Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.
Abstract
Der Zweck dieser Methode ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien gesammelt von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Wir haben fünf Schritte im Workflow identifiziert, die entscheidend für den Erhalt der RNA-Isolate aus enterischen Ganglien mit ausreichend hoher Qualität und Quantität für RNA-Seq. Zuerst, muss bei der Vorbereitung von Darmgewebe jede Probe alle überschüssige Flüssigkeit durch Löschpapier vor der Abflachung der Darmhaut so weit wie möglich im unteren Bereich des großen Basis Formen entfernt haben. Proben werden dann schnell auf einen Brei aus Trockeneis und 2-Methylbutane eingefroren. Zweitens, wenn das Gewebe zu schneiden, ist es wichtig, Cryomolds zu positionieren, so dass Darmabschnitte das vollständige Flugzeug den Auerbach-Plexus parallel, damit die größte Fläche des enterischen Ganglien pro Folie nachgeben. Dritte, während LCM, Polyethylen Napthalate (PEN)-Membran Folien bieten die größte Geschwindigkeit und Flexibilität der ungleichmäßigen Formen der enterischen Ganglien zu umreißen, wenn Enterische Ganglien zu sammeln. Viertens, bieten für deutliche Visualisierung der enterischen Ganglien in Abschnitten, Ethanol-kompatiblen Farbstoffe wie Cresyl violett, ausgezeichnete Erhaltung der Integrität der RNA relativ wässrigen Farbstoffe. Zu guter Letzt für die Gewinnung von RNA aus aufgenommenen Ganglien beobachteten wir Unterschiede zwischen kommerziellen RNA-Extraktion-Kits, die überlegene RNA-Menge ergab und Qualität, beim DNA-Kontaminationen zu beseitigen. Optimierung dieser Faktoren in das aktuelle Protokoll stark beschleunigt den Workflow und enterischen Ganglien Proben mit außergewöhnlichen RNS-Qualität und Quantität ergibt.
Introduction
Diese Methode soll qualitativ hochwertige RNA-Proben der enterischen Ganglien aus menschlichen intestinalen Gewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um ausreichende RNS-Qualität und Erträge für RNA Sequenzierung (RNA-Seq) bieten und mit frisch reseziert, fixierten, Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe verwendet werden soll.
Funktionelle Magen-Darm- und Darm-Motilität-Störungen betroffen einer von vier Menschen in den Vereinigten Staaten. Das Enterische Nervensystem (ENS), auch bekannt als die zweite Gehirn1, ist oft in der Mitte dieser Störungen, wie es eine entscheidende Rolle im Darm Homöostase und Motilität spielt. Manipulation von Darm-Motilität wurde in der Regel auf chirurgische Resektion des aganglionären/noncontractile Gewebe, chronische ernährungsumstellung und/oder Medikamente eingeschränkt. Überraschend, bleibt das volle Transkriptom der Erwachsenen ENS sequenziert werden, stark begrenzen unsere Fähigkeit, Moleküle innerhalb der ENS zu identifizieren, die pharmazeutisch ausgerichtet oder in Stammzelltherapien genutzt werden können.
Es gibt relativ wenige Methoden zur Isolierung von RNA aus menschlichen enterischen Ganglien. Der erste Ansatz, Zelle Dissoziation2, erfordert hohe Inkubation Temperaturen und langen Inkubationszeiten; sowohl von denen, die zur Förderung der RNA-Abbau und verändern die Transkriptom-2,-3bekannt sind. Ein alternativer Ansatz, LCM, mehr zuverlässig das Transkriptom bewahrt und schützt die Integrität der RNA. Obwohl mehrere Studien LCM Ganglien von menschlichen Tiefkühlfrische Darmgewebe4,5,6sammeln verwendet haben, diese Ansätze wurden entweder von Armen RNS-Qualität und Quantität behindert, waren sehr arbeitsintensiv, oder notwendige Änderung der Färbung oder RNA Extraktionstechniken in unseren Händen zu arbeiten. Andere LCM Protokolle entwickelt, die für die Erhaltung der RNA, die in LCM Produkt, die Handbücher zur Verfügung gestellt gefunden wurden, weitere Verbesserungen7,8, sondern Anpassung war notwendig, angewandt auf die Isolation der enterischen Ganglien8, 9. aus diesen Gründen entwickelten wir eine optimierte Protokoll basierend auf diese Ressourcen, die erhebliche Mengen an hoher Integrität RNA aus menschlichen enterischen Ganglien ergibt, hat einen relativ schnellen Workflow und konsistente Ergebnisse produziert, über eine große Anzahl der Proben.
In dieser Studie stellen wir Ihnen eine Übersicht über optimierte Abläufe, die die Isolation der RNA hoher Integrität von enterischen Ganglien aus resezierten menschlichen Darmgewebe bezogen zu erleichtern. Unsere Methode beinhaltet fünf wichtige Aspekte. Erste, frisch reseziert, unfixierte Darm Humanproben sollte getrimmt werden, um Größe, haben alle überschüssige Feuchtigkeit mit einem Labor-Gewebe entfernt und in einer großen Basis Form vor dem Blitz-einfrieren auf einer Aufschlämmung von Trockeneis und 2-Methylbutane (2 MB) abgeflacht. Zweite, histologische Abschnitte des Darmes sollte bereit sein, die vollständige Flugzeug Auerbach Plexus auf einer Folie zu erhalten, bietet eine große Nutzlast des enterischen Ganglien. Erfolg mit diesem Schritt ist weitgehend abhängig von der Vorbereitungsprozess Gewebe. Drittens erfordert die uneinheitliche Struktur der Ganglien in der ENS die Verwendung von Polyethylen Napthalate (PEN) Membran Folien6, die die größte Geschwindigkeit und Präzision bei der LCM anbieten. Vierte, Ethanol-kompatible Farbstoffe, wie z. B. Cresyl violett, sollten zur RNA Integrität zu bewahren, während der Färbung enterischen Ganglien. Dauern Sie, die RNA-Extraktion ist entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis mit RNA-Seq. Wir suchten einen RNA-Extraktion-Ansatz, der produziert hohen Integrität der RNA, RNA Erträge maximiert, wenn beginnend mit einer kleinen Sammlung von enterischen Ganglien, DNA-Verunreinigung beseitigt und behält so viele RNA-Spezies wie möglich.
Zusammengenommen, Optimierung dieser Faktoren in der vorliegenden Studie stark beschleunigt den Workflow und Proben der enterischen Ganglien mit außergewöhnlichen RNA Quantität und Qualität liefert. Ergebnisse wurden weitgehend unter eine ansehnliche Gruppe von Proben, die Konsistenz dieses Ansatzes angibt. Darüber hinaus haben wir diese Ansätze verwendet, um Dutzende von RNA-Proben von enterischen Ganglien erfolgreich zu sequenzieren. Die Strategien, die hier hervorgehoben können auch weitgehend angepasst werden, für die Durchführung von LCM von gewünschten Ganglien oder Kerne des peripheren und zentralen Nervensystems und andere Fälle, in denen die Isolierung der RNA von hoher Qualität.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Protokolle wurden von der Vanderbilt Universität institutionelle Review Board (IRB) genehmigt.
1. Vorbereitung vor der Ankunft der Gewebe
- Richtige IRB Genehmigung einholen und mit menschliche Organ Spende Agenturen frisch reseziert, unfixierten Darmgewebe von Spendern zu erhalten, die alle Forschung für das Studium erforderlichen Kriterien zu koordinieren.
Hinweis: Dieses Protokoll kann für Mäuse und andere Nager-Modelle angepasst werden.- Sofort nach Resektion eines jeden Darm Segments, spülen Sie gründlich das Lumen mit gekühlten PBS oder Gewebe-Speichermedium luminalen Restmaterialien oder Kot zu entfernen.
- Tauchen Sie nach der Spülung und Verwerfen von Abfall in eine geeignete Biohazard Behälter das Gewebe in ausreichendem Umfang Gewebe-Speichermedium (z. B. 3-bis 5-Mal das Volumen der Darmgewebe) und speichern in individuell beschriften, wasserdicht Kunststoff Container, eingetaucht in Eis oder gekühlt bis zur Verwendung).
- Bearbeiten Sie das Gewebe innerhalb von 18-26 Stunden ab dem Zeitpunkt der Sammlung zu erheblichen RNA-Abbau zu verhindern.
Hinweis: Abhängig von der Sauberkeit des Darm-Segments und Lagerung, können unsere vorgeschlagenen Frist verlängern möglich.
- Alle benötigte Materialien für menschliches Gewebe Sammlung im voraus vorzubereiten, wie in diesem Protokoll angegeben (siehe die Tabelle der Materialien für detailliertere Produktinformationen). Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen persönlichen Schutzausrüstungen zu allen Zeiten getragen wird.
- Bereiten Sie Trockeneis Eimer zusammen mit einer Trockeneis-Gülle, wie in Abbildung 1dargestellt.
- Zerquetschen Sie genug Trockeneis um 4 standard kreisförmige Eiswürfelbehälter und eine rechteckige Eisbehälter füllen. Der standard Eimer sollte man klein (11 x 21 cm) Labor Gewebe platziert an der Oberfläche des Trockeneises. Verwenden Sie nach Möglichkeit neue, ungeöffnete Kisten mit Labor Gewebe.
- Machen Sie eine Trockeneis-Gülle durch powderizing 2 L von Trockeneis in einen sauberen rechteckige Eisbehälter.
- Fügen Sie vorgekühlt 2 MB bis zur Oberfläche des Trockeneises. Leicht zu mischen und Glätten der Gülle mit einer Pipette Tip Box Abdeckung in Form Oberfläche der Gülle in einem Kanal umgeben von größeren Stücken von Trockeneis entlang der Seiten des rechteckigen Eimers.
- Legen Sie mehrere dünne Blöcke Trockeneis an den Rändern der Eiskübel mehr schnelles Gefrieren zu fördern. Es sollte Platz für ≥4 Basis Formen passen locker in Trockeneis Gülle Eimer zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden sein.
- Optional gefüllt Stack den Eiskübel innerhalb einer anderen rechteckigen Eiskübel ¼ mit Trockeneis. Diese Positionierung hilft, die Trockeneis-Gülle besser zu isolieren und verhindert die Notwendigkeit für häufige Anpassungen von Trockeneis und 2 MB während des Verfahrens.
- Positionieren Sie die Trockeneis Eimer in einer Montagelinie in der folgenden Reihenfolge: (1) Trockeneis Gülle Eimer, 2) Labor Gewebe-Dry Eiskübel, 3 & 4) normal trocken Eis Eimer, 5) rechteckige Trockeneis Eimer (Abb. 1A).
2. Vorbereitung des menschlichen Darmgewebe Blitz eingefroren
Hinweis: Der gesamte Vorgang dauert zwischen 45-80 min pro Darm Segment, je nach Qualität der Darmgewebe. Wir empfehlen auch Qualitätskontrolle Probenahmen zur Beurteilung der RNS-Qualität und Histologie vor dem Fortfahren mit LCM.
- Einem großen Tablett mit nassem Eis füllen und chirurgische Schneidebretter auf Trockeneis zu platzieren.
- In diesem Setup chill einen 500-mL und 100 mL Becher zum Speichern der Gewebe und gestutzten Segmente in Cold Storage-Lösung. Pre-chill Basis Formen auf die Schneidebretter, so dass sie bereit sind, Gewebe zu erhalten.
- Gießen Sie nach Erhalt frischer Darmgewebe den Medien, in denen das Gewebe transportiert wird, und in die vorgekühlt Becher zu behalten. Lassen Sie etwas Platz in diesen Becher für die Zwischenlagerung von Darmgewebe und gestutzten Segmente, die in den nachfolgenden Schritten zubereitet werden.
- Schneiden Sie das Darm Segment auf eine Länge von ca. 20 cm, bietet reichlich Gewebe (40-60 cm2) RNA für downstream-Anwendungen zu generieren und Qualitätskontrolle Proben. Je nach Gewebe Integrität ist die RNA Isolierung für downstream-Processing mit einer viel kleineren Länge (z.B. 5 cm des Darmes) erreichen durchführbar.
- Trim entfernt Fett und Bindegewebe aus dem Darm mit einer chirurgischen Schere. Restwert adipösen entlang der Darm Darmhaut beeinträchtigt die Fähigkeit, Gewebe in den nachfolgenden Schritten vollständig glätten. Schneiden Sie sorgfältig das Gewebe, um zu vermeiden, nicking der Darmhaut während der Entfernung von Fett und Bindegewebe, die strukturell beschädigen den Auerbach-Plexus oder machen das äußere des Gewebes ungleichmäßig für Schneiden glätten können.
- Machen Sie einen längs-schnitt über die gesamte Länge der intestinalen Probe, vorzugsweise auf dem Gelände des mesenterialen Anlage.
- Sezieren Sie entfernt und verwerfen Sie die Tenia coli aus dem Dickdarm zu, so dass es leichter, flacht nach von Verspannungen befreit.
- Spreizen der Darm-Schleimhaut-Seite nach unten auf ein gekühltes Schneidebrett und 1,25 cm breiten Streifen aus die volle Länge des Gewebes.
Hinweis: Darmgewebe erweitert oft nach dem Stutzen, damit dieser Größe entsprechend angepasst werden sollte. - Temporär zu speichern die Streifen in gekühltem Gewebe-Storage-Lösung.
Hinweis: Wir verwenden Belzer UW-Cold Storage-Lösung, denn es eine lange Haltbarkeit hat, relativ kostengünstig ist und kann bei Raumtemperatur bis benötigt gespeichert werden. - Entfernen Sie einen Gewebe Streifen aus der Kühllagerung Projektmappe und schneiden Sie es in Segmente ~1.5-2 cm lang.
- Beflecken Sie schnell die intestinale Segmente auf einen Stapel von Labor-Tücher, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und verhindern die Bildung von Eiskristallen entlang der Darm Darmhaut beim Blitz-gefrieren. Wenn Gewebe nicht ausreichend getrocknet ist, wird es schwierig, qualitativ hochwertige Teile aus den Auerbach-Plexus zu erhalten sein.
- Legen Sie die verlaufene Darm Stücke Schleimhaut-Seite bis auf eine vorgekühlt, groß, Einweg Kunststoff Basis-Formenbau (37 x 24 x 5 mm).
- Glätten Sie sorgfältig jedes Segment indem leicht dehnen das Gewebe über der Oberfläche der Basis Form und mit gebogenen Pinzette sanft nach unten drücken und vertreiben keine Luftblasen, die unter die Darmhaut aufgefangen werden können. Beachten Sie, dass das Gewebe während der Abflachung erweitert. Bei Bedarf trimmen Sie die Segmente und schneiden Sie die restlichen Proben in einer kleineren Größe.
Hinweis: Wenn das Gewebe überdehnt ist, wird dies den Auerbach-Plexus verzerren. Nachdem alle Luftblasen entfernt werden, bewerten Sie die Dicke der Probe vor dem Einfrieren. Wenn nötig, die Ränder der Probe nach innen drücken, bis die Darm Probe seiner originale Dicke Ansätze. - Legen Sie die geladene Basis Form auf die Oberfläche des Trockeneises, 2 MB Gülle. Das Gewebe sollte innerhalb 30-60 s, je nach Größe und Dicke des Segments Darm komplett einfrieren.
- Trocknen Sie den Boden der base Form, passives 2 MB zu entfernen, durch schnell reiben die Basis Form auf das Labor Gewebe bereits in der zweiten Eimer mit Trockeneis gekühlt.
- Übertragen Sie die getrocknete Probe auf die dritte Wanne mit Trockeneis und unter der Oberfläche des Trockeneises zu begraben Sie, bis es gewickelt werden kann.
- Schnell beobachten der Unterseite der Basis Form vor dem Einwickeln, um die Qualität der Probenvorbereitung zu untersuchen. Notieren Sie sich alle Proben, die nicht erscheinen flach oder haben große Luftblasen, da diese für Kryoschneiden und LCM vermieden werden sollte.
- Wickeln Sie die Probe in Pre gekennzeichneten Aluminiumfolie, die auf Trockeneis in einen Eimer gelegt wird, so dass Umhüllung des Gewebes auftritt, während vollständig gefroren gehalten.
- Wickeln Sie die Probe mit einer Schicht aus Plastikfolie, um Gewebe Dehydrierung während der Lagerung bei-80 ° c zu minimieren
- Speichern Sie Proben in die rechteckige Eimer, bis sie bereit sind, in der Tiefkühltruhe verschoben werden.
- Pre-label und Pre-chill Gefrierschrank Boxen bei-80 ° C für die unmittelbare Lagerung der Proben nach der Entnahme.
- Nehmen Sie einen kleinen Teil des Gewebes aus jeder Darm Segment zur Beurteilung der Integrität der RNA vor Durchführung von LCM.
- Pre-Label ein 2-mL-RNase-freies Rohr für jedes Segment mit ≥500 µL Lyse Puffer gefüllt. Wir empfehlen die Verwendung von RNA-Extraktion Kit "D", in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
- Eine kleine (2 x 2 mm) Stück des Darms in einem standard Gewebe Mikro-Homogenisator (20-40 s, bis keine Klumpen Gewebe bleiben) zu homogenisieren. Dann sofort Einfrieren der RNS lysate auf Trockeneis und Store bei-80 ° C bis Sie fortfahren mit RNA-Extraktion.
- Optional einige Abschnitte in Gewebe Einfrieren Medium (TFM) als Back-Up einbetten. Bereiten Sie Gewebeschnitte in genau der gleichen Weise in diesem Abschnitt beschriebenen vor, aber Tauchen Sie Proben in TFM innerhalb der Basis Form vor dem Blitz-einfrieren.
(3) Kryoschneiden
- Bereiten Sie vor Kryoschneiden alle benötigten Materialien zum Beizen und Austrocknung und übertragen Sie die gewünschte Gewebeproben von-80 ° C Gefrierschrank in einen Eimer mit Trockeneis.
- Vorbereiten der Kryostat für die Verwendung durch Einstellung auf die optimale Temperatur (-18 bis-22 ° C) und Abwischen der Oberflächen mit 100 % Ethanol und Behandlung der Klinge und Pinsel Tablett mit RNase Dekontaminationslösung.
- Um die Probe an das Futter am besten zu halten, verwenden Sie die folgende Vorgehensweise.
- Legen Sie Zangen in Trockeneis für mindestens 30 s vor dem Auspacken der intestinalen Probe und stellen Sie es an der Oberfläche des Trockeneis Darmhaut-Side-Up.
- Gießen Sie einen 3-5 mm-Hügel aus Gewebe Einfrieren Medium (TFM) auf einem großen Kryostat Probenhalter und sofort übertragen Sie die intestinale Probe Darmhaut Seite nach oben auf die TFM.
- Übertragen Sie schnell Probenhalter Trockeneis und Deckel mit pulverisierte Trockeneis nach Abzug der TFM die Probe für 2-5 s bei Raumtemperatur einhalten. Sicherstellen Sie, dass die TFM unterhalb der Ebene der Auerbach-Plexus bleibt.
Hinweis: Im Idealfall die äußere Oberfläche der Darmschleimhaut vollständig die TFM haften an bevor die TFM beginnt zu frieren ohne Auftauen der Probe.
- Probenhalter in den Kryostaten Objektkopf montieren und Ausrichten der Probekörpers mit der Kryostat Klinge, so dass das Flugzeug den Auerbach-Plexus parallel zu dem Schneidmesser.
- Legen Sie die Stationspunkte Dicke auf der Kryostat bis 8 µm. Die perfekt Ausrichten der Probekörpers soll die größte mögliche Fläche von Auerbach Plexus auf jeder Folie zu erhalten. Diese Dicke empfiehlt sich im Allgemeinen für Mensch und Nagetier Gewebe, sondern kann eingestellt werden, je nach Bedarf.
- Schnitt durch die Darmhaut und längs-Muskel bis zum Erreichen der Auerbach-Plexus.
- Um den Auerbach-Plexus zu finden, montieren Sie einen Probe-Abschnitt auf einer Folie zu und Flecken Sie Abschnitt mit einer wässrigen Farbstoff, z. B. 1 % Cresyl violett oder Toluidin blau usw..
- Lesen Sie den Abschnitt unter einem Lichtmikroskop bei 40-2000 X Vergrößerung, die Verbindung zwischen der Längs- und kreisförmige Muskelschichten zu identifizieren. Mikroskop-Parameter sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt. Zu Beginn der Schnitt wird die Darmhaut durch die Anwesenheit von Bindegewebe gekennzeichnet. Einige verbleibende mesenterialen Fett kann auch entlang der Darmhaut vorhanden sein. Dann beginnt ein Blatt von der äußeren longitudinale Muskelschicht. Sobald die Grenze zwischen der Längs- und kreisförmige Muskelschichten erreicht ist, wird ein Teil des enterischen Ganglien beobachtet werden.
Hinweis: In den nächsten mehrere Abschnitten den Auerbach-Plexus sehr offensichtlich, mit großen Schwaden von Ganglien anwesend innerhalb eines einzelnen Abschnitts (Abbildung 2C) werden. Wenn das Gewebe zu Beginn der Schnitt nicht ganz flach ist, wird nur ein Teil der Ganglien vorhanden in den einzelnen Abschnitten zu einem bestimmten Zeitpunkt sein. Manchmal müssen die intestinale Probe eine von Natur aus ungleichmäßigen Auerbach-Plexus, trotz des Gewebes erscheinen vollkommen flach. Dies gilt insbesondere für Zwölffingerdarm Proben. Erfahrungsgemäß können diese Proben mit LCM, Verarbeitung wesentlich länger nehmen aber ausreichend RNA kann in einem einzigen Tag Sitzung gesammelt werden. Die genaue Lage von den Auerbach-Plexus variiert erheblich zwischen Proben, basierend auf das Gewebe und deren Vorbereitung vor dem Einfrieren.
- Beginnen Sie, sammeln Schnittserien für LCM, mit optimalen Sammlungen bietet die größte Anzahl von Neuronen und Glia pro Folie. Je nach Oberfläche der Probe können mehrere Abschnitte auf einer einzelnen Folie Stift-Membran kombiniert werden.
- Montieren Sie die Abschnitte auf Stift Membran Folien, kurz in den Kryostaten für 5-10 s gekühlt. Bei der Montage sollte das Gewebe nur leicht schmelzen maximal RNA Integrität bewahren.
(4) Färbung
Hinweis: Eine Übersicht über die Färbung Prozess, siehe Tabelle 1. Alle Lösungen sind im standard 50 mL konische Röhrchen bereit. Behandlung von der Außenseite der Rohre mit RNase Dekontaminationslösung erscheint nicht zur Ergebnisverbesserung (Daten nicht gezeigt).
- Vorbereiten einer gesättigten Lösung von 4 % Cresyl violett in 95 % igem Ethanol mindestens einen Tag im voraus und vollständig neu Cresyl violett vor dem Laden der Spritze auszusetzen.
Hinweis: Die Konzentration von Ethanol müssen für effektive Färbung, gesenkt werden wie im Diskussion Abschnitt beschrieben. Wir haben nicht geprüft, ob die Integrität der RNA mit 50 % oder 75 % Ethanol während der Färbung deutlich reduziert werden. Cresyl violett ist lichtempfindlich und sollte daher vor Licht geschützt werden. - Nach der Montage Teile der Auerbach Plexus auf der Folie, Tauchen sofort die Folie in einem konischen Fläschchen von 95 % Ethanol (vorher bei-20 ° C gekühlt) für 30 s.
- Wenn die Abschnitte nicht voll und ganz auf die Folie im vorherigen Schritt befolgten, leicht warm unten auf der Folie mit einer behandschuhten Hand (ein Labor abwischen sollte platziert zwischen der Folie und Handschuh), für die vollständige Einhaltung vor dem Eintauchen in 95 % igem Ethanol. Diese Lösung kann für mindestens 3-6 Folien wiederverwendet werden, ohne Verringerung der RNA Integrität.
- Legen Sie die Folie nach oben auf ein Labor abwischen, platziert auf einem vorbehandelt, RNase-freie Container8.
- Pre-fill eine 3-mL-Spritze mit 4 % Cresyl violett und befestigen Sie einen 0,2 µm Spritze Filter.
Hinweis: Es wird empfohlen, Cellulose-Acetat-Filter. - 6-10 Tropfen Fleck direkt auf das Gewebe Abschnitte8 und inkubieren Sie für 10-30 s, oder bis Sie ausreichend Farbstoff wird beibehalten, wenn de-gebeizt. Während der Färbung, sanft drehen des Folie Containers per hand, um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte mit beize gleichmäßig überzogen sind.
- Gießen Sie den Fleck und de-Fleck sofort die Folie in einer Durchstechflasche von 75 % Ethanol. Immer wieder Tauchen Sie die Folie bis die überschüssige Farbe vor allem aus der Probe sickerte hat. Dies kann zwischen 10-20 s dauern.
- Schließen Sie de-Färbung durch immer wieder Eintauchen der Probe in ein Fläschchen mit 95 % igem Ethanol für 10 S. Submerge Probe wiederholt, bis alle überschüssigen Fleck entfernt wurde.
- Nach Bedarf zu optimieren, die Färbung der Ganglien, ändern Sie die destaining Dauer. Wenn zu viel Fleck entfernt wird, die Probe wird auch transparent und es möglicherweise schwierig zu visualisieren
Hinweis: Diese Färbung Protokoll wurde optimiert, basierend auf mehreren Veröffentlichungen5,8,10,11 die Änderung erforderlich, bevor zufriedenstellende Ergebnisse erzielt wurden. Daher sollte die Konzentration von Ethanol in den Farbstoff und während das destaining Verfahren geändert werden, wenn nötig, um ein optimales Ergebnis zu erhalten.
- Nach Bedarf zu optimieren, die Färbung der Ganglien, ändern Sie die destaining Dauer. Wenn zu viel Fleck entfernt wird, die Probe wird auch transparent und es möglicherweise schwierig zu visualisieren
(5) Dehydratation
- Sofort Tauchen Sie die Folie in 100 % igem Ethanol 2-3 Mal, für eine Gesamtmenge von 10-20 s.
- Tauchen Sie die Folie in wasserfreien 100 % Ethanol mindestens 30 s. Wie wasserfreiem Ethanol sehr hygroskopisch ist, Hinzufügen der Durchstechflasche mit 100 % igem Ethanol vor Beginn des Verfahrens, absorbiert Wasser entfernen und somit vollständig Austrocknen der Probe5Molekularsiebe (8 bis 12 Maschen).
- Immer wieder Tauchen Sie die Folie in Xylol für 15-20 s. Dieser Schritt entfernt vollständig die Schicht von Ethanol auf der Folie. Die Rohre der Xylol, um überschüssige Ethanol und Wasser-Moleküle5vollständig zu adsorbieren fügen Sie Molekularsiebe vor der Zeit hinzu.
Achtung: Xylen gelten als reizend auf die Augen und der oberen Atemwege und sollte in einem chemischen Abzug verwendet werden. - Tauchen Sie die Folie in Xylol (mit Molekularsieben, 8-12 Maschen) für mindestens 10 Minuten.
Hinweis: Eine kurze Pause kann nach diesem Schritt genommen werden, wenn nötig. Proben können für 4-5 Stunden ohne nachteilige Auswirkungen zu beflecken, LCM oder RNA Ertrag/Integrität in Xylol gelassen werden. - Bereiten Sie optional, individuell zu diesem Zeitpunkt mehrere zusätzliche Folien. Wenn eine zweite Runde der Folien vorbereiten nach Abschluss der LCM auf allen vorbereiteten Folien, kann das Gewebe in der Kryostat müssen nachgearbeitet werden, durch Austrocknung der Gewebeoberfläche. Bis zu vier Abschnitte müssen verworfen werden, bevor nutzbare Abschnitte gesammelt werden können.
(6) Laser Capture Microdissection (LCM)
- Entfernen Sie die Folie von Xylol und trocknen Sie es in einem chemischen Abzug für mindestens 1 min. einfügen eine Patrone von LCM Caps in der LCM Mikroskoptisch. Laden Sie die Folie auf die Bühne und erwerben ein Übersichtsbild der Folie.
- Geben Sie den gewünschten Standort für LCM und laden Sie eine Kappe auf der Folie.
- Richten Sie den Infrarot (IR) Laser und passen Sie ihre Kraft und Dauer um 20-30 µm Durchmesser erfassen vor Ort machen.
- Suchen Sie die ultravioletten (UV) Laser und legen Sie eine geeignete Schnittgeschwindigkeit und Intensität.
- Skizzieren Sie die gewünschten Ganglien zu erhebenden mit LCM Software, achten Sie darauf, innerhalb der Grenzen des Bereichs Sammlerstücke auf der Kappe (dargestellt in der Dia-Übersicht über das Software-Programm als ein grüner Kreis) bleiben.
- Passen Sie in jedem der Spuren die IR-Spots so, dass es mindestens eine IR spot jeder 100-500 µm.
- Drücken Sie IR/UV-Schnitt mit der Sammlung von allen markierten Ganglien vorzugehen.
- Nach Abschluss Sammlungen sind die Kappe an einen neuen Speicherort verschieben und wiederholen Sie die Einziehung von Forderungen oder prüfen Sie LCM GAP an der QC-Station zu, wenn die Kappe ausreichend gefüllt ist, mit Ganglien (oder bis die empfohlenen Frist von 60-80 Minuten erreicht ist).
- Wenn Schmutz auf die Kappe vorhanden sind, wischen Sie es mit einem feinen Spitzen Pinsel, der mit RNase Dekontaminationslösung vorbehandelt, mit Nuklease-freies Wasser gespült, und wurde vollständig getrocknet.
- Sorgfältig prüfen die Kappe mit dem Auge oder mit Vergrößerung unter dem Hellfeld-Mikroskop um alle Ablagerungen zu gewährleisten wurde entfernt. Wenn der Schmutz durch Einsatz von vorbehandelten Pinsel entfernt werden kann, verwenden Sie eine feine PIPETTENSPITZE (RNase-freie) entfernt den Schmutz kratzen.
- Sichern Sie die Kappe auf eine 0,5 mL Microfuge Rohr gefüllt mit 230 µL RNA Lysis Buffer (Puffer RLT von RNA-Extraktion Kit "B", mit β-Mercaptoethanol hinzugefügt in einer Konzentration von 10 µL/mL).
- Invertieren Sie der Kappe, kurz Wirbel und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie bei ≥ 5.000 x g für 5 min und übertragen Sie dann die Microfuge trocken Ice tube.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. RNA Lysates können bei-80 ° C ohne einen wesentlichen Einfluss auf RNA-Abbau für mindestens 1 Woche gespeichert werden. RNA Isolierung am selben Tag erfolgt, dann kühlen Sie die Proben auf Eis, bis sie bereit sind für die Extraktion. - Führen Sie alle weiteren Sammlungen innerhalb der empfohlenen maximalen Frist von 80-90 min nach dem Entfernen der Folie von Xylol. Da die trockene Abschnitte Luftfeuchtigkeit ausgesetzt sind, können allmählich RNases reaktiviert werden. Einschränkung des Zeitraums der kann solche Effekte minimieren und maximal die Integrität der RNA.
(7) RNA-Isolierung
- RNA-Extraktion einen RNase-freie Arbeitsplatz vorbereiten.
- Bereiten Sie alle Rohre und Reagenzien gemäß dem Handbuch für die RNA-Extraktion-Kit.
Hinweis: Zwar gibt es viele Kits für RNA Isolierung nach LCM, hatten wir viel Erfolg mit dem RNA-Extraktion Kit "B", in der Materialliste aufgeführt. Siehe Abbildung 5 für einen Side-by-Side-Vergleich der RNA-Extraktion-Reagenzien. - -80 ° C Gefrierschrank Proben entnehmen und schnell Auftauen im Wasserbad 37 ° C.
- Vortex aufgetaut sofort Proben für 2-3 s die Guanidinium-Thiocyanat-Salze gleichmäßig zu verteilen.
- Verbinden Sie jede Probe mit ein gleiches Volumen von 70 % Ethanol. Bündeln Sie 2 oder mehr Lysates zusammen, falls erforderlich, um eine ausreichende RNA-Konzentration zu erreichen.
- Gehen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers in der Bedienungsanleitung für die RNA-Extraktion mit dem Protokoll optimiert für Microdissected Proben.
- Eluieren Sie RNA im letzten Schritt in die empfohlene Mindestmenge von Nuklease-freies Wasser (14 µL).
- Nach RNA Isolierung bereits beschriftet aliquoten 1-2 µL RNA von jeder Probe in ein neues RNase-freies Rohr für Qualität Bewertung/Qualitätskontrolle mit einem Mikrofluidik-Gerät, die geringe Mengen an RNA, z. B. einem Bioanalyzer visualisieren kann. Aliquoten eine zusätzliche 1 µL in ein separates Rohr für die Quantifizierung mit einem hochempfindlichen RNA Quantifizierung Kit.
- Diese Schritte nach Bedarf anpassen, um eine ausreichende Menge an RNA für nachgelagerte Analyse zu erhalten, (zB., pool eine größere Anzahl von LCM Kappen vor RNA-Extraktion).
- Shop-RNA bei-80 ° C bis genügend Proben für nachgelagerte Analyse.
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Representative Results
Wir haben einige Verbesserungen an vorhandenen Protokolle, mit denen die relativ schnelle Erfassung der enterischen Ganglien aus menschlichen Darm Proben mit LCM, Erfüllung der Standards für RNA-Seq. Erstens haben wir optimiert das schnelle Einfrieren von Darmgewebe Segmente in großen Basis Formen an der Oberfläche der Gülle von Trockeneis in 2 MB (Abbildung 1B) platziert. Der beste Erfolg bei Kryoschneiden und anschließende LCM wurde durch Verlegung Darm Segmente flach innerhalb einer base Form, mit Blick auf Schleimhaut-Seite nach oben (Zahlen 1 b-1 C) erhalten. Sicherstellen Sie, dass die Basis Formen so flach wie möglich an der Basis, da Krümmung wird es viel schwieriger, einen großen Querschnitt von Auerbach Plexus zu erhalten. Dieser Ansatz führt im Gewebe, das ist leicht bei 8 µm Dicke (Abbildung 1E) geschnitten und ermöglicht die vollständige Beseitigung der TFM vom Färbung Prozess. Wir fanden, dass TFM mit der Färbung Prozess interferiert und somit die Kennung des enterischen Ganglien verdeckt. Positionierung des Gewebes in dieser Ausrichtung auch vermeidet, Schnitt durch die Schleimhaut, die einen hohen Gehalt an RNases12hat, obwohl nach unserer Erfahrung scheint es, dass die Verwendung von ethanolische Flecken weitgehend hemmt diese RNases. In Fällen wo TFM oder optimale Arbeitstemperatur (OCT) Medium ist notwendig, wir fanden es zuverlässigste, zuerst flach die Probe an der Unterseite der Basis Form und fügen Sie dann die TFM an der Form nach diesem Schritt (Abbildung 1D). Dies lässt ein "Fenster" in dem Darm können visualisiert werden, macht es einfach, richten Sie die Probe und Abschnitte, die völlig parallel zu den Auerbach-Plexus (Abbildung 1E) zu produzieren.
Vorbereitung der Cryosections längs über die gesamte Länge des Darms in Richtung parallel zu den Auerbach-Plexus (Abb. 2A), erzeugt Abschnitte in dem größten Bereich der enterischen Ganglien pro Folie sind sichtbar auf Färbung) Abbildung 2 ( C). bei den Auerbach-Plexus (Abbildung 2C), bei der Apposition die Längs- und kreisförmige Muskelschichten (Abbildung 2B) nähert, kann 6-12 Schnittserien gesammelt (Abbildung 2A, Longitudinal) enthalten, die große Schwaden des enterischen Ganglien (Abbildung 2C). LCM Kappen können mithilfe eines einzelnen Abschnitts (Abbildung 4D) Kapazität geladen werden. Im Gegensatz dazu Wenn Sie Querschnitte von Tiefkühlfrische Darm (Figuren 2A-2 b) vorbereiten, gibt es nur eine kleine Fläche von Auerbach-Plexus, die auf jeder Folie (Abbildung 2B). Sehr wenige Enterische Ganglien können quer Gewebeschnitte, was mehr Zeit investiert und höheren Kosten pro Probe insgesamt abgeholt werden. Die parallelen schneiden Ansatz nutzt weniger als ein Fünftel der Zahl der LCM Kappen und Folien im Vergleich zu Querschnitte und die Sammlung erheblich beschleunigt.
Bevor Sie LCM müssen Proben gebeizt und zur Vermeidung von RNase Aktivität während LCM Sammlung komplett dehydriert. Wir entwarfen ein Experiment, um die Wirkung von wässrigen Flecken vs. Ethanolische Flecken auf Integrität der RNA direkt miteinander vergleichen. In diesem Experiment zwei Darmabschnitte waren zusammen auf einer einzelnen Folie angebracht und wurden in eine der vier Möglichkeiten, verarbeitet mit n = 2-3 biologische Wiederholungen pro Gruppe. In der ersten Gruppe frische Darmabschnitte wurden nicht auf eine Folie angebracht und jeder war direkt in RNA-Lyse-Puffer mit RNase-freie Pinzette vorab gekühlt auf Trockeneis(Abbildung 3)überführt. Für alle übrigen Gruppen wurden Abschnitte eingehalten zu einer Folie, verarbeitet aus der Folie mit einer RNase-Dekontamination Rasierklinge Lösung behandelt abgeschabt und mit RNase-freie Zangen an RNA Lyse Puffer übertragen. Eine standard Micro-Homogenisator wurde verwendet, um die Proben in allen Gruppen vollständig aufzulösen. In der zweiten Gruppe die Folien verarbeitet wurden, durch alle Schritte, aber kein Farbstoff diente während der Färbeverfahren (Abbildung 3B). Gruppe 3 wurde mit dem Protokoll beschriebenen, mit 4 % Cresyl violetten Farbstoff (Abb. 3C) verarbeitet. In der vierten Gruppe wurde eine wässrige Flecken, Toluidin blau, verwendet, während im Anschluss an des Protokolls für eine wässrige Basis Färbung Kit mit einer Mischung aus Toluidin blau und Hämatoxylin (Abbildung 3D). Nach dem Entpacken RNA, war wie beschrieben, mit einem Bioanalyzer RNS-Qualität bewertet. Der einzige Unterschied zwischen der wässrigen und ethanolische Färbung Protokolle war die Zugabe von zwei Wasser Inkubationen (30 s), unmittelbar vor und nach der Färbung, die für Aufnahme und Speicherung des Farbstoffs erforderlich ist. Wir fanden, dass den Prozess der Gewebeschnitte an der Folie haften und Verarbeitung mit der Austrocknung Schritte führte zu einer leichten, unvermeidbare Reduktion der RNS-Qualität (Abbildungen 3A-3 b), aber, dass die Färbung mit der ethanolische Farbstoff, Cresyl violett, nicht weiter reduzieren Sie RNS-Qualität (Abb. 3C). Im Gegensatz dazu führte der wässrige Farbstoff, Toluidin blau, zu erheblichen RNA-Abbau, wahrscheinlich aufgrund der längeren wässrigen Exposition, die körpereigene RNase Aktivität (Abbildung 3D) erlaubt.
Die einzigartigen Formen der enterischen Ganglien bereiten Schwierigkeiten standard IR-LCM mit herkömmlichem Glas Folien6 (Abb. 4A). Bei der Verwendung von PEN-Membran Folien (Abbildung 4B) werden Proben ein dünnes Blech eingehalten, die von der Mehrzahl der Objektträger getrennt ist. Der UV-Laser schneidet durch die Probe und Stift Membran, wodurch die vollständige Ablösung der Ganglien aus der Folie (Abbildung 4C) und die vollständige Einhaltung der LCM-Kappe (Abbildung 4D). Strukturen der gewünschten Größe und Form (> 10-15 µm) kann vollständig und präzise gesammelt (Bezifferten 4E-4 H). Für einige Proben mit weniger Ganglien pro Abschnitt kann GAP verschobenen ≥ viermal vor dem sammeln. In diesem Fall minimiert zwei bis drei Abschnitte pro Folie Montage den Verbrauch von PEN-Membran-Folien.
Bei der RNA aus LCM Proben für RNA-Seq zu isolieren, ist das Ziel, die höchstmögliche RNA Qualität und Quantität, zu erhalten, während die Beseitigung aller genomischen DNS (gDNA). Um eine ideale RNA Isolierung Verfahren zu identifizieren, führten wir einen direkten Vergleich mit einem RNA-Extraktion-Kit "A" (Abb. 5A), RNA-Extraktion Kit "B" (Abb. 5B) oder RNA Extraktionsmethode "C" mit clean-Up der RNA-Proben RNA-Extraktion Kit "B" (Abbildung 5C). Nach der Verarbeitung von Proben mit der optimierten Cresyl violett Färbeprotokoll, wurde LCM zur standardisierten kreisförmige Proben (Durchmesser von 500 µm) von Darmgewebe entnommen die longitudinale Muskelschicht zu sammeln. Jede Kappe wurde aller drei RNA Isolierungsgruppen, platziert auf einem 0,5 mL Microfuge Rohr vorausgefüllt mit den jeweiligen Lyse Puffer aus jedem Kit nach dem Zufallsprinzip zugewiesen. Genau wie für jedes Kit mit RNA-Extraktion Kit "Einen" Lyse-Puffer, die Inkubation bei 42 ° C für 30 min beschrieben wurden die Anweisungen befolgt. Für die anderen Kits wurde Raumtemperatur Inkubation für 30 min verwendet. Alle Proben waren kurz verwirbelt auf Ergänzung zu Lysis Puffer. Proben wurden dann auf Eis gekühlt, bis Extraktionen am selben Tag durchgeführt wurden (n = 4). Wir fanden, dass RNA-Extraktion Kit "B" mit einem auf Spalte DNA Verdauung Schritt geführt und effektiv eliminieren gDNA (Figuren 5A-5 C) die höchste RNS-Qualität und Quantität. Wichtig ist, lyses der RNA Lyse Puffer zur Verfügung gestellt von RNA-Extraktion Kit "B" vollständig erfassten Ganglien beim Sammeln von enterischen Ganglien (Abbildung 5D).
Im Durchschnitt haben unsere Proben eine RIN von 7,49 ± 0,53 (Tabelle 2). RIN Partituren von mehr als 6 bis 7 gelten von ausreichender Qualität für RNA-Seq (abhängig von dem spezifischen RNA-Profil)13, dass Sie uns Vertrauen, dass unsere Proben von ausreichender Qualität für RNA-Seq. sind, wenn man bedenkt, dass RIN für diese Proben, nach Erhalt, hat reichten von 7,4 bis 9,5, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unser optimiertes Protokoll ausgezeichnete Erhaltung der Integrität der RNA bietet. Repräsentative Ergebnisse der RNA-Qualität von Einsendungen für die RNA-Seq sind in Figuren 6A-6 Cdargestellt. Ergebnisse aus RNA-Seq demonstrieren, dass unsere Proben erfolgreich sequenziert wurden und haben eine bescheidene 3'-Ende Voreingenommenheit (Abbildung 6D). Im Allgemeinen wird ein größere 3'-Bias in Proben mit niedriger RIN14begünstigt; Dieser Effekt spiegelt sich mäßig in unseren Beispielen. Trotzdem waren die beobachteten gen Biotypen weitgehend unter allen Proben (Abbildung 6E), die Zuverlässigkeit der Daten angibt.
Abbildung 1 . Optimale Einfrieren von Darmgewebe. (A) trocken eiseimer sind bereit, in der Reihenfolge dargestellt; Ich) Trockeneis Gülle, Ii) Labor Gewebe auf Trockeneis, Iii) Zwischenlagerung Eimer, iv) Verpackung Eimer, V) Pre-Tiefkühllager Eimer, vi) Pre-Tiefkühllager Überlauf Eimer gelegt. (B) wir optimiert schnelles Gefrieren der Gewebe Segmente in großen Basis Formen an der Oberfläche der Gülle von Trockeneis und 2-Methylbutane platziert. (C) A näher Bild einer vollständig gefroren Probe, beobachtet im Setup gezeigt im Bedienfeld "B. Darm, Segmente in einer base Form Schleimhaut-Seite oben flach gelegt werden. (D) diese Methode zum Einfrieren kann durch Vorbereitung des Gewebes auf die gleiche Weise, aber die Basis Form vor dem Einfrieren TFM hinzufügen für Gebrauch mit TFM leicht angepasst werden. Die Stichprobe haben eine völlig flache Auerbach-Plexus, mit einem Darmhaut, die leicht sichtbar gemacht werden können. (E) beide Gewebe Vorbereitung Ansätze produzieren ausgezeichnete Gewebeschnitte bei der empfohlenen 8 µm Dicke. Das Verfahren mit TFM ist hier dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Korrekte Ausrichtung der Darmgewebe enthält Abschnitte, die reich an enterischen Ganglien. Wenn Sie standard quer Querschnitte der Tiefkühlfrische Darm (A, B) vorbereiten, gibt es nur eine kleine Fläche von Auerbach Plexus (B) auf jeder Folie vorhanden. Sehr wenige Enterische Ganglien können pro Folie, gesammelt werden, die Zeit- und kostenintensiv ist. Im Gegensatz dazu bietet Vorbereitung Längsprofile im Flugzeug von den Auerbach-Plexus (C) eine viel größere Fläche von Ganglien (C). Abschnitte des Auerbach Plexus erhält man durch die Darmhaut ab und schneiden nach innen durch den längs-Muskel (B). Bei der Annäherung an den Auerbach-Plexus, an der Kreuzung der Längs- und kreisförmige Muskelschicht (B), können zwischen 6-12 Schnittserien gesammelt werden. Jeder Längsschnitt Auerbach Plexus enthält große Schwaden des enterischen Ganglien (dargestellt in C, mit einer modifizierten Färbeverfahren ohne Xylol, bevorzugt die Ganglien Fleck). LCM Kappen können mithilfe eines einzigen Gewebe Abschnitts gefüllt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Färbung mit einem Ethanol-kompatiblen Farbstoff RNS-Qualität verbessert. RNS-Qualität wurde gemessen, indem die Bioanalyzer und repräsentative Ergebnisse zweier Proben aus jeder Gruppe werden angezeigt. Ursprünglichen RNA-Qualität von frischen, unmontierte Abschnitte (A, keine Behandlung) gemessen, hatte eine RNA-Integrität-Reihe (RIN) von 8,65 ± 0,07. RIN war für Abschnitte montiert und verarbeitet durch alle Schritte, aber ohne Flecken (B) 7,95 ± 0,35. Wenn mit 4 % Cresyl violette Färbung der Dehydrierung Schritte hinzugefügt wurde, gab es ein vernachlässigbaren Effekt auf RIN, mit einer durchschnittlichen RIN von 7,87 ± 0,35 (C). Im Vergleich dazu führte die Verwendung von wässrigen Fleck, Toluidin blau (T-blau) und die Zugabe von Wasser spült das Verfahren (D) zu deutlich reduzierten RNS-Qualität mit einem RIN von 6,45 ± 0,21. Jede Gruppe bestand aus n = 3 biologische Wiederholungen mit Ausnahme von "Keine Behandlung" und "T-Blue"(n=2). RINs berichtet hier als Mittelwert ± Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . PEN-Membran-LCM-Folien ermöglichen präzise Sammlungen der enterischen Ganglien. Mit Normalglas Objektträger Enterische Ganglien über LCM sammeln neigt dazu, unerwünschte Gewebe Pickup (A) zur Folge haben. Die roten Kreise (30 µm im Durchmesser) geben die Größe der IR LCM-Spots verwendet, während die Einziehung von Forderungen. Der weiße Pfeil zeigt eine Auflistung der Ganglienzellen, die ein Stück des angrenzenden Muscularis Gewebe gezogen. Mit Stift-Membran Rutschen (B) werden Proben ein dünnes Blech eingehalten, die von der Mehrzahl der Objektträger getrennt ist. Beim Schneiden mit der UV-LCM-Laser der Probe und Stift Membran sind in Scheiben geschnitten, wodurch die vollständige Ablösung der Ganglien aus der Folie, ohne Rücksicht auf Ganglion Form (C), und komplette Einhaltung der LCM GAP beim Entfernen aus der Probe (D ). Strukturen eines gewünschten Größe und Form ≥10-15 µm kann vollständig und genau gesammelt [(E), erste Gewebe Mark-Up; (F) IR und UV-Laserschneiden abgeschlossen; (G) LCM Kappe aus Abschnitt entfernt], wie die LCM-Kappe (H) visualisiert. Die gesprenkelte Hintergrund im Bedienfeld "H" ist inhärent GAP und ist nicht unerwünschte Ablagerungen. Das grüne Kreise blau Fadenkreuz in E-H -Panels sind Teil des Programms LCM und sind Platzhalter für die UV- und IR-Laser bzw.. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Auswahl einer optimalen RNA-isolierungskit. RNA-Integrität-Ergebnisse sind nach einem gleichzeitigen Vergleich drei verschiedener RNA-Isolierung-Verfahren dargestellt. Zwei repräsentative Grundstücke aus jeder Gruppe werden angezeigt, um die Variabilität zu veranschaulichen, die zwischen Proben parallel verarbeitet auftreten können. RNA-Extraktion Kit "A" (A) hergestellten Proben mit einem RIN von 6,83 ± 0,65 und moderate Renditen der RNA und DNA-Verunreinigung, trotz Durchführung einer auf Spalte DNase Verdauung haben tendenziell. RNA-Extraktion Kit "B" (B) führte zu der höchsten gemessenen RIN am 8.3 ± 0,1. Während die Phenol-basierte RNA Extraktionsmethode "C" (gefolgt von clean-Up von der RNA-Proben mit RNA-Extraktion Kit "B") (C) erschien, gDNA zu beseitigen und hatte ein RIN von 7,5 ± 0,26, gab es große Bänder, die entstanden sind, vor dem Schmelzen der Kontamination der selbstklebende Polymer aus der LCM Kappe während der RNA-Lyse-Schritt. Darüber hinaus waren Sie RNA aus RNA Extraktion Kit "A" und Extraktionsmethode "C" durchweg niedriger als jene, die durch RNA-Extraktion Kit "B". Vor allem der RNA Lyse Puffer von RNA-Extraktion Kit "B" zur Verfügung gestellt. (mit zusätzlichen β-Mercaptoethanol) lyses vollständig erfassten Ganglien (D). Jede Gruppe hatte n = 3 biologische repliziert und ist hier als Mittelwert ± Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Repräsentative Ergebnisse. Wenn zwei Kappen der enterischen Ganglien pro Probe zu bündeln, erhalten wir ausreichende Mengen an RNA für RNA-Seq (> 1 ng) zusammen mit ausgezeichneten RNS-Qualität. Repräsentative RNA Grundstücke sind für eine Probe mit RIN von 8,3 (A), 7,5 (B) und (C) 6.9 dargestellt. RNA-Seq-Daten wurden durch eine Qualitätsbeurteilung Programme, in R. (D) der Ende-Bias-Plot zeigt an, dass die Proben erfolgreich sequenziert wurden und eine bescheidene 3'-Ende Voreingenommenheit haben laufen. (E) das Gen Biotyp Grundstück steht auch, dass die Sequenzierung Ergebnisse zwischen den Proben weitgehend übereinstimmen. Insgesamt hatten wir eine > 95 % Erfolgsquote bei der Schaffung von Proben nutzbar für RNA-Seq Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Schritt | Dauer | Zweck |
| 95 % Ethanol (-20 oC) | 30 s | Fixierung |
| 4 % Cresyl violett in 95 % igem Ethanol | 10-30 s | Fleck |
| 75 % Ethanol (mit wiederholten Eintauchen) | 15-25 s | De-Fleck |
| 95 % Ethanol (mit wiederholten Eintauchen) | 5-15 s | De-Fleck |
| 100 % Ethanol | 15 s | Dehydrierung |
| 100 % Ethanol (wasserfrei) | 30 s | Dehydrierung |
| Xylol (mit wiederholten Eintauchen) | 15-20 Sek. | Dehydrierung |
| Xylol | > 10 min | Dehydrierung |
| An der Luft trocknen | 1-3 min | Verdunstung von Xylol |
Tabelle 1. Färbung und Dehydratation Protokoll Übersicht. Diese Tabelle zeigt unsere optimierte Färbung Protokoll. Hinweis, die beliebige Ethanol-kompatible Beflecken kann verwendet werden, Cresyl violett, ersetzen, wenn es bessere Ergebnisse bietet. In einigen Fällen müssen die Dauer der Färbung und Entfärben verlängert oder verkürzt werden. Im Allgemeinen gilt: je länger wird die Fixierzeit, desto schneller das Gewebe vollständig gefärbt werden. Wir haben nicht bemerkt, eine Verringerung der RNA Integrität nach Wiederverwendung von Fläschchen bis zu 3 Mal, wenn Sie Folien aus dem gleichen Gewebe Segment vorbereiten.
| Spender | Gewebe | RIN |
| F | Doppelpunkt | 7.1, 7.2, 7.4 |
| M | Ileum | 7.2, 6.9, 7,8 |
| M | Zwölffingerdarm | 8.2, 7.4, 7,7 |
| Ileum | 7.3, 7.4, 7.6 | |
| Doppelpunkt | 7.7, 7.8, 7.3 | |
| F | Zwölffingerdarm | 7.1, 7.3, 6,9 |
| Ileum | 7.8, 7.9, 7.6 | |
| Doppelpunkt | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | Ileum | 6.9, 6,7, 6,9 |
| Doppelpunkt | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Ileum | 7.2, 7.3, 7.6 |
| Doppelpunkt | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | Ileum | 8.3, 7,8, 7.4 |
| Doppelpunkt | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | Zwölffingerdarm | 8.3, 8.8, 8.0 |
| Ileum | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| Doppelpunkt | 8.4, 8.6, 7.1 |
Tabelle 2: Repräsentative RNA Integrität Ergebnisse. Der Proben, die in dieser Tabelle angezeigt wurden von menschlichen enterischen Ganglien erhalten. Alle ausgewählten Proben haben ausreichende RNA-Qualität und Quantität für die Analyse der RNA-Seq. Die durchschnittliche RIN aller Proben, die in dieser Tabelle aufgelisteten ist 7,49 ± 0,53. RNA-Konzentration wurde auch mit der RiboGreen Quant-iT-Assay gemessen und alle Proben, die in dieser Tabelle angezeigt die minimalste benötigte Menge für unsere RNA-Seq getroffen haben (> 1 ng) Experimente. Kleinere Mengen können je nach Vorverstärkung Verfahren verwendet werden. Solche Verfahren sind jedoch zuverlässiger, wenn man es zu große Unterschiede in der Genexpression zwischen Proben werden oder Gruppen verglichenen erwartet; Ansonsten können diese Ergebnisse echte Unterschiede in einigen RNA-Seq-Anwendungen maskieren. Es empfiehlt daher in der Regel mit mehr Material wenn möglich zu beginnen.
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Discussion
Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Sammlung von zahlreichen enterischen Ganglien als Quelle abzuleiten RNA für RNA-Seq. Hier haben wir die Prozesse gemäß bestehender Protokolle gleichzeitig maximal RNA Integrität beschleunigt. Da alle Schritte in diesem Verfahren voneinander abhängig sind, ist es wichtig, dass alle Probleme aus dem Beginn der Studie beseitigt werden und dass alle Proben so ähnlich zueinander wie möglich, bereit sind, zuverlässige RNA-FF zu erhalten
Von Beginn des Verfahrens kann RNA Integrität negativ beeinflusst werden, wenn das Zeitintervall (kalte ischämische Zeit) Sammlung von Gewebe bei der Organspende und Erhalt des Gewebes für die Verarbeitung im Labor zu lang ist. Angesichts dieses Anliegen, waren wir überrascht, dass qualitativ hochwertige RNA noch Darm Proben auch nach 24 Stunden kalt ischämischen Zeit entzogen werden kann. Wenn der Darm Muster sind gekühlt und in Cold Storage-Lösung gelagert, gibt es hervorragenden Schutz von Gewebe Integrität und RNS-Qualität. Wir verlangen, dass das Darmgewebe gespült wird bei der Abholung vom Organ-Sammlung-Team zur Begrenzung der Exposition des Darms, Verdauungsenzyme, RNases und anderen Molekülen, die RNS-Qualität in diesem Zeitraum auswirken könnten. Wir haben festgestellt, dass wenn die Darm Probe nicht vollständig geleert wird, das die Probe RIN deutlich reduzieren kann.
Mit unserem optimierten Verfahren für Darmgewebe Probenvorbereitung, können wir vermeiden, Proben in TFM einzubetten. Da TFM mit Ethanol und Xylol interagiert, einen dunklen braunen Niederschlag bilden, der mit der Visualisierung der enterischen Ganglien stört, bevorzugen wir unsere Proben auszuschließen. Allerdings kann beim Arbeiten mit Darmgewebe von Mäusen oder anderen Arten der Ausschluss der TFM nicht möglich. In diesem Fall haben wir experimentierten mit TFM aus eingehalten auf einer Folie zu entfernen. Wenn das Gewebe eine ausreichende Fläche hat, kann Äthanol (gekühlt bei-20 ° C) auf der Folie mit einer transferpipette, TFM, so dass sie mit der Pinzette entfernt werden schnell zu beheben tropfte. Tropfen Ethanol auf den Objektträger, vermeidet die Ansammlung von TFM innerhalb der Durchstechflasche von Ethanol, die die Bräunung Wirkung verschlimmern kann, wenn mehrere Folien verarbeitet werden.
Beim Blitz-Gefrieren bevorzugen wir eine Trockeneis-Gülle mit 2 MB, anstatt 100 % Ethanol, weil 2 MB bereitwillig verdunstet bei der Landung auf der Oberfläche des Gewebes. Ethanol ist tendenziell mehr langsam verdunsten, vor allem in Kombination mit TFM, bilden einen chemische Schlamm auf den Gewebe-Block, der leicht entfernt werden kann. Ethanol und 2 MB tendenziell fizz und splatter kräftig beim Einfrieren in kleinen Behältern Einfrieren, weil das geringe Volumen des Schlickers Trockeneis eine niedrige spezifische Wärmekapazität hat. Stattdessen mit einem großen rechteckigen Eimer voller pulverisierte Trockeneis bietet eine große Masse der kühle und Temperaturschwankungen verhindert, während das Gewebe eingefroren wird.
Wie bereits erwähnt, ist es manchmal einfacher, kontinuierliche Blätter des enterischen Ganglien von einigen Gewebeproben im Vergleich zu anderen zu erhalten. Verständlicherweise, unterliegt die Gesamtgeschwindigkeit der LCM Variabilität je nach den Eigenschaften des Gewebes Quelle oder der intestinalen Region abgetastet wird. Aus diesem Grund ist es oft am besten, viele Tiefkühlfrische Proben zu Beginn vorzubereiten. Wir haben in der Regel festgestellt, dass insgesamt 20 Proben pro Segment des Darmes (~ 2 cm x 1,5 cm, jedes) weit mehr als ausreichend, um genügend RNA für downstream-Anwendungen zur Verfügung zu stellen. Wenn nur eine kleine Länge von Darmgewebe verfügbar ist, empfehlen wir jedoch eine Mindestlänge von 5 cm. Mit unserem Ansatz würde der geringste Ertrag, der erreicht werden würde reichen von 18 bis 30 ng RNA, wie weiter unten besprochen. Die Mindestabstand von 5 cm Länge kann potenziell abhängig von der Anwendung reduziert werden, vor allem, wenn größere Mengen von cDNA-Vorverstärker eingesetzt werden. Diese Parameter wurden nicht in der aktuellen Studie getestet. Zum Beispiel wurden Enterische Ganglien aus voll-Dicke intestinale Biopsie Proben (2 x 2 cm) für die Verwendung mit qPCR4gesammelt.
Wie wir in dieser Studie zeigen, bietet der Einsatz von Ethanol-kompatiblen Farbstoff, Cresyl violett, viel besseren Schutz der Integrität der RNA als den wässrigen Fleck, Toluidin blau. Wenn in Ethanol getaucht, werden RNases inaktiv5,15. RNases erlangen jedoch noch Funktion einmal um7,15Wasser ausgesetzt. Bei der Färbung mit wässrigen Farbstoffe, darf das Gewebe Nuklease-freies Wasser für fast 1 min9, ausgesetzt werden, führt zu erheblichen RNA-Abbau. Bei der Verwendung von Toluidin blauer Färbung Gewebe konnten wir nicht zur Verringerung der Exposition zu Wasser vor und nach dem Färben, da solche Änderungen auch die Aufnahme und Speicherung von Toluidin blau, bzw. reduziert. Ein ähnliches Problem wurde auch mit Hämatoxylin-basierte Farbstoff9gefunden. In dem hier beschriebenen modifizierten Protokoll vermeidet Färbung mit Cresyl violett direkte Belichtung der intestinalen Proben an Wasser ab, damit maximal RNA Integrität bewahren. Diese Ergebnisse entfällt die Notwendigkeit für zusätzliche RNase-Inhibitoren in der Färbelösung. Wir fanden, dass solche Inhibitoren unwirksam sind bei Aktivieren der Verwendung von wässrigen Farbstoff, Toluidin blau, wie es mit der Aufnahme und Beibehaltung des Farbstoffs gestört.
Wenn wir zunächst unsere Färbung Protokoll optimieren, wir waren nicht in der Lage, die Ergebnisse in anderen Protokollen zu reproduzieren und5,7,8,11, berichtet. Während der Grund dafür unklar ist, fanden wir mehrere Faktoren, die zum inkonsistenten Farbstoff-Aufnahme und Speicherung geführt. Zum Beispiel obwohl bestimmte Protokolle erfolgreich Gewebe mit Cresyl violett in 100 % Ethanol8 oder 75 % Ethanol5befleckt haben, gegenüber nur schwach mit der Bezeichnung Ganglien oder hohen Hintergrund hatte der Farbstoff mit Cresyl violett in 95 % igem Ethanol. Der Anteil der Cresyl violett in der Färbelösung verwendet ist auch sehr wichtig. Die meisten Protokolle empfehlen eine 1 % Cresyl violette Lösung7,8, aber diese Konzentration keine zuverlässige Färbung in unseren Händen, sogar nach der Färbung Abschnitte für bis zu 2 min. Wir hatten viel Erfolg Färbung mit einem geklärten gesättigten Färbelösung von 4 % Cresyl violett11 auf die Probe durch eine sterile Spritze Filter8angewendet. Diese gesättigte Lösung ermöglicht viel rascher Färbung der Probe, in weniger als 10-15 s. Pre-Fixierung der Probe in gekühlten 95 % igem Ethanol (bei-20 ° C) ermöglicht eine schnellere Aufnahme des Flecks.
Ein weiterer Bericht festgestellt, dass Enterische Ganglien meist deutlich in Tiefkühlfrische menschlichen Darmabschnitte, beim Kombinieren von Cresyl violett mit Eosin in einem 75 % Ethanol Lösung5 gefärbt wurden. Allerdings haben wir festgestellt, dass Eosin erschwerte Ganglien zu identifizieren und diese Cresyl-violett, allein, überlegene Erkennung bietet. In einer anderen Studie wurde festgestellt, dass eine gepufferte Cresyl violette Lösung für Endometriumkarzinom Gewebe10einheitliche Färbung Ergebnisse zur Verfügung gestellt. Allerdings fanden wir dies nicht bieten keine Verbesserung für menschliche Darmgewebe und könnte auch nicht umgesetzt werden, wenn Sie 95 % igem Ethanol für die Färbelösung zu verwenden.
Wir haben eine Reihe von Bedingungen getestet, in denen das Protokoll angehalten und zu einem späteren Zeitpunkt wieder aufgenommen. Viele Protokolle empfehlen schneiden Folien vor der Zeit und wieder sofort nach der Montage auf die Folie5,9bei-80 ° C eingefroren. Mit diesem Ansatz, Färbung und LCM kann dann wieder aufgenommen werden innerhalb der nächsten Woche bietet großen Flexibilität. Jedoch hat dies nicht nur erheblich beeinträchtigt, mit Färbung; Darüber hinaus reduziert RNA Integrität in unseren Händen (Daten nicht gezeigt). Um dieses Problem zu umgehen, empfehlen Grover Et Al. Färbung und entwässern die Abschnitte vor der Lagerung im Gefrierschrank11. Bei diesem Ansatz werden Dias befleckt und dehydriert (wie in Tabelle 1) bis zu 100 % wasserfreiem Ethanol Schritt (Protokoll Abschnitt 5.2). Dann Proben werden in einem zweiten Fläschchen von wasserfreiem Ethanol 100 % für 10 min inkubiert und eine konische Rohr mit Trockenmittel Gel, das dann auf Trockeneis gekühlt werden und an die-80 ° C Gefrierschrank sofort übertragen werden. Beim Entfernen von Proben aus der Tiefkühltruhe sind Folien sofort in 100 % wasserfreiem Ethanol für 30 s und luftgetrockneten vor getaucht, zur Durchführung von LCM11. Leider in unseren Händen reduziert dieser Ansatz RIN von 0,6-0,8 (Daten nicht gezeigt). Wir griffen daher auf alle schneiden, färben und LCM am selben Tag durchführen, um maximale RNA-Integrität in unseren Bedingungen zu erhalten. Dies erweist sich als sehr zeitaufwändig, aber 10-14 LCM Kappen während eines vollen Arbeitstages gefüllt werden können.
Der zuverlässigste Punkt, an dem unser Protokoll angehalten werden kann, steht das Xylol inkubationsschritt. Folien haben in Xylol (mit Molekularsieben) für bis zu 4-5 Std. ohne offensichtliche Auswirkung auf RNA Integrität verlassen. Wir haben festgestellt, dass wenn drei Folien gleichzeitig vorbereitet werden, alle mit LCM innerhalb dieses Zeitraums verarbeitet werden können, selbst wenn eine Stunde Pause benötigt wird. Eine Alternative ist es, die Folien nach Färbung und Austrocknung Schritte innerhalb einer vakuumdichten Exicator16auszutrocknen, aber wir haben noch nicht versucht, diesen Ansatz.
RNA Isolation ist noch ein weiterer entscheidender Schritt des Verfahrens mit den wichtigsten Faktoren sein: um die maximale Ausbeute von RNS, halten das gesamte Spektrum der RNA (ohne Verlust der kleinere RNA-Spezies)17,18, und genomischen DNA aus der Probe17vollständig zu beseitigen. In unseren Händen zur Verfügung gestellt RNA Extraktion Kit "B" des besten Ergebnis mit unseren Proben, es bot größere Erträge und effizienter auf genomischer DNA Beseitigung war. Unsere Beobachtungen über Unterschiede in der Renditen zwischen RNA Extraktion Reagenzien stehen im Einklang mit früheren Berichten17,18. Allerdings gibt es auch viele LCM-Studien, die Erfolg mit anderen RNA-Extraktion Reagenzien19,20gemeldet haben. Vorherige Berichte zeigen auch, dass die Spalte basierenden RNA Extraktion Prozessen bessere Retention von kleinen RNA-Molekülen als Phenol basierende RNA-Extraktion Methoden18 anbieten, wie kleine RNA-Moleküle im überstand während RNA Niederschlag verloren gehen kann Schritte.
Wir beobachteten, dass RNA-Lyse-Puffer, die Guanidinium-Thiocyanat mit zusätzlichen β-Mercaptoethanol zu verwenden ist sehr effektiv bei der Beseitigung aller erfassten Ganglien aus dem LCM-Deckel (Abbildung 5D). Während die meisten LCM-Protokolle nicht aufschütteln der lysate empfehlen zu tun, haben wir festgestellt, dass dies hervorragende Ergebnisse erzeugt und nicht zu einer RNA-Abbau führt. Darüber hinaus, dass ein noch größerer Wahrscheinlichkeit, dass alle Ganglien gefangen genommen von der Kappe für RNA-Extraktion veröffentlicht werden. Mit diesen Methoden erhalten wir in der Regel RNA ausbeuten von LCM von enterischen Ganglien im Bereich von 1,8 bis 18 ng/cm2 von Darmgewebe, je nachdem, wie viele Ganglien auf einer bestimmten Folie vorhanden sind. Unsere RNA-Seq-Verfahren erfordert einen minimalen Aufwand 10 ng RNA können, aber andere Verfahren viel niedrigeren RNA Eingabe, wenn eine Sequenzierung Verarbeitung eine größere Anzahl von Zyklen Vorverstärkung umfasst. Die Gesamtfläche des Gewebes von der Vorbereitung und Blitz-einfrieren-Prozess gespeichert ist 40-60 cm2, das reichlich RNA cDNA Bibliothek Prep und Low-Input-RNA-Seq-Anwendungen bietet.
Während unsere Verfahren zur Erfassung der gesamten enterischen Ganglien konzipiert ist, kann der Ansatz leicht für die Sammlung von einzelnen Neuronen oder Gliazellen, geändert werden, auf Wunsch5. Jedoch da Gliazellen dicht verarbeitet werden Ensheath Neuronen der ENS, Glia RNA zusammen mit RNA des erfassten Neuronen, wenn auch in geringer Anzahl eingeschlossen. Dies wirft Fragen, wenn Sie versuchen, neuronale Transkripte ausgedrückt bei niedrigen Ausfertigung eine eigene Nummer zu identifizieren. Einzelne Zelle RNA-Seq bietet in dieser Hinsicht die beste Präzision und Erkennung, erfordert aber Neuronen aus dem Darm Gewebe getrennt, gebeizt mit Pan-neuronale Marker und isoliert mit Durchflusszytometrie21 oder vom gesamten Darm identifiziert werden Dissoziationen nach der Sortierung mit Bioinformatik Ansätze. Der Nachteil der meisten Dissoziation Studien ist, dass die meisten Protokolle erfordern, dass die Probe inkubiert werden, bei Raumtemperatur oder 37 ° C über einen längeren Zeitraum, die bekanntlich die Transkriptom-3zu ändern. Vor kurzem, die Kälte-aktiv-Protease aus Bacillus Licheniformis seit Generation von einzelnen Zellsuspensionen für Maus Gewebe verwendet und es kann möglich sein, dieses Enzym für die Dissoziation des menschlichen Gewebes bei 4 ° C22gelten. Bis solche Optimierung erreicht ist, ist LCM frisch eingefrorenen menschlichen Gewebes ein robustes Mittel RNA zu erfassen, für Ausdruck Profilierung des peripheren Nervensystems Elemente wie enterischen Ganglien.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine zuverlässige und konsistente Protokoll für die Sammlung von RNA aus menschlichen enterischen Ganglien entwickelt. Wir haben die Vorbereitung der menschlichen Darmgewebe, Färbung, LCM-Prozess und RNA-Extraktion anhand zahlreicher Publikationen und Protokolle optimiert. Wir haben auch bewiesen, die Zuverlässigkeit dieses Ansatzes bei der Erhebung von RNA-Proben von ausreichender Qualität, RNA für RNA-Seq. Dieses Protokoll kann im großen und ganzen auf Gewebe von Patienten mit einer Reihe von Magen-Darm-Krankheiten gesammelt angewendet werden und lässt sich leicht für die Verwendung mit Nager-Modelle, und bietet damit eine zuverlässige Strategie für die Entwicklung neuer Therapeutika.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Spender und deren Familien, die diese Arbeit möglich gemacht. Wir schätzen auch die Unterstützung des Personals am International Institute of Medicine und Tennessee Spender Dienstleistungen zur Unterstützung koordinieren Sammlung von Gewebe, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 EMS2 und Stipendium Unterstützung von NIH T32-DK007673, AMZ. Wir sind dankbar für Mitarbeiter der Vanderbilt translationale Pathologie gemeinsame Ressource für den Zugriff auf die LCM Instrument und Beratung auf Gewebe Vorbereitung. Die Vanderbilt Gewebe Pathologie gemeinsame Ressource wird teilweise von NIH-Stipendien P30-CA068485-14 und 13 / DK059637 / U24 unterstützt. Wir danken der Genom-Technologiezentrum-Zugang in der Abteilung für Genetik an der Washington University School of Medicine für Hilfe bei der Genomanalyse. Die AGB ist teilweise von NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842, Siteman Cancer Center und IKT/CTSA Grant #UL1TR002345 vom nationalen Zentrum unterstützt für Forschung Ressourcen (NCRR), eine Komponente der National Institutes of Health (NIH) und der NIH Fahrplan für die medizinische Forschung. Diese Publikation ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NCRR oder NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
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