Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode für die Extraktion und Quantifizierung des Koffeins in Zellsuspensionen von C. Arabica L. und einer experimentellen Verfahren für die Bewertung der enzymatischen Aktivität von Koffein-Synthase mit dem Ausdruck Das Gen, das dieses Enzym kodiert.
Abstract
Koffein (1,3,7-Trimethylxanthine) ist ein Purin-Alkaloid in beliebte Getränke wie Kaffee und Tee vorhanden. Diese sekundären Metaboliten gilt als eine chemische Verteidigung, denn es antimikrobielle Wirkung hat und ein natürliches Insektizid als gilt. Koffein kann auch negative Allelopathische Effekte produzieren, die das Wachstum der umliegenden Pflanzen zu verhindern. Darüber hinaus verbrauchen die Menschen auf der ganzen Welt Koffein für seine schmerzlindernde und stimulierende Wirkung. Aufgrund des Interesses in der technologischen Anwendungen von Koffein ist Forschung auf der biosynthetische Bahn dieser Verbindung gewachsen. Diese Studien konzentrierten sich in erster Linie auf das Verständnis der biochemischen und molekularen Mechanismen, die die Biosynthese von Koffein zu regulieren. In-vitro- Gewebekultur ist ein nützliches System für das Studium dieser biosynthetische Bahn geworden. In diesem Artikel wird Schritt für Schritt-Protokoll für die Quantifizierung von Koffein und Messung der Transkription des Gens (CCS1) Codierung Koffein-Synthase (CS) in Zellsuspensionen von C. Arabica L. sowie seine Tätigkeit beschreiben.
Introduction
Koffein ist eine sekundäre Metaboliten, die Biosynthesized von Pflanzen der Gattung Coffea1ist. Dieses Alkaloid gehört zur Familie methylxanthin und gilt als eine Chemiefabrik Verteidigung, weil es gegen die schädlichen Wirkungen von Krankheitserregern und Pflanzenfresser2,3handeln kann. Dieser Metabolit ist darüber hinaus verantwortlich für die stimulierenden Eigenschaften von Kaffee trinken, die häufig konsumierte weltweit4,5. Aufgrund seiner Eigenschaften interessieren mehrere Forschergruppen Studium die biosynthetische Bahn und Katabolismus von Koffein6,7. Derzeit betreuen Pflanzenkulturen in-vitro- Zelle/Gewebe als Alternative für die Bewertung der Koffein-Ansammlung unter verschiedenen biotischen und abiotischen Strategien8,9.
Koffein-Biosynthese beinhaltet die hydrolytische Freisetzung von 7-methylxanthin aus der entsprechenden Ribose Nukleosid, gefolgt von einem bestellten N-Methylations an den Positionen 3 und 1. Eine spezielle S- Adenosyl-Methionin (SAM)-abhängige N-Methyltransferase (NMT) katalysiert die Methylierung bei Position 7, während Theobromin Synthase (TS) und CS engagieren sich in der 3 - und 1-Methylations, bzw. Herstellung von Theobromin und Koffein. Die Studie von Genen Codierung unterschiedliche NMTs ermöglichte Verständnis der Mechanismen, die Koffein Produktion10,11regelt. CS, die N -Methyltransferase-Aktivität besitzt, katalysiert die letzten beiden Schritte die biosynthetische Weg Koffein11. Kaffeebaum Sämlinge hat sich gezeigt, dass Lichtstrahlung CS Aktivität erhöhen kann, führt zu einer Zunahme der Koffein-Biosynthese. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass die Aufrechterhaltung der Zellsuspensionen von C. Arabica L. unter Lichteinstrahlung die optimale Voraussetzung ist für die Bewertung der Auswirkungen, die abiotischen Stressfaktoren beeinflussen die biosynthetische Bahn Koffein8zu produzieren. Die Informationen in diesen Studien haben Anwendungen in metabolic Engineering und Systembiologie für die Studie des biosynthetischen Koffein-Signalwegs in solchen in-vitro- Systemen zu maximieren.
Angesichts der Vorteile ein geeignetes Modell für die Untersuchung von Koffein Biosynthese zu erhalten, haben wir die Extraktionsbedingungen für Koffein auf Zellsuspensionen von C. Arabica L. optimiert Es war auch möglich, ein nützliches Protokoll für das Studium der enzymatische Aktivität sowie methodische Schritte zur Bewertung des gen Abschriften der Coffea -Koffein-Synthase 1 (CCS1) Kodierung dieses Enzym zu entwickeln. Hier berichten wir über ein Protokoll zum Extrahieren und Koffein in C. Arabica Zellsuspensionen von Dünnschichtchromatographie und Densitometrie (TLC-Densitometrie) zu quantifizieren.
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Protocol
1. Koffein Extraktion in Zellsuspensionen von C. Arabica L.
- Verwenden Sie C. Arabica Zelle Suspensionen9. Pflegen Sie die Suspensionen von zweiwöchentlich Subkulturen in Murashige und Skoog Medium bei pH 4,3 mit konstant 100 u/min schütteln bei 25 ° C unter Dauerlicht (8,3 W/m2).
- Ernten Sie die Zellen unter Vakuumfiltration mit 11 µm Pore Filterpapier und einen Büchner-Trichter.
- Registrieren das Frischgewicht der gesammelten Zellen mit Hilfe einer Skala, in Alufolie wickeln und Einfrieren in flüssigem Stickstoff aufbewahren bei-80 ° C bis zur Analyse.
- Lyophilize das gefrorene Zellmaterial für 72 h.
- Registrieren Sie das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen um das Trockengewicht Ertrag abschätzen zu können.
- Speichern Sie das pulverisierte Material in wiederverwendbare Polyethylen-Beutel (9 x 7,5 cm). Das Material zu einem feinen Pulver und Shop in einem Exsikkator bis zum Gebrauch einweichen.
- 0,5 g zellulären Trockenmasse auf der analytischen Ebene zu messen und zu einem Glaskolben (25 mL) hinzufügen.
- Die gefriergetrockneten Zellen 10 mL Aceton hinzu und mischen Sie in einem Vortex-Mixer für 30 s für Homogenisierung. Anschließend, versiegeln Sie die Küvette mit Alu-Folie.
- Mischen Sie bei 100 u/min mit einem Rotator bei Raumtemperatur (25 ° C) für 5 h.
- Übertragen Sie sämtliches Material auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 13.000 X g für 10 min. Transfer Flüssigkeit phase zu einem neuen Schlauch und darauf reduzieren Trockenheit bei Raumtemperatur in der Dunstabzugshaube.
- Die Probe mit 25 µL Aceton aufzuwirbeln.
2. Voraussetzungen für die Beurteilung des Koffeins durch dünne Schicht Chromatographie (TLC)-Densitometrie
- Gelten Sie 1 µL der zuvor resuspendierte Koffein-Extrakt für die stationäre Phase.
Hinweis: Silica-Gel-Platten (F254) sind als die stationäre Phase verwendet. Vor der Anwendung der Muster, die Platten wurden mit 10 mL Chloroform-Methanol [9:1 V/V] in einer Chromatographie-Kammer entwickelt (14 x 12 cm x 9,5 cm), und die Platten wurden bei Raumtemperatur getrocknet. Die Merkmale der chromatographischen Platte wo die Proben angewendet werden sind in Abbildung 1dargestellt. Die Kammer wurde für 30 min mit Lösungsmittel gesättigt, vor der Entwicklung der Plattenrandes. TLC-Platten sollten behandelt werden mit Handschuhen um Verunreinigungen zu vermeiden. - Die TLC in der Chromatographie-Kammer mit 10 mL der mobilen Phase Cyclohexan-Aceton [40:50 V/V] zu entwickeln.
Hinweis: Diese Mischung ermöglicht die Trennung von Koffein auf ein Zurückbehaltungsrecht-Faktor (Rf) von 0,34.- Entfernen Sie die TLC Platte aus der Kammer und vollständig bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Koffein-Bands im kurzwelligen UV-Licht zu visualisieren (UV, 254 nm). Verwenden Sie eine kompakte UV Lampe. Darüber hinaus für diesen Schritt verwenden Brille mit UV-Schutz.
- Quantifizieren von Koffein durch Densitometrie bei 273 nm. Das Instrument wird mit Chromatographie-Software gesteuert.
(3) Ribonukleinsäure (RNA) Isolierung
- Nehmen Sie die Zellsuspensionen von Schritt 1.1 und Vakuum Filtrat mit Filterpapier (11 µm Porengröße).
- Das Zellmaterial aus dem Filterpapier zu sammeln, 0,5 g von Zellmaterial auf einer Analysenwaage wiegen und in Alufolie packen. Einfrieren der Probe mit Flüssigkeit N2.
- Die Zellprobe in einem Porzellan-Mörser mit flüssigem Stickstoff mazeriert und 1 mL RNA Isolierung Reagenz bis homogenisiert.
Hinweis: Sterilisieren Sie die Porzellan-Mörser im Muffelofen bei 300 ° C, 6 h. RNA Isolierung Reagenz Phenol, Guanidin-Herstellung und andere Komponenten enthält.- 500 µL der Probe zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch (1,5 mL) zu übertragen. Fügen Sie 300 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1) und 300 μL äquilibriert Phenol (pH 8,0).
- Mischen Sie die Probe mit einem Vortex-Mixer und Zentrifugieren Sie es bei 20.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
- Übertragen Sie 300 μL der oberen Phase zu einem Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 200 μl Isopropanol. Inkubieren Sie das Rohr für 1 h bei-20 ° c
- Das Rohr auf 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und dann Dekantieren der flüssigen Phase.
- Fügen Sie 1 mL Ethanol (70 %) ein Pellet in das Rohr zu bilden. 12.000 x g für 10 min zentrifugieren und Dekantieren. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Trocknen Sie die Probe für 1,5 h bei Raumtemperatur (25 ° C). Aufschwemmen den RNA-Extrakt mit 25 μL der Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser.
Hinweis: Für die RNA-Extraktion verwenden Sie Wasser mit 0,1 % DEPC V/V behandelt.
(4) Inkubation von RNA-Transkript mit Deoxyribonuclease (DNase)
- Fügen Sie zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch 2 µg Gesamt-RNA extrahieren. Fügen Sie 1 μl 10 X Reaktion Puffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Fügen Sie 1 μl 1 U/µL DNase.
- Die Reaktion auf ein Endvolumen von 10 μl mit DEPC-behandeltem Wasser zu bringen. Verrühren Sie Probe und Zentrifuge kurz bei 2.000 X g für 1 min.
- Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 30 min.
- Die Reaktion mit der Zugabe von 1 μl 50 mM binatrium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrat (Na2EDTA) zu stoppen und die Probe bei 65 ° C für 10 min inkubieren.
- Analysieren Sie die Integrität der RNA durch Agarose-Gelelektrophorese.
- Bereiten Sie eine standard 1 % Agarosegel und Färben Sie es mit 1 µL 3 x verschuppen Nukleinsäure-Fleck Lösung.
- Anwenden von 500 ng RNA, die Agarose gel und führen Sie das Gel.
- Visualisieren Sie die Integrität der RNA mit einem Gel-Foto-Dokumentationssystem.
- Verwenden Sie RNA als Vorlage für die cDNA-Synthese durch Reverse Transkriptase.
5. ergänzende Desoxyribonukleinsäure (DNA) Synthese
- Fügen Sie 2,5 μg von Gesamt-RNS zu einem Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 1 μL der Oligo-Deoxythymine (dT) Grundierung und füllen Sie den Schlauch zu einem 13 μL Endvolumen mit Nuklease-freies Wasser. Mischen Sie die Probe und dann Zentrifugieren Sie ein 2.000 X g für 1 min.
- Inkubieren Sie die Probe bei 65 ° C für 5 min und dann bei 4 ° C für 2 min.
- Fügen Sie 4 μl 5 x Reaktion Puffer für die Reverse Transkriptase, 2 μL Deoxynucleotide Triphosphate (dNTPs) Mix (10 mM jedes dNTP) und 1 μl Reverse Transkriptase (200 U/µL) verwendet. Vorsichtig mischen und bei 2.000 X g für 1 min zentrifugieren.
- Inkubieren Sie die Probe bei 45 ° C 50 min. und dann bei 70 ° C für 10 min.
- Die cDNA-Konzentration mit einer UV-Spektralphotometer zu quantifizieren.
- Verwenden Sie die cDNA als Vorlage für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Hinweis: Die Reaktion Puffer diente als 10 x (Schritt 4.1.1) und 5 X mal konzentriert (Schritt 5.3), beziehungsweise.
(6) Real-Time Quantitative PCR (qPCR) gen CCS1 zu verstärken
- Eine PCR Microcentrifuge Schlauch 7,5 μl Taq DNA Polymerase 2 x (0,1 U/mL) und 0,1 μM von 5-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) hinzufügen.
Hinweis: Die hot-Start Taq DNA-Polymerase 2 X diente als Lösung 2 x konzentriert.- Fügen Sie 5 μL der Nuklease-freies Wasser.
- Hinzufügen von 0,75 μL 10 μM vorwärts- und Grundierung, das gen CCS1 (AB086414) zu verstärken (nach vorn: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' und reverse: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3 "). Primer für Tubulin als Housekeeping Gene in einer separaten Reaktion verwenden (nach vorn: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' und reverse: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3 ")9.
- Fügen Sie 600 ng cDNA-Vorlage.
- Durchführen die Verstärkung Reaktion bei 50 ° C für 2 min und 95 ° C für 5 min. die Reaktion in Echtzeit-PCR-System für 40 Zyklen von 95 ° C für 30 inkubieren s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s.
- Inkubation die Probe bei 50 ° C für 30 s und 20 ° C für 10 s.
- Analysieren Sie die Daten mit der PCR-Software.
- Berechnung des relativen Ausdrucks durch die 2-ΔΔCT -Methode von Livak und Schmittgen (2001)12beschrieben.
Hinweis: Analysieren Sie eine Kontrollreaktion, die alle Komponenten außer der DNA-Vorlage (keine Vorlage Kontrolle, NTC) enthält zu verwerfen kontaminierten Reagenzien oder Verstärkung Grundierung-Dimere.
7. total Proteinextrakt Zellsuspensionen von C. Arabica L.
- Filter-Zellsuspensionen unter Vakuum mit einem Medium-Pore-Filterpapier.
- Gewicht von 1 g von Zellmaterial und packen Sie es in Alufolie.
- Einfrieren der Probe mit flüssigem Stickstoff. Einweichen der Probe in einem sterilisierten Porzellan-Mörser zu ein feines Pulver zu erhalten.
- Übertragen Sie die Probe auf eine Glasflasche und 2,5 mL Extraktionspuffer (400 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochlorid (Tris-HCl) bei pH 8.0, mit β-Mercaptoethanol 10 mM, 5 mM Na2EDTA und 0,5 % (w/V) Natrium Ascorbat.
- Mischen Sie die Probe in einem Vortex-Mischer für 2 min.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Probe auf dem Eis, Protein-Denaturierung zu verhindern gehalten wird.
- Mischen Sie die Probe in einem Vortex-Mischer für 2 min.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 20.000 X g für 20 min bei 4 ° C und übertragen Sie 500 µL-Aliquots in kryogenen Fläschchen (2 mL). Proben bei-72 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
- Messen Sie die Proteinkonzentration der Probe bei 562 nm in einem Spektralphotometer mit Bicinchoninic Säure Assay mit Rinderserumalbumin als Standard.
8. enzymatische Assays für Koffein-Synthase
- Bereiten Sie eine Reaktionsmischung in einem Microcentrifuge Schlauch mit 200 µM SAM, 4,07 kBq von Methyl [3H]-SAM, 200 µM Theobromin, 200 µM MgCl2und 5 µM Koffein. Erhöhen Sie die Lautstärke auf 200 µL mit 100 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 8,0.
- Halten Sie den Microcentrifuge Schlauch auf Eis und fügen Sie ein Volumen von die löslichen Fraktion mit 7 bis 9 mg Protein. Dann durch Vortex mischen und 30 min. bei 30 ° C in einem thermostatischen Bad/Zirkulator inkubieren. Inkubieren Sie für einen Stapel von mehreren Proben jede Probe in zweifacher Ausfertigung in 1 min Perioden, genug Zeit, um die Reaktionen für alle Proben in einen genauen Zeitraum von 30 min Halt zu geben.
- Fügen Sie 1 mL Chloroform, die Reaktion zu stoppen und dann schütteln Sie die Probe mit einem Vortex-Mixer. Schütteln Sie die Probe mit einem Vortex-Mixer für 3 min, um das radioaktive Koffein in das Lösungsmittel zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie Proben bei 11.000 X g für 5 min und erholen Sie einem Volumen von 900 µL sorgfältig zu. Übertragen Sie anschließend die Proben auf Funkeln Fläschchen.
- Verdunsten Sie das Chloroform zur Vervollständigung der Trockenheit in der Haube bei Raumtemperatur bei 25 ° C. Die Ampulle 5 mL Funkeln Flüssigkeit hinzufügen und Mischen der Probenmaterials.
- Analysieren Sie die Radioaktivität in das Koffein in einem Szintillationszähler integriert.
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Representative Results
Koffein-Extrakte erhalten über das hier vorgestellte Verfahren analysiert wurden von TLC-Densitometrie durch die Proben um Chromatographie nach dem Schema in Abbildung 1gezeigte Platte zu unterwerfen. Verwendet, um die Ebenen von Koffein in zellextrakte, eine Kurve mit verschiedenen Konzentrationen von kommerziellen Standard zu quantifizieren, denn diese Verbindung war (Abbildung 2A). Das Muster der Absorption für Koffein wurde analysiert, in das Spektrum des sichtbaren Lichts (UV-VIS) über eine maximale Absorption Spitze am 273 nm (Abb. 2 b) und die Peak-Trennung von Koffein auf die TLC Platte zeigte eine Rf zwischen 0,34 und 0,39 (Abbildung 2).
Die Aktivität von Koffein-Synthase anhand dieses Protokolls angegeben eine bestimmte Aktivität dieses Enzyms 1,2 Pkat (Tabelle 1). Dieses Enzym-Aktivität war ähnlich, die von anderen Autoren, die gereinigtes Protein verwendet gemeldet.
Der erste Schritt vor der Auswertung des Ausdrucks CCS1 gen war die Isolation von hoher Qualität RNA. Die Qualität des Extraktes von der Gesamt-RNS von Zellsuspensionen abgeleitet wurde bewertet, und die Trennung von 28 s, 18 s und 5 s rRNA Untereinheiten zeigte, darauf hinweist, dass die RNA aus Proben extrahiert von hoher Qualität (Abbildung 3A). Allerdings hatte diese RNA-Extrakte mit DNase Enzym genomische DNA-Verunreinigung (Abb. 3 b), zu entfernen, die mit der Vorbereitung der cDNA stört behandelt werden. Anschließend erfolgte qPCR mittels der oben beschriebenen Protokoll, und das Ergebnis der Schmelze Kurve zeigte eine einzelne Amplifikationsprodukt für das Koffein-Synthase-gen (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schema für die Anwendung des Koffeins extrahieren Proben auf einer TLC Platte. Das Schema zeigt eine Kieselsäure Platte Dimension (6 x 10 cm), die verwendet wird, um bis zu acht Proben einschließlich Koffein Extrakte oder Normen gelten. Halten Sie einen Abstand von 1 cm zwischen den Proben in der TLC Platte, besseren Auflösung der Koffein Band Trennung zu erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Erkennung von Koffein von TLC-Densitometrie in Zelle extrahiert von C. Arabica L. (A) Trennung von verschiedenen standard-Koffein-Konzentrationen (Bahn 1, 0,4; 2, 0,6; 3, 0,8; 4, 1, 5, 6, und 1,2; 1,4 µg) und Trennung von ihren Höchstständen im Bild auf der rechten Seite. (B) Absorption Muster eines Koffein standard (violette Linie) und Koffein zu extrahieren (grüne Linie) bei verschiedenen Wellenlängen mit Absorptionsspektren (ultravioletten und sichtbaren). (C) Peak Trennung von Koffein in der Zelle zu extrahieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Extraktion von Gesamt-RNS. Die RNA-Extrakte von zellulären Suspensionen von C. Arabica L. wurden durch Elektrophorese analysiert. (A) RNA-Extraktion, (Bahnen 1-2 Duplikate); (B) RNA-Proben mit DNase Behandlung unterzogen. 1 % Agarose Gele wurden vorbereitet und mit 3 x verschuppen Nukleinsäure-Fleck-Lösung gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Schmelzenden Kurve mit qPCR Software und RT-qPCR Daten produziert. Die Kurve, die rot markiert ist ein Einzelprodukt verstärkt, die das Koffein-Synthase-gen entspricht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Anlage | Proteinextrakt | CS spezifische Aktivität | Referenz |
| Coffea | |||
| Zellsuspension | Rohöl | 1.2 pkat | Dieses Protokoll |
| Endosperm | Gereinigt | 5.7 pkat | 12 |
| Tee | |||
| Blätter | Gereinigt | 11 pkat | 13 |
| Guarana | |||
| Samen | Gereinigt | 20 fkat | 14 |
Tabelle 1. Vergleich der CS-spezifische Aktivität in verschiedenen Kulturen.
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Discussion
Wir stellen Ihnen hier die optimalen Bedingungen für die Bewertung der Koffein Inhalt, CS Aktivität und Transkript Ebenen in ein in-vitro- Pflanzen Gewebekultur, z. B. Zellsuspensionen von C. Arabica. Frühere Berichten haben bestätigt, dass die Zellen unter Lichteinstrahlung und in Anwesenheit von Theobromin in das Kulturmedium geeignete Parameter für die Erhöhung von Koffein, die es ermöglichen, die Koffein-Trennverfahren bewerten umgekehrt-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) verwenden. Derzeit gibt es nur wenige Berichte, mit denen eine einfache und schnelle Methode mit wirtschaftlichen Vorteilen für Koffein-Biosynthese in Zellsuspensionen zu studieren. Hier zeigte eine alternative Bewertung ein Trennverfahren für Koffein mit TLC-Densitometrie, die effizient für die Quantitative Analyse von Koffein in Zelle Extrakten. Um Koffein in den Zellen zu bewerten, war es nicht notwendig, Theobromin, die Zellkulturen wie bereits berichtet,14,15zu ernähren.
Koffein-Synthase-Aktivität wurde in verschiedenen Pflanzengeweben, einschließlich das Endosperm, Blättern und Samen untersucht. In diesen Studien enthalten die Methoden zur Bestimmung der Koffein-Synthase-Aktivität einen Schritt teilweise Proteinreinigung, die vorgeschlagen, dass es notwendig war, verwenden Sie die gereinigte Enzym16,17. Hier führten wir eine optimale Protokoll für die Studie der CS enzymatische Aktivität mit einem lösliche Protein-Extrakt, ohne die Notwendigkeit von Schritten, die Reinigung des Proteins. CS-Aktivität im Rohöl Extrakt von Zellsuspensionen kann in Einheiten von Pkat, gemessen werden, wie andere Autoren berichtet haben. Wir bewerten das Koffein und enzymatische Aktivität in den Blättern, und sie haben ähnliche Ebenen, die in in-vitro- Kultur.
Schließlich, obwohl frühere Autoren die Expression von Koffein-Synthase studiert haben, haben mehrere differenzierte Gewebekultur6,18verwendet. Die hier vorgestellte Methodik eignet sich eine RNA Extrakt zu erhalten und den Ausdruck Niveaus des Gens CCS1 von RT-qPCR in verschiedenen in-vitro- Modelle der Pflanze Zellsuspensionen, wie Tee und Kakao zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Arbeit unseres Labors wurde finanziert durch einen Zuschuss aus dem Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) an SMTHS. Diese Forschung wurde auch durch ein Stipendium gewährte CONACyT und Sistema Nacional de Investigadores (4422), RJPK (Nr. 37938) unterstützt. Die Autoren danken CIATEJ für die Nutzung der Anlagen während des Schreibens dieses Manuskriptes. Besonderer Dank sind für alle Empfehlungen im Bereich Molekularbiologie und Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM für die Einrichtungen zu Dr. Víctor Manuel González Mendoza verlängert, während der Dreharbeiten zu diesem Artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
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