Summary
本协议描述了一种高效的方法, 用于提取和定量的咖啡因在细胞悬浮液中的表达水平和评价咖啡因合酶酶活性的实验过程。编码这种酶的基因。
Abstract
咖啡因 (13, 7-trimethylxanthine) 是一种嘌呤生物碱, 目前流行饮料, 如咖啡和茶。这种次生代谢产物被认为是一种化学防御, 因为它具有抗菌活性, 被认为是一种天然杀虫剂。咖啡因也可以产生负面的化感作用, 防止周围植物的生长。此外, 世界各地的人们使用咖啡因的镇痛和刺激作用。由于对咖啡因技术应用的兴趣, 这种化合物的生物合成途径的研究已经发展。这些研究主要集中于了解调节咖啡因生物合成的生物化学和分子机制。体外组织培养已成为研究这种生物合成途径的有用系统。本文将介绍一步一步的协议, 以量化咖啡因和测量的转录水平的基因 (CCS1) 编码咖啡因合成酶 (CS) 的细胞悬浮液, 以及它的活动。
Introduction
咖啡因是咖啡1属植物 biosynthesized 的次生代谢产物。这生物碱属于甲基黄嘌呤家庭并且被认为作为一个化工厂防御, 因为它可能采取行动反对病原体和草食动物的有害作用2,3。此外, 这种代谢物负责的刺激性能的咖啡饮料, 这是普遍消费全球4,5。由于其特性, 一些研究小组对咖啡因6,7的生物合成途径和分解代谢有兴趣。目前, 植物体外细胞/组织培养作为评价咖啡因积累的替代品, 在不同的生物和非生物学的战略8,9。
咖啡因的生物合成涉及 7-甲基黄嘌呤的水解释放从相应的核糖核苷, 其次是有序的n-methylations 在位置3和1。特定的s-甘基蛋氨酸 (SAM) 依赖 n-甲基 (NMT) 催化甲基化在位置 7, 而可可碱合酶 (TS) 和 CS 分别参与3和 1-methylations, 生产可可碱和咖啡因。对不同 NMTs 基因编码的研究, 使人们了解调节咖啡因生产的机制10,11。CS 具有n-甲基活性, 催化了咖啡因11生物合成途径的最后两个步骤。在咖啡树幼苗中, 光辐射可以增加 CS 的活性, 从而增加咖啡因的生物合成。最近, 我们发现, 在光照射下维持细胞悬浮液是评价产生非生物胁迫因子影响咖啡因生物合成途径的最佳条件.8。这些研究中获得的信息可能在代谢工程和系统生物学中的应用, 以最大限度地研究这种体外系统中的咖啡因生物合成途径。
鉴于获得合适的咖啡因生物合成模型的优点, 我们优化了咖啡因在细胞悬浮液中的提取条件. 还有可能制定一个有用的协议来研究酶活性, 以及评估咖啡咖啡因合酶 1 (CCS1) 编码这种酶的基因转录水平的方法学步骤。在此, 我们报告了一个协议, 以提取和量化的咖啡因在C.
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Protocol
1. 咖啡因在咖啡细胞悬浮液中的提取。
- 使用C. 咖啡细胞悬浮液9。保持悬浮由双周亚文化在 Murashige 和 Skoog 培养基在 pH 值4.3 与恒定的 100 rpm 震动25°c 在连续的光之下 (8.3 瓦特/m2)。
- 用11µm 孔滤纸和傅书礼漏斗在真空过滤下收获细胞。
- 用鳞片将收集到的细胞的新鲜重量进行登记, 用铝箔包裹, 将它们冷冻在液氮中, 并保持在-80 摄氏度直到分析。
- Lyophilize 冷冻细胞材料为72小时。
- 登记冻干细胞的重量, 以估计干重产量。
- 将粉状物料存放在可重复使用的聚乙烯袋中 (9 厘米 x 7.5 厘米)。浸渍的材料, 以细粉和储存在干燥, 直到使用。
- 测量0.5 克的干细胞物质的分析尺度, 并添加到一个玻璃瓶 (25 毫升)。
- 在冻干细胞中加入10毫升丙酮, 混合在三十年代的涡旋搅拌机中均匀化。然后, 用铝箔封住瓶子。
- 混合在 100 rpm 使用一个转子在室温 (25 °c) 为5小时。
- 将所有材料转移到15毫升圆锥管和离心机在 1.3万 x g 10 分钟. 将液相转移到一个新的管, 并减少在室温下的通风罩干燥。
- 并用重悬25µL 丙酮的样品。
2. 用薄层层析法 (TLC) 评价咖啡因的条件. 密度测定
- 将先前悬浮咖啡因提取物的1µL 应用于固定相。
注: 硅胶板 (F254) 用作固定相。在应用样品之前, 在色谱室 (14 厘米 x 12 厘米 x 9.5 厘米) 上, 用10毫升的氯仿-甲醇 [9:1 伏/v] 开发了板材, 并在室温下干燥。图 1显示了应用样品的色谱板的特性。在研制该板材之前, 该室用溶剂饱和30分钟。薄层板应处理使用手套, 以避免污染。 - 用10毫升的流动相环己烷丙酮 [40:50 v/v], 在色谱室中开发薄层层析。
注: 这种混合物允许咖啡因的分离在保留因素 (Rf) 0.34。- 从房间中取出薄层色板, 让它在室温下完全干燥。
- 在短波长紫外光中可视化咖啡因波段 (UV, 254 nm)。使用紧凑型紫外线灯。此外, 在这一步, 使用护目镜与紫外线防护。
- 通过密度 273 nm 量化咖啡因含量。该仪器采用色谱软件进行控制。
3. 核糖核酸 (RNA) 分离
- 用过滤纸 (11 µm 孔径) 从步骤1.1 和真空滤液中取细胞悬浮液。
- 收集过滤纸上的蜂窝材料, 在分析天平上称量0.5 克的蜂窝材料, 并将其包装在铝箔上。冷冻样品与液体 N2。
- 浸渍用液态氮瓷砂浆中的细胞样品, 加入1毫升的 RNA 分离试剂直至均匀化。
注: 在300摄氏度的消音器炉内对瓷迫击炮进行杀菌消毒6小时, RNA 分离试剂含有苯酚、异硫氰酸胍等成分。- 将样品的500µL 转移到无菌离心管 (1.5 毫升)。加入300µL 氯仿-异戊醇 (24:1) 和 300 ul 平衡苯酚 (pH 8.0)。
- 将样品与涡旋搅拌机混合, 然后将其离心在 2万 x g 15 分钟, 在4摄氏度。
- 转移 300 ul 的上部阶段到一个离心管。添加 200 ul 的异丙醇。在-20 摄氏度孵育1小时的管子。
- 离心管在 1.2万 x g 10 分钟在4摄氏度, 然后醒酒液相。
- 加入1毫升乙醇 (70%), 形成试管中的颗粒。离心机在 1.2万 x g为10分钟和醒酒。重复此步骤两次。
- 在室温下干燥样品1.5 小时 (25 摄氏度)。并用重悬 RNA 提取物与 25 ul 焦碳酸二乙基 (DEPC) 处理的水。
注: 用于 RNA 提取, 使用 0.1% DEPC 的水处理。
4. RNA 转录与脱氧核糖核酸酶 (DNase) 的孵化
- 加入一个无菌离心管, 添加2µg 的总 RNA 提取物。添加 1 ul 10x 反应缓冲器 (100 毫米三盐酸, 25 毫米氯化镁2, 1 毫米 CaCl2)。添加 1 ul 1 U/µL DNase。
- 用 DEPC 处理的水将反应带到 10 ul 的最终体积。将样品和离心机简单地混合在 2000 x g上, 1 分钟。
- 以37摄氏度孵化样品30分钟。
- 停止反应与增加 1 ul 50 毫米二钠 ethylenediaminetetraacetate 二水合物 (Na2EDTA) 和孵化样品在65°c 为10分钟。
- 用琼脂糖凝胶电泳分析 RNA 的完整性。
- 准备一个标准的1% 琼脂糖凝胶和染色1µL 3x 锂核酸染色溶液。
- 将500的 RNA 应用于琼脂糖凝胶, 并运行凝胶。
- 使用凝胶照片文档系统可视化 RNA 的完整性。
- 用 RNA 作为逆转录酶 cDNA 合成的模板。
5. 补充脱氧核糖核酸 (cDNA) 合成
- 在离心管中添加2.5 微克的总 RNA。添加 1 ul deoxythymine (dT) 底漆, 并填补管到 13 ul 最终体积与核酸酶的水。混合样品, 然后离心 2000 x g 1 分钟。
- 将样品孵化65摄氏度, 5 分钟, 然后在4°c 2 分钟。
- 添加 4 ul 5x 反应缓冲器用于逆转录酶, 2 ul 的核苷酸 triphosphates (dNTPs) 混合 (每 dNTP 10 毫米) 和 1 ul 逆转录酶 (200 U/µL)。轻轻搅拌, 离心机在 2000 x g 1 分钟。
- 将样品孵化45摄氏度, 50 分钟, 然后在70°c 10 分钟。
- 使用紫外分光光度计量化 cDNA 浓度。
- 用 cDNA 作为聚合酶链反应 (PCR) 的模板。
注: 反应缓冲器分别用作 10x (步进 4.1.1) 和5x 倍浓缩 (步骤 5.3)。
6. 实时定量 PCR (qPCR) 放大基因CCS1
- 添加 7.5 ul 的 Taq DNA 聚合酶 2x (0.1 U/毫升) 和0.1 微米5羧基 x 罗丹明 (火箭) 到 PCR 离心管。
注: 热启动 Taq DNA 聚合酶2x 被用作2x 浓缩溶液。- 添加 5 ul 的无核酸酶水。
- 添加 0.75 ul 每10微米向前和反向底漆放大基因CCS1 (AB086414) (向前: 5 '-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3 ' 和反向: 5 '-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3 ')。在单独的反应 (向前: 5 '-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3 ' 和反向: 5 '-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3 ')9, 使用引物为蛋白作为保留的基因。
- 添加 600 ng cDNA 模板。
- 执行放大反应在50°c 2 分钟和95°c 5 分钟. 孵化反应在实时 PCR 系统为40个周期95°c 为三十年代, 60 °c 三十年代和72°c 为三十年代。
- 在三十年代和20°c 孵化样品在50°c 十年代。
- 用 PCR 软件对数据进行分析。
- 用由 Livak 和 Schmittgen (2001)12描述的 2-ΔΔCT方法计算相对表达式。
注: 分析包含除 DNA 模板 (无模板控制、NTC) 以外的所有组件的控制反应, 以丢弃被污染的试剂或放大底漆-脂肪酸。
7.咖啡细胞悬浮液总蛋白提取物。
- 用中孔过滤纸在真空下过滤细胞悬浮液。
- 重1克的蜂窝材料和包装在铝箔。
- 用液氮冷冻样品。浸渍在灭菌瓷砂浆中取样, 以获得细粉。
- 将样品转移到玻璃瓶中, 加入2.5 毫升萃取缓冲器 (400 毫米三羟甲基) 氨基甲烷盐酸盐 (三盐酸), pH 为 8.0, 含10毫米β巯基乙醇, 5 毫米 Na2EDTA 和 0.5% (w/v) 抗坏血酸钠。
- 将样品混合在涡流搅拌机中2分钟。
注意: 在冰上保存样品是很重要的, 以防止蛋白质变性。
- 将样品混合在涡流搅拌机中2分钟。
- 离心样品在 2万 x g 20 分钟在4°c 和转移500µL 整除数入低温小瓶 (2 毫升)。将样品存放在-72 摄氏度, 直到使用。
- 以牛血清白蛋白为标准, 用二辛可宁酸法测定分光光度计中 562 nm 样品的蛋白质浓度。
8.咖啡因合成酶的酶法测定
- 在含有200µM sam 的离心管中制备反应混合物, 4.07 kBq 甲基 [3H]-SAM, 200 µM 可可碱, 200 µM 氯化镁2, 5 µM 咖啡因。在 pH 值为8.0 的情况下, 将体积增加到200µL, 100 毫米三盐酸。
- 将离心管放在冰上, 加入含有7-9 毫克蛋白质的可溶性分数的体积。然后, 在恒温浴/循环器中, 通过涡旋和孵育30分钟, 在30摄氏度处进行混合。对于一批样品, 在1分钟内以重复的方法孵化每个样品, 给予足够的时间在30分钟的确切时间内停止对所有样品的反应。
- 加入1毫升氯仿以停止反应, 然后用涡流搅拌机摇动样品。用涡旋搅拌机3分钟摇动样品, 去除溶剂中的放射性咖啡因。
- 离心机样品在 1.1万 x g为5分钟, 并且仔细地恢复容量900µL。然后, 将样品转移到闪烁瓶中。
- 蒸发氯仿, 在室温下25摄氏度完成干燥。将5毫升的闪烁液体添加到瓶子中, 并混合样品。
- 分析在闪烁计数器中加入咖啡因的放射性物质。
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Representative Results
根据图 1所示的方案, 通过对样品进行色谱分析, 对通过本工艺获得的咖啡因提取物进行了薄层定量分析。为了量化细胞提取物中咖啡因的含量, 使用了这种化合物的各种商业标准的曲线 (图 2A)。用 273 nm 的最大吸收峰值 (图 2B) 分析了咖啡因的吸光度模式, 在薄层色谱板上, 咖啡因的峰值分离显示出0.34 和0.39 之间的射频 (图 2C)。
使用本协议评估的咖啡因合成酶的活性表明, 这种酶的特定活动为 1.2 pkat (表 1)。这种酶的活性类似于其他使用纯化蛋白的作者所报告的。
评价CCS1基因表达的第一步是高质量 RNA 的分离。对细胞悬浮液中总 RNA 提取物的质量进行了评价, 证明了28S、18S 和 5S rRNA 亚基的分离, 表明从样品中提取的 rna 质量较高 (图 3A)。然而, 这些 RNA 提取物必须用 DNase 酶处理, 以消除基因组 DNA 污染 (图 3B), 这干扰了 cDNA 的制备。随后, 使用上述协议进行 qPCR, 熔融曲线的结果显示了咖啡因合酶基因的单一放大产物 (图 4)。
图1。用于在薄层色板上应用咖啡因提取物的方案.该方案显示硅胶板尺寸 (6 x 10 厘米), 用于应用多达八个样品, 包括咖啡因提取物或标准。考虑在薄层色板中的样品之间的距离为1厘米, 以获得更好的分辨率的咖啡因带分离。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。用薄层密度法测定 咖啡中咖啡因的含量。(A) 不同咖啡因标准浓度的分离 (车道 1, 0.4; 2, 0.6; 3, 0.8; 4, 1; 5, 1.2; 和 6, 1.4 µg) 和在右边图像中的峰值分离。(B) 使用吸收光谱 (紫外和可见光) 在不同波长的咖啡因标准 (紫线) 和咖啡因提取物 (绿线) 的吸光度模式。(C) 细胞提取物中咖啡因的峰值分离。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。提取总 RNA.用电泳法分析了三种咖啡细胞悬浮液的 RNA 提取物。(A) RNA 提取, (车道1-2 重复);(B) DNase 治疗的 RNA 样品。用3x 锂核酸染色液制备并染色了1% 琼脂糖凝胶。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。使用 qPCR 软件和 RT qPCR 数据生成的熔融曲线.红色标记的曲线是一种与咖啡因合成酶基因相对应的单一放大产物。请单击此处查看此图的较大版本.
| 植物 | 蛋白质提取物 | CS 特定活动 | 参考 |
| 咖啡 | |||
| 细胞悬浮液 | 原油 | 1.2 pkat | 此协议 |
| 胚乳 | 纯化 | 5.7 pkat | 12 |
| 茶 | |||
| 叶 | 纯化 | 11 pkat | 13 |
| 瓜 | |||
| 种子 | 纯化 | 20 fkat | 14 |
表1。不同作物中 CS 特异活性的比较。
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Discussion
我们在这里提出了评价咖啡因含量, CS 活动和转录水平的最佳条件在体外植物组织培养, 如细胞悬浮的C. 阿拉伯咖啡。以前的报告已经证实, 在光照射下维持细胞和在培养基中存在可可碱, 是提高咖啡因含量的合适参数, 从而可以评价咖啡因分离方法。采用反相高效液相色谱法 (RP)。目前, 很少有报道使用一种简单而快速的方法和经济优势来研究细胞悬浮液中的咖啡因生物合成。在这里, 一个替代性评估显示了咖啡因的分离方法, 用薄层密度测量, 这是有效的定量分析咖啡因的细胞提取物。为了评估细胞中的咖啡因, 没有必要将可可碱与以前报告的14、15的培养细胞一起喂养。
咖啡因合酶活性已被评估的几个植物组织, 包括胚乳, 叶和种子。在这些研究中, 测定咖啡因合酶活性的方法包括部分蛋白质纯化步骤, 这表明必须使用纯化酶16,17。在这里, 我们做了一个优化的协议, 以研究 CS 酶活性, 使用可溶性蛋白提取物, 而不需要采取步骤涉及纯化蛋白质。正如其他作者所报道的, 在细胞悬浮液中的 CS 活性可以用 pkat 的单位来测量。我们对叶片中的咖啡因含量和酶活性进行了评价, 它们与体外培养的水平相似。
最后, 虽然以前的作者研究了咖啡因合成酶的表达, 几个已使用分化组织培养6,18。本文所提出的方法对于获得 RNA 提取物和评价 qPCR 在植物细胞悬浮液 (如茶叶和可可) 的不同体外模型中CCS1基因的表达水平是有用的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们实验室的工作由委员会 Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) 的赠款提供给 SMTHS。这项研究还得到了 CONACyT 和 Sistema 全国 Investigadores (4422) 授予 RJPK (37938 号) 的奖学金的支持。作者感谢 CIATEJ 在撰写本手稿时使用了它的安装。特别感谢 Víctor 博士的所有建议在分子生物学科和 Valentín 门多萨, 国际金融公司, UNAM 的设施在拍摄这篇文章。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
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