanolbevattend vlekken op RNA integriteit. In dit experiment, twee intestinale secties samen waren gemonteerd op een enkele dia en werden verwerkt in vier manieren, met n = 2-3 biologische duplo's per groep. In de eerste groep, verse intestinale secties waren niet gemonteerd op een dia en elk overgeplaatst rechtstreeks in RNA lysis-buffermengsel met behulp van RNase-vrije pincet vooraf gekoeld op droog ijs (Figuur 3A). Voor alle overige groepen, werden secties vastgehouden aan een dia, verwerkt, van de dia met behulp van een RNase decontaminatie oplossing behandeld scheermesje afgeschraapt en overgebracht naar RNA lysis-buffermengsel met een tang RNase-gratis. Een standaard micro-homogenizer gewend was volledig lyse de monsters in alle groepen. In de tweede groep, de dia's werden verwerkt door alle stappen, maar geen kleurstof werd gebruikt tijdens de kleuring procedure (Figuur 3B). Groep drie is verwerkt met het protocol beschreven, met behulp van 4% Cresyl violet kleurstof (Figuur 3C). In de vierde groep, werd een waterige vlek, toluïdine blauw, terwijl volgens het protocol voor een waterige gebaseerde kleuring kit met behulp van een mengsel van toluïdine blauw en Haematoxyline (Figuur 3D) gebruikt. Na extractie van RNA, zoals beschreven, werd RNA kwaliteit beoordeeld met een Bioanalyzer. Het enige verschil tussen de waterige en ethanolbevattend kleuring protocollen was de toevoeging van twee water incubations (30 s elk), onmiddellijk vóór en na de kleuring, die nodig is voor opname en retentie van de kleurstof. We vonden dat het proces voor het naleven van weefselsecties aan de dia en verwerken met de uitdroging stappen geleid tot een vermindering van het lichte, onvermijdelijk van RNA kwaliteit (cijfers 3A-3B), maar dat kleuring met het ethanolbevattend kleurstof, Cresyl violet, niet verder verminderen van RNA kwaliteit (Figuur 3C). In tegenstelling, leidde de waterige kleurstof, toluïdine blauw, tot aanzienlijke RNA afbraak, waarschijnlijk te wijten aan langdurige waterige blootstelling waarmee endogene RNase activiteit (Figuur 3D).
De unieke vorm van darmen ganglia opleveren moeilijkheden voor standaard IR-LCM met conventionele glas dia6 (Figuur 4A). Bij het gebruik van PEN-membraan dia's (Figuur 4,B), worden monsters een dunne plaat die is losgekoppeld van de meerderheid van het glasplaatje nageleefd. De UV-laser snijdt door zowel het monster en de PEN membraan, wat resulteert in de volledige detachement van de ganglia van de dia (Figuur 4C) en de volledige naleving van het LCM GLB (Figuur 4D). Structuren van een gewenste grootte en vorm (> 10-15 µm) kan volledig en precies verzameld (Basso 4E-4 H). Voor sommige monsters met minder ganglia per sectie, het GLB mogelijk verplaatste ≥ vier keer voordat het verzamelen. In dit geval minimaliseert twee tot drie secties per dia montage het gebruik van PEN-membraan dia's.
Bij het isoleren van RNA van LCM monsters voor RNA-seq, is het doel het verkrijgen van de hoogst mogelijke kwaliteit van RNA en de hoeveelheid, terwijl het elimineren van alle genomic DNA (gDNA). Ter identificatie van een ideale RNA isolatie procedure, wij uitgevoerd een head-to-head vergelijking met een RNA extractie Kit "A" (Figuur 5A), RNA extractie Kit "B" (Figuur 5B), of RNA extractiemethode "C" met clean-up van de RNA-monsters door RNA extractie Kit "B" (Figuur 5C). Na het verwerken van monsters met de geoptimaliseerde Cresyl violet kleuring protocol, werd LCM gebruikt voor het verzamelen van gestandaardiseerde circulaire monsters (diameter van 500 µm) van intestinale weefsel, genomen uit de Musculus longitudinalis laag. Elk cap werd willekeurig toegewezen aan elk van de drie groepen voor RNA isolatie, gelegd bovenop een 0,5 mL microfuge buis vooraf gevuld met de respectieve lysis-buffermengsel van elke kit. De instructies waren precies zoals beschreven voor elke kit, met RNA extractie Kit "A" lysis-buffermengsel vereisen incubatie bij 42 ° C gedurende 30 minuten gevolgd. Voor de andere kits, werd kamertemperatuur incubatie gebruikt voor 30 min. Alle monsters werden kort vortexed op toevoeging aan lysis-buffermengsel. Monsters werden vervolgens gekoeld op ijs totdat extracties werden dezelfde dag uitgevoerd (n = 4). We vonden dat RNA extractie Kit "B" met een op-kolom stap voor de vertering van de DNA in de hoogste kwaliteit van RNA en de hoeveelheid resulteerde terwijl het effectief elimineren van gDNA (cijfers 5A-5 C). Nog belangrijker is, lyses het RNA lysis-buffermengsel geboden door RNA extractie Kit "B" volledig de vastgelegde ganglia bij het verzamelen van darmen ganglia (Figuur 5D).
Onze voorbeelden hebben gemiddeld een RIN van 7.49 ± 0,53 (tabel 2). RIN scores van meer dan 6-7 worden geacht van voldoende kwaliteit voor RNA-seq (afhankelijk van het specifieke profiel van de RNA)13, geeft ons vertrouwen dat onze voorbeelden zijn van voldoende kwaliteit voor RNA-seq. gezien het feit dat de RIN voor deze monsters, na ontvangst, heeft varieerden van 7,4 naar 9.5, deze resultaten wijzen erop dat onze geoptimaliseerde protocol uitstekende behoud van RNA integriteit biedt. Representatieve resultaten van de kwaliteit van de RNA van RNA-seq geteste monsters worden afgebeeld in Cijfers 6A-6 C. Resultaten van RNA-seq aantonen dat onze voorbeelden met succes werden sequenced en hebben een bescheiden 3'-eind bias (Figuur 6D). In het algemeen is een grotere 3'-bias favoriet in monsters met lagere RIN14; Dit effect is matig weerspiegeld in onze voorbeelden. Desondanks waren de waargenomen gene biotypes grotendeels overeen onder alle monsters (Figuur 6E), die de betrouwbaarheid van de gegevens aangeeft.
Figuur 1 . Optimale bevriezing van intestinale weefsel. (A) droge ijs-emmers zijn bereid in de volgorde die afgebeeld; Ik) droogijs drijfmest, ii) laboratorium weefsels geplaatst bovenop droogijs, iii) tijdelijke opslag emmer, iv) verpakking emmer, v) pre diepvries opslag emmer, vi) pre diepvries opslag overloop emmer. (B) We geoptimaliseerd snelle bevriezing van weefsel segmenten in grote basis mallen geplaatst op het oppervlak van een gier van droogijs en 2-methylbutane. (C) A dichter-up afbeelding voor een volledig bevroren specimen, waargenomen in de setup weergegeven in het deelvenster B. Intestinal segmenten zijn plat in een basis mal mucosa-kant naar boven. (D) deze bevriezing methode kan gemakkelijk aangepast voor gebruik met TFM worden door het weefsel op dezelfde manier bereiden, maar TFM toe te voegen aan de basis mal vóór het invriezen. Het resulterende monster zal hebben een volledig vlakke myenteric plexus, met een sereus vlies die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd. (E) beide weefsel voorbereiding benaderingen produceren uitstekende weefselsecties bij de dikte van de aanbevolen 8-µm. De procedure met behulp van TFM is hier afgebeeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Goede richting van intestinale weefsel biedt secties rijk aan darmen ganglia. Bij het opstellen van standaard dwarse dwarsdoorsneden van vers bevroren darm (A, B), is er slechts een klein gedeelte van de myenteric plexus (B) op elke dia aanwezig. Zeer weinig darmen ganglia kunnen worden verzameld per dia, die tijdrovend en kostbaar is. Voorbereiding van de longitudinale secties in het vlak van de myenteric plexus (C), biedt daarentegen een veel grotere oppervlakte van ganglia (C). Secties van myenteric plexus worden verkregen door vanaf het sereus vlies en segmenteren naar binnen via de Musculus longitudinalis (B). Bij het naderen van de plexus myenteric, op de kruising van de lengterichting en spier laag (B), kunnen 6-12 seriële secties worden verzameld. Elke Langsdoorsnede van myenteric plexus bevat grote zwaden van darmen ganglia (aangegeven in C, met behulp van een gemodificeerde kleuring procedurezonder, xyleen, om bij voorkeur vlek de ganglia). LCM caps kunnen worden gevuld met behulp van een enkele weefselsectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Kleuring met een kleurstof ethanol-compatibele verbetert de kwaliteit van het RNA. RNA kwaliteit werd gemeten door de Bioanalyzer en representatieve resultaten van twee monsters uit elke groep worden weergegeven. Oorspronkelijke RNA kwaliteit gemeten vanaf vers, niet gemonteerd secties (A, geen behandeling), had een RNA integriteit aantal (RIN) 8.65 ± 0,07. Voor secties gemonteerd en verwerkt door alle stappen, maar zonder vlek (B), was RIN 7,95 ± 0.35. Toen kleuring met 4% Cresyl violet is toegevoegd aan de uitdroging stappen, was er een te verwaarlozen effect op RIN, met een gemiddelde RIN van 7.87 ± 0.35 (C). In vergelijking, het gebruik van de waterige vlek, toluïdine blauw (T-blauw), en de toevoeging van vereiste water gespoeld om de procedure (D) geleid tot aanzienlijk lagere RNA-kwaliteit, met een RIN van 6.45 ± 0.21. Elke groep bestond uit n = 3 biologische replicatieonderzoeken met uitzondering van "No behandeling" en "T-Blue"(n=2). RINs zijn gemeld hier als gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . PEN membraan LCM dia's in staat stellen nauwkeurige collecties van darmen ganglia. Met behulp van reguliere glas Microscoop dia's voor het verzamelen van darmen ganglia via LCM neigt te leiden tot ongewenste weefsel pickup (A). De rode cirkels (30 µm in diameter) geven de grootte van de plekken van de IR LCM gebruikt tijdens het proces van het verzamelen. De witte pijl geeft een ganglion-collectie die een stukje weefsel van de aangrenzende muscularis trok. Een dunne plaat die is losgekoppeld van de meerderheid van het glasplaatje met PEN-membraan glijbanen (B), worden monsters nageleefd. Wanneer met de UV-LCM laser snijden, zowel de monster en de PEN membraan worden gesneden, wat resulteert in de volledige detachement van de ganglia van de dia, ongeacht de ganglion vorm (C), en een volledige naleving van het GLB van de LCM wanneer verwijderd uit het monster (D ). Structuren van een gewenste grootte en vorm ≥10-15 µm kan volledig en precies verzameld [(E), eerste weefsel mark-up; (F) IR en UV-lasersnijden voltooid; (G) LCM GLB verwijderd uit sectie], zoals gevisualiseerd op het LCM GLB (H). De gespikkelde achtergrond in deelvenster H is inherent aan het GLB en is geen ongewenste puin. De groene cirkels blauw crosshairs in panelen E-H deel uitmaken van de LCM-programma en zijn tijdelijke aanduidingen voor de UV- en IR-lasers, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Selecteren van een optimale RNA isolatie kit. RNA integrity resultaten worden weergegeven na een gelijktijdige vergelijking van drie verschillende procedures van de isolatie van het RNA. Twee representatieve percelen uit elke groep worden weergegeven om te illustreren de variabiliteit die tussen de monsters verwerkt in parallel optreden kan. RNA extractie Kit "A" (A) geproduceerd van monsters met een RIN van 6.83 ± 0,65 geboden gematigde rendementen van RNA en DNA besmetting, ondanks het uitvoeren van een op-kolom DNase spijsvertering hebben de neiging. RNA extractie Kit "B" (B) resulteerde in de hoogste gemeten RIN, bij 8.3 ± 0,1. Terwijl de fenol gebaseerde RNA extractiemethode "C" (gevolgd door een clean-up van de RNA-monsters met RNA extractie Kit "B") (C) leek te elimineren gDNA en had een RIN van 7,5 ± 0,26, er waren grote verontreiniging van banden, die het gevolg kunnen zijn van het smelten van de Zelfklevende polymeer van het LCM GLB tijdens de stap van de lysis van RNA. Verder, RNA opbrengst van RNA extractie Kit "A" en "C" van extractiemethode consequent lager waren dan die verkregen door RNA extractie Kit "B". Nog belangrijker is, het RNA lysis-buffermengsel geboden door RNA extractie Kit "B". (met extra β-mercaptoethanol) lyses volledig de vastgelegde ganglia (D). Elke groep had n = 3 biologische replicatieonderzoeken en wordt gepresenteerd hier als gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Representatieve resultaten. Wanneer twee caps van darmen ganglia per monster bundelen, we krijgen voldoende hoeveelheden van RNA voor RNA-seq (> 1 ng) samen met de uitstekende kwaliteit van RNA. Representatieve RNA percelen worden weergegeven voor een monster met een RIN van 8.3 (A), (B) 7.5 en 6,9 (C). RNA-seq gegevens werden geleid door een kwaliteitsbeoordeling programma'slooppas, in R. (D) de eind-bias plot geeft aan dat de monsters werden met succes sequenced en een bescheiden 3'-eind vooroordeel hebben. (E) de gene biotype plot ook vertegenwoordigt dat rangschikkend resultaten grotendeels onder de monsters stroken. In totaal hebben we een > 95% slagingspercentage bij het genereren van monsters bruikbaar voor RNA-Seq Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stap | Duur | Doel |
| 95% ethanol (-20 oC) | 30 s | Fixatie |
| 4% cresyl Violet in 95% Ethanol | 10-30-s | Vlek |
| 75% ethanol (met herhaalde dompelen) | 15-25 s | De vlek |
| 95% ethanol (met herhaalde dompelen) | 5-15 s | De vlek |
| 100% ethanol | 15 s | Uitdroging |
| 100% ethanol (watervrij) | 30 s | Uitdroging |
| Xyleen (met herhaalde dompelen) | 15-20 s | Uitdroging |
| Xyleen | > 10 min | Uitdroging |
| Drogen | 1-3 min | Verdamping van xyleen |
Tabel 1. Kleuring en uitdroging Protocol overzicht. In deze tabel vindt u een overzicht onze geoptimaliseerde kleuring protocol. Merk op dat elke ethanol-compatibele vlekken kan worden gebruikt ter vervanging van Cresyl violet, als het biedt betere resultaten. In sommige gevallen zal de totale duur van de kleuring en destaining moet worden verlengd of ingekort. In het algemeen, hoe langer zal de tijd van fixatie, hoe sneller het weefsel worden volledig gekleurd. We hebben niet gemerkt eventuele vermindering van RNA integriteit na het hergebruik van flesjes tot 3 keer bij de voorbereiding van de dia's uit hetzelfde weefsel segment.
| Donor | Weefsel | RIN |
| F | Dikke darm | 7.4, 7.1, 7.2 |
| M | Kronkeldarm | 7.2, 6,9, 7,8 |
| M | Twaalfvingerige darm | 8.2, 7.4, 7.7 |
| Kronkeldarm | 7.4, 7.6, 7.3 | |
| Dikke darm | 7.7, 7.8, 7.3 | |
| F | Twaalfvingerige darm | 7.1, 7.3, 6,9 |
| Kronkeldarm | 7.8, 7,9 7,6 | |
| Dikke darm | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | Kronkeldarm | 6,9 6,7, 6,9 |
| Dikke darm | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Kronkeldarm | 7.2, 7.3, 7.6 |
| Dikke darm | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | Kronkeldarm | 8.3, 7.8, 7.4 |
| Dikke darm | 7.4, 7.0, 7.0 | |
| F | Twaalfvingerige darm | 8.8, 8.3, 8.0 |
| Kronkeldarm | 8.0, 8.1, 7,8 | |
| Dikke darm | 8.4, 8.6, 7.1 |
Tabel 2. Representatieve RNA integriteit resultaten. De monsters weergegeven in deze tabel zijn alle verkregen uit menselijke darmen ganglia. Alle geselecteerde monsters moeten voldoende RNA kwaliteit en kwantiteit voor RNA-seq analyse. De gemiddelde RIN van alle monsters die zijn vermeld in deze tabel is 7.49 ± 0,53. RNA concentratie werd ook gemeten met behulp van de bepaling van de RiboGreen Quant-iT en alle monsters in weergegeven in deze tabel hebben voldaan aan de minimale hoeveelheid die nodig is voor onze RNA-seq (> 1 ng) experimenten. Kleinere hoeveelheden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de versterking van de pre-procedure. Dergelijke procedures zijn echter betrouwbaarder wanneer men er verwacht te grote verschillen in genuitdrukking worden tussen monsters of groepen worden vergeleken; deze resultaten kunnen anders waar verschillen in sommige toepassingen van RNA-seq maskeren. Het wordt daarom aanbevolen om te beginnen met meer materiaal indien mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met deze procedure kunt het efficiënt verzamelen van talrijke darmen ganglia als een bron voor het afleiden van RNA voor RNA-seq. Hier hebben we de processen die worden beschreven in de bestaande protocollen maximaal behoud van RNA integriteit versneld. Zoals alle stappen in deze procedure onderling afhankelijk zijn zijn, is het belangrijk dat alle kwesties vanaf het begin van de studie worden geëlimineerd en dat alle monsters bereid zijn zo op dezelfde manier aan elkaar mogelijk te verkrijgen van betrouwbare RNA-seq.
Vanaf het begin van de procedure, kan RNA integriteit worden negatief beïnvloed als het tijdsinterval (koude ischemische keer) tussen collectie van weefsel ten tijde van orgaandonatie en ontvangst van weefsel voor verwerking in het laboratorium te lang is. Deze bezorgdheid gezien, waren we verbaasd dat kwalitatief hoogwaardige RNA nog steeds kan worden geëxtraheerd uit intestinale monsters zelfs na 24 uur koud ischemische tijd. Wanneer de intestinale monsters worden gekoeld en goed in koude opslagoplossing opgeslagen, is er uitstekende bescherming van weefsel integriteit en kwaliteit van RNA. Wij eisen dat de intestinale weefsel wordt geleegd bij de inzameling door het orgel collectie team, om de blootstelling van de darm spijsverteringsenzymen, RNases en andere moleculen die de kwaliteit van het RNA, tijdens deze periode beïnvloeden kunnen te beperken. We hebben vastgesteld dat wanneer de intestinale specimen niet volledig leeggemaakt is, dit van het monster RIN behoorlijk kan aantasten.
Met onze geoptimaliseerde procedure voor het voorbereiden van intestinale weefselsteekproeven, zijn we in staat om te voorkomen dat monsters te embedding in TFM. Omdat TFM met ethanol en xyleen communiceert vormen een donker bruin neerslag dat met de visualisatie van darmen ganglia interfereert, verkiezen wij het uitsluiten van onze voorbeelden. Echter, wanneer u werkt met weefsel van de darm van muizen of andere soorten, de uitsluiting van TFM niet mogelijk. In dit geval hebben we geëxperimenteerd met TFM uit een zelfklevend sectie op een dia verwijderen. Als het weefsel een voldoende oppervlakte heeft, kan ethanol (gekoeld op-20 ° C) worden droop op de dia met een pipet overdracht snel de TFM, toestaand het om te worden verwijderd met een tang vast te stellen. Druipend van ethanol in de dia's vermijdt de accumulatie van TFM binnen de flacon van ethanol, die het browning effect verergeren kan wanneer meerdere dia's worden verwerkt.
Tijdens de flash-bevriezing gunst wij met behulp van een gier van droogijs met 2-MB, in plaats van 100% ethanol, omdat 2-MB gemakkelijk verdampt tijdens de landing op het oppervlak van het weefsel. Ethanol heeft de neiging te verdampen langzamer, vooral wanneer gecombineerd met TFM, vormen een chemische slib op het blok van weefsel dat niet gemakkelijk worden verwijderd. Zowel ethanol als 2-MB neigen te bruisen en splatter krachtig wanneer invriezen in kleine recipiënten van bevriezing, omdat het kleine volume van de drijfmest droogijs een lage soortelijke warmte-capaciteit heeft. In plaats daarvan, met behulp van een grote rechthoekige emmer gevuld met powderized droogijs biedt een grote massa van de koeling en voorkomt temperatuurschommelingen terwijl het weefsel wordt bevroren.
Zoals vermeld, is het soms gemakkelijker om continu vellen darmen ganglia van sommige weefselsteekproeven ten opzichte van anderen. Begrijpelijk, geldt de algemene snelheid van LCM variabiliteit naargelang de kenmerken van het weefsel van de bron of de intestinale regio wordt bemonsterd. Om deze reden is het vaak best te bereiden veel vers bevroren monsters bij het begin. Over het algemeen hebben we gevonden dat een totaal van 20 monsters per segment van de darm (~ 2 cm x 1,5 cm, elke) veel meer dan voldoende is voor voldoende RNA voor downstream toepassingen. Echter als er slechts een kleine lengte van intestinale weefsel beschikbaar is, is het raadzaam een minimale lengte van 5 cm. Met onze aanpak, zou het laagste rendement die zou zijn verkregen variëren van 18-30 ng van RNA, zoals nader besproken. De minimale 5 cm lengte kan mogelijk worden verminderd, afhankelijk van de toepassing, vooral als er hogere bedragen van cDNA preamplification worden gebruikt. Deze parameters zijn niet getest in de huidige studie. Bijvoorbeeld, zijn darmen ganglia verzameld van full-dikte intestinale biopsie monsters (2 x 2 cm) voor gebruik met qPCR4.
Zoals we in deze studie aantonen, biedt het gebruik van de ethanol-compatibele kleurstof, Cresyl violet, veel betere bescherming van RNA integriteit dan de waterige vlek, toluïdine blauw. Wanneer ondergedompeld in ethanol, RNases worden inactief5,15. RNases kunnen echter nog steeds opnieuw functie eenmaal blootgesteld aan water van7,15. Wanneer de vlekken met waterige verf, moet het weefsel worden blootgesteld aan nuclease-gratis water voor bijna 1 min9, wat tot aanzienlijke achteruitgang van het RNA leidt. Bij het gebruik van toluïdine blauwe weefsel kleuring, konden we verminderen van de blootstelling aan water, voor en na de kleuring, omdat dergelijke wijzigingen ook verminderd de opname en retentie van toluïdine blauw, respectievelijk. Een soortgelijk probleem opgetreden ook met een kleurstof haematoxyline gebaseerde9. In het gewijzigde protocol beschreven hier, vermijdt kleuring met Cresyl violet de rechtstreekse blootstelling van de intestinale monsters water, waardoor maximaal behoud van RNA integriteit. Deze resultaten elimineren de noodzaak voor extra RNase remmers in de kleurstofoplossing. We vonden dat deze remmers niet effectief zijn bij het inschakelen van het gebruik van de waterige kleurstof, toluïdine blauw, zoals het bemoeid met de opname- en de retentie van de kleurstof.
Bij het aanvankelijk optimaliseren onze kleuring protocol, we konden de resultaten in andere protocollen te reproduceren en rapporten5,7,8,11. Terwijl de reden hiervoor onduidelijk is, vonden we verschillende factoren die tot inconsistente kleurstof-opname en retentie leidde. Bijvoorbeeld, hoewel bepaalde protocollen hebben met succes gekleurd weefsel met Cresyl violet in 100% ethanol8 of 75% ethanol5, vergeleken de kleurstof alleen flauw label ganglia of had hoge achtergrond, met Cresyl violet in 95% ethanol. Laatst, het percentage van Cresyl violet gebruikt in de kleurstofoplossing is ook zeer belangrijk. De meeste protocollen aanbevelen een 1% Cresyl violet oplossing7,8, maar deze concentratie did niet zorgen voor betrouwbare kleuring in onze handen, zelfs na de kleuring van secties voor maximaal 2 min. We hadden de beste succes kleuring met een geklaarde verzadigde kleurstofoplossing van 4% Cresyl violet11 toegepast op het monster door een steriele injectiespuit filter8. Deze verzadigde oplossing laat veel sneller vlekken van het monster, in zo weinig als 10-15-s. pre fixatie van het monster in gekoeld 95% ethanol (-20 ° C) maakt een snellere opname van de vlek.
Een ander rapport blijkt dat de darmen ganglia waren meest duidelijk gekleurd in vers bevroren menselijke intestinale secties bij het combineren van Cresyl violet met eosine in een 75% ethanol oplossing5. We vonden echter dat eosine maakte het moeilijker om te identificeren ganglia en dat Cresyl violet, alleen, superieure detectie biedt. In een andere studie bleek dat een gebufferde Cresyl violet-oplossing consistente kleuring resultaten endometriumkanker weefsel10 voorziet. Echter vonden wij dit een verbetering voor menselijke intestinale weefsel niet bieden en ook kan niet worden uitgevoerd bij het gebruik van 95% ethanol voor de kleurstofoplossing.
We hebben een aantal voorwaarden waarop het protocol kan worden onderbroken en hervat op een later tijdstip getest. Vele protocollen stellen voor dia's tevoren segmenteren en opnieuw bevriezen ze bij-80 ° C onmiddellijk na de montage op de dia5,9. Met deze benadering, de kleuring en de LCM kan vervolgens worden hervat in de komende week, biedt grote flexibiliteit. Echter niet alleen dit sterk verstoren kleuring; het verminderd ook RNA integriteit in onze handen (gegevens niet worden weergegeven). Om te omzeilen van dit probleem, raden Grover et al. kleuring en drogen van de secties voorafgaand aan opslag in de diepvriezer11. In deze benadering zijn de dia's gekleurd en gedehydrateerde (zoals in tabel 1) tot de 100% watervrij ethanol stap (protocol punt 5.2). Vervolgens monsters worden geïncubeerd in een tweede flesje van 100% watervrij ethanol voor 10 min en onmiddellijk worden overgebracht naar een conische buis met dessicant gel, die vervolgens wordt gekoeld op droog ijs en overgedragen aan de vriezer-80 ° C. Bij het verwijderen van monsters uit de diepvries, zijn dia's onmiddellijk ondergedompeld in 100% watervrij ethanol voor 30 s en aan voorafgaande aan het uitvoeren van de LCM11. Helaas, in onze handen, is deze aanpak RIN verminderd met 0,6-0,8 (gegevens niet worden weergegeven). Wij zijn het daarom toevlucht genomen tot het uitvoeren van alle afdelen, kleuring en LCM in dezelfde dag met het oog op een maximale integriteit van RNA in onze voorwaarden. Dit blijkt te zijn een tijdrovend proces, maar 10-14 LCM caps kunnen worden gevuld tijdens een volledige dagtaak.
De meest betrouwbare punt waartegen ons protocol kan worden onderbroken is de stap van de incubatie xyleen. Dia's zijn gelaten in xyleen (met moleculaire zeef) voor maximaal 4-5 uur zonder enig zichtbaar effect op RNA integriteit. We hebben vastgesteld dat wanneer er drie dia's worden opgesteld in een tijd, allemaal kunnen worden behandeld met LCM binnen deze termijn, zelfs als een uur pauze nodig is. Een alternatieve optie is om dia's droog na kleuring en uitdroging deelactiviteiten binnen een vacuüm verzegelde exicator16, maar we hebben deze aanpak nog niet geprobeerd.
RNA isolatie is nog een andere cruciale stap de procedure, met de belangrijkste factoren zijn: het verkrijgen van de maximaal mogelijke opbrengst van RNA, behoud van het volledige spectrum van RNA (zonder verlies van kleinere soorten van RNA)17,18, en volledig elimineren genomic DNA van het monster17. In onze handen verstrekt RNA extractie Kit "B" het beste resultaat met onze monsters, zoals het grotere opbrengsten aangeboden en efficiënter aan de genomic DNA eliminatie was. Onze opmerkingen over de verschillen in opbrengsten tussen RNA extractievloeistoffen stroken met voorafgaande verslagen17,18. Er zijn echter ook vele LCM studies die hebben gemeld succes met andere RNA extractie reagentia19,20. Voorafgaande rapporten geven ook aan dat de kolom gebaseerde RNA extractie processen bieden betere retentie van kleine molecules van RNA dan de fenol gebaseerde RNA extractie methoden18 kleine molecules van RNA kunnen worden verloren in het supernatant tijdens neerslag van RNA stappen.
We hebben vastgesteld dat RNA lysis buffers die guanidinium kaliumthiocyanaat gebruiken met extra β-mercaptoethanol is zeer effectief bij het verwijderen van alle gevangen ganglia van het LCM GLB (Figuur 5D). Terwijl de meeste LCM protocollen geeft geen aanwijzingen voor vortexing de lysate, hebben we geconstateerd dat dit uitstekende resultaten levert en niet leidt een aantasting van het RNA tot. Het biedt ook een nog grotere waarschijnlijkheid dat alle ganglia gevangen zal worden vrijgegeven van het GLB voor RNA extractie. Met behulp van deze methoden verkrijgen we over het algemeen RNA opbrengsten van LCM van darmen ganglia in het bereik van 1.8 tot en met 18 ng/cm2 van intestinale weefsel, afhankelijk van hoeveel ganglia op een bepaalde dia aanwezig zijn. Onze RNA-seq-procedure vereist een minimale inbreng van 10 ng RNA kunnen, maar andere procedures veel lagere RNA ingang als een sequencing verwerking een groter aantal pre amplificatie cycli bevat. De totale oppervlakte van weefsel van de voorbereiding en de flash-bevriezing proces opgeslagen is 40-60 cm,2, die ruime RNA voorziet van cDNA Bibliotheek prep en lage-input RNA-Seq toepassingen.
Terwijl onze procedure is ontworpen voor het verzamelen van de hele darmen ganglia, kan de aanpak worden gemakkelijk gewijzigd voor de collectie van één neuronen of glia, indien gewenst5. Echter omdat gliale dichtbevolkte verwerkt zal ensheath neuronen van de ENS, gliale RNA worden opgenomen samen met de RNA van vastgelegde neuronen, zij het op een lagere graven. Dit leidt tot problemen wanneer het proberen om te identificeren van neuronale afschriften uitgedrukt op een lage exemplaaraantal. Eencellige RNA-seq biedt de beste precisie en detectie in dit opzicht, maar vereist neuronen worden losgekoppeld van de intestinale weefsel, gekleurd met pan-neuronale markers, en geïsoleerd met stroom cytometry21 of geheel-intestinale geïdentificeerd dissociations na sortering met bioinformatics benaderingen. Het nadeel van de meeste dissociatie studies is dat de meeste protocollen nodig dat het monster bij kamertemperatuur of 37 ° C gedurende langere perioden, waarvan bekend is dat het veranderen van de transcriptome3worden geïncubeerd. Onlangs, de koude-actieve protease van Bacillus licheniformis is gebruikt voor de generatie van eencellige schorsingen voor weefsels van de muis en het mogelijk toe te passen dit enzym voor dissociatie van menselijk weefsel bij 4 ° C-22. Totdat dergelijke optimalisatie wordt bereikt, is LCM van vers bevroren menselijk weefsel een robuust middel te vangen van RNA voor expressie profilering van perifeer zenuwstelsel elementen zoals darmen ganglia.
Kortom, hebben wij een betrouwbare en consistente protocol voor het verzamelen van RNA van menselijke darmen ganglia ontwikkeld. We hebben de voorbereiding van menselijk weefsel van de darm, kleuring, LCM proces en RNA extractie op basis van talrijke publicaties en protocollen geoptimaliseerd. We hebben ook aangetoond dat de betrouwbaarheid van deze aanpak in het verzamelen van RNA monsters van voldoende RNA kwaliteit voor RNA-Seq. Dit protocol kan kan worden toegepast in grote lijnen op weefsels verkregen van patiënten met een aantal gastro-intestinale ziekten en gemakkelijk aangepast voor gebruik met knaagdier modellen, waardoor het aanbieden van een betrouwbare strategie voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan de donoren en hun families die dit werk mogelijk gemaakt. Wij waarderen ook de hulp van medewerkers aan het International Institute of Medicine en Tennessee donorschap voor het helpen van de coördinaat collectie van weefsel in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 tot EMS2 en toelage ondersteuning van NIH T32-DK007673 naar AMZ. We zijn dankbaar voor personeel van de Vanderbilt translationeel pathologie gedeelde Resource voor toegang tot de LCM Instrument en adviezen over de voorbereiding van het weefsel. De Vanderbilt weefsel pathologie gedeelde Resource wordt gedeeltelijk ondersteund door de NIH grants P30-CA068485-14 en U24-DK059637-13. Wij danken het genoom Technology Access Center in het departement van genetica aan de Washington University School of Medicine voor hulp bij genomic analyse. De GTAC is slechts gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Center ondersteuning Grant #P30 CA91842 aan de Siteman Cancer Center en ICT/CTSA Grant #UL1TR002345 van het National Center voor onderzoek middelen (NCRR), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH) en NIH Routekaart voor medisch onderzoek. Deze publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van NCRR of NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
