Summary
Målet med detta protokoll är att erhålla hög integritet RNA prover från enteriska ganglier isolerade från ofixerade, nymalen resected mänskliga Tarmvävnaden använder laser fånga lokalt (LCM). Protokollet innebär att förbereda flash-frysta prover av mänskliga Tarmvävnaden, kryosnitt, enprocentig färgning och uttorkning, LCM, och RNA-extraktion.
Abstract
Syftet med denna metod är att erhålla hög integritet RNA prover från enteriska ganglier som samlats in från ofixerade, nymalen resected mänskliga Tarmvävnaden använder laser fånga lokalt (LCM). Vi har identifierat fem steg i arbetsflödet som är avgörande för att erhålla RNA isolat från enteriska ganglier med tillräckligt hög kvalitet och kvantitet för RNA-följande punkter Först när du förbereder Tarmvävnaden, måste varje prov ha alla överflödig vätska tas bort genom att läska före utplattning slemhinnorna så mycket som möjligt över botten av stora bas formar. Proverna fryses sedan snabbt ovanpå en slurry av torris och 2-methylbutane. Andra, vid snittning av vävnaden, det är viktigt att placera cryomolds så att intestinal sektioner parallella full planet i plexus myenteric, därmed ger den största ytan av enteriska ganglier per bild. Tredje, under LCM, polyeten napthalate (PEN)-membran diabilder har störst hastighet och flexibilitet i beskriver icke-enhetlig formerna av enteriska ganglier när samla enteriska ganglier. Fjärde, för tydlig visualisering av enteriska ganglier inom sektioner, etanol-kompatibel färgämnen, som tolyloxi Violet, erbjuder utmärkta bevarandet av RNA integritet i förhållande till vattenhaltiga färgämnen. Slutligen för utvinning av RNA från fångade ganglier observerat vi skillnader mellan kommersiella RNA extraktion kit som gav överlägsna RNA kvantitet och kvalitet, samtidigt som det eliminerar DNA kontaminering. Optimering av dessa faktorer i det nuvarande protokollet kraftigt påskyndar arbetsflödet och ger enteriska ganglier prover med enastående RNA kvalitet och kvantitet.
Introduction
Denna metod är utformad för att erhålla hög kvalitet RNA prover av enteriska ganglier från mänskliga Tarmvävnaden använder laser fånga lokalt (LCM). Protokollet beskrivs här har optimerats för att ge tillräcklig RNA kvalitet och avkastning för RNA-sekvensering (RNA-seq) och är avsedd att användas med nymalen resected, ofixerade, flash-fryst mänskliga Tarmvävnaden.
Funktionella mag- och tarm motilitetsrubbningar påverkar en av fyra personer i Förenta staterna. Det enteriska nervsystemet (ENS), även kallad den andra hjärna1, är ofta i centrum för dessa störningar, eftersom det spelar en avgörande roll i gut homeostas och motilitet. Manipulation av gut motilitet i allmänhet varit begränsad till kirurgisk resektion av aganglionic/noncontractile vävnad, kronisk koständring eller mediciner. Överraskande, återstår den full transkriptom av de vuxna ENS sekvenseras, kraftigt begränsa vår förmåga att identifiera molekyler inom det ENS som kan riktade farmaceutiskt eller utnyttjas i stamceller terapier.
Det finns relativt få metoder för att isolera RNA från mänskliga enteriska ganglier. Det första synsättet, cell dissociation2, kräver hög inkubation temperaturer och långa inkubationstider; både som är kända för att främja RNA nedbrytning och förändra den transkriptom2,3. Ett alternativt tillvägagångssätt, LCM, mer tillförlitligt bevarar transkriptom och skyddar RNA integritet. Även om flera studier har använt LCM samla ganglier från färskfryst mänskliga Tarmvävnaden4,5,6, dessa synsätt antingen hämmas av dålig RNA kvalitet och kvantitet, var ganska arbetsintensiva, eller behövs för modifiering av färgning eller RNA utvinning tekniker att arbeta i våra händer. Andra LCM protokoll utformat för att bevara RNA som hittades i LCM produkt manualer som tillhandahålls ytterligare förbättringar7,8, men anpassning behövdes när det gäller isolering av enteriska ganglier8, 9. av dessa skäl har vi utvecklat ett optimerat protokoll baserat på dessa resurser som ger betydande mängder av hög integritet RNA från mänskliga enteriska ganglier, har en relativt snabb arbetsflödet och ger konsekvent resultat över en stor antal prover.
I denna studie presenterar vi en sammanfattning av optimerade rutiner som underlättar isolering av hög integritet RNA från enteriska ganglier från opererande mänskliga Tarmvävnaden. Vår metod omfattar fem viktiga aspekter. Första, nymalen resected, ofixerade human intestinal prover bör trimmas till rätt storlek, har all överflödig fukt bort med en laboratorium vävnad och tillplattade i en stor bas mögel innan flash-frysning ovanpå en slurry av torris och 2-methylbutane (2 MB). Andra, histologisk delar av tarmen bör vara beredd att erhålla full planet i plexus myenteric i en bild, som erbjuder en stor nyttolast av enteriska ganglier. Framgång med detta steg är till stor del beroende av vävnad förberedelseprocessen. För det tredje, ganglier i ENS nonuniform struktur kräver användning av polyeten napthalate (PEN) membran diabilder6, som har störst hastighet och precision under processen LCM. Fjärde, etanol-kompatibel färgämnen, såsom tolyloxi violett, bör användas för att bevara RNA integritet medan färgning enteriska ganglier. Senast, RNA extraktionsprocessen är avgörande för ett lyckat resultat med RNA-följande punkter Vi sökte ett tillvägagångssätt av RNA-extraktion som producerar hög RNA integritet, maximerar RNA avkastning när start med små samlingar av enteriska ganglier, eliminerar DNA kontaminering och behåller så många RNA arter som möjligt.
Sammantaget optimering av dessa faktorer i den aktuella studien kraftigt påskyndar arbetsflödet och ger prov på enteriska ganglier med enastående RNA kvantitet och kvalitet. Resultaten har varit till stor del konsekvent mellan en betydande grupp av prover, som visar konsekvensen av detta synsätt. Vidare har vi använt dessa metoder framgångsrikt sekvensera dussintals RNA prover från enteriska ganglier. De strategier som markeras här kan också anpassas i stort för att utföra LCM av önskad ganglierna eller kärnor i perifera och centrala nervsystemet och andra fall som kräver isolering av hög kvalitet RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll som beskrivs här har godkänts av den Vanderbilt University institutionella granskning Board (IRB).
1. beredning vävnad ankomst
- Få korrekt IRB godkännande och samordna med mänskliga organ donation organ få nybakade resected, ofixerade Tarmvävnaden från givare som uppfyller alla forskning kriterier krävs för studien.
Obs: Detta protokoll kan anpassas för användning med möss och andra gnagare modeller.- Omedelbart efter resektion av varje intestinal segment, spola det lumen med kylda PBS eller vävnad-lagringsmedium för att ta bort luminala restmaterial eller avföring.
- Efter spolning och kasta avfallet i en lämplig biohazard kärl, dränka vävnaden i en tillräcklig mängd vävnad-lagringsmedium (t.ex. 3 - 5 gånger volymen av Tarmvävnaden) och lagra i individuellt-märkt, vattentäta plast behållare, nedsänkt i is eller kyld fram till användning).
- Bearbeta vävnaden inom 18-26 timmar från tidpunkten för att förhindra betydande RNA nedbrytning.
Obs: Beroende på renhet av intestinal segment och lagring, kan det vara möjligt att förlänga våra föreslagna tidsfrist.
- Förbereda alla material som behövs för mänsklig vävnad samling i förväg, som anges i detta protokoll (se Tabell av material för mer detaljerad produktinformation). Se till att alla nödvändiga personlig skyddsutrustning bärs hela tiden.
- Förbereda torris hinkar tillsammans med pimpstensputs torris som visas i figur 1.
- Krossa tillräckligt torr-is för att fylla 4 standard cirkulär is hinkar och en rektangulär ishink. En standard hinkar ska ha liten (11 x 21 cm) laboratorium vävnader placeras på ytan av torris. Använd om möjligt nya, oöppnade lådor av laboratoriet vävnader.
- Göra en torris slurry av powderizing 2 L torr-is i en ren rektangulära ishink.
- Lägg till före kylda 2-MB upp till ytan av torris. Något blanda och platta den slurry som använder en pipett tip box täcka formen ytan av slammet till en kanal omgiven av större bitar av torr-is längs sidorna av rektangulära skopan.
- Placera flera tunna block med torr-is längs kanterna av is hink att uppmuntra mer snabb nedfrysning. Det bör finnas utrymme för ≥4 bas formar att passa löst i torris flytgödsel skopan vid en given tidpunkt.
- Alternativt, fylld stack ishink inom en annan rektangulär ishink ¼ med torris. Denna placering hjälper bättre isolera torris slammet och förhindrar behovet av frekventa justeringar av torris och 2-MB under förfarandet.
- Placera de torr-is hinkarna i en monteringslinje i följande ordning: 1) torris flytgödsel hink, 2) laboratorium tissue-torr is hink, 3 & 4) normal torr is hinkar, 5) rektangulära torr-is hink (figur 1A).
2. beredning av Flash-fryst mänskliga Tarmvävnaden
Obs: Hela den här processen kan ta mellan 45-80 min per intestinal segment, beroende på Tarmvävnaden kvalitet. Vi rekommenderar också att samla in kvalitetskontroll prover för att bedöma RNA kvalitet och histologi innan du fortsätter med LCM.
- Fyll en stor bricka med våt is och placera kirurgiska skärbrädor ovanpå torris.
- I den här installationen chill en 500 mL och 100 mL bägare för lagring av vävnad och trimmade segment i kalla lagringslösning. Pre chill base formar på skärbrädor så att de är redo att ta emot vävnad.
- Vid mottagandet av färska Tarmvävnaden, Häll av media där vävnaden transporteras och behålla det i de redan kylda bägarna. Lämna lite utrymme i dessa bägare för tillfällig lagring av Tarmvävnaden och trimmade segmenterar, som kommer att förberedas i efterföljande steg.
- Skär intestinal segmentet till en längd av ungefärligt 20 cm, vilket ger gott om vävnad (40-60 cm2) att generera RNA för nedströms tillämpningar och kvalitetskontroll prover. Beroende på vävnad integritet, kan det vara praktiskt att utföra RNA isolering för nedströms behandling med en mycket mindre längd (dvs. 5 cm av tarmen).
- Putsa bort fett och bindväv från tarmen med hjälp av kirurgisk sax. Kvarvarande fett längs den intestinala serosa äventyrar möjligheten att helt platta vävnad i efterföljande steg. Försiktigt trimma vävnaden, för att undvika Hack buk-och brösthinnan under borttagning av fett och bindväv, som strukturellt kan skada plexus myenteric eller gör utsidan av vävnad platta ojämnt för snittning.
- Gör ett längsgående snitt längs hela längden av intestinal provet, företrädesvis vid platsen för mesenterica fastsättning.
- Dissekera bort och kassera den tenia coli från tjocktarmen, så att det planar lättare, efter att ha släppts från spänningar.
- Splay tarm slemhinnan-sidan ner på en kyld skärbräda och skär 1,25-cm breda remsor från hela längden av vävnaden.
Obs: Tarmvävnaden ofta expanderar efter trimning, så denna storlek bör anpassas i enlighet därmed. - Tillfälligt lagra remsor i kylda vävnad-lagringslösning.
Obs: Vi använder Belzer UW kyllagring lösning eftersom den har lång hållbarhet, är relativt kostnadseffektivt och kan lagras i rumstemperatur tills den behövs. - Ta bort en vävnad remsa från kylförvaring lösningen och skär den i segment ~1.5-2 cm lång.
- Snabbt blot intestinal segmenten i en stack av laboratoriet våtservetter, ta bort överflödig vätska och förhindra bildandet av iskristaller längs den intestinala serosa under flash-frysning. Om vävnaden inte är tillräckligt torkat, blir det svårt att få hög kvalitet sektioner från plexus myenteric.
- Låg skrynkligt intestinal bitar slemhinna-sidan på en pre kylda, stora, disponibel plast bas mögel (37 x 24 x 5 mm).
- Platta försiktigt till varje segment av lätt stretching vävnaden över ytan av bas mögel och använda böjd pincett att försiktigt trycka ner och utvisa alla luftbubblor som kan bli instängd under buk-och brösthinnan. Observera att vävnaden expanderar medan tillplattning. Om det behövs, trimma segmenten och skär resterande proverna i en mindre storlek.
Obs: Om vävnaden är överansträngd, kommer detta att snedvrida plexus myenteric. Efter att alla luftbubblor avlägsnas, bedöma tjockleken på provet före frysning. Om det behövs, tryck kanterna av preparatet inåt tills intestinal provet närmar sig sin ursprungliga tjocklek. - Placera den inlästa bas mögel på ytan av torris, 2-MB flytgödsel. Vävnaden ska helt frysa inom 30-60 s, beroende på storlek och tjocklek av intestinal segmentet.
- Torr botten av bas mögel att ta bort kvarvarande 2-MB av snabbt gnugga bas mögel på laboratoriet vävnader pre kyld i andra hinken torr-is.
- Överföra torkade provet till tredje badkaret torris och begrava det under ytan av torris tills den är redo att packas.
- Snabbt följa botten av bas mögel innan inslagning, för att undersöka kvaliteten på provberedning. Anteckna alla prover som inte visas platta eller har stora luftbubblor, eftersom dessa bör undvikas för kryosnitt och LCM.
- Linda in provet i pre märkt aluminiumfolie som läggs ovanpå torris i en hink så att inslagning av vävnad uppstår samtidigt hålls helt fryst.
- Wrap provet med ett lager av plastfolie, att minimera vävnad uttorkning under lagring vid-80 ° C.
- Lagra prover i rektangulär hink tills de är redo att flyttas till frysen.
- Före etikett och pre kyla frys lådor vid-80 ° C för omedelbar förvaring av prover efter samlingen.
- Ta en liten del av vävnad från varje intestinal segment för bedömning av RNA integritet innan LCM.
- Före etikett 2mL RNase-fri rör för varje segment, fylld med ≥500 μl lyseringsbuffert. Vi rekommenderar att du använder RNA Extraction Kit ”D”, som anges i Tabellen för material.
- Homogenisera en liten (2 x 2 mm) bit av tarmen i en standard vävnad mikro-Homogenisatorer (20-40 s, tills ingen vävnad bitar blir kvar). Sedan, genast frysa RNA lysate på torris och förvaras vid-80 ° C tills fortsätter med RNA-extraktion.
- Du kan också bädda in några av avsnitten i vävnad frysning medium (TFM) som en back-up. Förbereda vävnadssnitt på exakt samma sätt som beskrivs i detta avsnitt, men sänk prover i TFM inom bas mögel före flash-frysning.
3. kryosnitt
- Innan kryosnitt, förbereda alla nödvändiga material för färgning och uttorkning och överföra de önskade vävnadsproverna från-80 ° C frysen i en hink med torr-is.
- Förbereda kryostaten för användning genom att ange att den optimala skärtemperatur (-18 till-22 ° C) och avtorkning av ytor med 100% etanol och behandling av bladet och borsta bricka med RNase sanering lösning.
- För att bäst följer provet till chucken, använder du följande metod.
- Placera pincetten i torris för minst 30 s före uppackning intestinal provet och placera den på ytan av torris serosa-sida-upp.
- Häll en 3-5 mm högen av vävnad frysning medium (TFM) på en stor kryostaten preparathållaren och omedelbart överföra den intestinala prov serosa-sida-upp på TFM.
- Snabbt överföra preparathållaren till torris och täck med powderized torris efter att låta TFM att följa provet för 2-5 s vid rumstemperatur. Säkerställa att TFM förblir under planet i plexus myenteric.
Obs: Idealiskt, den yttre ytan av tarmslemhinnan kommer att helt följa TFM innan TFM börjar att frysa utan upptining av provet.
- Montera preparathållaren i kryostatens preparathuvudet och justera preparatet mot kryostaten bladet, så att planet i plexus myenteric kommer att vara parallell med kniven.
- Ange snittningen tjocklek på kryostaten 8 µm. Syftet med att perfekt anpassa förlagan är att erhålla största möjliga yta myenteric plexus på varje bild. Denna tjocklek är generellt rekommenderas för både människa och gnagare vävnad, men kan justeras efter behov.
- Sektion genom de serosa och längsgående muskel tills de når den myenteric plexus.
- Leta upp plexus myenteric, montera ett exempelavsnitt på ett objektglas och fläcken avsnittet med en vattenbaserad dye, såsom 1% tolyloxi violett eller toluidin blå, etc.
- Visa avsnittet under ett ljusmikroskop med 40-2000 X förstoring att identifiera korsningen mellan de längsgående och cirkulära muskellager. Mikroskopet parametrar finns i Tabell för material. I början av snittning, markeras buk-och brösthinnan av närvaron av bindväv. Några återstående mesenterica fett kan också förekomma längs slemhinnorna. Ett blad av lagrets yttre längsgående muskel börjar sedan. När gränsen mellan de längsgående och cirkulära muskellager nås, observeras en del av de enteriska ganglierna.
Obs: I nästa flera avsnitt, plexus myenteric kommer att bli mycket tydliga, med stora strängar av ganglier närvarande inom ett enda avsnitt (figur 2C). Om vävnaden inte är helt platt i början av snittning, då blir endast en del av ganglier närvarande i varje avsnitt vid en given tidpunkt. Ibland, kanske intestinal provet en inneboende ojämn myenteric plexus, trots den vävnad som visas helt platt. Detta är särskilt sant för tolvfingertarmen prover. Vår erfarenhet, dessa prover kan ta mycket längre tid att bearbeta med LCM, men tillräckligt RNA kan samlas inom ett enda dagens sammanträde. Den exakta platsen i plexus myenteric kan variera avsevärt mellan prover, baserat på vävnaden och dess förberedelser före frysning.
- Börja samla seriell avsnitt för LCM, med optimal samlingar som ger det största antalet nervceller och glia per bild. Beroende på ytan av provet, kan flera avsnitt kombineras till en enda penna-membran-bilden.
- Montera avsnitten på pennan membran rutschbanor, kylda kort i kryostaten för 5-10 s. Vid montering, ska vävnaden smälta endast något, maximally RNA bevara.
4. färgning
Obs: En översikt av färgning processen, se tabell 1. Alla lösningar som används är beredda i standard 50 mL koniska flaskor. Behandling av utsidan av rören med RNase sanering lösning verkar inte förbättra resultaten (inga data anges).
- Förbereda en mättad lösning av 4% tolyloxi violett i 95% etanol minst en dag i förväg och fullt återsuspendering tolyloxi violett före lastningen sprutan.
Obs: Koncentrationen av etanol kan behöva sänkas för effektiv färgning, som beskrivs i diskussionsavsnittet. Vi har inte testat om du använder 50% eller 75% etanol under färgning avsevärt minskar RNA integritet. Tolyloxi violett är ljuskänsliga och således bör skyddas från ljus. - Efter montering av delar av myenteric plexus in i bilden, omedelbart dränka bilden i en konisk injektionsflaska av 95% etanol (pre kyld vid-20 ° C) för 30 s.
- Om avsnitten inte helt följer bilden i föregående steg, något varma botten av bilden med en behandskade hand (en laboratorium torka bör placeras mellan bilden och handske), för full vidhäftning innan dränka i 95% etanol. Denna lösning kan återanvändas för minst 3-6 bilder utan att minska RNA integritet.
- Låg på bild ansikte-upp på en lab torka placeras ovanpå en förbehandlade, RNase-fri behållare8.
- Förväg fylla en 3-mL spruta med 4% tolyloxi violett och bifoga ett 0,2 µm spruta filter.
Obs: Vi rekommenderar cellulosaacetat filter. - Applicera 6-10 droppar av fläcken direkt på den vävnad avsnitt8 och inkubera i 10-30 s, eller tills tillräcklig dye behålls när de färgade. Medan färgning, försiktigt rotera behållaren bild för hand för att säkerställa att vävnadssnitt jämnt är belagda med fläcken.
- Häll bort fläcken och omedelbart de fläckar i bilden i en injektionsflaska av 75% etanol. Upprepade gånger dränka bilden tills den överflödiga färgen har mestadels trängt bort av provet. Detta kan ta mellan 10-20 s.
- Slutföra de färgning genom att upprepade gånger doppa provet i en injektionsflaska av 95% etanol för 10 s. Sänk provet upprepade gånger tills alla överskott fläcken har tagits bort.
- Ändra destaining varaktighet, som behövs för att optimera färgningen av ganglier. Om för mycket fläckar avlägsnas, provet blir alltför öppet och det kan vara svårt att visualisera
Obs: Detta färgning protokoll har optimerats utifrån flera publikationer5,8,10,11 som krävs ändring innan tillfredsställande resultat erhölls. Därför bör koncentrationen av etanol som används i färgen och under processen destaining ändras, när nödvändigt, att få ett optimalt resultat.
- Ändra destaining varaktighet, som behövs för att optimera färgningen av ganglier. Om för mycket fläckar avlägsnas, provet blir alltför öppet och det kan vara svårt att visualisera
5. dehydrering
- Omedelbart doppa bilden i 100% etanol 2 - 3 gånger, sammanlagt 10-20 s.
- Sänk bilden i vattenfri 100% etanol för minst 30 s. Som vattenfri etanol är mycket hygroskopiskt, lägga till injektionsflaskan med 100% etanol före starten av förfarandet för att ta bort något absorberas vatten och därmed mer fullständigt torka prov5molekylsiktar (8-12 mesh).
- Upprepade gånger doppa bilden i xylen för 15-20 s. Detta steg tar helt bort lagret av etanol i bilden. Lägga till molekylsiktar förväg rören av xylen, att fullt adsorbera överskott etanol och vatten molekyler5.
FÖRSIKTIGHET: Xylol klassificeras som irriterande för ögon och övre luftvägar och kan användas i kemiska dragskåp. - Sänk bilden i xylen (med molekylsiktar, 8-12 mesh) i minst 10 min.
Obs: En kort paus kan tas efter detta steg, om det behövs. Prover kan lämnas i xylen 4-5 timmar utan skadliga effekter till färgning, LCM eller RNA avkastning/integritet. - Alternativt, individuellt förbereda flera ytterligare bilder på denna punkt. Om förbereder en andra omgång bilder efter avslutad LCM på alla förberedda bilder, behöva vävnaden i kryostaten vara huvudfasad, på grund av uttorkning av vävnadsytan. En till fyra sektioner kan behöva kasseras innan användbara sektioner kan samlas.
6. laser Capture lokalt (LCM)
- Ta bort bilden från xylen och lufttorka det i kemiska dragskåp för minst 1 min. Infoga en patron av LCM caps i LCM Mikroskop scenen. Ladda bilden på scenen och få en översikt bild av bilden.
- Identifiera önskad plats för LCM och ladda en cap in i bilden.
- Rikta in infraröd (IR) lasern och justera dess styrka och varaktighet för att göra en 20-30 µm diameter fånga plats.
- Leta upp ultraviolett (UV) lasern och ange en lämplig styckning hastighet och intensitet.
- Beskriva de önska ganglierna att samlas med programvaran LCM, se till att bo inom gränserna för collectable området på den gemensamma jordbrukspolitiken (skildras i översikten bild av programvaran som en grön cirkel).
- I varje spår, justera IR fläckarna så att det finns minst en IR plats varje 100-500 µm.
- Tryck på knappen IR/UV-skära att fortsätta med insamling av alla markerade ganglier.
- När samlingar har slutförts, antingen flytta locket till en ny plats och upprepa insamlingen eller undersöka LCM locket på QC stationen när locket är tillräckligt fylld med ganglier (eller tills den rekommendera tidsfristen på 60-80 minuter har nåtts).
- Om det finns skräp på cap torka bort det med en spetsig målarpensel som har förbehandlats med RNase sanering lösning, med nuclease-gratis vatten och helt torkat.
- Noggrant undersöka den gemensamma jordbrukspolitiken genom ögat eller med förstoring i ljusa fält Mikroskop för att säkerställa alla skräp har tagits bort. Om skräp inte kan avlägsnas genom användning av förbehandlade pensel, Använd sedan en fin pipettspetsen (RNase-fri) för att skrapa bort skräp.
- Säkra korken på en 0,5 mL mikrofugrör fylld med 230 µL RNA lyseringsbuffert (buffert RLT från RNA Extraction Kit ”B”, med β-merkaptoetanol lagt till vid en koncentration på 10 µL/mL).
- Vänd den gemensamma jordbrukspolitiken, kort vortex och odla i rumstemperatur i 30 min.
- Centrifugera vid ≥ 5 000 x g för 5 min och överför sedan microfuge tube till torr is.
Obs: Protokollet kan pausas här. RNA lysates kan lagras vid-80 ° C utan en betydande effekt på RNA nedbrytning i minst 1 vecka. Om RNA isolering utförs samma dag, då chill proverna på is tills de är redo för utvinning. - Utföra alla ytterligare samlingar inom den rekommenderade maximal tid på 80-90 min efter att ta bort bilden från xylen. Som dehydratiserade avsnitten utsätts för luftfuktighet, kan RNaser gradvis bli återaktiveras. Begränsa insamlingsperioden kan minimera sådana effekter och maximally bevara RNA integritet.
7. RNA isolering
- Förbereda ett RNase-fri arbetsstation för RNA extraktioner.
- Förbereda alla rör och reagenser enligt handboken för RNA extraktion Kit.
Obs: Medan det finns många kits för RNA isolering efter LCM, vi har haft bästa framgång med hjälp av RNA extraktion Kit ”B”, visas i listan material. Se figur 5 för en sida-vid-sida jämförelse av RNA extraktion reagenser. - Ta prover från-80 ° C frysen och Tina snabbt i 37 ° C vattenbad.
- Omedelbart vortex tinade prover för 2-3 s att jämnt fördela guanidinium kaliumtiocyanat salter.
- Kombinera varje prov med en lika stor volym 70% etanol. Sammanföra 2 eller fler lysates, om nödvändigt, att nå en tillräcklig RNA-koncentrationen.
- Fortsätt enligt tillverkarens instruktioner i manualen för RNA extraktionsprocessen, genom att använda protokollet optimerad för microdissected prover.
- Eluera RNA på det sista steget in i minsta rekommenderade volymen nuclease-fritt vatten (14 µL).
- Efter RNA isolering, alikvotens 1-2 µL av RNA från varje prov in i en ny pre märkt RNase-Gratis tube för kvalitetskontroll bedömning och kvalitet med en mikrofluidik enhet som kan visualisera små mängder RNA, såsom en Bioanalyzer. Alikvot en ytterligare 1 µL i ett separat rör för kvantifiering med en hög känslighet RNA kvantifiering kit.
- Justera dessa steg, för att få en tillräcklig mängd RNA för efterföljande analys (dvs., pool ett större antal LCM caps före RNA-extraktion).
- Store RNA vid-80 ° C tills samla tillräckligt många prover för efterföljande analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har gjort flera förbättringar av befintliga protokoll som möjliggör relativt snabb insamling av enteriska ganglier från human intestinal prover använder LCM, uppfyller normerna för RNA-följande punkter Det första optimerat vi snabb frysning av Tarmvävnaden segment i stora bas formar placeras på ytan av en slurry av torr-is i 2-MB (figur 1B). Bästa framgången under kryosnitt och efterföljande LCM erhölls genom att lägga intestinal segment platta inom en bas mögel, vänd slemhinna-sida upp (siffror 1B-1 C). Säkerställa att bas formarna är lika platt som möjligt vid basen, såsom någon krökning kommer att göra det mycket svårare att få ett stort tvärsnitt av myenteric plexus. Detta synsätt resulterar i vävnad som är enkelt sektioneras på 8 µm tjocklek (figur 1E) och möjliggör ett fullständigt avskaffande av TFM från färgning processen. Vi hittade att TFM stör färgning processen och därmed skymmer identifiering av enteriska ganglier. Positionering vävnaden i denna inriktning också undviker snittnings genom slemhinnan, som har ett högt innehåll av RNaser12, även om från vår erfarenhet, det visar sig att användningen av enprocentig fläckar i hög grad hämmar dessa RNaser. I fall där TFM eller Optimal skärtemperatur (ULT) medium behövs, vi fann det säkrast att först platta provet vid botten av bas mögel och Lägg sedan till TFM mögel efter detta steg (figur 1D). Detta lämnar ett ”fönster” i vilken tarmen kan enkelt visualiseras, vilket gör det enkelt att anpassa förlagan och producera sektioner som är helt parallella med plexus myenteric (figur 1E).
Beredning av kryosnitt längdriktningen ned längden på tarmen i en riktning som är parallell till myenteric plexus (figur 2A), genererar sektioner där det största området av enteriska ganglier per bild är synliga vid färgning) Figur 2 C). när man närmar sig den myenteric plexus (figur 2C), på apposition av de längsgående och cirkulära muskellager (figur 2B), 6-12 seriell avsnitt kan samlas in (figur 2A, längsgående) som innehåller stora strängar av enteriska ganglier (figur 2C). LCM caps kan läsas kapacitet med hjälp av ett enda avsnitt (figur 4D). Däremot när du förbereder tvärgående delar av färskfryst tarmen (siffror 2A-2B), finns det bara ett litet område av myenteric plexus närvarande på varje bild (bild 2B). Mycket få enteriska ganglier kan samlas från tvärgående vävnadssnitt, vilket resulterar i större tid investerat och högre kostnad per prov övergripande. Metoden med parallell-snittning använder mindre än en femtedel av antalet LCM caps och diabilder i jämförelse med tvärgående sektioner och påskyndar kraftigt inkassoprocessen.
Innan LCM, måste prover färgas och helt uttorkad för att undvika RNase aktivitet under LCM samling. Vi utformade ett experiment att direkt jämföra effekten av vattenbaserade fläckar vs. enprocentig fläckar på RNA integritet. I detta experiment, två intestinal avsnitt monterades ihop i en enda bild och bearbetades på fyra olika sätt, med n = 2-3 biologiska replikat per grupp. I den första gruppen, färska intestinal sektioner var inte monterad på ett objektglas och varje överfördes direkt till RNA lyseringsbuffert använder RNase-fri pincett pre kyld på torris (figur 3A). För alla återstående grupperna, var sektioner följas till en bild, bearbetas, skrapas bort från bilden med hjälp av ett RNase sanering lösning-behandlade rakblad och överförs till RNA lyseringsbuffert med RNase-fri pincett. En standard micro-Homogenisatorer användes till fullt lysera proverna i alla grupper. I den andra gruppen, bilderna bearbetades genom alla steg, men ingen färgämne användes under förfarandet färgning (figur 3B). Grupp tre bearbetades med det protokoll som beskrivs ovan, använder 4% tolyloxi violett färgämne (figur 3C). I den fjärde gruppen användes en vattenbaserad bets, toluidin blå, samtidigt följa protokollet för en vattenlösning-baserade färgning kit använder en blandning av toluidin blå och hematoxylin (figur 3D). Efter utdrager RNA, som beskrivits, bedömdes RNA kvalitet med en Bioanalyzer. Den enda skillnaden mellan vattenfasen och enprocentig färgprotokoll var tillägget av två vatten inkubationer (30 s varje), omedelbart före och efter färgning, vilket krävs för upptag och bevarande av färgen. Vi fann att processen att följa vävnadssnitt till bild och bearbetning med uttorkning steg ledde till en liten, oundvikliga minskning av RNA kvalitet (siffror 3A-3B), men att färgning med enprocentig färgämnet, tolyloxi violett, inte ytterligare minska RNA kvalitet (figur 3C). Däremot ledde den aqueous dye, toluidin blå, till betydande RNA nedbrytning, sannolikt på grund av utökad aqueous exponering som tillåter endogena RNase aktivitet (figur 3D).
De unika formerna av enteriska ganglier innebära svårigheter för standard IR-LCM med konventionella glas diabilder6 (figur 4A). När du använder penna-membran diabilder (figur 4B), följs prover en tunn plåt som är fristående från majoriteten av glasskiva. Den UV-lasern skär genom både prov och penna membran, vilket resulterar i fullständig avskildheten av ganglier från bild (figur 4C) och full efterlevnad av LCM GJP (figur 4D). Strukturer av någon önskad storlek och form (> 10-15 µm) kan vara helt och just insamlade (Basso 4E-4 H). För vissa prover med färre ganglier per sektion, kan den gemensamma jordbrukspolitiken vara flyttade ≥ fyra gånger innan vi samlar in. I detta fall minimerar montering två till tre sektioner per bild användningen av PEN-membran diabilder.
När isolera RNA från LCM prover för RNA-seq, är målet att få högsta möjliga RNA kvalitet och kvantitet, samtidigt som det eliminerar alla genomiskt DNA (gDNA). För att identifiera en idealisk RNA isolering förfarande, vi utfört en head-to-head jämförelse med en RNA Extraction Kit ”A” (figur 5A), RNA Extraction Kit ”B” (figur 5B), eller RNA extraktionen metod ”C” med sanering av de RNA-proverna av RNA Extraction Kit ”B” (bild 5C). Efter bearbetning prover med optimerad tolyloxi violett färgning protokoll, användes LCM att samla standardiserade cirkulära prover (diameter 500 µm) av Tarmvävnaden, tagna från längsgående muskellagrar. Varje cap tilldelades slumpmässigt till var och en av de tre RNA isolering grupper, placeras ovanpå en 0,5 mL mikrofugrör förfylld med den respektive lyseringsbuffert från varje kit. Anvisningarna följdes exakt som beskrivs för varje kit, med RNA Extraction Kit ”A” lyseringsbuffert kräver inkubation vid 42 ° C i 30 min. För de andra kit användes rumstemperatur inkubation i 30 min. Alla prover var kort vortexed vid tillägg till lyseringsbuffert. Proverna var sedan kyld på is tills extraktioner utfördes samma dag (n = 4). Vi hittade att RNA Extraction Kit ”B” med ett på-kolumn DNA matsmältningen steg resulterade i högsta RNA kvalitet och kvantitet samtidigt effektivt eliminera gDNA (siffror 5A-5 C). Ännu viktigare, lyserar den RNA lyseringsbuffert som tillhandahålls av RNA Extraction Kit ”B” fullt fångade ganglier när samla enteriska ganglier (figur 5D).
I genomsnitt har våra prover en RIN 7.49 ± 0,53 (tabell 2). RIN noter av större än 6-7 bedöms vara av tillräcklig kvalitet för RNA-seq (beroende på den specifika RNA-profilen)13, ger oss förtroende att våra prover är av tillräcklig kvalitet för RNA-följande punkter med tanke på att RIN för dessa prover, vid mottagandet, har varierat från 7,4 till 9,5, indikerar dessa resultat att vår optimerade protokoll ger utmärkt bevarandet av RNA integritet. Representativa RNA kvalitetsresultat från prover som lämnats in för RNA-seq skildras i Siffror 6A-6 C. Resultat från RNA-seq visar att våra prover var framgångsrikt sekvenserade och har en blygsam 3'-änden bias (figur 6D). Generellt är en större 3'-bias gynnade i prover med lägre RIN14; Denna effekt är måttligt återspeglas i våra prover. Trots detta överensstämde de observerade gen biotyp i stort sett bland alla prover (figur 6E), som anger tillförlitligheten i uppgifterna.
Figur 1 . Optimal frysning av Tarmvävnaden. (A) torr is hinkar är beredda i den ordning som skildras; Jag) torris flytgödsel, ii) laboratorium vävnader placeras ovanpå iii) tillfällig lagring hink, v) före frys lagring hink, iv) förpackning hink, torris, vi) före frys lagring overflow hink. (B) vi optimerat snabb nedfrysning av vävnad segment i stora bas formar placeras på ytan av en slurry av torris och 2-methylbutane. (C) en närmare upp bilden av ett helt fryst provexemplar observerats i setup visas i panelen B. intestinala segment läggs platt i en bas mögel uppåt slemhinna-sida. (D), denna frysning metod kan lätt anpassas för användning med TFM av förbereda vävnaden på samma sätt, men att lägga till TFM bas mögel före frysning. Resulterande provet kommer att ha en helt platt myenteric plexus, med en serosa som enkelt kan visualiseras. (E), båda vävnad förberedelse metoder producerar utmärkta vävnadssnitt på rekommenderade 8 µm tjocklek. Proceduren med TFM avbildas här. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Rätt orientering av Tarmvävnaden ger sektioner rik på enteriska ganglier. När du förbereder standard tvärgående tvärsnitt av färskfryst inälvan (A, B), finns det bara ett litet område av myenteric plexus (B) på varje bild. Mycket få enteriska ganglier kan samlas per bild, vilket är tidsödande och kostsamt. Däremot erbjuder förbereder längdsnitt i planet i plexus myenteric (C), en mycket större yta av ganglier (C). Delar av myenteric plexus erhålls genom start från buk-och brösthinnan och snittning inåt genom längsgående muskeln (B). När man närmar sig den myenteric plexus, vid korsningen av längsgående och cirkulär muskel skiktet (B), kan 6-12 seriell avsnitt samlas. Varje längdsnitt av myenteric plexus innehåller stora strängar av enteriska ganglier (representeras i C med en modifierad färgningsproceduren, utan xylen, företrädesvis färga ganglier). LCM caps kan vara fylld till kapacitet med hjälp av en enda vävnad avsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Färgning med en etanol-kompatibel färgämne förbättrar RNA. RNA kvalitet mättes genom Bioanalyzer och representativa resultat av två prover från varje grupp visas. Inledande RNA kvalitet mätt från färska, omonterade delar (A, ingen behandling), hade en RNA integritet antal (RIN) 8,65 ± 0,07. För avsnitt monterad och bearbetas genom alla steg, men utan fläcken (B), var RIN 7,95 ± 0,35. När färgning med 4% tolyloxi violett lades till uttorkning stegen, fanns det en försumbar effekt på RIN, med en genomsnittlig RIN 7,87 ± 0,35 (C). I jämförelse resulterade användningen av vattenbaserade fläcken, toluidin blå (T-blå) och tillägg av krävs vatten sköljer förfarandet (D) i avsevärt reducerat RNA kvalitet, med en RIN 6,45 ± 0,21. Varje grupp bestod av n = 3 biologiska replikat utom ”nr behandling” och ”T-Blue"(n=2). RINs redovisas här som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . PEN membran LCM diabilder aktivera exakt samlingar av enteriska ganglier. Med vanligt glas objektglas att samla in enteriska ganglier via LCM tenderar att resultera i oönskade vävnaden pickup (A). De röda cirklarna (30 µm i diameter) ange storleken på de IR LCM ställen används under inkassoprocessen. Den vita pilen indikerar en ganglion samling som drog upp en bit av intilliggande muscularis vävnad. Med penna-membran rutschkanor (B) följs prover en tunn plåt som är fristående från majoriteten av glasskiva. När du klipper med UV-LCM laser, både prov och penna membran skivas, vilket resulterar i fullständig avskildheten av ganglier från bilden, oavsett ganglion formen (C), och slutföra adherencen till LCM locket när bort från provet (D ). Strukturer av någon önskad storlek och form ≥10-15 µm kan helt och just insamlade [E, inledande vävnad pålägg; (F) IR och UV laserskärning har slutförts. (G) LCM cap bort från avsnittet], som visualiseras på LCM cap (H). Spräckliga bakgrunden i panelen H är inneboende i den gemensamma jordbrukspolitiken och inte oönskade skräp. Gröna cirklar blå hårkorset i paneler E-H är en del av programmet LCM och platshållare för UV- och IR-lasrar, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Att välja en optimal RNA isolering kit. RNA integritet resultaten visas efter en samtidiga jämförelse av tre olika RNA isolering förfaranden. Två representativa tomter från varje grupp visas för att illustrera de variationer som kan uppstå mellan prover bearbetas parallellt. RNA Extraction Kit ”A” (A) producerade prover med en RIN 6,83 ± 0,65 förutsatt måttlig RNA avkastning och tenderade att ha DNA kontaminering, trots utföra en på-kolumn DNAS matsmältningen. RNA Extraction Kit ”B” (B) resulterade i den högsta uppmätta RIN, 8,3 ± 0,1. Medan den fenol-baserade RNA extraktion metoden ”C” (följt av sanering av de RNA-proverna med RNA Extraction Kit ”B”) (C) föreföll eliminera gDNA och hade en RIN 7,5 ± 0,26, fanns det stora kontaminerande band, som kan ha resulterat från smältningen av den självhäftande polymer från LCM locket under RNA lysis steg. Ytterligare, RNA avkastning från RNA Extraction Kit ”A” och extraktionen metod ”C” var genomgående lägre än sådana som erhållits genom RNA Extraction Kit ”B”. Ännu viktigare, den RNA lyseringsbuffert som tillhandahålls av RNA Extraction Kit ”B”. (med extra β-merkaptoetanol) lyserar fullt fångade ganglier (D). Varje grupp hade n = 3 biologiska replikat och presenteras här som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Representativa resultat. Vid poolning två mössor av enteriska ganglier per prov, vi får tillräckliga mängder RNA för RNA-seq (> 1 ng) tillsammans med utmärkt RNA kvalitet. Representativa RNA tomter visas ett exempel med en RIN 8,3 (A) och 7,5 (B) 6,9 (C). RNA-seq data drevs via en kvalitetsbedömning program, som kör i R. (D) slut-bias tomten anger att proverna var framgångsrikt sekvenserade och har en blygsam 3'-änden bias. (E) genen biotyper tomten representerar också att sekvensering resultat är till stor del konsekvent mellan proverna. Totalt har vi haft en > 95% framgång i genererar prover användbara för RNA-Seq vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Steg | Varaktighet | Syfte |
| 95% etanol (-20 oC) | 30 s | Fixering |
| 4% tolyloxi violett i 95% etanol | 10-30 s | Fläcken |
| 75% etanol (med upprepade doppning) | 15-25 s | De bets |
| 95% etanol (med upprepade doppning) | 5-15 s | De bets |
| 100% etanol | 15 s | Dehydrering |
| 100% etanol (vattenfri) | 30 s | Dehydrering |
| Xylen (med upprepade doppning) | 15-20 s | Dehydrering |
| Xylen | > 10 min | Dehydrering |
| Lufttorka | 1-3 min | Avdunstning av xylen |
Tabell 1. Färgningen och uttorkning protokoll översikt. Denna tabell beskriver vårt optimerade färgning protokoll. Observera att alla etanol-kompatibla fläcken kan användas att ersätta tolyloxi violett, om det ger bättre resultat. I vissa fall måste varaktigheterna för färgning och avfärgning ska förlängas eller förkortas. Generellt, ju längre kommer fixering tiden, desto snabbare vävnaden att fullt färgas. Vi har inte märkt någon minskning av RNA integritet efter återanvändning av flaskor upp till 3 gånger när du förbereder bilder från segmentet samma vävnad.
| Givare | Vävnad | RIN |
| F | Kolon | 7.1, 7,4, 7,2 |
| M | Ileum | 7.2, 6,9, 7,8 |
| M | Tolvfingertarmen | 8,2, 7,4, 7,7 |
| Ileum | 7,4, 7,6, 7,3 | |
| Kolon | 7,7, 7,8, 7,3 | |
| F | Tolvfingertarmen | 7.1, 7.3, 6,9 |
| Ileum | 7,8, 7,9, 7,6 | |
| Kolon | 7.3, 8.0, 7,5 | |
| M | Ileum | 6,9, 6,7, 6,9 |
| Kolon | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Ileum | 7.2, 7.3, 7,6 |
| Kolon | 6,7, 7,6, 7,7 | |
| M | Ileum | 8,3, 7,8, 7,4 |
| Kolon | 7.0, 7,4, 7.0 | |
| F | Tolvfingertarmen | 8,3, 8,8, 8.0 |
| Ileum | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| Kolon | 8,4, 8,6, 7,1 |
Tabell 2. Representativa RNA integritet resultat. Alla de prover som visas i den här tabellen erhölls från mänskliga enteriska ganglier. Alla valda prover har tillräcklig RNA kvalitet och kvantitet för RNA-seq analys. Den genomsnittliga RIN av alla prover i tabellen är 7.49 ± 0,53. RNA-koncentrationen mättes också med RiboGreen Quant-iT-analys och alla prover visas i i den här tabellen har träffat den minsta kvantitet som krävs för våra RNA-seq (> 1 ng) experiment. Mindre mängder kan användas, beroende på förfarandet före förstärkning. Dock är sådana förfaranden mer tillförlitliga när man förväntar sig det att vara stora skillnader i genuttryck mellan prover eller grupper som jämförs; Annars kan dessa resultat maskera verkliga skillnader i vissa RNA-seq-program. Det är därför allmänt rekommenderas att börja med mer material om möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta förfarande möjliggör effektiv insamling av talrikt enteriska ganglier som en källa att härleda RNA för RNA-följande punkter Här har vi påskyndat de processer som beskrivs i befintliga protokoll samtidigt maximally RNA integritet. Som alla stegen i proceduren är beroende av varandra, är det viktigt att alla problem elimineras från uppkomsten av studien och att alla prover är beredda som likaså till varandra som möjligt, att erhålla tillförlitlig RNA-följande punkter.
Från början av förfarandet, kan RNA integritet påverkas negativt om tidsintervallet (kall ischemisk tid) mellan insamling av vävnad vid tidpunkten för organdonation och mottagandet av vävnad för bearbetning i laboratoriet är för lång. Med tanke på denna oro, blev vi förvånade att hög kvalitet RNA fortfarande kan extraheras från intestinal prover även efter 24 timmar kalla ischemisk tid. När tarmens proverna är kylda och lagras korrekt i kylförvaring lösning, finns det fantastiskt skydd vävnad integritet och RNA kvalitet. Vi kräver att Tarmvävnaden spolas vid insamling av orgel samling teamet, för att begränsa exponeringen av tarmen till matsmältningsenzymer, RNaser och andra molekyler som kan påverka RNA kvalitet under denna period. Vi har funnit att när intestinal preparatet inte töms helt, kan detta avsevärt minska provets RIN.
Använder vår optimerade procedur för att förbereda intestinal vävnadsprover, kan vi undvika inbäddning prover i TFM. Eftersom TFM interagerar med etanol och xylen bildar en mörk brun fällning som stör visualisering av enteriska ganglier, föredrar vi att undanta den från våra prover. När du arbetar med Tarmvävnaden från möss eller andra arter, kan uteslutandet av TFM dock inte möjligt. I detta fall, har vi experimenterat med att ta bort TFM från ett vidhäftat avsnitt i en bild. Om vävnaden har en tillräcklig yta, kan etanol (kyld vid-20 ° C) vara droppade in i bilden med en överföring pipett fixar snabbt den TFM, så att den kan tas bort med pincett. Droppande etanol på bilderna undviker ansamling av TFM inom injektionsflaskan med etanol, vilket kan förvärra browning effekten när flera bilder bearbetas.
Under flash-frysning gynnar vi med pimpstensputs torr-is med 2-MB, i stället för 100% etanol, eftersom 2-MB lätt förångas när landning på ytan av vävnaden. Etanol tenderar att avdunsta mer långsamt, särskilt i kombination med TFM, bildas en kemisk slam på blocket vävnad som inte kan avlägsnas enkelt. Både etanol och 2-MB tenderar att fizz och splatter kraftigt när frysning i små frysning behållare, eftersom den lilla volymen av torris slam har en låg specifik värmekapacitet. I stället använder en stor rektangulär hink fylld med powderized torris ger en stor kylande massa och förhindrar temperaturvariationer medan vävnaden är att frysas.
Som nämnts, är det ibland lättare att få kontinuerlig ark enteriska ganglier från vissa vävnadsprover i relation till andra. Förståeligt, den totala hastigheten av LCM är föremål för variationer beroende på källa vävnaden eller intestinal regionen som provtas egenskaper. Av denna anledning är det ofta bäst att förbereda många färskfryst prover vid uppkomsten. Generellt har vi funnit att sammanlagt 20 prover per segment av tarmen (~ 2 cm x 1,5 cm, varje) är långt mer än tillräckligt för att ge gott om RNA för nedströms tillämpningar. Men om bara en liten längd av Tarmvävnaden finns, rekommenderar vi en minimilängd på 5 cm. Med vår strategi, skulle den lägsta avkastning som man får variera från 18-30 ng av RNA, som närmare diskuteras nedan. Minst 5 cm längd kan potentiellt minskas beroende på programmet, särskilt om högre mängder av cDNA preamplification används. Dessa parametrar testades inte i den aktuella studien. Till exempel har enteriska ganglier samlats från fullhudsskador intestinal biopsiprover (2 x 2 cm) för användning med qPCR4.
Som vi visar i denna studie, erbjuder användningen av etanol-kompatibel färgämnet, tolyloxi violett, mycket bättre skydd av RNA integritet än aqueous fläcken, toluidin blå. När nedsänkt i etanol, blir RNaser inaktiva5,15. RNaser kan dock fortfarande återfå funktionen en gång utsätts för vatten7,15. När färgning med aqueous färgämnen, måste vävnaden utsättas för nuclease-fritt vatten för nästan 1 min9, vilket leder till betydande RNA nedbrytning. När du använder toluidin blå vävnad färgning, har vi kunnat minska exponering för vatten före och efter färgning, eftersom sådana ändringar också reducerade upptag och lagring av toluidin blå, respektive. Ett liknande problem uppstod också med en hematoxylin-baserade dye9. I det ändrade protokollet som beskrivs här, undviker färgning med tolyloxi violett direkt exponering av intestinal proverna till vatten, därmed maximally RNA bevara. Dessa resultat eliminera behovet av ytterligare RNase-hämmare i färglösningen. Vi hittade att sådana hämmare är ineffektiva möjliggöra användningen av vattenbaserade färgen, toluidin blå, eftersom det störde både upptag och bevarande av färgen.
När du först optimerar våra färgning protokoll, vi kunde inte reproducera resultaten av andra protokoll och rapporter5,7,8,11. Anledningen till detta är oklara, hittade vi flera faktorer som lett till inkonsekvent dye-upptag och retention. Till exempel, även om vissa protokoll har framgångsrikt målat vävnad hjälp tolyloxi violett i 100% etanol8 eller 75% etanol5, färgämnet endast svagt märkt ganglierna eller hade hög bakgrund, jämfört med att använda tolyloxi violett i 95% etanol. Senast, procentuella andelen tolyloxi violett används i färglösningen är också mycket viktigt. De flesta protokoll rekommenderar en 1% tolyloxi violett lösning7,8, men denna koncentration tillhandahöll inte pålitlig färgning i våra händer, även efter färgning sektioner för upp till 2 min. Vi hade bästa framgång färgning med en klargj橬一j mättade färglösningen 4% tolyloxi violett11 tillämpas på provet genom en steril spruta filter8. Denna mättad lösning möjliggör mycket mer snabb färgning av provet, i så lite som 10-15 s. före fixering av provet i kylda 95% etanol (vid-20 ° C) möjliggör ett snabbare upptag av fläcken.
En annan rapport fann att enteriska ganglier tydligast var målat i färskfryst human intestinal sektioner när man kombinerar tolyloxi violett med eosin i en 75% etanol lösning5. Vi hittade dock att eosin gjort det svårare att identifiera ganglier och att tolyloxi violett, ensam, erbjuder överlägsen identifiering. I en annan studie konstaterades det att en buffrad tolyloxi violett lösning gav konsekvent färgning resultat för endometriecancer vävnad10. Vi hittade dock detta inte erbjöd någon förbättring för mänskliga Tarmvävnaden och också inte kunde genomföras när du använder 95% etanol för färglösningen.
Vi har testat ett antal villkor som protokollet kan pausas och återupptas vid ett senare tillfälle. Många protokoll föreslå snittning diabilder före tid och åter frysa dem vid-80 ° C direkt efter montering på bild5,9. Med denna inställning, färgning och LCM kan sedan återupptas inom nästa vecka, erbjuder stor flexibilitet. Dock inte bara detta kraftigt störa färgning; det minskade också RNA integritet i våra händer (inga data anges). För att kringgå problemet, rekommenderar Grover et al. färgning och uttorkande avsnitten innan förvaring i frys11. I denna strategi, är diabilder målat och uttorkad (som i tabell 1) upp till 100% vattenfri etanol steget (protokoll avsnitt 5.2). Sedan prover inkuberas i en andra injektionsflaska med 100% vattenfri etanol i 10 min och överförs omedelbart till ett koniskt rör med torkmedel gel, som sedan kyld på torris och överförs till-80 ° C frysen. När du tar prover från frysen, är diabilder omedelbart nersänkta i 100% vattenfri etanol för 30 s och lufttorkad före att utföra LCM11. Tyvärr i våra händer minskas detta tillvägagångssätt RIN med 0,6-0,8 (inga data anges). Vi tillgrep därför utför alla snittning, färgning och LCM i samma dag för att få maximal RNA integritet i våra villkor. Detta visar sig vara en tidskrävande process, men 10-14 LCM caps kan fyllas under en hel dags arbete.
Den mest pålitliga punkt där våra protokoll kan pausas är xylen inkubation steget. Bilderna har lämnats i xylen (med molekylsiktar) för upp till 4-5 h utan någon uppenbar effekt på RNA integritet. Vi har funnit att när tre bilder är beredda på en gång, alla kan behandlas med LCM inom denna tidsperiod, även om en timmes paus behövs. Ett alternativ är att ut bilder efter färgning och uttorkning steg inom en vakuum förslutna exicator16, men vi har ännu inte försökt detta tillvägagångssätt.
RNA isolering är ännu ett avgörande steg till förfarandet, med de viktigaste faktorer som: att erhålla maximal möjliga avkastningen av RNA, behålla hela spektrumet av RNA (utan förlust av mindre RNA arter)17,18, och helt eliminera genomiskt DNA från prov17. I våra händer gav RNA Extraction Kit ”B” det bästa resultatet med våra prover, det erbjuds större avkastning och var effektivare på genomisk DNA eliminering. Våra observationer angående skillnaderna i avkastning mellan RNA extraktionsreagens överensstämmer med tidigare rapporter17,18. Men finns det också många LCM studier som rapporterat framgång med andra RNA extraktion reagenser19,20. Tidigare rapporter visar också att de kolumnbaserade RNA extraktion processerna erbjuder bättre bevarande av små RNA-molekyler än fenol-baserade RNA-extraktion metoder18 eftersom små RNA-molekyler i supernatanten kan gå förlorade under RNA nederbörd steg.
Vi observerade att RNA lysis buffertar som använder guanidinium kaliumtiocyanat med extra β-merkaptoetanol är mycket effektiv på att ta bort alla fångade ganglier från LCM GJP (figur 5D). Medan de flesta LCM protokoll tyder inte på vortexa det lysate, har vi funnit att detta ger utmärkta resultat och inte resulterar i RNA nedbrytning. Det ger också en ännu större sannolikhet att alla fångade ganglier kommer att frigöras från den gemensamma jordbrukspolitiken för RNA-extraktion. Med dessa metoder, få vi generellt RNA avkastning från LCM av enteriska ganglier i spänna av 1,8 till 18 ng/cm2 av Tarmvävnaden, beroende på hur många ganglier finns på en viss bild. Vårt RNA-seq förfarande kräver en minsta ingång 10 ng RNA, men andra förfaranden kan ha mycket lägre RNA ingång om en sekvensering bearbetningen omfattar ett större antal före förstärkning cykler. Den totala ytan av vävnad som lagras från förberedelserna och flash-frysning processen är 40-60 cm2, som ger gott om RNA för cDNA bibliotek prep och lågintensivt RNA-Seq applikationer.
Medan vårt förfarande är avsedd för insamling av hela enteriska ganglier, kan metoden lätt ändras för insamling av enstaka nervceller eller glia, om så önskas5. Men eftersom gliaceller bearbetar tätt inkluderas ensheath nervceller i ENS, gliaceller RNA tillsammans med RNA av fångade nervceller, om än i lägre antal. Detta väcker frågor när du försöker identifiera neuronala avskrifter uttryckt på en låg kopia nummer. Encelliga RNA-seq erbjuder det bästa precision och upptäckt i detta avseende, men kräver nervceller att skiljas från Tarmvävnaden, målat med pan-neuronala markörer, och isoleras med flödescytometri21 eller identifierade från hela-tarm dissociations efter sortering med bioinformatik metoder. Nackdelen med de flesta dissociation studier är att de flesta protokoll kräver att provet inkuberas vid rumstemperatur eller 37 ° C under längre perioder, som är kända för att påverka den transkriptom3. Nyligen, den kalla-aktiva proteashämmaren från Bacillus licheniformis har använts för generering av enda cellsuspensioner för mus vävnader och det kan vara möjligt att tillämpa detta enzym för dissociationen av mänsklig vävnad vid 4 ° C22. Tills sådan optimering är fulländad, är LCM av färsk fryst mänsklig vävnad ett robust sätt att fånga RNA för uttryck profilering av perifera nervsystemet element som enteriska ganglier.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett pålitligt och konsekvent protokoll för insamling av RNA från mänskliga enteriska ganglier. Vi har optimerat utarbetandet av mänskliga Tarmvävnaden, färgning, LCM processen och RNA-extraktion baserat på talrika publikationer och protokoll. Vi har också visat tillförlitligheten i denna strategi att samla in RNA prover av tillräcklig kvalitet för RNA för RNA-följande punkter Detta protokoll kan användas i stort sett på vävnader som tagits från patienter med ett antal gastrointestinala sjukdomar och kan lätt anpassas för användning med gnagare modeller, därmed kan erbjuda en tillförlitlig strategi för utvecklingen av nya behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma att givare och deras familjer som gjort detta arbete möjligt. Vi uppskattar också hjälp av personalen vid International Institute of Medicine och Tennessee givare tjänster för att hjälpa samordna insamling av vävnad används i denna studie. Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 till EMS2 och stipendium stöd från NIH T32-DK007673 till AMZ. Vi är tacksamma till personal vid Vanderbilt translationell patologi delade resursen för tillgång till LCM Instrument och råd om vävnad förberedelse. Vanderbilt vävnad patologi delade resursen stöds delvis av NIH grants P30-CA068485-14 och U24-DK059637-13. Vi tackar i genomet Technology Access Center i Department of Genetics vid Washington University School of Medicine för hjälp med genomanalys. GTAC är delvis stöds av NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 till Siteman Cancer Center och IKT/CTSA Grant #UL1TR002345 från National Center för forskning resurser (NCRR), en komponent av National Institutes of Health (NIH) och NIH Färdplan för medicinsk forskning. Denna publikation ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis de officiella syn på NCRR eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
