Summary
O objetivo do presente protocolo é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos isolados de não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Este protocolo envolve congelado amostras de tecido intestinal humano, cryosectioning, coloração etanólica e desidratação, LCM, a preparar e a extração do RNA.
Abstract
A finalidade desse método é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos colhidos não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Nós identificamos cinco etapas do fluxo de trabalho que são cruciais para a obtenção de RNA isolados de gânglios entéricos com qualidade e quantidade para RNA-Seq Em primeiro lugar, ao preparar o tecido intestinal, cada amostra deve ter excesso de líquido removido pela mancha antes de achatamento do serosa, tanto quanto possível através da parte inferior dos moldes base grandes. Amostras são então rapidamente congeladas em cima de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane. Em segundo lugar, quando cortar o tecido, é importante para a posição cryomolds para que seções intestinais paralelo ao plano completo do Plexo mioentérico, produzindo, assim, a maior área de superfície dos gânglios entéricos por slide. Terceiro, durante a LCM, polietileno napthalate (caneta)-slides de membrana para oferecer a maior velocidade e flexibilidade para delinear as formas não-uniforme dos gânglios entéricos quando coletando gânglios entéricos. Em quarto lugar, para visualização distinta dos gânglios entéricos dentro de seções, etanol-compatível com corantes, como Violet cresilo, oferecem excelente preservação da integridade do RNA em relação a corantes aquosos. Finalmente, para a extração de RNA de gânglios capturados, observamos diferenças entre jogos comerciais da extração do RNA que rendeu superior quantidade de RNA e de qualidade, ao eliminar a contaminação de DNA. Otimização desses fatores no atual protocolo grandemente acelera o fluxo de trabalho e produz amostras de gânglios entéricos com excepcional qualidade de RNA e quantidade.
Introduction
Este método foi projetado para obter amostras de RNA de alta qualidade dos gânglios entéricos do tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). O protocolo descrito aqui foi otimizado para fornecer qualidade de RNA e rendimentos suficientes para o RNA (RNA-seq) de sequenciamento e destina-se a ser usado com o recém-ressecados, não fixado, congelado tecido intestinal humano.
Transtornos da motilidade gastrointestinal e intestino funcional afetam um em cada quatro pessoas nos Estados Unidos. O sistema nervoso entérico (ENS), também conhecido como o segundo cérebro1, muitas vezes está no centro desses distúrbios, como desempenha um papel fundamental na homeostase de intestino e motilidade. Manipulação da motilidade do intestino tem sido geralmente restrita a ressecção cirúrgica do tecido agangliônico/noncontractile, modificação dietética crônica e/ou medicamentos. Surpreendentemente, a transcriptoma cheia de ENS o adulto permanece para ser sequenciado, limitando grandemente a nossa capacidade de identificar moléculas dentro do ENS que podem ser direcionados farmaceuticamente ou utilizados em terapias de células-tronco.
Há relativamente poucos métodos para isolar o RNA de gânglios entéricos humanos. A primeira abordagem, a dissociação de célula2, requer incubação alta temperaturas e tempos de incubação longo; ambos dos quais são conhecidos por promover a degradação de RNA e alterar o transcriptoma2,3. Uma abordagem alternativa, LCM, mais confiantemente preserva a transcriptoma e protege a integridade do RNA. Embora diversos estudos utilizaram LCM para coletar gânglios do tecido intestinal humano fresco congelado4,5,6, essas abordagens também foram prejudicados pela má qualidade do RNA e quantidade, foram bastante trabalhosas, ou necessária a modificação da coloração ou técnicas de extração de RNA para trabalhar nas nossas mãos. Outros protocolos de LCM projetados para a preservação do RNA que foram encontrados no produto LCM manuais fornecidos melhorias adicionais7,8, mas a adaptação foi necessária quando aplicado ao isolamento dos gânglios entéricos8, 9. por estas razões, nós desenvolvemos um protocolo otimizado com base nesses recursos que produz quantidades substanciais de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos humanos, tem um fluxo de trabalho relativamente rápido e produz resultados consistentes através de um grande número de amostras.
Neste estudo, apresentamos uma sinopse de procedimentos otimizados que facilitar o isolamento do RNA de alta integridade dos gânglios entéricos, originados de tecido intestinal humano ressecado. Nosso método incorpora cinco aspectos importantes. Primeiras, recém-ressecados, unfixed amostras intestinais humanas devem ser aparadas de tamanho, tem toda a umidade em excesso removido com um tecido de laboratório e achatada em um molde grande base antes do flash-congelamento em cima de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane (2 MB). Em segundo lugar, histológicas seções do intestino devem estar preparadas para obter o plano completo do Plexo mioentérico em um slide, que oferece uma grande carga de gânglios entéricos. Sucesso com este passo é largamente dependente do processo de preparação do tecido. Em terceiro lugar, a estrutura não-uniforme de gânglios no ENS requer o uso de polietileno napthalate (caneta) membrana slides6, que oferecem a maior velocidade e precisão durante o processo de LCM. Quarta, etanol-compatível com tinturas, tais como cresilo violeta, devem ser usadas para preservar a integridade do RNA enquanto coloração gânglios entéricos. Por último, o processo de extração de RNA é fundamental para um bom resultado com RNA-Seq Buscamos uma abordagem de extração de RNA que produz alta integridade do RNA, maximiza o rendimento do RNA quando começando com pequenas coleções de gânglios entéricos, elimina a contaminação de DNA e mantém o maior número de espécies de RNA quanto possível.
Tomados em conjunto, otimização desses fatores no presente estudo grandemente acelera o fluxo de trabalho e produz amostras dos gânglios entéricos com excepcional RNA de quantidade e qualidade. Os resultados foram amplamente consistentes entre um grupo considerável de amostras, indicando a consistência desta abordagem. Além disso, usamos essas abordagens para sequenciar com sucesso dezenas de amostras de RNA dos gânglios entéricos. As estratégias destacadas aqui também podem ser adaptadas em geral para a realização de LCM de gânglios desejados ou núcleos de periférico e sistema nervoso central e outros casos que requerem o isolamento do RNA de alta qualidade.
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Protocol
Todos os protocolos aqui descritos foram aprovados pela Vanderbilt University institucional Review Board (IRB).
1. preparação antes da chegada do tecido
- Obter a devida aprovação do IRB e coordenar com as agências de doação de órgão humano para obter o tecido intestinal não fixado, recém-ressecados de doadores que atendam todos os critérios de pesquisa necessários para o estudo.
Nota: Este protocolo pode ser adaptado para uso com ratos e outros roedores modelos.- Imediatamente após a ressecção de cada segmento intestinal, lave minuciosamente o lúmen com PBS refrigerados ou meio de armazenamento de tecido para remover material residual luminal ou fezes.
- Após a lavagem e descarte de resíduos em um recipiente apropriado risco biológico, mergulhe o tecido em um volume suficiente de meio de tecido-armazenamento (por exemplo, 3 - 5 vezes o volume do tecido intestinal) e armazenar em plástico rotulados individualmente, à prova d'água recipientes, submerso em gelo ou refrigerada até o uso).
- Processo o tecido dentro de 18-26 horas do tempo de coleta para evitar degradação substancial de RNA.
Nota: Dependendo da limpeza do segmento intestinal e armazenamento, pode ser possível estender nosso prazo sugerido.
- Preparar todos os materiais necessários para coleta de tecido humano com antecedência, conforme indicado no presente protocolo (consulte a Tabela de materiais , para obter informações mais detalhado do produto). Certifique-se de que todos os necessários equipamentos de proteção individual é usado em todos os momentos.
- Prepare os baldes de gelo seco, juntamente com uma pasta de gelo seco conforme mostrado na Figura 1.
- Esmague bastante gelo seco para preencher 4 padrão circulares baldes de gelo e um balde de gelo retangular. Um dos baldes padrão deve ter laboratório pequeno (11 x 21 cm) tecidos colocados na superfície do gelo seco. Se possível, use o novas, por abrir caixas de lenços de laboratório.
- Faça uma pasta de gelo seco por powderizing 2L de gelo seco em um balde de gelo limpo retangular.
- Adicione 2-MB previamente refrigerada até a superfície do gelo seco. Ligeiramente, misturar e achatar o chorume usando uma tampa de caixa de ponta de pipeta à superfície de forma do chorume em um canal cercado por pedaços grandes de gelo seco ao longo dos lados do balde retangular.
- Coloque vários blocos finos de gelo seco ao longo das bordas do balde de gelo para incentivar a congelação mais rápida. Deve haver espaço para ≥4 moldes base caber vagamente no balde de gelo seco de chorume em um determinado momento.
- Opcionalmente, pilha o balde de gelo dentro de outro balde de gelo Retangular preenchido ¼ com gelo seco. Este posicionamento ajuda a isolar melhor o chorume de gelo seco e evita a necessidade de ajustes frequentes de gelo seco e 2 MB durante o procedimento.
- Posicione os baldes de gelo seco em uma linha de montagem na seguinte ordem: 1) gelo seco balde de chorume, balde de gelo 2) laboratório tecido seco, 3 & 4) normais baldes de gelo secos, balde de gelo 5) retangulares (Figura 1A).
2. preparação do tecido Intestinal humano congelado
Nota: Todo esse processo pode levar entre 45-80 min por segmento intestinal, dependendo da qualidade do tecido intestinal. Recomendamos também que recolher amostras de controlo de qualidade para avaliar a qualidade do RNA e histologia antes de prosseguir com a LCM.
- Encha uma grande bandeja com gelo molhado e colocar placas de corte cirúrgico em cima do gelo seco.
- Nesta instalação, acalme-se um béquer de 500 mL e 100 mL para armazenar o tecido e segmentos aparados em solução de armazenamento de frio. Moldes de base pre-calma sobre as tábuas de corte para que eles estão prontos para receber o tecido.
- Após receber o tecido intestinal fresco, despeje a mídia em que o tecido é transportado e retê-lo os copos previamente refrigerados. Deixe algum espaço nestes copos para o armazenamento temporário do tecido intestinal e segmentos aparados, que serão preparados em etapas subsequentes.
- Corte o segmento intestinal a um comprimento de aproximadamente 20 cm, que fornece amplo tecido (40-60 cm2) para gerar o RNA para aplicações a jusante e amostras de controlo de qualidade. Dependendo da integridade do tecido, ela pode ser viável para realizar o isolamento de RNA para processamento a jusante, com um comprimento muito menor (ou seja, 5 cm do intestino).
- Apare fora adiposo e tecido conjuntivo no intestino com uma tesoura cirúrgica. Adiposa junto o serosa intestinal residual compromete a capacidade de achatar totalmente tecido em etapas subsequentes. Apare cuidadosamente o tecido, a fim de evitar entalhar as membranas serosas durante a remoção da gordura e do tecido conjuntivo, que estruturalmente pode danificar o Plexo mioentérico ou fazer com que o exterior do tecido achatar desigualmente para corte.
- Faça uma incisão longitudinal ao longo de todo o comprimento da amostra intestinal, de preferência no local de fixação mesentérica.
- Dissecar afastado e descartar a ténia coli do cólon, para que ele achata mais facilmente, após ser liberado de tensão.
- Splay lado mucosa do intestino para baixo em uma placa de corte refrigerado e cortar tiras de 1,25 cm de largura do comprimento total do tecido.
Nota: Tecido Intestinal expande-se muitas vezes depois de aparelhar, assim deste tamanho deve ser ajustado em conformidade. - Armazene temporariamente as tiras em solução de armazenamento de tecidos refrigerados.
Nota: Nós usamos a solução de armazenamento frio Belzer UW porque tem uma vida útil longa, é relativamente de baixo custo e podem ser armazenado à temperatura ambiente até que seja necessário. - Remova a solução de armazenamento frio uma tira de tecido e corte-o em segmentos ~1.5-2 cm de comprimento.
- Rapidamente borre os segmentos intestinais sobre uma pilha de lenços de laboratório, para remover o excesso de líquido e evitar a formação de cristais de gelo ao longo do serosa intestinal durante congelamento flash. Se o tecido não é suficientemente secos, será difícil obter as seções de alta qualidade do Plexo mioentérico.
- Deite o borrado peças intestinal mucosa-lado para um pre-refrigerado, grande, descartável base molde plástico (37 x 24 x 5 mm).
- Achate cuidadosamente cada segmento levemente esticar o tecido sobre a superfície do molde base e usando pinça curva suavemente Pressione para baixo e expulsar quaisquer bolhas de ar que podem ser preso sob o serosa. Observe que o tecido se expande enquanto o achatamento. Se necessário, apare os segmentos e cortar as amostras restantes em um tamanho menor.
Nota: Se o tecido for excessivamente esticado, isto irá distorcer o Plexo mioentérico. Após todas as bolhas de ar são removidas, avalie a espessura da amostra antes da congelação. Se necessário, empurre as bordas do interno a amostra até a amostra intestinal se aproxima de sua espessura original. - Coloque o molde base carregado para a superfície do gelo seco, chorume de 2 MB. O tecido deve congelar completamente dentro de 30-60 s, dependendo do tamanho e espessura do segmento intestinal.
- Seque o fundo do molde base para remover residual 2-MB esfregando rapidamente o molde base sobre os tecidos de laboratório pré-refrigerados no segundo balde de gelo seco.
- Transferir a amostra seca para a terceira banheira de gelo seco e enterrá-lo sob a superfície do gelo seco, até que esteja pronto para ser enrolado.
- Rapidamente observe a parte inferior do molde base antes da embalagem, para examinar a qualidade da preparação da amostra. Anote quaisquer amostras que não aparecem plana ou tem bolhas de ar grandes, como estas devem ser evitadas para cryosectioning e LCM.
- Enrole a amostra em papel de alumínio previamente rotulado que é colocada em cima de gelo seco em um balde, para que o envolvimento do tecido ocorre ao mesmo tempo sendo mantidas completamente congeladas.
- Enrole a amostra com uma camada de plástico, para minimizar a desidratação do tecido durante o armazenamento a-80 ° C.
- Armazenar as amostras no balde retangular até que estejam prontos para ser movido para o congelador.
- Pre-rotular e pre-relaxar caixas de congelador a-80 ° C para armazenamento imediato das amostras após a coleta.
- Pegue uma pequena porção de tecido de cada segmento intestinal para avaliação da integridade do RNA antes da realização de LCM.
- Pré-etiqueta um tubo de RNase-livre de 2mL para cada segmento, cheio de ≥500 µ l de tampão de Lise. Nós recomendamos usar o Kit de extração de RNA "D", constantes da Tabela de materiais.
- Homogeneizar um pedaço pequeno (2 mm x 2 mm) do intestino em um padrão micro-homogeneizador (20-40 s, até permanecem sem pedaços de tecido). Então, imediatamente congele o RNA lisado em gelo seco e loja a-80 ° C até prosseguir com a extração do RNA.
- Opcionalmente, incorpore algumas das seções no meio de congelamento de tecido (TFM) como um back-up. Preparar os cortes histologicos da mesma maneira descrita nesta seção, mas submergir as amostras no TFM dentro do molde base antes do congelamento flash.
3. Cryosectioning
- Antes cryosectioning, preparar todos os materiais necessários para a coloração e a desidratação e transferir as amostras de tecido desejado do freezer-80 ° C num balde de gelo seco.
- Preparar o criostato para uso definindo para a temperatura de corte ideal (-18 a-22 ° C) e limpar as superfícies com 100% de etanol e tratando a lâmina e escovar a bandeja com solução de descontaminação de RNase.
- Para melhor aderir a amostra para o chuck, use a seguinte abordagem.
- Coloque a pinça em gelo seco para pelo menos 30 s antes de desembrulhar a amostra intestinal e colocando-o na superfície do gelo seco serosa-lado-acima.
- Encham um suporte de amostra grande criostato com um monte de 3-5mm de meio de congelamento de tecido (TFM) e imediatamente transferir a amostra intestinal serosa-lado-para cima para o TFM.
- Rapidamente transferi o suporte de amostra de gelo seco e cubra com powderized gelo seco depois permitindo o TFM aderir à amostra para 2-5 s à temperatura ambiente. Certifique-se que o TFM permanece abaixo do plano do Plexo mioentérico.
Nota: Idealmente, a superfície exterior da mucosa intestinal totalmente aderirão o TFM antes o TFM começa a congelar sem descongelação da amostra.
- Monte o suporte de amostra no cabeçote do criostato e alinhar a amostra com a lâmina do criostato, tal que o avião do Plexo mioentérico será paralelo à lâmina de corte.
- Defina a espessura de corte no criostato para 8 µm. O objetivo de alinhar perfeitamente o espécime é obter a maior área de superfície possível do Plexo mioentérico em cada slide. Esta espessura é geralmente recomendada para tecidos humanos e roedores, mas pode ser ajustada conforme necessário.
- Secção através da serosa e músculo longitudinal até atingir o Plexo mioentérico.
- Para localizar o Plexo mioentérico, montar uma seção de amostra numa lâmina e manchar a seção com uma tintura aquosa, tais como 1% cresilo violeta ou azul de toluidina, etc.
- Consulte a secção sob um microscópio de luz no 40-2000 X ampliação para identificar a junção entre as camadas musculares longitudinais e circulares. Microscópio parâmetros são fornecidos na Tabela de materiais. No início do corte, as membranas serosas serão marcada pela presença de tecido conjuntivo. Gordura mesentérica restante pode estar presente ao longo do serosa. Começa, então, uma folha da camada muscular longitudinal externa. Quando tiver alcançada a fronteira entre as camadas musculares longitudinal e circular, observar-se-á uma parte dos gânglios entéricos.
Nota: Nas próximas seções diversas, o Plexo mioentérico vai se tornar muito evidente, com grandes áreas de gânglios estando presente dentro de uma única seção (Figura 2C). Se o tecido não é completamente plano no início do corte, então, apenas uma parte dos gânglios estará presente em cada seção em um determinado momento. Às vezes, a amostra intestinal pode ter um Plexo mioentérico inerentemente desigual, apesar do tecido aparecendo perfeitamente plana. Isto é especialmente verdadeiro para as amostras do duodeno. Em nossa experiência, estas amostras podem levar muito mais tempo para processar com LCM, mas suficiente RNA pode ser coletado dentro da sessão do dia. A localização exata do Plexo mioentérico pode variar consideravelmente entre as amostras, baseadas sobre o tecido e a sua preparação antes do congelamento.
- Começa a recolher seções seriais para LCM, com coleções ideais, fornecendo o maior número de neurônios e glia por slide. Dependendo da área da superfície da amostra, várias seções podem ser combinadas em um único slide de caneta-membrana.
- Monte as seções sobre guias de membrana de caneta, refrigeradas brevemente em criostato para 5-10 s. Durante a montagem, o tecido deve derreter ligeiramente, maximamente, preservando a integridade do RNA.
4. coloração
Nota: Para uma visão geral do processo de coloração, consulte a tabela 1. Todas as soluções utilizadas são preparadas em padrão frascos de Erlenmeyer de 50 mL. Tratar o exterior dos tubos com solução de descontaminação de RNase parece não melhorar os resultados (dados não mostrados).
- Preparar uma solução saturada de violeta de cresilo 4% em etanol a 95% pelo menos um dia de antecedência e totalmente re-suspender a violeta cresilo antes de carregar a seringa.
Nota: A concentração de etanol pode precisar ser reduzido para coloração eficaz, conforme descrito na seção de discussão. Nós não testamos se usar etanol 50% ou 75% durante coloração significativamente reduz a integridade do RNA. Violeta de cresilo é sensível à luz e, portanto, deve ser protegida da luz. - Depois de montar seções do Plexo mioentérico para o slide, imediatamente submergir o slide em um frasco Erlenmeyer de etanol a 95% (pre-refrigerado a-20 ° C) por 30 s.
- Se as seções não se aderiu totalmente ao escorregão na etapa anterior, aquecer ligeiramente o fundo do slide com uma mão enluvada (uma limpeza de laboratório deve ser colocado no meio do slide e luva), para total aderência antes submergindo em etanol a 95%. Esta solução pode ser reutilizada pelo menos 3-6 slides sem reduzir a integridade do RNA.
- Coloque a slide viradas para cima em uma limpeza de laboratório colocada em cima de um recipiente previamente tratada, livre de RNase8.
- Pre-encher uma seringa de 3mL com violeta de cresilo 4% e anexar um filtro de seringa 0,2 µm.
Nota: Recomendamos filtros de acetato de celulose. - Aplicar 6-10 gotas de mancha diretamente sobre o tecido seções8 e incubar por 10-30 s, ou até tinta suficiente é retida quando de manchado. Enquanto a coloração, Rode suavemente o recipiente de slide manualmente para garantir que as secções de tecido são uniformemente revestidas com mancha.
- Deite fora a mancha e imediatamente de manchar o slide em um frasco de 75% de etanol. Repetidamente submergi o slide até o corante em excesso se infiltrou na maior parte da amostra. Isto pode demorar entre 10-20 s.
- Finalize de coloração mergulhando repetidamente a amostra em um frasco de etanol a 95% para 10 s. submergir a amostra várias vezes até que todo excesso mancha foi removida.
- Modifica a duração descoloração, conforme necessário, para otimizar a coloração dos gânglios. Se demasiado mancha é removida, a amostra torna-se muito transparente e pode ser difícil Visualizar
Nota: Este protocolo de coloração foi otimizado baseado em várias publicações5,8,10,11 que necessária modificação antes de que obtiveram-se resultados satisfatórios. Portanto, a concentração de álcool etílico utilizado na tintura e durante o processo de descoloração deve ser modificada, quando necessário, para obter um resultado ideal.
- Modifica a duração descoloração, conforme necessário, para otimizar a coloração dos gânglios. Se demasiado mancha é removida, a amostra torna-se muito transparente e pode ser difícil Visualizar
5. a desidratação
- Imediatamente, mergulhe o slide em etanol 100% 2 - 3 vezes, para um total de 10-20 s.
- Submergir o slide em 100% de etanol anidro pelo menos 30 s. Como o etanol anidro é muito higroscópico, adicione peneiras moleculares (malha de 8-12) para o frasco de etanol 100% antes do início do procedimento para remover toda a água absorvida e, portanto, mais completamente desidratar a amostra5.
- Repetidamente, mergulhe o slide em xilol para 15-20 s. Esta etapa totalmente remove a camada de etanol no slide. Adicione os tubos de xileno, para adsorver totalmente o excesso de etanol e água moléculas5peneiras moleculares antes do tempo.
Cuidado: Xilenos são classificados como um irritante para os olhos e trato respiratório superior e devem ser usados em uma coifa de química. - Submergi o slide em xilol (com peneiras moleculares, malha de 8-12) pelo menos 10 min.
Nota: Uma breve pausa pode ser tomada após esta etapa, se necessário. Amostras podem ser deixadas no xilol para 4-5 horas sem efeitos prejudiciais à mancha, rendimento/integridade LCM ou RNA. - Opcionalmente, individualmente prepare vários slides adicionais neste momento. Se preparar uma segunda rodada de slides após completar LCM em todos os slides preparados, o tecido no criostato pode precisar de ser refaced, devido à desidratação da superfície do tecido. Um a quatro seções podem precisar de ser descartado antes de seções utilizáveis podem ser coletadas.
6. laser captura Microdissection (LCM)
- Remover o slide de xileno e secar ao ar livre, em uma coifa química pelo menos 1 min. inserir um cartucho de caps LCM na fase de microscópio LCM. Carregar o slide para o palco e adquirir uma imagem panorâmica do slide.
- Identificar o local desejado para LCM e carregar uma tampa sobre o slide.
- Alinhe o laser de infravermelho (IR) e ajustar a sua alimentação e duração para fazer um 20-30 µm de diâmetro captura local.
- Localize o laser ultravioleta (UV) e defina uma intensidade e velocidade de corte adequada.
- Contorne os gânglios desejados para ser coletados usando o software de LCM, certificando-se de ficar dentro do limite da área de colecionável no tampão (retratado no geral slide do programa de software como um círculo verde).
- Em cada um dos traços, ajuste os pontos IR tais que haja pelo menos um spot de IR todos os 100-500 µm.
- Pressione o botão de corte de IR/UV para prosseguir com a coleção de todos os gânglios marcados.
- Coleções são concluída, mova a tampa para um novo local e repita o processo de coleta ou examinar o cap LCM na estação de QC, uma vez que o limite é suficientemente preenchido com gânglios (ou até que seja atingido o limite de tempo recomendado de 60-80 minutos).
- Se os restos estão presentes no tampão, limpá-lo usando um pincel de ponta fina que foi previamente tratado com solução de descontaminação de RNase, enxaguado com água livre de nuclease e completamente seco.
- Cuidadosamente examinar a tampa a olho nu ou com ampliação sob um microscópio de campo claro para assegurar todos os detritos foi removido. Se os resíduos não podem ser removidos através da utilização do pincel previamente tratada, use uma ponta de pipeta fina (RNase-livre) para raspar os restos.
- Fixe a tampa de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL cheio com 230 µ l de tampão de lise de RNA (RLT Buffer do Kit de extração de RNA "B", com β-Mercaptoetanol adicionado em uma concentração de 10 µ l/mL).
- Inverter o cap, brevemente vortex e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
- Centrifugar a ≥ 5.000 x g por 5 min e depois transferir a microcentrífuga de tubo de gelo seco.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Lisados de RNA podem ser armazenados a-80 ° C, sem um efeito substancial na degradação de RNA pelo menos 1 semana. Se a isolação do RNA é executada no mesmo dia, então relaxa as amostras no gelo até que estejam prontos para a extração. - Execute todas as coleções adicionais dentro do limite de tempo máximo recomendado de 80-90 min depois de remover o slide do xileno. Como as seções desidratadas são expostas à umidade do ambiente, RNases pode tornar-se gradualmente reativado. Restringir o período de coleta pode minimizar esses efeitos e màxima preservar a integridade do RNA.
7. isolação do RNA
- Prepare uma estação de trabalho livre de RNase para extração de RNA.
- Preparem-se todos os tubos e os reagentes de acordo com o manual para o Kit de extração de RNA.
Nota: Enquanto há muitos kits disponíveis para isolamento de RNA seguindo LCM, tivemos sucesso melhor usando o Kit de extração de RNA "B", constantes da lista de materiais. Consulte a Figura 5 para uma comparação lado-a-lado dos reagentes de extração de RNA. - Retire amostras do freezer-80 ° C e descongelar rapidamente em banho maria a 37 ° C.
- Imediatamente o vórtice descongelados amostras para 2-3 s para distribuir uniformemente os sais de tiocianato de guanidínio.
- Combine cada amostra com igual volume de etanol a 70%. Juntar 2 ou mais lysates, se necessário, para atingir uma concentração suficiente de RNA.
- Proceda conforme as instruções do fabricante no manual para o processo de extração de RNA, usando o protocolo otimizado para amostras microdissected.
- Eluir RNA na etapa final para o volume mínimo recomendado de água livre de nuclease (14 µ l).
- Após o isolamento do RNA, alíquota 1-2 µ l de RNA de cada amostra em uma nova pre-rotulado tubo livre de RNase para controle de avaliação de qualidade de qualidade com um dispositivo microfluídica que pode visualizar pequenas quantidades de RNA, como um Bioanalyzer. Alíquota um adicional 1 µ l em um tubo separado para quantificação com um kit de quantificação de RNA de alta sensibilidade.
- Ajuste estes passos, conforme necessário, para obter uma quantidade suficiente de RNA para análise a jusante (i. e., reunir um número maior de LCM caps antes da extração do RNA).
- RNA de loja a-80 ° C até coletar suficiente amostras para análise a jusante.
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Representative Results
Fizemos várias melhorias para protocolos existentes que permitem a coleção relativamente rápida dos gânglios entéricos de amostras intestinais humanas usando LCM, atendendo aos padrões de RNA-Seq Primeiro, nós aperfeiçoamos a congelação rápida de segmentos de tecido intestinal em grandes moldes base colocados na superfície de uma suspensão de gelo seco em 2 MB (Figura 1B). O melhor sucesso durante cryosectioning e subsequente LCM foi obtido mediante o estabelecimento de segmentos intestinais plana dentro de um molde base, voltado para o lado-mucosa acima (Figuras 1B-1C). Certifique-se de que os moldes de base são tão planos quanto possível na base, como qualquer curvatura tornará muito mais difícil obter uma grande secção transversal do Plexo mioentérico. Essa abordagem resulta em tecido que é facilmente seccionado em 8 µm espessura (Figura 1E) e permite a eliminação completa de TFM do processo de coloração. Descobrimos que TFM interfere com o processo de coloração e obscurece assim a identificação dos gânglios entéricos. Posicionamento do tecido nesta orientação também evita corte através da mucosa, que tem um alto teor de RNases12, apesar de nossa experiência, parece que o uso de etanol manchas inibe em grande parte estes RNases. Em casos onde TFM ou ideal da temperatura de corte médio (OCT) é necessário, nós a encontramos mais confiável para primeiro achatar a amostra no fundo do molde base e em seguida, adicione o TFM no molde, seguindo este passo (Figura 1D). Isto deixa uma "janela" em que o intestino pode ser facilmente visualizado, tornando mais fácil para alinhar o espécime e produzir seções que são completamente paralelas ao Plexo mioentérico (Figura 1E).
Preparação de cryosections longitudinalmente todo o comprimento do intestino em uma orientação paralela ao Plexo mioentérico (Figura 2A), gera seções em que a maior área dos gânglios entéricos por slide são visíveis em cima (a coloração Figura 2 C). quando se aproxima o Plexo mioentérico (Figura 2C), com a aposição das camadas musculares longitudinais e circulares (Figura 2B), 6-12 seções seriais podem ser coletado (Figura 2A, longitudinal) que contêm grandes áreas de gânglios entéricos (Figura 2C). Tampões de LCM podem ser carregadas à capacidade usando uma única seção (Figura 4-D). Em contraste, quando preparando seções transversais do intestino fresco congelado (figuras 2A-2B), há apenas uma pequena área de Plexo mioentérico presente em cada slide (Figura 2B). Muito poucos gânglios entéricos podem ser coletados de seções transversais do tecido, resultando em maior tempo investido e o custo mais elevado por amostra global. A abordagem paralela-seccionamento usa menos de um quinto do número de caps de LCM e slides em comparação com secções transversais e acelera consideravelmente o processo de coleta.
Antes de LCM, amostras devem ser manchadas e totalmente desidratadas para evitar atividade RNase durante a coleta de LCM. Nós projetamos um experimento para comparar diretamente o efeito de manchas aquosas vs etanólica manchas na integridade do RNA. Neste experimento, duas seções intestinais foram montadas juntos em um único slide e foram processadas em uma das quatro maneiras, com n = 2-3 repetições biológicas por grupo. No primeiro grupo, novas seções intestinais não foram montadas numa lâmina e cada um foi transferido diretamente em tampão de lise de RNA usando fórceps RNase-livre pre-refrigerado em gelo seco(Figura 3). Para todos os restantes grupos, seções foram aderiu a um slide, processadas, raspadas de slide usando uma lâmina de barbear solução tratada RNase descontaminação e transferidas para tampão de lise de RNA com fórceps RNase-livre. Um padrão micro-homogenizador foi usado para lisar totalmente as amostras em todos os grupos. No segundo grupo, os slides foram processados por todos os passos, mas nenhuma tintura foi utilizada durante o procedimento de coloração (Figura 3B). Grupo três foi processada com o protocolo descrito acima, usando tintura de cresilo violeta de 4% (Figura 3C). No quarto grupo, utilizou-se uma mancha aquosa, toluidina azul, enquanto seguem o protocolo para um kit de coloração base aquosa, usando uma mistura de azul de toluidina e hematoxilina (Figura 3-D). Após a extração do RNA, conforme descrito, a qualidade do RNA foi avaliada com um Bioanalyzer. A única diferença entre o aquoso e etanólico de protocolos de coloração foi a adição de dois incubação do água (30 s cada), imediatamente antes e depois da coloração, que é necessário para a absorção e retenção do corante. Descobrimos que o processo de aderência cortes de tecido para o slide e processamento com as etapas de desidratação, conduziu a uma redução ligeira, inevitável de qualidade de RNA (Figura 3A-3B), mas que a coloração com o corante de etanol, violet cresilo, não mais Reduza a qualidade do RNA (Figura 3C). Em contraste, a tintura aquosa, azul de toluidina, levou à degradação substancial de RNA, provavelmente devido à exposição prolongada de aquosa que permite a atividade endógena de RNase (Figura 3-D).
As formas originais dos gânglios entéricos colocam dificuldades para IR-LCM padrão com corrediças de vidro convencional6 (Figura 4). Quando usando slides de caneta-membrana (Figura 4B), as amostras sejam cumpridas de uma folha fina que for retirada a maioria da lâmina de vidro. O laser UV atravessa a amostra e a membrana de caneta, originando o desprendimento completo do gânglio do slide (Figura 4C) e total aderência à tampa do LCM (Figura 4-D). Desejado de estruturas de qualquer tamanho e forma (> 10-15 µm) pode ser completamente e precisamente coletadas (Cifrado 4E-4 H). Para algumas amostras com menos gânglios por seção, a tampa pode ser movido ≥ quatro vezes antes de coletar. Neste caso, duas ou três seções por slide de montagem minimiza o uso de slides de caneta-membrana.
Quando isolar o RNA de amostras de LCM para RNA-seq, o objetivo é obter a melhor qualidade possível de RNA e a quantidade, ao eliminar o DNA genômico tudo (gDNA). Para identificar um procedimento de isolamento de RNA ideal, realizamos um Head-to-comparação com um Kit de extração de RNA "A" (Figura 5A), Kit de extração de RNA "B" (Figura 5B), ou método de extração de RNA "C" com o clean-up de amostras de RNA pelo Kit de extração de RNA "B" (Figura 5-C). Após o processamento de amostras com a violeta de cresilo otimizada mancha o protocolo, LCM foi usado para recolher amostras de circulares padronizadas (diâmetro de 500 µm) de tecido intestinal, retirado a camada muscular longitudinal. Cada cap foi aleatoriamente a cada um dos três grupos de isolamento do RNA, sendo colocados em cima de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL pré-preenchido com o respectivos lise de cada kit. As instruções foram seguidas exatamente como descrito por cada kit, com Kit de extração de RNA "Um" tampão de Lise exigindo incubação a 42 ° C por 30 min. Para os outros kits, temperatura de incubação foi usada por 30 min. Todas as amostras foram brevemente vortexed sobre adição de Lise. As amostras foram então refrigeradas no gelo até extrações foram realizadas no mesmo dia (n = 4). Nós achamos que Kit de extração de RNA "B" com um passo de digestão de DNA na coluna resultou na mais alta qualidade de RNA e quantidade, eliminando efetivamente gDNA (figuras 5A-5C). Importante, a lise de RNA fornecido pelo Kit de extração de RNA "B" totalmente lise os gânglios capturados quando coletando gânglios entéricos (Figura 5-D).
Em média, nossas amostras tem um RIN de 7.49 ± 0,53 (tabela 2). Golo de RIN de superior a 6-7 é considerados de qualidade suficiente para RNA-seq (dependendo do perfil específico do RNA)13, dando-nos confiança de que nossas amostras são de qualidade suficiente para RNA-Seq. Considerando que a RIN para estas amostras, após o recebimento, variou de 7,4 para 9.5, estes resultados indicam que nosso protocolo otimizado fornece excelente preservação da integridade do RNA. Resultados de qualidade de RNA representativos das amostras enviadas para RNA-seq são retratados em Figuras 6A-6C. Resultados do RNA-seq demonstram que nossas amostras foram sequenciadas com sucesso e têm um viés de modesto 3'-extremidade (Figura 6D). Geralmente, um maior 3'-viés é favorecido em amostras com baixa RIN14; Este efeito é moderadamente refletido em nossas amostras. Apesar disso, os biótipos de gene observados foram amplamente consistentes entre todas as amostras (Figura 6E), indicando a confiabilidade dos dados.
Figura 1 . Ideal de congelamento de tecido intestinal. Baldes de gelo seco (A) são preparados na ordem descrita; Eu) gelo seco chorume, tecidos de laboratório ii) colocados no topo de gelo seco, balde de armazenamento iii) temporário, balde iv) envolvimento, balde de armazenamento v) pré-congelador, balde de estouro de armazenamento vi) pré-congelador. (B) nós aperfeiçoamos a congelação rápida de segmentos de tecido em grandes moldes base colocados na superfície de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane. (C) A imagem de aproxima-te de um espécime totalmente congelado, observada na configuração mostrada no painel B. Intestinal segmentos são colocados horizontalmente em um molde base para cima, mucosa-lado. (D), esse método de congelamento podem ser facilmente adaptadas para uso com o TFM por preparar o tecido da mesma forma, mas adicionando TFM no molde base antes do congelamento. A amostra resultante terá um Plexo mioentérico completamente plana, com uma serosa que pode ser facilmente visualizado. (E) ambos preparação do tecido abordagens produzem excelentes cortes histologicos no recomendado 8-µm de espessura. O procedimento usando TFM é retratado aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Orientação adequada do tecido intestinal fornece seções ricas em gânglios entéricos. Ao preparar padrão secções transversais do intestino fresco congelado (A, B), há apenas uma pequena área do Plexo mioentérico (B) presente em cada slide. Muito poucos gânglios entéricos podem ser coletados por slide, que é demorado e caro. Em contraste, preparando seções longitudinais no plano do Plexo mioentérico (C), oferece uma área superficial muito maior dos gânglios (C). Seções do Plexo mioentérico são obtidas a partir do serosa e seccionamento para dentro através do músculo longitudinal (B). Ao aproximar-se do Plexo mioentérico, na junção da camada muscular circular e longitudinal (B), 6-12 seções seriais podem ser coletadas. Cada seção longitudinal do Plexo mioentérico contém grandes áreas de gânglios entéricos (representados em C, usando um procedimento de coloração modificado, sem xileno, preferencialmente manchar os gânglios). Tampões de LCM podem ser preenchidas a capacidade de usar um tecido único seção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Coloração com um corante compatível com etanol melhora a qualidade do RNA. Qualidade do RNA foi medida por Bioanalyzer e resultados representativos de duas amostras de cada grupo são exibidos. Qualidade de RNA inicial medido do frescas, desmontadas seções (A, sem tratamento), tinha um número de integridade do RNA (RIN) de 8,65 ± 0,07. Para seções montadas e processados por todos os passos, mas sem mancha (B), RIN era 7,95 ± 0.35. Quando a coloração com violeta de cresilo 4% foi adicionada para as etapas de desidratação, houve um efeito negligenciável sobre RIN, com uma média RIN de 7.87 ± 0.35 (C). Em comparação, o uso da mancha aquosa, azul de toluidina (T-azul) e a adição de lavagens de água necessária para o procedimento (D) resultou na qualidade de RNA substancialmente reduzida, com um RIN de 6,45 ± 0,21. Cada grupo consistia de n = 3 repetições biológicas, exceto "Sem tratamento" e "T-Blue"(n=2). RINs são relatados aqui como média ± desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Slides de LCM de membrana caneta permitem coleções precisas dos gânglios entéricos. Usando regular de vidro corrediças do microscópio para coletar gânglios entéricos através do LCM tende a resultar em retirada de tecido indesejados (A). Os círculos vermelhos (30 µm de diâmetro) indicam o tamanho dos pontos IR LCM usado durante o processo de coleta. A seta branca indica uma coleção de gânglio que puxou um pedaço de tecido muscular adjacente. Com slides de caneta-membrana (B), as amostras sejam cumpridas de uma folha fina que for retirada a maioria da lâmina de vidro. Ao cortar com o laser UV-LCM, a amostra e a membrana de caneta são cortadas, resultando no desprendimento completo do gânglio de slide, independentemente da forma de gânglio (C) e completa adesão ao PAC LCM quando retiradas da amostra (D ). Desejado de estruturas de qualquer tamanho e forma ≥ 10-15 µm pode completamente e precisamente coletadas [(E), inicial de tecido marca-up; Corte a laser (F) IR e UV concluída; Cap (G) LCM removido da seção], como visualizado na tampa do LCM (H). O fundo salpicado no painel H é inerente à tampa e não detritos indesejáveis. Mira em painéis E-H círculos verdes e azuis fazem parte do programa LCM e é espaços reservados para os lasers UV e IR, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Selecionando um kit de isolamento de RNA ideal. Resultados de integridade do RNA são mostrados após uma comparação simultânea de três diferentes procedimentos de isolamento de RNA. Duas parcelas representativas de cada grupo são exibidas para ilustrar a variabilidade que pode ocorrer entre amostras processadas em paralelo. Kit de extração de RNA "A" (A) produzido amostras com um RIN de 6,83 ± 0,65 e fornecido moderados rendimentos de RNA e tende a ter contaminação de DNA, apesar de apresentarem uma digestão de DNase na coluna. Kit de extração de RNA "B" (B) resultou na RIN medido mais alto, a 8,3 ± 0,1. Enquanto o método de extração de RNA baseado em fenol "C" (seguido de limpeza das amostras de RNA com Kit de extração de RNA "B") (C) apareceu para eliminar gDNA e tinha um RIN de 7,5 ± 0,26, havia grandes contaminando as bandas, o que podem ter resultado de derretimento da polímero adesivo da tampa do LCM durante a etapa de lise de RNA. Além disso, rendimentos de RNA do Kit de extração de RNA "A" e "C" do método de extração foram sistematicamente inferiores aos obtidos pelo Kit de extração de RNA "B". Importante, o RNA do lysis buffer fornecido pelo Kit de extração de RNA "B". (com adição de β-Mercaptoetanol) totalmente lise os gânglios capturados (D). Cada grupo tinha n = 3 repetições biológicas e é apresentado aqui como média ± desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Resultados representativos. Quando o pool de duas tampas dos gânglios entéricos, por exemplo, obtemos quantidades suficientes de RNA para RNA-seq (> 1 ng) juntamente com a excelente qualidade do RNA. Parcelas representativas do RNA são mostradas para uma amostra com um RIN de 8.3 (A), 7,5 (B) e 6,9 (C). RNA-seq dados foram executados por meio de um programas de avaliação de qualidade, executado em R. (D) o enredo final-viés indica que as amostras foram sequenciadas com sucesso e têm um viés de modesto 3'-extremidade. (E), a trama do biótipo do gene também representa que resultados do sequenciamento são amplamente consistentes entre as amostras. No total, temos tido um > 95% de sucesso na geração de amostras utilizáveis para RNA-Seq clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Duração | Finalidade |
| Etanol a 95% (-20 oC) | 30 s | Fixação |
| Violeta de cresilo 4% em etanol a 95% | 10-30 s | Mancha |
| 75% etanol (com mergulhando repetidas) | 15-25 s | Mancha de |
| 95% etanol (com mergulhando repetidas) | 5-15 s | Mancha de |
| 100% etanol | 15 s | Desidratação |
| 100% de etanol (anidro) | 30 s | Desidratação |
| Xileno (com mergulhando repetidas) | s de 15-20 | Desidratação |
| Xileno | > 10 min | Desidratação |
| Secar ao ar livre | 1-3 min | Evaporação de xileno |
Tabela 1. Coloração e visão geral do protocolo de desidratação. Esta tabela descreve o nosso protocolo de coloração otimizado. Observe que qualquer compatível com etanol mancha pode ser usado para substituir violeta cresilo, se oferece melhores resultados. Em alguns casos, as durações de coloração e descoloração precisará ser estendido ou encurtado. Geralmente, quanto mais o tempo de fixação, mais rápido o tecido vai ser totalmente manchado. Não notamos qualquer redução na integridade do RNA depois de re-utilizar frascos de até 3 vezes ao preparar slides do segmento de tecido mesmo.
| Dador | Tecido | RIN |
| F | Dois pontos | 7.4, 7.1, 7.2 |
| M | Íleo | 7.2, 6,9, 7,8 |
| M | Duodeno | 8.2, 7.4, 7,7 |
| Íleo | 7.4, 7.6, 7.3 | |
| Dois pontos | 7.7, 7.8, 7.3 | |
| F | Duodeno | 7.1, 7.3, 6,9 |
| Íleo | 7.8, 7.9, 7,6 | |
| Dois pontos | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | Íleo | 6.9, 6,7, 6,9 |
| Dois pontos | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Íleo | 7.2, 7.3, 7,6 |
| Dois pontos | 6,7, 7.6, 7.7 | |
| M | Íleo | 8.3, 7,8, 7.4 |
| Dois pontos | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | Duodeno | 8.3, 8.8, 8.0 |
| Íleo | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| Dois pontos | 8.4, 8.6, 7.1 |
Tabela 2. Resultados representativos de integridade do RNA. As amostras exibidas nesta tabela foram todos obtidas de gânglios entéricos humanos. Todas as amostras selecionadas têm suficiente RNA qualitativo e quantitativo para análise de RNA-seq. A RIN média de todos os exemplos listados nesta tabela é 7.49 ± 0,53. Concentração de RNA também foi medida usando o ensaio de RiboGreen Quant-lo e todas as amostras exibidas na tabela reuniram-se a quantidade mínima necessária para nossa RNA-seq (> 1 ng) experiências. Quantidades menores podem ser usadas, dependendo do procedimento pré-amplificação. No entanto, tais procedimentos são mais confiáveis quando se espera lá para ser grandes diferenças na expressão do gene entre amostras ou grupos a serem comparados; caso contrário, estes resultados podem mascarar verdadeiras diferenças em algumas aplicações de RNA-seq. Portanto, geralmente recomenda-se iniciar com mais material quando possível.
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Discussion
Este procedimento possibilita a coleta eficiente de inúmeros gânglios entéricos como uma fonte para derivar do RNA para RNA-Seq Aqui, nós temos acelerado os processos descritos nos protocolos existentes, maximamente, preservando a integridade do RNA. Como todas as etapas neste procedimento são interdependentes, é importante que todas as questões sejam eliminados desde o início do estudo e que todas as amostras são preparadas como da mesma forma um ao outro quanto possível, para obter confiança RNA-Seq
Desde o início do procedimento, a integridade do RNA pode ser um impacto negativo se o intervalo de tempo (tempo isquemia frio) entre a coleção de tecidos no momento da doação de órgãos e recibo do tecido para processamento em laboratório é muito longo. Tendo em conta esta preocupação, ficamos surpresos que RNA de alta qualidade pode ainda ser extraída amostras intestinais mesmo após 24 horas de tempo de isquemia fria. Quando as amostras intestinais são refrigeradas e armazenadas adequadamente em solução de armazenamento frio, há proteção excelente de qualidade de RNA e integridade do tecido. Exigimos que o tecido intestinal é liberado após a coleta, a equipa de colheita de órgãos, para limitar a exposição do intestino a enzimas digestivas, RNases e outras moléculas que poderiam afetar a qualidade do RNA durante este período. Achamos que quando o espécime intestinal não é completamente liberado, isto pode reduzir significativamente RIN a amostra.
Usando nosso procedimento otimizado para a preparação de amostras de tecido intestinal, somos capazes de evitar a incorporação de amostras no TFM. Porque TFM interage com etanol e xileno para dar forma a um precipitate marrom escuro que interfere com a visualização dos gânglios entéricos, preferimos que excluí-lo de nossas amostras. No entanto, quando se trabalha com tecido intestinal de ratos ou outras espécies, a exclusão de TFM pode não ser possível. Neste caso, nós já experimentou remover TFM de uma seção aderida em um slide. Se o tecido tem uma superfície suficiente, etanol (refrigerado a-20 ° C) pode ser escorria para o slide com uma pipeta de transferência para corrigir rapidamente o TFM, permitindo que ele deve ser removido com fórceps. Pingar etanol sobre as guias evita o acúmulo de TFM dentro do frasco de etanol, que pode exacerbar o efeito tostagem quando vários slides estão sendo processados.
Durante flash-congelamento, favorecemos usando uma pasta de gelo seco com 2 MB, ao invés de 100% de etanol, porque 2-MB prontamente evapora quando aterrar na superfície do tecido. Etanol tende a evaporar-se mais lentamente, especialmente quando combinado com o TFM, formando um lodo químico sobre o bloco de tecido que não pode ser removido facilmente. Etanol e 2-MB tendem a fizz e salpicar vigorosamente ao congelar em pequenos recipientes de congelação, porque o pequeno volume de chorume o gelo seco tem uma capacidade de baixo calor específico. Em vez disso, usar um balde retangular grande cheio de powderized gelo seco fornece uma grande massa de arrefecimento e impede que as flutuações de temperatura, enquanto o tecido estiver a ser congelado.
Como mencionado, às vezes é mais fácil de obter folhas contínuas dos gânglios entéricos de algumas amostras de tecido em relação a outros. Compreensivelmente, a velocidade geral do LCM é sujeito a variabilidade em função das características do tecido a fonte ou a região intestinal sendo amostrado. Por esta razão, muitas vezes é melhor preparar muitas amostras fresco congelado no início. Geralmente encontramos que um total de 20 amostras por segmento do intestino (~ 2 cm x 1,5 cm, cada) é muito mais do que suficiente para fornecer amplo RNA para aplicações a jusante. No entanto, se apenas um pequeno comprimento do tecido intestinal está disponível, recomendamos um comprimento mínimo de 5 cm. Com nossa abordagem, o menor rendimento que seria obtido se situaria entre 18-30 ng de RNA, como discutido abaixo. O comprimento mínimo de 5 cm pode potencialmente ser reduzido, dependendo da aplicação, especialmente se quantidades mais elevadas de cDNA preamplificação são usadas. Esses parâmetros não foram testados no estudo atual. Por exemplo, gânglios entéricos foram coletados de amostras de biópsia intestinal de espessura total (2 x 2 cm) para uso com qPCR4.
Como demonstramos neste estudo, o uso do corante compatível com etanol, cresilo violeta, oferece melhor proteção da integridade do RNA do que a mancha aquosa, azul de toluidina. Quando submerso em etanol, RNases tornam-se inativos5,15. No entanto, RNases ainda pode recuperar a função, uma vez exposta a água7,15. Quando a coloração com corantes aquosos, o tecido deve ser exposto a água livre de nuclease por quase 1 min9, que leva a uma degradação substancial de RNA. Quando se utiliza a coloração de tecido azul de toluidina, fomos capazes de reduzir a exposição à água, antes e depois da coloração,... porque tais modificações também reduziram a captação e retenção de toluidina azul, respectivamente. Um problema semelhante também foi encontrado com um corante hematoxilina-base9. No protocolo modificado descrito aqui, coloração com violeta de cresilo evita a exposição direta das amostras de água, intestinais màxima assim, preservando a integridade do RNA. Estes resultados eliminam a necessidade de inibidores de RNase adicionais na solução de coloração. Achamos que tais inibidores são ineficazes para permitir o uso da tintura aquosa, azul de toluidina como isso interferiu com a captação e retenção do corante.
Quando inicialmente otimizando o nosso protocolo de coloração, nós não foram capazes de reproduzir os resultados obtidos em outros protocolos e relatórios5,7,8,11. Enquanto a razão para isso é clara, encontramos diversos fatores que levaram à tintura inconsistente-captação e retenção. Por exemplo, embora certos protocolos com sucesso tem manchado tecido usando violeta cresilo em 100% etanol8 ou em 75% etanol5, a tintura apenas fracamente rotulado gânglios ou tinha fundo elevado, em comparação ao uso cresilo violeta em etanol a 95%. Por último, a percentagem de violeta de cresilo usada na solução de coloração também é muito importante. A maioria dos protocolos recomendam um 1% cresilo solução violeta7,8, mas esta concentração não apresentaram coloração confiança em nossas mãos, mesmo após coloração de seções para até 2 min. Tivemos um sucesso melhor coloração com uma solução de coloração esclareceu saturada de 4% de cresilo violeta11 aplicado à amostra por meio de uma seringa estéril filtro8. Esta solução saturada permite muito mais rápida a coloração da amostra, em tão pouco como 10-15 s. pré-fixação da amostra refrigerada 95% de etanol (a-20 ° C) permite uma absorção mais rápida da mancha.
Outro relatório encontrou que gânglios entéricos mais distintamente foram corados em seções de intestinais humanas fresco congelado quando combinando violeta cresilo com eosina em uma solução de álcool etílico de 75%5. No entanto, descobrimos que eosina tornou mais difícil para identificar gânglios e aquela violeta cresilo, sozinha, oferece deteção superior. Em um estudo diferente, verificou-se que uma solução tamponada de cresilo violeta fornecido resultados consistentes de coloração para câncer endometrial tecido10. No entanto, encontramos isto não ofereceu qualquer melhoria para tecido intestinal humano e também não poderia ser implementado quando utilizar etanol a 95% para a solução de coloração.
Nós testamos várias condições em que o protocolo pode ser pausado e reiniciado em um momento posterior. Muitos protocolos sugerem slides antes do tempo de corte e re-congelando-as a-80 ° C imediatamente após a montagem para o slide5,9. Com esta abordagem, a coloração e a LCM pode então ser retomada na próxima semana, oferecendo grande flexibilidade. No entanto, não só isto grandemente interferir na coloração; Ele também reduziu a integridade do RNA em nossas mãos (dados não mostrados). Para contornar esse problema, Grover et al . recomendo coloração e desidratar as seções antes do armazenamento no congelador11. Nesta abordagem, slides estão manchadas e desidratados (como na tabela 1) até a etapa 100% de etanol anidro (protocolo seção 5.2). Em seguida, as amostras são incubadas em um segundo frasco de 100% de etanol anidro por 10 min e são transferidas imediatamente para um tubo cônico com gel dessecante, que é então refrigerado em gelo seco e transferido para o congelador a-80 ° C. Quando retirar amostras do congelador, slides são imediatamente submersa em 100% de etanol anidro por 30 s e secas ao ar antes para executar LCM11. Infelizmente, em nossas mãos, esta abordagem reduzida RIN por 0.6-0.8 (dados não mostrados). Portanto, recorremos a executar todos os corte, coloração e LCM no mesmo dia a fim de obter a máxima integridade de RNA em nossas condições. Esta prova para ser um processo demorado, mas as tampas de LCM de 10-14 podem ser preenchidas durante trabalho um dia inteiro de.
O ponto mais confiável no qual nosso protocolo pode ser pausado é a etapa de incubação xileno. Slides foram deixadas na xileno (com peneiras moleculares) para até 4-5 h sem nenhum efeito aparente na integridade do RNA. Achamos que quando três slides são preparados em um momento, tudo pode ser processado com LCM dentro deste prazo, mesmo que uma hora de intervalo é necessária. Uma opção alternativa é para desidratar slides após coloração e desidratação passos dentro de um vácuo exicator16, mas nós ainda não ter tentado essa abordagem.
Isolamento de RNA constitui mais um passo crucial para o procedimento, com os mais importantes fatores ser: obtendo o máximo rendimento possível do RNA, retendo o espectro completo de RNA (sem perda de espécies menores de RNA)17,18, e eliminar completamente o DNA genômico da amostra17. Em nossas mãos, Kit de extração de RNA "B" fornecido o melhor resultado com nossas amostras, que oferecia o maior rendimento e foi mais eficiente na eliminação de DNA genômica. As nossas observações sobre diferenças de rendimento entre os reagentes de extração de RNA são consistentes com relatórios anteriores17,18. No entanto, também existem muitos estudos de LCM que têm relatado sucesso com outro RNA extração reagentes19,20. Relatórios anteriores também indicam que os processos de extração de RNA baseados em colunas oferecem melhor retenção de pequenas moléculas de RNA do que o de métodos de extração do RNA baseado em fenol18 como pequenas moléculas de RNA podem ser perdidas no sobrenadante durante a precipitação do RNA passos.
Observamos que os buffers de lise de RNA que usam de guanidinium com β-Mercaptoetanol adicionado é altamente eficaz na remoção de todos os gânglios capturados da tampa do LCM (Figura 5-D). Enquanto a maioria dos protocolos de LCM não sugerem a utilização do Vortex o lisado, descobrimos que este produz excelentes resultados e não resulta na degradação do RNA. Ele também fornece uma probabilidade ainda maior que todos capturados gânglios será lançada da tampa para extração de RNA. Usando estes métodos, geralmente obtemos RNA rendimentos de LCM de gânglios entéricos na faixa de 1,8 a 18 ng/cm2 do tecido intestinal, dependendo de quantos gânglios estão presentes em um determinado slide. Nosso procedimento de RNA-seq requer uma entrada mínima de 10 ng de RNA, mas outros procedimentos podem ter muito menor RNA se um processamento de sequenciamento inclui um maior número de ciclos de Pre-amplificação de entrada. A área de superfície total do tecido armazenado desde a preparação e o processo de congelamento flash é 40-60 cm2, que prevê amplo RNA prep de biblioteca de cDNA e aplicações de baixa-entrada RNA-Seq.
Enquanto nosso procedimento é projetado para a coleção de gânglios toda entéricas, a abordagem pode ser modificada facilmente para a coleção de neurônios único ou glia, se desejado5. No entanto, porque processos gliais densamente ensheath neurônios das ENS, RNA glia será incluídos junto com o RNA de neurônios capturados, embora a contagem inferior. Isto levanta questões ao tentar identificar transcrições neuronais, expressadas em um número baixo de cópia. Célula única RNA-seq oferece a melhor precisão e detecção a este respeito, mas precisa de neurônios para ser dissociada do tecido intestinal, manchado com marcadores de pan-neuronal e isolados com citometria de fluxo21 ou identificados de todo-intestinal dissociações após separação com bioinformática abordagens. A desvantagem da maioria dos estudos de dissociação é que a maioria dos protocolos exigem que a amostra ser incubadas a temperatura ambiente ou a 37 ° C por períodos prolongados, que é conhecido por alterar o transcriptoma3. Recentemente, a protease frio-ativo de Bacillus licheniformis tem sido usada para geração de suspensões celulares único para os tecidos do mouse e é possível aplicar esta enzima para dissociação de tecido humano em 4 ° C22. Até que essa otimização é realizada, LCM de tecido humano congelado fresco é um meio robusto para capturar RNA para criação de perfil de expressão dos elementos do sistema nervoso periférico como gânglios entéricos.
Em resumo, nós desenvolvemos um protocolo confiável e consistente para a coleção de RNA de gânglios entéricos humanos. Otimizamos a preparação do tecido intestinal humano, coloração, processo de LCM e extração de RNA com base em inúmeras publicações e protocolos. Também demonstrámos a confiabilidade desta abordagem na recolha de amostras do RNA de qualidade de RNA suficiente para RNA-Seq Este protocolo pode ser aplicado amplamente aos tecidos coletados de pacientes com um número de doenças gastrointestinais e pode ser facilmente adaptado para uso com modelos de roedores, oferecendo assim uma estratégia confiável para o desenvolvimento de novas terapêuticas.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Somos gratos aos doadores e suas famílias que tornaram este trabalho possível. Agradecemos também a ajuda de funcionários do Instituto Internacional de medicina e Tennessee doador serviços para ajudar a coordenar a coleção de tecido utilizado neste estudo. Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 para suporte a EMS2 e bolsa de NIH T32-DK007673 para AMZ. Estamos gratos ao pessoal da Vanderbilt translacional patologia recurso compartilhado para acesso ao instrumento de LCM e aconselhamento sobre a preparação do tecido. O recurso compartilhado de patologia tecido Vanderbilt é suportado em parte pelo NIH subvenções P30-CA068485-14 e U24-DK059637-13. Agradecemos o genoma tecnologia acesso centro, no departamento de genética na faculdade de medicina da Universidade de Washington para a ajuda com análise genômica. O GTAC parcialmente financiado pelo NCI câncer centro apoio Grant #P30 CA91842 ao centro Siteman de câncer e pelo TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 do centro nacional para recursos de pesquisa (NCRR), um componente do National Institutes of Health (NIH) e do NIH Roteiro para pesquisa médica. Esta publicação é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa, necessariamente, a visão oficial da NCRR ou NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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