Summary
Цель настоящего Протокола заключается в том, для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, изолированных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Этот протокол предусматривает подготовка флэш замороженных образцов человеческой кишечника ткани, cryosectioning, обколоть окрашивание и обезвоживания, НОК и извлечение RNA.
Abstract
Этот метод предназначен для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, собранных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Мы определили пять шагов в рабочем процессе, которые имеют решающее значение для получения РНК изоляты от кишечных ганглиев с достаточно высокого качества и количества РНК seq. Во-первых при подготовке кишечника ткани, каждый образец должен иметь все лишнюю жидкость, удалены промокательной до рихтовки serosa как можно больше в нижней части большого базовой формы. Затем образцы быстро заморожены на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane. Во-вторых при резании ткани, важно располагать cryomolds кишечная разделам параллельно плоскости полная myenteric сплетения, тем самым давая наибольшую площадь поверхности кишечного ганглиев на слайд. В-третьих, во время LCM, полиэтилен napthalate (PEN)-мембраны слайды предлагают наибольшую скорость и гибкость в зарисовке неоднородной формы кишечной ганглии, при сборе интестинальная ганглии. В-четвертых для различных визуализации кишечных ганглиев в пределах секции, этанол совместимых красители, как количество кресил фиолетовый, предлагают отличные сохранение целостности РНК относительно водные красители. Наконец для извлечения РНК из захваченных ганглии, мы наблюдали различия между коммерческой РНК добыча комплекты, которые принесли Реновированый РНК и качества, устраняя загрязнения ДНК. Оптимизация этих факторов в текущий протокол значительно ускоряет процесс и дает кишечных ганглиев образцы с исключительной РНК качества и количества.
Introduction
Этот метод предназначен для получения высокого качества образцов РНК кишечных ганглиев от кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Протокол, описанные здесь был оптимизирован для обеспечения достаточной РНК качества и урожайности для РНК (РНК seq) последовательности и предназначен для использования с свежезаваренным резецируется, нефиксированных, флэш замороженные кишечных тканей человека.
Расстройства функциональные моторики желудочно-кишечного тракта и кишки затрагивает один из каждых четырех человек в Соединенных Штатах. Кишечные нервной системы (Ен), также именуемый второй мозг1, часто находится в центре этих расстройств, как она играет решающую роль в кишечнике гомеостаза и подвижности. Манипуляция сократительной способности кишечника обычно ограничивались хирургическая резекция aganglionic/noncontractile ткани, хронический диетическое изменение и/или лекарства. Удивительно полным транскриптом взрослых ENS остается последовательной, значительно ограничивает нашу способность идентифицировать молекул в ENS, которые могут быть направлены фармацевтически или используются в терапии стволовой клетки.
Существует относительно небольшое число методов для изоляции RNA от человека кишечные ганглии. Первый подход, клетки диссоциации2, требует температуры высокой инкубации и длительный инкубационный раз; оба из которых известны содействовать деградации РНК и изменить транскриптом2,3. Альтернативный подход, НОК, более надежно сохраняет транскриптом и защищает целостность РНК. Хотя ряд исследований использовали LCM для сбора ганглиев от кишечных тканей человека свежемороженые4,5,6, эти подходы были либо затруднены бедных РНК качества и количества, были довольно трудоемкий, или необходимые модификации пятнать или РНК добыча методы для работы в наших руках. Другие LCM протоколы предназначены для сохранения РНК, которые были найдены в продукте LCM, предоставляемых пособий, дополнительные усовершенствования7,8, но адаптация необходима при применении к изоляции кишечных ганглиев8, 9. по этим причинам, мы разработали оптимизированный протокол, основанный на эти ресурсы, дает значительное количество высокопрочные РНК от человека кишечные ганглии, имеет сравнительно быстрый рабочий процесс и производит последовательные результаты через большой Количество выборок.
В этом исследовании мы представляем краткий обзор оптимизации процедур, которые способствуют изоляции высокопрочные РНК от кишечных ганглии, получены из резекции кишечника ткани человека. Наш метод включает в себя пять важных аспектов. Во-первых, свежезаваренным резецируется, незафиксированная человека кишечные образцы должны быть сокращены до размера, имеют все излишки влаги удален с ткани лаборатории и выравнивается в большой базы плесень до флэш замораживания на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane (2 МБ). Во-вторых, гистологическое части кишечника должны быть готовы получить полное плоскости myenteric сплетения на слайде, который предлагает большой полезной кишечной ганглии. Успех этого шага в значительной степени зависит от процесса подготовки ткани. В-третьих неоднородной структуры ганглиев в ENS требует использования полиэтиленовых napthalate (PEN) мембраны слайды6, который предлагают наибольшую скорость и точность в процессе НОК. Четвертый, этанол совместимых красителей, таких как количество кресил фиолетовый, должны использоваться для сохранения целостности РНК во время окрашивания кишечных ганглии. Наконец процесс извлечения РНК имеет решающее значение для успешного исхода с РНК-последующие Мы стремились РНК добыча подход, который производит высокой целостности РНК, максимизирует РНК урожайности при запуске с небольшими коллекциями кишечных ганглиев, устраняет загрязнения ДНК и сохраняет как много видов РНК как можно скорее.
Вместе взятые, оптимизация этих факторов в настоящем исследовании значительно ускоряет процесс и дает образцы кишечных ганглиев с исключительной РНК количества и качества. Результаты были во многом согласуется среди значительные группы образцов, указывающее последовательность этого подхода. Кроме того мы использовали эти подходы для успешной виртуализации десятки образцов РНК от кишечных ганглии. Стратегии, подчеркнул здесь также может быть широко адаптирована для выполнения LCM желаемого ганглиев или ядер периферической и центральной нервной системы и других случаях, требующих изоляции высокого качества РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы, описанные здесь были одобрены, Вандербильт университета институционального обзора (КИБ).
1. подготовка до прибытия ткани
- Получение надлежащего утверждения IRB и координировать с учреждениями человеческий орган пожертвование для получения свежей резецируется, незафиксированная кишечных тканей от доноров, которые отвечают всем критериям исследований, необходимых для исследования.
Примечание: Этот протокол может быть адаптирован для использования с мышей и других грызунов модели.- Немедленно после резекции кишечника каждого сегмента, тщательно промойте люмен с охлажденной PBS или ткани-носитель для удаления остаточного материала Люминал или Кале.
- После промывки и выброса отходов в соответствующей биологической сосуда, погружать ткани в достаточном объеме ткани-носителя (например, 3 - 5 раз объем кишечного ткани) и хранить в индивидуально меченых воды плотный пластик контейнеры, погруженной в лед или в холодильнике до использования).
- Обрабатывать ткани в течение 18-26 часов от времени сбора для предотвращения существенной деградации РНК.
Примечание: В зависимости от чистоты кишечных сегмента и хранения, это может быть возможным распространить наши предлагаемые сроки.
- Подготовить все материалы, необходимые для коллекции тканей человека заранее, как указано в настоящем Протоколе (см. Таблицу материалы для более подробной информации). Убедитесь, что все необходимые средства индивидуальной защиты носится во все времена.
- Подготовьте сухой лед ведра наряду с сухим льдом пульпы, как показано на рисунке 1.
- Раздавить достаточно сухого льда для заполнения 4 стандартных круговой лед ведра и одно прямоугольное ведро льда. Один из стандартных контейнеров должны иметь небольшие (11 x 21 см) Лаборатория тканей помещается на поверхности сухого льда. Если возможно используйте новые, закрытой коробки лаборатории тканей.
- Сделайте раствор сухой лед, powderizing 2 Л сухого льда в чистой прямоугольное ведро льда.
- Добавьте предварительно охлажденный 2 МБ до поверхности сухого льда. Слегка перемешать и придавить суспензии с помощью пипетки кончик Обложка формы поверхности навозной жижи в окружении больших частей сухого льда по бокам прямоугольное ведро канал.
- Место несколько тонких блоков сухого льда по краям ведро льда, чтобы стимулировать более быстрое замораживание. Там должно быть места для базовой формы ≥4 свободно помещается в ведро раствора сухого льда в данный момент.
- При необходимости стек ведро льда внутри другой прямоугольное ведро льда заполнены ¼ с сухим льдом. Это позиционирование помогает лучше изолировать навозной жижи сухого льда и предотвращает необходимость частых корректировок сухого льда и 2 МБ во время процедуры.
- Расположите сухой лед ведра в сборочной линии в следующем порядке: 1) сухого льда навозной жижи ведро, ведро льда ткани сухой 2) лаборатории, 3 & 4) обычной сухой лед ведра, 5) прямоугольной сухой лед ведро (рис. 1А).
2. Подготовка Flash замороженные кишечных тканей человека
Примечание: Весь этот процесс может занять от 45-80 мин на кишечные сегмент, в зависимости от качества кишечных тканей. Мы также рекомендуем, сбор образцов контроля качества для оценки качества РНК и гистология перед НОК.
- Заполнить большой поднос с влажного льда и место хирургические разделочные доски на вершине сухой лед.
- В этой установки холод 500 мл и 100 мл мензурки для хранения ткани и обрезать сегменты в холодного хранения решения. Предварительно холод база формы на доски так, что они готовы принять ткани.
- По получении свежей кишечных тканей, слить СМИ, в котором перевозится ткани и сохраняет его в предварительно охлажденные стаканы. Некоторые оставляют в эти стаканы для временного хранения кишечных тканей и подстриженные сегментов, которые будут подготовлены в последующих шагах.
- Вырежьте кишечных сегмент длиной около 20 см, что обеспечивает достаточно ткани (40-60 см2) для создания РНК нисходящие приложения и контроля качества образцов. В зависимости от целостности тканей это может быть возможным для достижения изоляции РНК для последующей обработки с гораздо меньшей длины (т.е. 5 см кишечника).
- Трим прочь жировой и соединительной ткани из кишечника, используя Ножницы хирургические. Остаточные жировой вдоль кишечных serosa подрывает способность полностью свести ткани в последующих шагах. Тщательно Обрежьте ткань, с тем чтобы избежать уменьшение поперечного сечения serosa во время удаления жира и соединительной ткани, которые структурно может повредить myenteric сплетения или сделать внешний вид ткани неравномерно сплющить для разрезания.
- Сделайте продольный разрез вдоль всей длины кишечника образца, предпочтительно в месте верхней брыжеечной вложения.
- Вскрыть прочь и отбросить теня палочки из толстой кишки, так что он выравнивает более легко, после освобождения от напряжения.
- Скошенный кишечника слизистую оболочку стороне вниз на охлажденные разделочную доску и вырежьте полоски шириной 1,25 см от полной длины ткани.
Примечание: Кишечные ткани часто расширяет после обрезки, так что этот размер должен быть соответствующим образом скорректированы. - Временно Храните полоски в охлажденной ткани хранения решения.
Примечание: Мы используем Belzer UW холодного хранения решения, потому что он имеет длительный срок хранения, относительно экономически эффективным и может храниться при комнатной температуре до тех пор, пока требуется. - Удаление полосы ткани из холодного хранения решения и разрезать его на сегменты ~1.5-2 см длиной.
- Быстро промокните кишечных сегментов в стеке лаборатории салфетки, чтобы удалить лишнюю жидкость и предотвратить образование кристаллов льда вдоль кишечных serosa во флэш замораживания. Если ткань высушивается не достаточно, это будет трудно получить высокое качество разделы из myenteric сплетения.
- Класть блотирования кишечных кусочки слизистой оболочки стороне на предварительно охлажденные, большой, одноразовые базовый пластмасс (37 x 24 x 5 мм).
- Тщательно выравнивают каждый сегмент слегка растяжение тканей над поверхностью базовой формы и с помощью Изогнутый пинцет аккуратно прижмите и изгнать все пузырьки воздуха, которые могут быть в ловушке под serosa. Обратите внимание, что расширяет сферу уплощение ткани. При необходимости, обрезать сегменты и вырезать остальные образцы с меньшим размером.
Примечание: Если ткань истощенные, то это будет мешать myenteric сплетения. После того, как будут удалены все пузырьки воздуха, оцените толщину образца до замораживания. При необходимости нажмите края внутрь образца до кишечной образца приближается к своей оригинальной толщины. - Поместите загруженные базы плесень на поверхность сухим льдом, суспензии 2 МБ. Ткани следует полностью замораживание в течение 30-60 сек, в зависимости от размера и толщины кишечника сегмента.
- Химчистка в нижней части базовой формы для удаления остаточного 2 МБ, быстро потерев базы плесень на лабораторных ткани, предварительно охлажденный в втором сегменте, сухого льда.
- Высушенные образцы передать третьей ванны сухого льда и похоронить его по поверхности сухой лед, до тех пор, пока он готов быть обернуты.
- Быстро наблюдать в нижней части базы плесень до упаковка, чтобы изучить качество подготовки образца. Запишите любые образцы, которые не появляются плоские или имеют большие воздушные пузыри, как они должны избегать для cryosectioning и НОК.
- Оберните образца в предварительно помечены алюминиевой фольги, которая укладывается поверх сухого льда в контейнере таким образом, чтобы упаковка ткани происходит во время держат полностью заморожены.
- Оберните образца с слоем полиэтиленовой пленкой, чтобы свести к минимуму обезвоживания тканей во время хранения при температуре-80 ° C.
- Хранить образцы в прямоугольное ведро, пока они не готовы быть перемещены в морозильник.
- Предварительно метку и предварительно охладите морозильная камера коробки на-80 ° C для немедленного хранения образцов после сбора.
- Возьмите небольшую часть ткани от каждого кишечных сегмента для оценки целостности РНК до проведения НОК.
- Предварительно ярлык бесплатно РНКазы трубку 2 мл для каждого сегмента, наполненный пола≥500 мкл буфера lysis. Мы рекомендуем использовать РНК добыча комплект «D», перечисленных в Таблица материалов.
- Гомогенизации маленьких (2 мм х 2 мм) кусок кишечника в стандартные ткани микро гомогенизатора (20-40 s, до тех пор, пока не куски ткани остаются). Затем немедленно заморозить РНК lysate на сухой лед и хранить при температуре-80 ° C до разбирательства с извлечение RNA.
- При необходимости внедряйте некоторые из разделов в ткани замораживания среднего (TFM) как back-up. Подготовка разделов ткани в точно так же, описанные в этом разделе, но потопить образцов в TFM в пределах базовой формы до флэш замораживания.
3. Cryosectioning
- До cryosectioning подготовить все необходимые материалы для окрашивания и обезвоживания и передавать образцы желаемого ткани из морозильной камеры-80 ° C в ведро сухого льда.
- Подготовить криостат для использования, установив для оптимального раскроя температуры (-18-22 ° c) и вытирая вниз поверхностей с 100% этанола и лечении лезвие и чистите лоток с РНКазы обеззараживания решения.
- Лучше всего придерживаться образец патрона, используйте следующий подход.
- Место щипцами в сухой лед для по крайней мере 30 s перед разверток кишечных образца и поместив его на поверхности сухой лед serosa стороной вверх.
- Залить 3-5 мм Курган ткани замораживания среды (TFM) на держатель образца большой криостат и немедленно передать кишечных образца serosa стороной вверх на TFM.
- Быстро передавать держатель образца сухого льда и накрыть порошкообразного сухого льда после позволяя TFM придерживаться образца для 2-5 s при комнатной температуре. Убедитесь, что TFM остается ниже плоскости myenteric сплетения.
Примечание: В идеале, внешняя поверхность слизистой оболочки кишечника будет полностью придерживаться TFM прежде чем TFM начинает заморозить без оттаивания образца.
- Смонтировать держатель образца в криостата образца голову и выравнивание образца с лезвием криостат, таким образом, чтобы плоскость myenteric сплетения будет параллельно лезвие.
- Установите Толщина резания на криостат для 8 мкм. Отлично выравнивание образца предназначен для получения максимально возможной площади поверхности myenteric сплетения на каждом слайде. Эта толщина обычно рекомендуется для ткани человека и грызунов, но может быть скорректирована, при необходимости.
- Раздел через serosa и продольные мышцы до достижения myenteric сплетения.
- Чтобы найти myenteric сплетения, смонтировать раздел Пример на слайд и пятен раздел с водной краской, например 1% количество кресил фиолетовый или толуидиновый синий, и т.д.
- Просмотрите раздел под световой микроскоп с увеличением 40-2000 X для определения соединения между слоями продольных и круговых мышц. Микроскоп параметры приведены в Таблице материалов. В начале секционирование будет отмечен serosa присутствие соединительной ткани. Некоторые оставшиеся брыжеечных жира может также присутствовать вдоль serosa. Затем начинается лист внешней продольных мышц слоя. По достижении границы между слоями продольных и круговых мышц будет соблюдаться часть кишечных ганглиев.
Примечание: В следующих нескольких разделах, myenteric сплетения, станет весьма очевидным, с большим swaths ганглии, присутствуя в пределах одного раздела (рис. 2C). Если ткани в начале секционирование не вполне плоско, то только часть ганглиев будет присутствовать в каждом разделе в данный момент. Иногда кишечные образца могут иметь по сути неравномерным myenteric сплетения, несмотря на ткани, появляются совершенно плоские. Это особенно верно для образцов двенадцатиперстную кишку. В нашем опыте, эти образцы может занять гораздо больше времени для обработки с LCM, но достаточно РНК могут быть собраны в течение одного дня сессии. Точное расположение myenteric сплетения может существенно различаться между образцами, основанный на ткани и его подготовки до замораживания.
- Начните сбор последовательных секций для LCM, с оптимальной коллекции, обеспечивая наибольшее количество нейронов и глии каждого слайда. В зависимости от площади поверхности образца несколько разделов могут быть объединены на один слайд перо мембраны.
- Смонтируйте разделы на перо мембраны слайды, охлажденные кратко в криостат для 5-10 s. При монтаже, ткани должны расплава незначительно, максимально сохраняя целостность РНК.
4. Окрашивание
Примечание: Обзор процесса окрашивания, обратитесь к таблице 1. Все решения, используемые готовятся в стандартных 50 мл конические флаконов. Лечении наружной трубки с РНКазы обеззараживания решения не представляется, улучшить результаты (данные не показаны).
- Подготовить насыщенный раствор 4% количество кресил фиолетовый в 95% этаноле заранее по крайней мере один день и полностью вновь приостановить количество кресил фиолетовый перед загрузкой шприца.
Примечание: Концентрация этанола может потребоваться быть снижен для эффективного окрашивание, как описано в разделе обсуждения. Мы не испытали ли использование 50% или 75% этанола во время окрашивания значительно уменьшает РНК целостности. Количество кресил фиолетовый светочувствительных и таким образом должны быть защищены от света. - После монтирования разделов myenteric сплетения на слайд, немедленно погрузите слайд в коническую пробирку 95% этанола (предварительно охлажденным при-20 ° C) для 30 s.
- Если разделы не полностью придерживаться слайд на предыдущем шаге, слегка теплой в нижней части слайда с перчатке (Лаборатория очистки должны быть помещены между слайд и перчатки), за полное соблюдение перед погружаясь в 95% этаноле. Это решение может быть повторно использован для по крайней мере 3-6 слайдов без снижения РНК целостности.
- Положите слайд вверх на wipe лаборатории размещены на вершине предварительно очищенной, RNase бесплатный контейнера8.
- Предварительно заполните шприц 3 мл с 4% количество кресил фиолетовый и прикрепить фильтр шприц 0,2 мкм.
Примечание: Мы рекомендуем фильтры ацетат целлюлозы. - 6-10 капель пятно непосредственно на ткани разделы8 и инкубировать на 10-30 s, или до достаточного краска сохраняется при исключении из окрашенных. Во время окрашивания, осторожно поверните контейнере слайда вручную, чтобы обеспечить, что в разделах ткани равномерно покрыты пятно.
- Слить пятно и немедленно снять пятно слайд в флакон 75% этанола. Неоднократно погрузите слайд до тех пор, пока избыток краска просочилась основном офф образца. Это может занять от 10-20 s.
- Завершить де пятнать неоднократно окунания образец в пузырек этанола 95% для 10 s. Submerge образца неоднократно до тех пор, пока все излишки пятно было удалено.
- Измените destaining продолжительность, при необходимости, для оптимизации пятнать ганглии. Если слишком много пятно удаляется, образец становится слишком прозрачным, и это может быть трудно визуализировать
Примечание: Это окрашивание протокол оптимизирован на основе нескольких публикаций5,8,10,11 необходимые изменения до того, как были получены удовлетворительные результаты. Таким образом концентрация этанола, используемых в краске и во время процесса destaining следует изменить, при необходимости, для получения оптимального результата.
- Измените destaining продолжительность, при необходимости, для оптимизации пятнать ганглии. Если слишком много пятно удаляется, образец становится слишком прозрачным, и это может быть трудно визуализировать
5. обезвоживание
- Сразу же погрузите слайд в 100% этанола 2 - 3 раза, для в общей сложности 10-20 s.
- Погрузите слайд в безводный 100% этанола для по крайней мере 30 s. Как очень гигроскопичен безводного этилового спирта, добавьте молекулярные сита (8-12 меш) флакон 100% этанола до начала процедуры, чтобы удалить любые поглощенной воды и таким образом более полностью обезвоживает образца5.
- Неоднократно погрузите слайд в ксилоле на 15-20 s. Этот шаг полностью удаляет слой этанола на слайде. Добавьте молекулярные сита досрочно трубы ксилол, чтобы полностью абсорбируются излишки этанол и вода молекул5.
Предупреждение: Ксилолов классифицируются как раздражение глаз и верхних дыхательных путей и должен использоваться в химической зонта. - Погрузите слайд в ксилоле (с молекулярные сита, 8-12 сетки) для по крайней мере 10 мин.
Примечание: Краткий перерыв может приниматься после этого шага, при необходимости. Образцы можно оставить в ксилоле на 4-5 часов без вредных последствий для окрашивания, НОК или РНК доходность/целостность. - При необходимости, индивидуально Подготовьте несколько дополнительные слайды на данный момент. При подготовке второго раунда слайды после завершения LCM на всех подготовленных слайдов, ткани в криостата может потребоваться refaced, из-за обезвоживания на поверхности ткани. Одного до четырех разделов может должны быть отброшены, прежде чем использовать разделы могут быть собраны.
6. Лазерная захвата Microdissection (LCM)
- Удалить слайд из ксилол и просушите его в химической зонт для по крайней мере 1 min. вставить картридж LCM шапки в LCM микроскопа. Загрузить слайд на сцену и приобрести обзор изображение слайда.
- Определить нужное место для LCM и загрузить колпачок на слайд.
- Совместите инфракрасные (ИК) лазер и отрегулировать его мощность и длительность сделать 20-30 мкм диаметр захвата пятна.
- Найдите лазер ультрафиолетового (УФ) и задайте соответствующие резки скорость и интенсивность.
- Наброски желаемого ганглиев собираться с помощью программного обеспечения LCM, убедившись в том, чтобы остаться в пределах границ области коллекционные на крышку (изображены в слайд Обзор программного обеспечения как зеленая окружность).
- В каждом из следов Отрегулируйте ИК пятна, таким образом, что есть по крайней мере один ИК съемки каждые 100-500 мкм.
- Нажмите кнопку Вырезать ИК/УФ приступить к коллекции все отмеченные ганглии.
- После завершения коллекции, переместите крышку на новое место и повторите процесс сбора или изучить LCM колпачок на КК станции после достаточно заполнена с ганглии (или пока не будет достигнуто рекомендуемый срок 60-80 минут).
- Если мусора присутствуют на крышку, протрите его с помощью острым концом кисточки, предварительно обработанных раствором РНКазы обеззараживания, промываются водой, нуклеиназы свободной и полностью высох.
- Тщательно изучить колпачок на глаз или с увеличением под микроскопом светлые области для обеспечения всех мусор был удален. Если мусор не могут быть удалены путем использования предварительно очищенной кисть, используйте кончик тонкой пипетки (РНКазы бесплатно) чтобы отчищать мусора.
- Закрепите колпачок на 0,5 мл отцентрифугировать заполнены с 230 мкл буфера lysis РНК (RLT буфера от РНК добыча комплект «B», с β-меркаптоэтанол добавлены в концентрации 10 мкл/мл).
- Инвертировать шапку, кратко вихрь и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
- Центрифуга ≥ 5000 g x 5 мин и затем передачи отцентрифугировать трубки для сухого льда.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Лизатов РНК может храниться при температуре-80 ° C без существенного влияния на РНК деградации по крайней мере за 1 неделю. Если РНК изоляция выполняется в тот же день, затем охладите образцы на льду, пока они не готовы для извлечения. - Выполните все дополнительные коллекции в рекомендованные максимальные сроки 80-90 мин после удаления слайд из ксилола. Как обезвоженные секций подвергаются воздействию влажности, полиадениновый постепенно может стать реактивирован. Ограничение периода сбора можно свести к минимуму таких последствий и максимально сохранить целостность РНК.
7. РНК изоляции
- Подготовьте РНКазы свободной станции для экстракции РНК.
- Подготовьте все трубы и реагенты согласно инструкции для извлечения набора РНК.
Примечание: Хотя многие наборы доступны для изоляции РНК после LCM, у нас было лучшее успеха, используя РНК добыча комплект «B», в списке материалов. Смотрите Рисунок 5 для бок о бок сравнения РНК добыча реагентов. - Удаление образцов из морозильной камеры-80 ° C и быстро таять в ванну воды 37 ° C.
- Сразу же вихрь талой образцы для 2-3 s, чтобы равномерно распределить тиоцианат соли Гуанидиновые.
- Объединить каждого образца с равным объемом 70% этанола. Бильярд 2 или более лизатов вместе, при необходимости, для достижения достаточной концентрации РНК.
- Действовать согласно инструкциям производителя в руководстве для процесса извлечения РНК, используя протокол, оптимизированный для microdissected образцов.
- Элюировать РНК на заключительном этапе в минимальный рекомендуемый объем свободной от нуклеиназы воды (14 мкл).
- После изоляции РНК аликвота 1-2 мкл РНК от каждого образца в новую предварительно помечены бесплатные РНКазы трубка для оценки качества/контроля качества микрофлюидика устройство, которое может визуализировать небольшие количества РНК, например Bioanalyzer. Алиготе дополнительные 1 мкл в отдельную трубу для количественной оценки с комплектом количественного определения РНК высок чувствительности.
- Настроить эти шаги, по мере необходимости, чтобы получить достаточное количество РНК течению анализа (т.е., бассейн большее количество LCM шапки перед извлечение RNA).
- Магазин РНК-80 ° c до сбора достаточно образцов для анализа ниже по течению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы сделали несколько улучшений в существующих протоколов, позволяющих коллекции относительно быстрое интестинальной ганглиев от человека кишечные образцов с помощью LCM, отвечающие стандартам для РНК-Seq. Во-первых мы оптимизировали быстрое замораживание кишечных тканей сегментов в больших базовой формы на поверхности навозной жижи сухого льда в 2 МБ (рис. 1Б). Успехов во время cryosectioning и последующие LCM был получен путем класть кишечных сегментов плоской базы плесень, стоящих перед слизистая оболочка стороной вверх (цифры 1B-1 C). Убедитесь, что базовый формы как плоский как можно на базе, как любой кривизны сделает его гораздо более трудным для получения большого сечения myenteric сплетения. Этот подход приводит к ткани, которая легко секционного на 8-мкм толщина (рис. 1E) и позволяет для полной ликвидации TFM из процесса окрашивания. Мы обнаружили, что TFM вмешивается в процесс окрашивания и таким образом скрывает идентификации кишечных ганглии. Позиционирование в ткани в этой ориентации также избегает секционирование через слизистую оболочку, которая имеет высокое содержание полиадениновый12, хотя из нашего опыта, представляется, что использование спиртового пятна во многом препятствует эти полиадениновый. В тех случаях, где TFM или оптимальной температуры вырезывания (OCT) среднего необходим, мы нашли наиболее надежным сначала выровнять образца в нижней части базовой формы и затем добавить TFM плесень следующий этот шаг (рис. 1D). Это оставляет «окна», в котором кишечника может быть легко визуализировать, что делает его легко выровнять образца и производить разделы, которые являются полностью параллельна myenteric сплетение (рис. 1E).
Подготовка cryosections продольно вниз по длине кишки в ориентации параллельно myenteric сплетение (рисA), создает разделы, в которых наибольшей области кишечных ганглиев на слайд видны при окрашивание) Рисунок 2 C). при приближении к myenteric сплетение (рис. 2C), в приложение продольных и круговой мышечных слоев (рис. 2B), 6-12 последовательных секции могут быть собраны (рис. 2А, продольная), которые содержат большие ряды кишечных ганглии (рис. 2C). LCM колпачки могут быть загружены в емкость с помощью одного раздела (рис. 4D). В противоположность этому при подготовке поперечной разделы свежемороженые кишечника (цифры 2А 2Б), есть только небольшой участок myenteric сплетения, присутствует на каждом слайде (рис. 2B). Очень немногие кишечных ганглии могут быть собраны из разделов поперечной ткани, приводит к большей время, потраченное и выше стоимость общего образца. Секционирование параллельный подход использует менее одной пятой числа LCM шапки и слайды по сравнению с поперечной секций и значительно ускоряет процесс сбора.
До LCM образцы должны витражи и полностью обезвоженный избежать РНКазы активности во время LCM коллекции. Мы разработали эксперимент непосредственно сравнить эффект водный пятна против обколоть пятна на РНК целостности. В этом эксперименте, два кишечная разделам были смонтированы вместе на одном слайде и были обработаны одним из четырех способов, с n = 2-3 биологических реплицирует каждой группы. В первой группе свежие кишечная разделам не были смонтированы на слайд и непосредственно каждый перевели в РНК литического буфера с помощью свободной РНКазы щипцы, предварительно охлажденный сухим льдом (рисA). Для всех остальных групп разделы были присоединились к слайду, обрабатываются, соскрести из слайда с помощью лезвия бритвы РНКазы решение лечение обеззараживания и переданы буфера lysis РНК пинцетом, RNase бесплатно. Стандартный микро гомогенизатор был использован для полностью лизируйте образцы во всех группах. Во второй группе слайды были обработаны через все шаги, но не краска была использована во время окрашивания процедуры (рис. 3B). Чтобы сгруппировать три был обработан с протоколом, описанных выше, с использованием 4% количество кресил фиолетового красителя (рис. 3C). В четвертой группе был использован водный пятно, толуидиновый синий, следуя протоколу для водной основе окрашивание kit, используя смесь толуидиновый синий и гематоксилином (рис. 3D). Как описано, после извлечения РНК, РНК качество оценивали с Bioanalyzer. Единственное различие между водной и спиртовой пятная протоколы было добавлением двух инкубаций воды (30 s каждый), непосредственно перед и после окрашивания, который необходим для поглощения и хранения красителя. Мы обнаружили, что процесс присоединения разделов ткани на слайд и обработки с обезвоживания шаги привели к небольшой, неизбежное снижение качества РНК (цифры 3А 3Б), но что окрашивание с обколоть красителем, количество кресил фиолетовый, не более снизить качество РНК (рис. 3C). В отличие от водного раствора красителя, толуидиновый синий, привело к существенной деградации РНК, вероятно, из-за расширенных водный воздействия, что позволяет эндогенного РНКазы активности (рис. 3D).
Уникальные формы кишечной ганглиев создают трудности для стандартных ИК-LCM с обычными стекла слайды6 (рис. 4A). При использовании пера мембраны слайды (Рисунок 4B), образцы привязаны к тонкий лист, которая отделяется от большинства стеклянное скольжение. УФ лазер прорезает образца и перо мембраны, что приводит к полной отряд ганглиев слайд (рис. 4C) и полное соблюдение LCM крышка (рис. 4D). Структуры любого желаемого размера и формы (> 10-15 µm) может быть полностью и точно собраны (Цифрованного 4E-4 H). Для некоторых образцов с меньшим количеством ганглиев каждой секции крышка может быть перемещенной ≥ четыре раза прежде чем собирать. В этом случае монтаж двух-трех секций на слайд минимизирует использование пера мембраны слайды.
При изоляции RNA от LCM образцов для РНК seq, целью является получить максимально высокое качество РНК и количества, устраняя все геномной ДНК (геномная ДНК). Для определения идеальной процедуры изоляции РНК, мы провели голова к голове сравнения с РНК добыча комплект «A» (рис. 5A), РНК добыча комплект «B» (рис. 5B), или РНК добыча метод «C» с очистки образцов РНК от РНК добыча комплект «B» (рис. 5C). После обработки проб с оптимизированной количество кресил фиолетовый, окрашивание протокол, LCM был использован для сбора стандартизированной круговые образцы (диаметр 500 мкм) кишечника ткани, взятые из продольных мышц слоя. Каждая крышка был назначен случайным образом для каждого из трех групп изоляции РНК, будучи помещанным на вершине отцентрифугировать 0.5 мл трубки, предварительно заполнены соответствующие литического буфера от каждого комплекта. Инструкций были точно так, как описано для каждого комплекта, с РНК добыча комплект «» буфера lysis, требующих инкубации при 42 ° C за 30 мин. Для других наборов комнатной температуре инкубации был использован для 30 мин. Все образцы были кратко vortexed на дополнение к буфера lysis. Образцы были затем охлаждается на льду до зубов были проведены в тот же день (n = 4). Мы обнаружили, что РНК добыча комплект «B» с шагом пищеварение ДНК на столбец привели к высоким РНК качество и количество эффективно устраняя геномная ДНК (цифры 5A-5 C). Важно отметить, что буфера lysis РНК, предоставляемый РНК добыча комплект «B» полностью лизирует захваченных ганглии, при сборе интестинальная ганглии (рис. 5D).
В среднем наши образцы имеют Рин 7.49 ± 0,53 (Таблица 2). Рин десятки более чем 6-7 считается достаточным качеством для РНК seq (в зависимости от конкретного профиля РНК)13, дает нам уверенность, что наши образцы являются достаточным качеством для РНК след, считая, что RIN для этих образцов, по получении, варьировалась от 7,4 до 9,5, эти результаты показывают, что наш оптимизированный протокол обеспечивает отличное сохранение целостности РНК. Представитель результаты качества РНК из образцов, представленных на РНК seq изображены в Цифры 6A-6 C. Результаты от РНК seq продемонстрировать, что наши образцы были успешно виртуализации и иметь уклон скромные 3'-конец (рис. 6D). Как правило больше 3'-уклон благоприятствования в образцах с нижней Рин14; Этот эффект умеренно отражается в наших образцов. Несмотря на это наблюдается гена биотипов во многом согласуются среди всех образцов (Рисунок 6E), показывающее достоверность данных.
Рисунок 1 . Оптимальный, замораживание кишечника ткани. (A) сухой лед ведра готовятся в порядке изображены; я) сухого льда шлама, ii) Лаборатория тканей, помещается поверх сухого льда, iii) временного хранения ведро, iv) упаковка ведро, ведро v) предварительно морозильной камеры хранения, vi) предварительно Морозильная Камера хранения переполнения ведро. (B) мы оптимизировали быстрое замораживание ткани сегментов в больших базовой формы на поверхности навозной жижи сухого льда и 2-methylbutane. (C) A ближе up изображение образца полностью замерзшим, наблюдается в установки, отображаемые в панели кишечной B. сегменты являются плоский проложены в базовый плесень вверх слизистой оболочки стороне. (D) Этот метод замораживания может быть легко адаптирована для использования с TFM путем подготовки ткани таким же образом, но добавление TFM базовой формы перед замораживанием. Результирующая выборка будет иметь полностью плоской myenteric сплетения, с serosa, который может быть легко визуализировать. (E) как подготовка тканей подходы производят отличные ткани секций на Рекомендуемые 8-мкм толщина. Процедура, с помощью TFM изображен здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Правильной ориентации кишечных тканей обеспечивает разделы богаты кишечных ганглии. При подготовке стандартных поперечных сечениях свежемороженые кишечника (A, B), есть только небольшой участок myenteric сплетение (B) на каждый слайд. Очень немногие кишечных ганглии могут быть собраны на слайд, который является длительным и дорогостоящим. В отличие от этого подготовка продольных секций в плоскости myenteric сплетения (C), предлагает гораздо больше площадь поверхности ганглиев (C). Разделы myenteric сплетения получаются путем начиная от serosa и секционирование внутрь через продольные мышцы (B). При приближении к myenteric сплетения, на стыке продольных и круговой мышцы слой (B), 6-12 последовательных секций могут быть собраны. Каждый продольный разрез myenteric сплетения содержит большие ряды кишечных ганглии (представлены в C, используя измененные процедуры окрашивания, без ксилол, преференциально пятно ганглии). LCM шапки может быть заполнен с помощью раздела одной ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Пятнать с краской этанола совместимых улучшает качество РНК. РНК качество измерялась Bioanalyzer и представитель результаты двух выборок из каждой группы отображаются. Первоначального качества РНК измеряется от свежих, демонтируются разделы (A, без лечения), имел ряд целостности РНК (Рин) 8.65 ± 0,07. Для разделов установлены и обрабатываются через все шаги, но без пятен (B) Рин была 7,95 ± 0,35. Когда окрашивание с 4% количество кресил фиолетовый был добавлен к обезвоживанию шаги, было незначительное воздействие на Рин, с среднем Рин 7.87 ± 0,35 (C). В сравнении использование водной пятно, толуидиновый синий (Т-синий), и добавление требуемых воды полоскания к процедуре (D) привело к значительно снижение качества РНК, с Рин 6,45 ± 0,21. Каждая группа состоит из n = 3 биологических реплицирует за исключением «No лечение» и «T-Blue"(n=2). Промывки сообщается здесь как среднее ± стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . РУЧКА мембраны LCM слайды позволяют точное коллекции кишечных ганглиев. С использованием обычных стеклянных скольжениях микроскопа для сбора кишечного ганглиев через LCM приводит к нежелательной ткани пикап (A). Красные круги (30 мкм в диаметре) указывают размер пятна ИК LCM, используемые в процессе сбора. Белая стрелка указывает коллекцию ганглия, подъехал кусок прилегающих мышечной ткани. С перо мембраны слайды (B) образцы привязаны к тонкий лист, которая отделяется от большинства стеклянное скольжение. Когда резка лазером УФ-НОК, образца и перо мембраны ломтиками, что привело в полный отряд ганглиев со слайда, независимо от формы ганглии (C) и полное соблюдение крышку LCM при удалении из образца (D ). Структуры любого желаемого размера и формы ≥10-15 мкм могут полностью и точно собранные [(E), первоначальный ткани знак вверх; (F) ИК и УФ лазерной резки завершена; Колпачок (G) LCM удалены из раздела], как визуализировать на крышку LCM (H). Краеглазка фон панели H присущие крышку и не нежелательного мусора. Зеленые круги синий крестик в панели E-H являются частью программы LCM и являются заполнителями для УФ- и ИК лазеров, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Выбор оптимального комплекта изоляции RNA. РНК целостности результаты отображаются после одновременного сравнения трех различных процедур изоляции РНК. Два представителя участки от каждой группы отображаются для иллюстрации изменчивость, которая может возникнуть между образцами, обрабатываются параллельно. РНК добыча комплект «» (A) производства образцов с Рин 6.83 ± 0,65 средней урожайности РНК, белье и, как правило, имеют ДНК загрязнения, несмотря на выполнение DNase переваривание на колонке. РНК добыча комплект «B» (B) в результате высоких измеряемых Рин, 8,3 ± 0.1. Хотя на основе фенола РНК добыча метод «C» (после очистки образцов РНК, РНК добыча комплект «B») (C) появился в ликвидации геномная ДНК и Рин 7,5 ± 0,26, там были большие загрязнять диапазоны, которые могли явиться результатом таяния Клей полимер от LCM крышки во время шага лизис РНК. Кроме того РНК урожайность от РНК добыча комплект «A» и извлечения метода «C» были постоянно ниже, чем те, которые получены путем РНК добыча комплект «B». Важно отметить, что РНК литического буфера предоставляемые РНК добыча комплект «B». (с дополнительной β-меркаптоэтанол) полностью лизирует захваченных ганглии (D). Каждая группа имела n = 3 биологических реплицирует и представлен здесь как среднее ± стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Представитель результаты. При объединении двух крышек кишечных ганглиев на сэмпл, мы получить достаточного количества РНК для РНК seq (> 1 нг) наряду с отличным качеством РНК. Представитель РНК участки отображаются для образца с Рин 8.3 (A), (B) 7.5 и 6,9 (C). РНК seq данных выполнялись путем оценки качества программы, запустить в р. (D) конец предвзятости сюжет показывает, что образцы были успешно виртуализации и имеют скромные 3'-конец предвзятости. (E) участок гена биотипа представляет также, что результаты секвенирования в значительной степени согласуются среди образцов. В общей сложности, мы имели > 95% успеха в создании образцов полезная для РНК-Seq пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаг | Продолжительность | Цель |
| 95% этанола (-20 oC) | 30 s | Фиксация |
| 4% количество кресил фиолетовый в 95% спирте | 10-30 s | Пятно |
| 75% этанола (с повторные погружения) | 15-25 s | Исключения из пятна |
| 95% этанола (с повторные погружения) | 5-15 s | Исключения из пятна |
| 100% этанола | 15 s | Обезвоживание |
| 100% этанола (безводный) | 30 s | Обезвоживание |
| Ксилол нефтяной (с повторные погружения) | 15-20 s | Обезвоживание |
| Ксилол нефтяной | > 10 мин | Обезвоживание |
| Воздушно-сухой | 1-3 мин | Испарение ксилол |
Таблицы 1. Окрашивания и обзор протокола обезвоживания. В этой таблице описаны наш оптимизированный протокол окрашивание. Обратите внимание, что любой этанола совместимых пятно может использоваться для замены количество кресил фиолетовый, если она обеспечивает лучшие результаты. В некоторых случаях длительности окрашивание и минигелей будет нужно быть продлен или сокращен. Как правило, что чем дольше время фиксации, тем быстрее ткани будет быть полностью окрашенные. Мы не заметили любое сокращение РНК целостности после повторного использования флаконов в 3 раза при подготовке слайды из той же ткани сегмент.
| Доноры | Ткани | РИН |
| F | Колон | 7.1, 7.2, 7.4 |
| M | Подвздошная кишка | 7.2, 6.9, 7,8 |
| M | Двенадцатиперстной кишки | 8.2, 7.4, 7.7 |
| Подвздошная кишка | 7.3, 7.4, 7,6 | |
| Колон | 7.7 7.8, 7.3 | |
| F | Двенадцатиперстной кишки | 7.1, 7.3, 6.9 |
| Подвздошная кишка | 7.8, 7.9, 7,6 | |
| Колон | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | Подвздошная кишка | 6.9, 6.7, 6.9 |
| Колон | 6.8, 6.4 и 6.6 | |
| M | Подвздошная кишка | 7.2, 7.3, 7,6 |
| Колон | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | Подвздошная кишка | 8.3, 7,8, 7.4 |
| Колон | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | Двенадцатиперстной кишки | 8.3, 8.8, 8.0 |
| Подвздошная кишка | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| Колон | 8.4, 8.6, 7.1 |
В таблице 2. Представитель РНК целостность результатов. Образцы, в этой таблице были получены от человека кишечные ганглии. Все отобранные образцы имеют достаточно РНК качества и количества РНК seq анализа. 7.49 ± 0,53 средняя Рин всех образцов, перечисленные в этой таблице. Концентрация РНК также была измерена с помощью анализа Quant это RiboGreen и все образцы в этой таблице выполнили минимальное количество необходимых для нашей РНК seq (> 1 нг) эксперименты. Небольших количествах может использоваться, в зависимости от процедуры предварительного усиления. Однако такие процедуры являются более надежными, когда один ожидает там быть большие различия в экспрессии генов между выборками или группы сравниваемых; в противном случае эти результаты могут маскировать истинный различия в некоторых приложениях РНК seq. Поэтому обычно рекомендуется начать с больше материала, когда это возможно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта процедура позволяет эффективного сбора многочисленных кишечных ганглиев в качестве источника для получения РНК для РНК seq. Здесь мы ускорили процесс, изложенные в существующих протоколах, максимально сохраняя целостность РНК. Поскольку все шаги в этой процедуре являются взаимозависимыми, важно ликвидировать все вопросы с самого начала исследования и что все образцы подготавливаются как аналогично друг к другу как можно скорее, чтобы получить надежные РНК след
С самого начала процедуры РНК целостность может негативно сказалось, если интервал времени (холодное время ишемического) между коллекции ткани в то время донорства и получения ткани для обработки в лаборатории является слишком длинным. Учитывая эту обеспокоенность, мы были удивлены, что РНК высокого качества по-прежнему могут быть извлечены из кишечника образцы даже после 24 часов холодное время ишемического. При кишечных образцы охлажденной и должным образом хранятся в холодильных решения, есть превосходное защиты целостности тканей и РНК качества. Мы требуем, что кишечных тканей очищается после коллекции коллекции группой орган, чтобы ограничить воздействие кишечника пищеварительные ферменты, полиадениновый и других молекул, которые могут повлиять на качество РНК в течение этого периода. Мы обнаружили, что когда кишечных образца не очищается полностью, это может значительно снизить образца Рин.
Используя наши оптимизированные процедуры для подготовки образцов кишечных тканей, мы в состоянии избежать внедрения образцы в TFM. Потому что TFM взаимодействует с этанолом и ксилол сформировать темно коричневый осадок, что мешает с визуализацией кишечных ганглии, мы предпочитаем, исключая из наших образцов. Однако при работе с кишечника ткани от мышей или других видов, исключение TFM может оказаться невозможным. В этом случае мы экспериментировали с удалением TFM придерживался секции на слайде. Если ткань имеет достаточную площадь, этанол (охлажденным при-20 ° C) может капала на слайд с пипеткой передачи быстро исправить TFM, позволяя ему быть удалены с щипцами. Капает этанола на слайды позволяет избежать накопления TFM внутри флакона этанола, который может усугубить подрумянивания эффект при обработке нескольких слайдов.
Во время вспышки замораживание, мы выступаем с помощью сухого льда пульпы с 2 МБ, а не 100% этанола, потому что 2 МБ легко испаряется при посадке на поверхности ткани. Этанол, как правило, испаряются медленнее, особенно в сочетании с TFM, образуя химического осадка на блоке ткани, которые не могут быть легко удалены. Этанола и 2 МБ, как правило, fizz и энергично брызги при замораживании в малые морозильные контейнеры, потому что небольшой объем раствора сухой лед имеет низкая Удельная теплоёмкость. Вместо этого используя большой прямоугольный ковш заполнены с порошкообразного сухого льда обеспечивает большой охлаждения массы и предотвращает колебания температуры, в то время как ткани замораживается.
Как уже упоминалось, иногда проще для получения непрерывной листы кишечных ганглиев от некоторых образцов тканей по сравнению с другими. Понятно, что общая скорость LCM подлежит изменчивости в зависимости от характеристики исходного ткани или кишечной региона производится выборка. По этой причине это часто лучше подготовить многих свежемороженые образцы на начальном этапе. Как правило мы обнаружили, что в общей сложности 20 образцов на сегмент кишечника (~ 2 см x 1,5 см, каждый) является более чем достаточным для обеспечения достаточно РНК нисходящие приложения. Однако если только небольшая длина кишечника ткани, мы рекомендуем минимальная длина 5 см. С нашим подходом низкая доходность, которые были бы получены будет варьироваться от 18-30 нг РНК, чем более подробно говорится ниже. Минимум 5 см Длина может потенциально уменьшиться, в зависимости от приложения, особенно если используется большее количество cDNA предварительное усиление. Эти параметры не были проверены в рамках нынешнего исследования. К примеру интестинальной ганглиев были собраны от полной толщина кишечное биопсии образцов (2 x 2 см) для использования с ПЦР4.
Как мы продемонстрировать в этом исследовании, использование этанола совместимых краситель, фиолетовый, количество кресил предлагает гораздо лучше защиты целостности РНК, чем водный пятно, толуидиновый синий. Когда погружен в этаноле, полиадениновый становятся неактивными5,15. Однако полиадениновый все еще можно восстановить функции при воздействии на воду7,15. При окрашивание с водные краски, ткани должны подвергаться нуклеиназы свободной воды для почти 1 мин9, что приводит к существенной деградации РНК. При использовании окрашивание ткани толуидиновый синий, мы смогли уменьшить подверженность воды до и после окрашивания, потому что такие изменения также уменьшить поглощение и хранение толуидиновый синий, соответственно. Аналогичная проблема была также столкнулись с на основе гематоксилином краска9. В измененный Протокол, описанные здесь окрашивание с фиолетовыми количество кресил избегает прямого воздействия кишечного проб воды, тем самым максимально сохранить целостность РНК. Эти результаты устранить потребность в дополнительных РНКазы ингибиторы в окрашивание раствора. Мы обнаружили, что таких ингибиторов являются неэффективными в возможность использования водного раствора красителя, толуидиновый синий, как он вмешался с поглощения и хранения красителя.
Когда первоначально оптимизации нашей окрашивание протокол, мы не смогли воспроизвести результаты, полученные в других протоколах и сообщает5,,78,11. Хотя причиной этого является неясным, мы нашли несколько факторов, которые привели к несовместимым краситель поглощения и хранения. Например хотя некоторые протоколы успешно окрашенные ткани, используя количество кресил фиолетовый в 100% этанола8 или в 75% этанола5, краситель только слегка помечены ганглиев или имел высокий фон, по сравнению с использованием количество кресил фиолетовый в 95% этаноле. Наконец процент количество кресил фиолетовый, используемых в решении окрашивание также очень важно. Большинство протоколов рекомендуем 1% количество кресил фиолетовый решения7,8, но эта концентрация не обеспечивают, надежный пятнать в наших руках, даже после окрашивания разделы для до 2 мин. У нас было лучшее успех окрашивания с уточнить окрашивание насыщенный раствор 4% количество кресил фиолетовый11 применяется к образцу через фильтр стерильный шприц8. Этот насыщенный раствор позволяет гораздо более быстрого окрашивания образца, как мало, как 10-15 s. предварительной фиксации образца в охлажденной этанола 95% (при температуре-20 ° C) позволяет более быстрое поглощение пятно.
Еще один доклад обнаружил, что кишечные ганглиев наиболее отчетливо витражи в свежезамороженной человека кишечные секций при объединении количество кресил фиолетовый с эозином в 75% этанола раствор5. Однако мы обнаружили, что эозина сделал это более трудно определить ганглиев и что количество кресил фиолетовый, в одиночку, предлагает превосходное обнаружение. В различные исследования было установлено, что количество кресил фиолетовый раствор предусматривает последовательные результаты окрашивания рака эндометрия ткани10. Однако мы обнаружили, это не предлагают каких-либо улучшений для кишечных тканей человека и также не может быть реализована при использовании этанола 95% для окрашивания решения.
Мы проверили ряд условий Протокола может быть приостановлено и возобновлено на более позднее время. Многие протоколы свидетельствуют о резании слайды заранее и повторного замораживания их при температуре-80 ° C сразу же после монтажа на слайд5,9. С этим подход, окрашивание и LCM затем может быть возобновлена в течение следующей недели, предлагая большую гибкость. Однако, не только это мешать значительно пятнать; Он также снижена РНК целостности в наших руках (данные не показаны). Чтобы обойти эту проблему, Гровер et al. рекомендуем окрашивание и обезвоживания секций до хранения в морозильник11. В этом подходе слайды витражи и обезвоженной (как показано в таблице 1) до 100% безводного этилового спирта шаг (протокол раздел 5.2). Затем Образцы инкубируют в второй флакон 100% безводный этанола за 10 минут и немедленно передаются Конические трубки с осушителем гель, который затем охлаждается на сухой лед и переведен в морозилке-80 ° C. При удалении образцы из морозилки, слайды сразу погружали в безводный 100% этанола за 30 s и воздушно-сухой для выполнения LCM11. К сожалению в наших руках, этот подход сократить Рин на 0,6-0,8 (данные не показаны). Поэтому мы прибегли к выполнению всех секционирование, окрашивание и НОК в тот же день с целью получения максимальной целостности РНК в наших условиях. Это доказывает быть длительным процессом, но 10-14 LCM колпачки могут быть заполнены во время работы полный рабочий день.
Наиболее надежным точка, в которой может быть приостановлена наш протокол находится на этапе инкубации ксилола. Слайды остались в ксилоле (молекулярные сита) до 4-5 часов без каких-либо явного воздействия на целостность РНК. Мы обнаружили, что когда три слайды готовятся в то время, все может быть обработан с НОК в течение этого срока, даже если необходим перерыв на час. Альтернативным вариантом является забираются слайды после окрашивания и обезвоживания шаги внутри вакуумной ексикаторе16, но мы еще не пытались этот подход.
РНК изоляции является еще одним важным шагом к процедуре, с наиболее важными факторами существо: получение максимальной возможной доходности РНК, сохраняя полный спектр РНК (без потери мелких видов РНК)17,18, и полностью устраняя геномной ДНК из образца17. В наших руках РНК добыча комплект «B» представила лучший результат с нашими образцами, как он предложил большую урожайность и был более эффективным в геномной ДНК ликвидации. Наши замечания относительно разницы в урожайности РНК добыча реагентов согласуются с предыдущих докладах17,18. Однако есть также много исследований LCM, которые сообщили успех с другими РНК добыча реагентов19,20. Предыдущих докладах также указывают, что процессы на основе столбцов РНК добыча предлагают лучшее удержание чем методы на основе фенола РНК добыча18 малых молекул РНК как малые молекулы РНК могут быть потеряны в надосадке во время осадков РНК шаги.
Мы наблюдали, что РНК лизис буферов, используемых Гуанидиновые тиоцианат с добавил β-меркаптоэтанол очень эффективен для удаления всех захваченных ганглиев от LCM крышки (рис. 5D). Хотя большинство LCM протоколы не предлагаете vortexing lysate, мы нашли, что это дает отличные результаты и не приводить к деградации РНК. Она также обеспечивает еще большую вероятность того, что все захваченные ганглиев будет освобожден от ПСП для извлечение RNA. С помощью этих методов, мы обычно получать урожаи РНК от LCM кишечных ганглиев в диапазоне от 1,8 до 18 нг/см2 кишечника ткани, в зависимости от того, сколько ганглиев присутствуют на данного слайда. Наша процедура РНК seq требует минимального ввода 10 нг РНК, но другие процедуры может иметь гораздо более низких РНК ввода если последовательность обработки включает в себя большее количество циклов предварительного усиления. Общая площадь поверхности ткани, хранящиеся от подготовки и flash замораживание процесса является 40-60 см2, который предусматривает достаточно РНК кДНК библиотеки prep и низкозатратных РНК-Seq приложений.
Хотя наша процедура предназначен для сбора всей кишечных ганглии, подход может быть легко изменен для коллекции одного нейронов, или глии, при желании5. Однако потому что глиальные обрабатывает плотно ensheath нейронов ENS, глиальные РНК будет включаться вместе с РНК захваченных нейронов, хотя и на более низких графов. Это вызывает проблемы при попытке определить нейрональных стенограммы, выразили в ряд низкая копирования. Одноместный клеточной РНК seq предлагает лучшие точность и обнаружения в этом отношении, но требует нейронов в отрыве от кишечных тканей, окрашенных с Пан нейронов маркеров и изолированных с проточной цитометрии21 или из состава кишечного диссоциацией после сортировки с биоинформатики подходы. Большинство исследований диссоциации оборотная сторона что большинство протоколов требуют, что образец быть инкубировали при комнатной температуре или 37 ° C для длительных периодов времени, который известен изменить транскриптом3. Недавно холодной активные протеаз из Bacillus licheniformis был использован для генерации одного клеточных суспензий для мыши тканей и это может быть возможным применить этот фермент для диссоциации тканей человека на 4 ° C22. До тех пор, пока такая оптимизация выполняется, LCM свежий замороженные человеческой ткани является надежное средство для захвата РНК для выражения профилирования элементов периферической нервной системы, как кишечные ганглии.
Таким образом мы разработали надежные и стабильные протокол для коллекции РНК от человека кишечные ганглии. Мы оптимизировали подготовки кишечника ткани человека, окрашивание, LCM процесса и извлечение RNA, основанный на многочисленных публикаций и протоколы. Мы также продемонстрировали надежность этого подхода в сборе образцов РНК достаточного качества РНК РНК-Seq. Этот протокол может широко применяться к тканей, собранных от больных с желудочно-кишечных заболеваний и может быть легко адаптирована для использования с грызун модели, создавая тем самым надежную стратегию развития Роман терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы признательны донорам и их семей, которые сделали возможной эту работу. Мы также ценим помощь персонала в Международный Институт медицины и Теннесси доноров услуг для помогать координировать коллекции ткани, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья, низ OT2-OD023850 EMS2 и стипендиальной поддержки от НИЗ T32-DK007673 до AMZ. Мы благодарны сотрудникам Вандербильта трансляционная патологии общих ресурсов для доступа к LCM инструмент и консультации по подготовке ткани. Общий ресурс патологии Вандербильта ткани частично поддерживается NIH грантов P30-CA068485-14 и U24-DK059637-13. Мы благодарим генома центр технологий доступа в отдел генетики в Вашингтоне школы медицины университета за помощь с геномного анализа. GTAC частично поддерживается NCI рака центр поддержки Грант #P30 CA91842 в Siteman центр рака и ИКТ/CTSA #UL1TR002345 грант от национального центра для исследования ресурсов (NCRR), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и низ Дорожная карта для медицинских исследований. Эта публикация является исключительно ответственности авторов и вовсе не обязательно отражает официальное мнение NCRR или низ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
